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Neuroscience

एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल

doi: 10.3791/51482 Published: June 8, 2014

Summary

Microglia उनके बाह्य वातावरण में सामग्री phagocytose या निगल करने के लिए एक उच्च क्षमता के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं. इधर, synaptic घटकों के microglia की मध्यस्थता घिराव दृश्यमान करने और मापने के लिए एक मोटे तौर पर लागू विश्वसनीय, और अत्यधिक मात्रात्मक परख वर्णित है.

Abstract

Phagocytosis एक सेल उसके आसपास के बाह्य वातावरण में सामग्री (संपूर्ण सेल, एक सेल, मलबे, आदि के कुछ हिस्सों) समाई है और बाद में सामान्यतः lysosomal गिरावट के माध्यम से, इस सामग्री को हज़म जिसमें एक प्रक्रिया है. Microglia जिसका phagocytic समारोह neurodegenerative रोग स्वस्थ मस्तिष्क का विकास करने के लिए (अल्जाइमर रोग में जैसे, बीटा amyloid निकासी) (जैसे, synaptic से स्थितियों की एक विस्तृत रेंज में वर्णित किया गया है केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं छंटाई) 1-6. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के विकास माउस retinogeniculate प्रणाली 7 में presynaptic आदानों की microglia की मध्यस्थता घिराव कल्पना और यों के लिए विकसित की एक घिराव परख है. इस परख इस विशेष संदर्भ में microglia समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, वहीं एक समान दृष्टिकोण मस्तिष्क (जैसे, astrocytes) और शरीर के बाकी भर में अन्य फ़ैगोसाइट का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(जैसे, परिधीय मैक्रोफेज) के रूप में भी synaptic remodeling है जिसमें वह अन्य संदर्भों (जैसे, मस्तिष्क की चोट / बीमारी).

Introduction

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Synaptic सर्किट एक जानवर के जीवन भर फिर से तैयार. विकासशील मस्तिष्क में, synapses अधिक फार्म और synapses के एक सबसेट के चुनिंदा हटाने और 8-10 रहते हैं कि उन synapses के रखरखाव और मजबूत बनाने शामिल है जो synaptic छंटाई से गुजरना होगा. इस प्रक्रिया वयस्क तंत्रिका तंत्र की सटीक कनेक्टिविटी विशेषता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. वयस्क में, synapses भी विशेष रूप से सीखने और स्मृति के संदर्भ में, प्लास्टिक हो सकता है. इस plasticity की संरचनात्मक संबद्ध वृक्ष के समान spines और presynaptic BOUTONS 11-13 के अलावा और / या उन्मूलन शामिल करने के लिए लगा रहे हैं. स्वस्थ तंत्रिका तंत्र में इन भूमिकाओं के अलावा, synaptic remodeling भी तंत्रिका तंत्र रोग / चोट 12,14,15 में शामिल है. उदाहरण के लिए, रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद, कटे axons बाद में फिर से तैयार और कार्यात्मक वसूली 16-19 हासिल करने के लिए नए synapses फार्म चाहिए.

NT "> synaptic plasticity का एक महत्वपूर्ण पहलू के रूप में उभरते phagocytosis या हटाने 3,5,20 के लिए किस्मत synapses के घिराव करने की प्रक्रिया है. हमने हाल ही स्वस्थ, प्रसव के बाद माउस मस्तिष्क 7 में synaptic छंटाई के संदर्भ में इस घटना से पता चला है. विशेष रूप से , microglia, निवासी सीएनएस प्रतिरक्षा कोशिकाओं और फ़ैगोसाइट, एक चोटी की अवधि के दौरान और विकासात्मक synaptic छंटाई, चेतक की प्रसव के बाद पृष्ठीय पार्श्व जानुवत नाभिक (dLGN) के एक क्षेत्र में presynaptic आदानों अपनी चपेट में ले दिखाया गया. इस घिराव की आनुवंशिक या औषधीय नाकाबंदी synaptic संपर्क में निरंतर घाटे में हुई.

इस प्रोटोकॉल में, हम presynaptic आदानों की भक्षककोशिकीय की मध्यस्थता घिराव को मापने के लिए एक विश्वसनीय और अत्यधिक मात्रात्मक परख का वर्णन. इस अनुच्छेद के प्रयोजनों के लिए, इस परख रेटिना में रहने वाले रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं शामिल है, जो विकासशील retinogeniculate प्रणाली, (RGCs) के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाएगाdLGN (चित्रा 1 ए) के लिए presynaptic आदानों परियोजना. शुरू करने के लिए, एक lysosomal गिरावट प्रतिरोधी अग्रगामी लेबलिंग रणनीति dLGN में RGC विशेष presynaptic आदानों (चित्रा 1) 7,21 कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो वर्णन किया जायेगा. इस वर्णन, इमेजिंग के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली के बाद और मात्रात्मक 3 आयामी (3 डी) सतह मात्रा प्रतिपादन के साथ संयुक्त confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग घिराव मापने दिया जाएगा. इस पद्धति तय ऊतक तैयार करने पर आधारित है, लेकिन यह भी रहते इमेजिंग अध्ययन में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. परख स्वस्थ, प्रसव के बाद retinogeniculate प्रणाली के संदर्भ में मान्य किया गया है, जबकि महत्वपूर्ण बात है,, एक अन्य मस्तिष्क भर में और बीमारी के दौरान भक्षककोशिकीय न्यूरॉन बातचीत, साथ ही अन्य अंग प्रणालियों में भक्षककोशिकीय समारोह का आकलन करने के लिए एक ही तकनीक लागू हो सकते हैं.

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Protocol

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RGC presynaptic आदानों की 1. अग्रगामी लेबल

नोट: जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों सभी एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार समीक्षा की है और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की देखरेख कर रहे थे.

  1. क्षेत्र और उपकरणों जीवाणुरहित.
  2. एक Plexiglas प्रेरण कक्ष में 4 वॉल्यूम isoflurane% (इस खंड isoflurane% नवजात वयस्क चूहों के लिए काम करता है) के साथ माउस anesthetize. पर-anesthetizing से बचने के लिए बारीकी से चूहों को ध्यान से देखें. चेतावनी: एक निर्वात अपशिष्ट गैस निकासी के साथ साँस लेना बचें.
  3. 1-3 मिनट के बाद, (बड़े चूहों कम समय की आवश्यकता होगी) संज्ञाहरण के उचित स्तर पूंछ बन्द रखो (कोई प्रतिक्रिया मनाया जाना चाहिए) और साँस लेने की दर (दर धीमी और स्थिर होना चाहिए) को देख कर हासिल की है सुनिश्चित करते हैं.
  4. थूथन से अधिक 3-4 वॉल isoflurane% पहुंचाने इसके पक्ष और जगह नाक शंकु पर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत माउस प्लेस (नवजात शिशुओं <प्रसव के बाद 10 दिन (P10) ~ 4 वॉल्यूम%;> P10 ~ 3 वॉल%).
  5. श्वेतपटल बेनकाब. नवजात शिशुओं के इंजेक्शन के लिए पूर्व आंख खोलने के लिए, पलक खोलने और श्वेतपटल को बेनकाब करने के लिए त्वचा वापस खींचने के लिए छोटे वसंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें. बड़े चूहों के लिए, श्वेतपटल को बेनकाब करने के लिए आंख के आसपास त्वचा वापस खींचने के लिए उंगलियों का उपयोग करें. चेतावनी: नवजात शिशुओं में, कभी कभी आंख के कोने पर एक और सीधा कटौती आवश्यक है. , कटौती, तो जरूरत से ज्यादा खून बहाना होगा कि एक रक्त वाहिका के रूप में वहाँ पलक के कोने काटने जब ख्याल रखना.
  6. श्वेतपटल शुरू होता है जहां लाइन पर आंख के पक्ष में एक छोटा सा छेद पंचर करने के लिए एक बाँझ 30.5 जी सुई का प्रयोग करें. अभी तक पर्याप्त उठाव आंख में चला जाता है कि सुई डालने से लेंस को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान रखना.
  7. कांच का छेद से बाहर प्रवाह और तरल अवशोषित करने के लिए एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग करने की अनुमति दें.
  8. कांच का छेद से बाहर बहने से बंद कर दिया गया है, अग्रगामी अनुरेखण डाई के साथ पहले से लोड एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी एक कुंद एंडेड सुई डालनेछेद में. चेतावनी: धीरे धीरे आंख के दूसरे पक्ष puncturing या लेंस को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए सुई डालें.
  9. धीरे धीरे आंख में डाई इंजेक्षन. आमतौर पर, एलेक्सा 594, 647, या 488 (CTB-594, CTB-647, या CTB-488, 5-6 ग्राम / μl) संयुग्मित सबयूनिट β हैजा विष anterogradely ट्रेस RGC आदानों के लिए प्रयोग किया जाता है. नवजात शिशुओं (≤ P10) के लिए 1-2 μl पर्याप्त है और चूहों के लिए> P10 ~ 3 μl पर्याप्त है. नोट: एलेक्सा रंगों lysosomal गिरावट के लिए विशेष रूप से प्रतिरोधी रहे हैं
  10. कुछ सेकंड के लिए छेद में सुई छोड़ दो और फिर धीरे धीरे हटा दें.
  11. अतिरिक्त तरल पदार्थ को अवशोषित और बाहर लीक से डाई को रोकने के लिए एक कपास इत्तला दे दी applicator का प्रयोग करें.
  12. आंखों के लिए एंटीबायोटिक मलहम की एक छोटी राशि लागू करें. नेत्र शल्य चिकित्सा द्वारा खोला गया था, तो धीरे एक साथ पलकें रखते हैं.
  13. दोनों आंखों में इंजेक्शन लगाने हैं, तो दूसरी आंख पर प्रक्रिया को दोहराने.
  14. यह anesth से उबरने के लिए शुरू होता है जब तक के बाद इंजेक्शन (एस), एक गर्मी दीपक के नीचे या एक गर्मी पैड पर माउस छोड़esia.
  15. एक साफ घर पिंजरे के लिए माउस लौटें और यह कॉलोनी की ओर लौटने से पहले पूरी तरह से जाग है बनाना निगरानी.

2. इमेजिंग के लिए ऊतक तैयार करें

इस ऊतक तैयारी प्रोटोकॉल फ़ैगोसाइट फ्लोरोसेंट मार्कर (जैसे, microglia के लिए CX3CR1-EGFP) के साथ चिह्नित कर रहे हैं जिसमें संवाददाता चूहों के लिए प्रयोग किया जाता है. एक संवाददाता लाइन उपलब्ध नहीं है, तो अन्वेषक (चर्चा देखें) ऊतक वर्गों immunostain कर सकते हैं.

  1. ~ 24 घंटा इंजेक्शन के बाद, माउस बलिदान और मस्तिष्क काटना.
  2. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ भरा एक बाज़ ट्यूब में मस्तिष्क को ठीक गिरा चेतावनी: पीएफए ​​विषैला होता है. एक धूआं हुड में या एक डाउनड्राफ्ट मेज पर उपयोग कर और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने से साँस लेना और त्वचा जोखिम से बचें. नोट: फिक्सेशन (≥ 4 घंटा) कम हो सकता है. बजाय ड्रॉप फिक्सिंग के अलावा, 4% पीएफए ​​छिड़काव इस्तेमाल किया एक 2-24 घंटे बूंद तय द्वारा पीछा किया जा सकता. हालांकि, छिड़कना की तुलनानिश्चित नवजात और वयस्क दिमाग ड्रॉप करने के लिए डी छवि गुणवत्ता या मात्रा का ठहराव में कोई अंतर का पता चला.
  3. फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में मस्तिष्क 3x कुल्ला.
    1. एक खाली तौलना नाव में मस्तिष्क और पीएफए ​​डालो.
    2. दूसरे करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण करने के लिए एक रंग का उपयोग पीबीएस के साथ भरा नाव तौलना.
    3. दो बार अधिक पीबीएस में धो मस्तिष्क (हस्तांतरण मस्तिष्क दो और पीबीएस के साथ भरा नौकाओं तौलना).
  4. एक 30% sucrose के समाधान के साथ भरा एक फाल्कन ट्यूब मस्तिष्क स्थानांतरण. मस्तिष्क ट्यूब (24-48 घंटा) की तह तक डूब जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सुक्रोज में मस्तिष्क छोड़ दें.
  5. मस्तिष्क डूब जाने के बाद, सेक्शनिंग के लिए मस्तिष्क को तैयार. निम्नलिखित कदम एक ठंड मंच के साथ एक रपट सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर 40 माइक्रोन चल वर्गों की तैयारी (एक cryostat भी इस्तेमाल किया जा सकता है) हैं.
    1. (DLGN के लिए, मस्तिष्क की विजय - स्तम्भ और दुम भागों निकालने के लिए) की जरूरत नहीं है कि मस्तिष्क के कुछ हिस्सों को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें.
    2. ब्रा रुकसूखी बर्फ पर एल्यूमीनियम पन्नी पर में. इस समय के दौरान, सूक्ष्म अवस्था स्थिर और 0.5 मिलीग्राम एम 0.1 के फॉस्फेट बफर (पंजाब) के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
  6. ठंड मंच पर (यह अपारदर्शी दिखाई देनी चाहिए) जमे हुए मस्तिष्क माउंट.
    1. मंच के लिए इष्टतम काटने तापमान यौगिक (अक्टूबर) की एक छोटी राशि लागू करें.
    2. अक्टूबर फ्रीज करने के लिए शुरू होता है, अक्टूबर में मस्तिष्क रखना. कटौती की जाएगी कि मस्तिष्क के अंत (दुम की ओर चेहरा, dLGN के लिए, उदाहरण के लिए) का सामना करना पड़ जाना चाहिए.
    3. बहुत सूक्ष्मता कुचल सूखी बर्फ के साथ मस्तिष्क और अक्टूबर कवर.
    4. ~ 30 सेकंड के लिए मस्तिष्क / अक्टूबर को सूखी बर्फ छोड़ दें.
    5. सूखी बर्फ को हटाने के लिए एक बड़े पेंट ब्रश का प्रयोग करें. मस्तिष्क और अक्टूबर चरण के लिए जमे हुए किया जाना चाहिए.
  7. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र तक पहुँच जाता है के माध्यम से ऊतक सेक्शनिंग शुरू करो.
  8. आरओआई पहुँच जाता है एक बार, ब्लेड से वर्गों को हटाने और 24 अच्छी तरह से बेनी के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए एक छोटा सा पेंट ब्रश का उपयोगई 0.1 एम पी बी (कदम 2.5.2) युक्त. पूर्व ब्लेड से वर्गों को दूर करने के लिए 0.1 एम पंजाब में यह गीला करके नम पेंट ब्रश रखें. नोट: धारा 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 0.1 एम पंजाब में छोड़ा जा सकता है
  9. वर्गों एकत्र किया गया है एक बार, एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अग्रगामी लेबलिंग कल्पना और लागत पर लाभ होते हैं कि वर्गों का चयन करें.
  10. एक छोटे पेंट ब्रश के साथ एक स्लाइड पर वर्गों माउंट.
    1. एक आरोप लगाया खुर्दबीन स्लाइड के लिए 0.1 एम पंजाब के एक छोटे से पूल लागू करें.
    2. पंजाब के पूल के लिए ऊतक अनुभाग स्थानांतरण.
    3. ओरिएंट को पंजाब और पेंट ब्रश का उपयोग करें और ऊतकों में फैल गया.
    4. अतिरिक्त पंजाब बंद बाती एक Kimwipe प्रयोग करें. खंड बंद wicking से बचने के लिए ध्यान रखना.
    5. पूरी तरह से हवा शुष्क करने की अनुमति दें.
    6. प्रत्येक खंड के लिए बढ़ते मध्यम की एक छोटी सी बूंद लागू करें और (22 x 50 मिमी, सं 1.5) शीर्ष पर एक coverslip माउंट.
    7. इमेजिंग सत्र तक -20 डिग्री सेल्सियस पर नेल पॉलिश और दुकान के साथ स्लाइड के किनारों को सील. नोट: इमेजिंग के साथ हालांकितैयारी की सलाह दी है की एक सप्ताह में, स्लाइड्स इमेजिंग के लिए पहले कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है.

3. इमेजिंग ऊतक

सभी छवियों को एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (UltraView स्वर कताई डिस्क लेजर डायोड (405 एनएम, 445 एनएम, 488 एनएम, 514 एनएम, 561 एनएम, और 640 एनएम) के साथ सुसज्जित confocal खुर्दबीन) पर अर्जित कर रहे हैं. छवियाँ भी (जैसे, लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन, deconvolution, आदि द्वारा पीछा epifluorescent माइक्रोस्कोप) उच्च संकल्प Z-ढेर हासिल करने की क्षमता के साथ किसी भी खुर्दबीन पर हासिल किया जा सकता है. फ्रेम आकार आमतौर पर 1000 x 1000 पिक्सल है.

  1. 10X बढ़ाई आरओआई का पता और एक छवि के अधिग्रहण. Retinogeniculate प्रणाली में microglia इमेजिंग के लिए, आरओआई सबसे औसत दर्जे का dLGN वर्गों है.
  2. उच्च वृद्धि के लिए शिफ्ट (एक 60X योजना ए पी ओ उद्देश्य, 1.4 एनए, आम तौर पर प्रयोग किया जाता है =).
  3. 0.2 माइक्रोन Z-कदम का उपयोग फ़ैगोसाइट युक्त देखने के पहले क्षेत्र मोलएस.
  4. पशु प्रति फ़ैगोसाइट युक्त 15-19 अधिक क्षेत्रों मोल.

4. मात्रा (ImageJ) के लिए छवियों को तैयार

  1. ImageJ में खुला z ढेर.
  2. छवि मेनू, रंग चुनें और विभाजित चैनल पर जाएँ.
  3. घिरा सामग्री युक्त चैनल (एस) से पृष्ठभूमि घटाना.
    1. घिरा सामग्री (जैसे, presynaptic आदानों) युक्त चैनल खिड़की का चयन करें.
    2. प्रक्रिया मेनू पर जाएँ और घटाना पृष्ठभूमि का चयन करें. DLGN में presynaptic आदानों की अग्रगामी पता लगाने के लिए 10 पिक्सल के एक रोलिंग गेंद त्रिज्या का प्रयोग करें. नोट: रोलिंग गेंद त्रिज्या अनुभव से निर्धारित होता है. हालांकि, यह आम तौर पर पृष्ठभूमि का हिस्सा नहीं है कि छवि में सबसे बड़ी वस्तु की त्रिज्या के रूप में बड़े रूप में होना चाहिए.
  4. भक्षककोशिकीय युक्त चैनल चिकना.
    1. भक्षककोशिकीय (जैसे, microglia) युक्त चैनल खिड़की का चयन करें.
    2. प्रक्रिया मेनू और एसईएल पर जाएँect फिल्टर, मीन. 1.5 का एक मतलब फिल्टर (इस बाद के चरणों में सतह प्रतिपादन के लिए छवि smoothes) का प्रयोग करें.
  5. भक्षककोशिकीय युक्त चैनल से पृष्ठभूमि घटाना.
    1. भक्षककोशिकीय (जैसे, microglia) युक्त चैनल खिड़की का चयन करें.
    2. (सेटिंग्स empirically निर्धारित करने की आवश्यकता होगी) घटाना पृष्ठभूमि का चयन करें, प्रक्रिया मेनू पर जाएँ. EGFP पॉजिटिव microglia के लिए 50 पिक्सल के एक रोलिंग गेंद त्रिज्या का प्रयोग करें.
  6. छवि मेनू करने के लिए जा रहे हैं और रंग, चैनल मर्ज का चयन करके चैनल मर्ज.
  7. (यह तेजी से प्रतिपादन सतह बनाता है, चरण 5 देखें) विलय फ़ाइल से भक्षककोशिकीय युक्त फसल आरओआई.
    1. टूल बार में आयताकार चयन के उपकरण का उपयोग आरओआई चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित.
    2. छवि मेनू पर जाएँ और फसल का चयन करें.
  8. (4.2 कदम देखें) फिर चैनलों भाजित.
  9. अपनी ही झगड़ा फ़ाइल के रूप में प्रत्येक चैनल को बचाओ.

5. मात्रा के लिए छवि तैयार करेंImaris में

  1. ओपन Imaris और वॉल्यूम आइकन ऊपर छोड़ दिया मेनू (चित्रा 2) में चयन किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें.
  2. फसली छवि का खुला पहला चैनल (चैनल के किसी भी, सिर्फ अनुरूप होना पहली बार खोला जा सकता है).
  3. अन्य चैनल (एस) जोड़ें. संपादन मेनू पर जाएँ, चैनल जोड़ें और फ़ाइल में अगले चैनल चयन का चयन करें. (किसी भी शेष चैनलों के लिए इस चरण को दोहराएँ). नोट:, रंग बदलने के प्रदर्शन समायोजन खिड़की के पास जाओ और चैनल का नाम (चित्रा 3) पर क्लिक करें. इस रंग को समायोजित करने के लिए एक संवाद बॉक्स को लाएगा. प्रदर्शन समायोजन खिड़की दिखाई नहीं देता है, तो संपादन मेनू पर जाकर प्रदर्शन समायोजन का चयन करें.
  4. पिक्सेल मूल्यों को समायोजित. संपादन मेनू पर जाएँ और छवि गुण का चयन करें. इस विंडो में, एक्स, वाई, जेड और पिक्सेल मूल्यों (ये मान माइक्रोस्कोप, उद्देश्य, कैमरा, और z कदम अधिग्रहण पर निर्भर करती है और छवि के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर में पाया जा सकता है) को समायोजित.
  5. चरण 5.5 एक बहुत में परिणाम होगाछोटी सी छवि. आकार बदलने के लिए, सही नीचे कोने में फ़िट चिह्न (चित्रा 2) पर क्लिक करें.
  6. प्रदर्शन समायोजन खिड़की में, बाईं और मध्य त्रिकोण का उपयोग हर चैनल के लिए चमक और विपरीत समायोजित.

भक्षककोशिकीय की 6. 3 आयामी (3 डी) पृष्ठ समर्पण

  1. शीर्ष टूल बार में, पार मोड (चित्रा -3 सी) का चयन किया है सुनिश्चित करें.
  2. प्रदर्शन समायोजन खिड़की में, भक्षककोशिकीय चैनल को छोड़कर सभी चैनलों अचयनित. यह देखने के क्षेत्र से उन्हें निकाल देंगे.
  3. पृष्ठ समर्पण चिह्न (चित्रा 2) पर क्लिक करें.
  4. एक बनाने खिड़की नीचे बाएँ (चित्रा -4 ए) में प्रदर्शित किया जाएगा, यकीन खण्ड आरओआई यह पहली खिड़की में अनियंत्रित है बनाते हैं. नीचे नीले आगे बटन पर क्लिक करें.
  5. समरेखण को समायोजित करें.
    1. अगली विंडो में, नीचे खींच मेनू (चित्रा 4 बी) से भक्षककोशिकीय चैनल का चयन करें. यह समायोजित कर देता हैसामने किया जाएगा और (0.1 माइक्रोन समरेखण आमतौर पर microglia के लिए प्रयोग किया जाता है) अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए कि विस्तार की राशि.
    2. निरपेक्ष thresholding का चयन करें.
    3. नीचे नीले आगे बटन पर क्लिक करें.
  6. थ्रेसहोल्ड छवि.
    1. छवि (चित्रा 4C) उचित रूप से सामने आया है जब तक हिस्टोग्राम और खींचें पर क्लिक करें. इस फ्लोरोसेंट छवि पर मढ़ा ग्रे सतहों एक सटीक सतह प्रतिनिधित्व कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए छवि घूर्णन द्वारा अनुभव से निर्धारित होता है. नोट:, बारी बारी से स्क्रीन (3B चित्रा) के ऊपरी दाएं पर सूचक मेनू में नेविगेट का चयन करें, क्लिक करें और बारी बारी से करने के लिए छवि रखें. मूल उन्मुखीकरण के लिए छवि लौटने के लिए, चुनें उत्पत्ति निचला दृश्य मेनू से छोड़ दिया.
    2. नीचे नीले आगे बटन पर क्लिक करें.
  7. अगली विंडो में, छवि बहुत शोर है जब तक आदि आकार, के द्वारा किसी भी सतहों बाहर फिल्टर करने के लिए एक विकल्प है, फिल्टर और एक को नष्ट नहीं हैस्वचालित रूप से दिखाई देते हैं कि y फिल्टर. भक्षककोशिकीय प्रतिपादन सतह खत्म करने के लिए तल पर हरे रंग का तीर क्लिक करें. टैब की एक नया सेट (चित्रा 5) दिखाई देगा
  8. यदि आवश्यक हो, ब्याज की भक्षककोशिकीय का हिस्सा नहीं हैं कि किसी भी सतहों को हटा दें.
    1. चयन विकल्प सूचक मेनू (चित्रा 3 बी) में चयन किया गया है कि सुनिश्चित करें.
    2. यह पीले रंग बदल जाता है, ताकि हटाए जाने के लिए किसी भी सतह पर क्लिक करें. नियंत्रण बटन को दबाकर रखते हुए कई सतहों को हटाने के लिए सतहों पर क्लिक करें.
    3. पेंसिल टैब के अंतर्गत हटाएँ क्लिक करें.
  9. का चयन करें और एक सतह में भक्षककोशिकीय की सभी सतहों विलय.
    1. कीप (चित्रा 5C यानी फ़िल्टर टैब पर क्लिक करें).
    2. जोड़ें पर क्लिक करें.
    3. , किसी भी फिल्टर चुनें दूर (सभी सतहों पीला होना चाहिए) को छोड़ दिया करने के लिए हिस्टोग्राम खींचें.
    4. वापस पेंसिल टैब पर जाएं और एकजुट क्लिक करें.
  10. ग्राफ़ टैब पर जाएं (चित्रा 5A (चित्रा 5D) का चयन करें. कई मापदंडों प्रदर्शित करने के लिए, बाईं तल पर रैंच आइकन (चित्रा 2) के लिए जाने के लिए और रिकॉर्ड करने के लिए मापदंडों का चयन करें.
  11. भक्षककोशिकीय की मात्रा रिकॉर्ड और आगे बढ़ने से पहले सहेजें.

घिरा सामग्री की 7. 3D सतह प्रतिपादन

  1. भक्षककोशिकीय से घिरा किया गया है कि सामग्री के लिए एक नया चैनल बनाएं.
    1. भक्षककोशिकीय सतह चयनित होने पर, पेंसिल टैब पर क्लिक करें.
    2. सभी मुखौटा क्लिक करें.
    3. प्रतीत होता है कि बातचीत में घिरा सामग्री (चित्रा 5 ब जैसे, presynaptic आदानों की अग्रगामी ट्रेसिंग) को इसी चैनल का चयन करें.
    4. मुखौटा लगाने से पहले डुप्लिकेट चैनल की जाँच करें और ठीक मारा.
    5. एक नया चैनल घिरा किया गया है कि केवल सामग्री शामिल है और अंदर है कि प्रदर्शन समायोजन विंडो में दिखाई देगाभक्षककोशिकीय.
  2. भूतल रेंडर कुल घिरा और nonengulfed सामग्री युक्त चैनल.
    1. सामने होने के लिए चैनल के लिए छोड़कर प्रदर्शन समायोजन खिड़की में सभी चैनलों को अचिह्नित और भक्षककोशिकीय के लिए बनाया सतह अचयनित.
    2. फिर सतह प्रतिपादन आइकन पर क्लिक करें (कदम 6.3 देखें) और (6.4-6.11 कदम) भक्षककोशिकीय के लिए वर्णित के रूप में एक ही चरणों का उपयोग चैनल के लिए एक सतह बना. नोट: प्रायर (कदम 6.5, चित्रा 4 बी) चौरसाई और thresholding को सही चैनल का चयन करना सुनिश्चित करें. दहलीज मूल्य के नोट करें (चित्रा 4C कदम 6.6 देखें). यह मान भी सतह प्रदान के बाद प्राप्त किया जा सकता है (छड़ी टैब, चित्रा 5A) पूरा हो गया है.
  3. कुल घिरा और गैर घिरा सामग्री की मात्रा रिकॉर्ड और आगे बढ़ने से पहले सहेजें.
  4. भूतल घिरा सामग्री (भक्षककोशिकीय भीतर सामग्री) प्रस्तुत करना.
    1. केवल प्रतिदीप्ति कल्पनाघिरा हुआ सामग्री का नया चैनल (कदम 7.2.1 देखें).
    2. ऊपर के रूप में एक ही कदम (7.2-7.3 कदम) का पालन करें. नोट: (कदम 7.1 में बनाया नया चैनल चयन) पूर्व चौरसाई के लिए पुल डाउन मेनू से सही चैनल का चयन करना सुनिश्चित करें. सीमा खिड़की में, मैन्युअल कुल घिरा और गैर घिरा सामग्री (कदम 7.2.2 देखें) प्रदान करने के लिए स्थापित किया गया था कि सीमा मान दर्ज करें.
  5. घिरा सामग्री की मात्रा रिकॉर्ड और आगे बढ़ने से पहले सहेजें.

8. देखने के क्षेत्र की कुल मात्रा की गणना

  1. किसी भी चैनल के लिए एक नई सतह बनाने.
  2. पूरे क्षेत्र में सामने है कि इतनी thresholding खिड़की (कदम 6.6) में, हिस्टोग्राम बाईं करने के लिए सभी रास्ते स्लाइड.
  3. पूरे क्षेत्र सरफेसिंग समाप्त करें और (6.7-6.11 कदम) की मात्रा रिकॉर्ड.
  4. फ़ाइल सहेजें.

9. Phagocytosed सामग्री की मात्रा की गणना

  1. के घनत्व की गणनानिम्नलिखित कलन विधि का उपयोग कुल घिरा और गैर घिरा सामग्री चैनल:
    फील्ड (चरण 8) की कुल घिरा और गैर घिरा सामग्री की मात्रा (7.3 कदम) / वॉल्यूम.
  2. निम्नलिखित कलन विधि का उपयोग सेल प्रति% घिराव की गणना:
    (घिरा सामग्री की मात्रा (7.5 कदम) / भक्षककोशिकीय (कदम 6.11) की कुल मात्रा) x 100
    नोट: सेल आकार में बदलाव के लिए खाते में करने के लिए, डेटा भक्षककोशिकीय की कुल मात्रा को सामान्यीकृत कर रहे हैं. कदम 9.1 से नंबर क्षेत्रों में अत्यधिक चर रहे हैं, यह 9.1 में गणना करने के लिए कदम 9.2 से डेटा मानक के अनुसार करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

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Representative Results

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हाल ही में, हम विकासशील retinogeniculate प्रणाली में presynaptic आदानों की microglia की मध्यस्थता घिराव (चित्रा 1) 7 कल्पना और जिसका अंदाजा इस घिराव परख इस्तेमाल किया. CX3CR1-EGFP विषमयुग्मजी चूहों से RGCs anterogradely क्रमश: छोड़ दिया और सही आँखों में CTB-594 और CTB-647 के साथ पता लगाया गया. इस ट्रेसिंग के बाद, dLGN भीतर EGFP पॉजिटिव microglia imaged थे. इन छवियों को बाद में मात्रा माप के लिए सतह से गाया गया था.

इस तकनीक का उपयोग करना, हम dLGN (पी -5) के भीतर विकास synaptic remodeling के एक व्यस्त अवधि के दौरान, presynaptic आदानों microglia (चित्रा 6) से घिरा हुआ पाया. Remodeling की एक बड़ी राशि (P9) लगभग पूरा हो गया है जब के रूप में कुछ के रूप में 4 दिन बाद घिरा आदानों की राशि में एक नाटकीय कमी नहीं है. इसके अलावा, घिराव और छंटाई शास्त्रीय पूरक झरना से संबंधित प्रोटीन में कमी चूहों में बाधित कर रहे हैं(नहीं दिखाया डेटा) neuronal फायरिंग की जोड़ - तोड़ के बाद (चित्रा 6) के साथ ही 7.

चित्रा 1
RGC presynaptic आदानों 7 के microglia की मध्यस्थता घिराव आकलन करने के लिए चित्रा 1. रणनीति. ए) अग्रगामी अनुरेखण रणनीति के योजनाबद्ध. वाम और सही नज़र RGC आदानों क्रमशः CTB-647 (नीला) और CTB-594 (लाल) के साथ पता लगाया जाता है. आदानों की Microglia की मध्यस्थता (हरा) घिराव बाद में मूल्यांकन किया है. बी) प्रसव के बाद सुबह 5 (पी -5) माउस dLGN का एक प्रतिनिधि कम बढ़ाई छवि छोड़ दिया (नीला) और सही (लाल) आँखों आदानों की अग्रगामी ट्रेसिंग निम्नलिखित. स्केल बार = 100 माइक्रोन. सीआई) एक microglia (EGFP, हरा) को छोड़ दिया (नीले रंग से सीमा क्षेत्र से जांचा) और सही (लाल) आँखों आदानों (बी में इनसेट). सीआईआई) CIII) सतह प्रतिपादन घटाया और RGC आदानों घिरा किया गया है. पी -5 dLGN से ग्रिड लाइन की वेतन वृद्धि = 5 माइक्रोन. डीआई) एक प्रतिनिधि microglia (हरा, EGFP). RGC आदानों CTB-594 (लाल) के साथ लेबल रहे हैं और लाइसोसोम विरोधी CD68 (नीला) के साथ लेबल रहे हैं. DiI) microglia मात्रा बाहर सभी CTB प्रतिदीप्ति हटा दिया गया है खुलासा microglia भीतर RGC आदानों (लाल) और लाइसोसोम (नीला) घिरा . सफेद तीर) डिव-V) CD68 (div) और CTB (डीवी) चैनलों अकेले;. (हरा) Diii) सबसे RGC आदानों (लाल) पूरी तरह से CD68 पॉजिटिव लाइसोसोम (नीला भीतर स्थानीयकृत हैं. स्केल बार = 10 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 2. Imaris सॉफ्टवेयर प्रतीक.

चित्रा 3
चित्रा 3. सॉफ्टवेयर में सामान्य नेविगेशन Windows. क) प्रदर्शन समायोजन विंडो. बी) सूचक खिड़की. का चयन करें विशिष्ट सतहों के चयन की अनुमति होगी. नेविगेट देखने के क्षेत्र में एक छवि के रोटेशन. सी) इसमें शामिल होना आवश्यक है मात्रा प्रतिपादन सतह के लिए मोड पार अनुमति देगा.

चित्रा 4
सॉफ्टवेयर में चित्रा 4. भूतल प्रतिपादन. ए) विंडो बनाएँ. बी) चिकनाखिड़की आईएनजी. . सी) फ्लोरोसेंट छवि को सतह थ्रेशोल्डिंग (पीले रंग में प्रकाश डाला) नीचे खींच मेनू से सतह के लिए चैनल का चयन करें. लाल बॉक्स से प्रकाश डाला कुल घिरा और गैर घिरा सामग्री के लिए दर्ज किया जाना चाहिए कि मूल्य सीमा है. यह संख्या सीमा को बाद में आवेदन किया है और घिरा सामग्री की सतह की जाएगी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. सॉफ्टवेयर में मात्रा माप प्राप्त करने के. निम्नलिखित सतह प्रतिपादन दिखाई देने वाले ए) टैब्स. मास्क सभी भक्षककोशिकीय भीतर घिरा सामग्री कल्पना करने की सुविधा पाठ. बी में पहचाने जाते हैं कि छड़ी, पेंसिल, कीप, और ग्राफ टैब) ध्यान दें. चयनित चैनल नोट (तुबॉक्स llow). सी) कीप / फिल्टर टैब के अंतर्गत विशेषता है कि यह पीला दिखाई देता है तो बाईं ओर हिस्टोग्राम सभी तरह फिसलने से क्षेत्र में सभी सतहों के चयन की अनुमति देता है. किसी भी फिल्टर ग्राफ टैब के तहत यह. डी) के लिए चुना जा सकता है, मात्रा माप प्राप्त और दर्ज किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
(फ्लोरोसेंट छवि चित्र 1 में दिखाया गया है P5 से चित्रा 6. प्रतिनिधि डेटा 7. ए) प्रतिनिधि सतह गाया microglia), P9, और P30 माउस dLGN. बढ़े insets एक काला बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित.RGC आदानों की ग्रिड लाइन की वेतन वृद्धि = 5 माइक्रोन. बी) घिराव काफी बड़ी उम्र (P9 और P30) बनाम dLGN (पी -5) में शिखर छंटाई के दौरान वृद्धि हुई है. * पूरक रिसेप्टर 3 में चूहों की कमी से पी <0.001 द्वारा एक तरह से एनोवा, एन = 3 चूहों / उम्र. सी) Microglia (को, काली पट्टी) WT littermates (सफेद पट्टी) की तुलना में काफी कम RGC आदानों अपनी चपेट में ले. सभी डेटा गुम्मट नियंत्रण मूल्यों को सामान्यीकृत कर रहे हैं. * पी <विद्यार्थी t-परीक्षण से 0.04, एन = 3 चूहों / जीनोटाइप. सभी त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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सही phagocytosis उपाय करने के लिए, घिरा सामग्री lysosomal गिरावट आ गई है एक बार अनुसंधानकर्ता यह कल्पना कर सकते हैं कि इस तरह से लेबल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, उच्च संकल्प इमेजिंग पूरे सेल की मात्रा कल्पना और उसकी सामग्री यों तो शोधकर्ता सक्षम हो जाएगा कि सॉफ्टवेयर के उपयोग के बाद, आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण के साथ संयुक्त घिरा सामग्री लेबल करने एलेक्सा रंगों संयुग्मित CTB का उपयोग भक्षककोशिकीय की मध्यस्थता घिराव को मापने के लिए एक अत्यंत विश्वसनीय और मात्रात्मक विधि का वर्णन. इस पद्धति को सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए माउस मस्तिष्क (retinogeniculate प्रणाली) 7 में synaptic remodeling के दौर से गुजर presynaptic आदानों की microglia मध्यस्थता-घिराव का विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, यह unde विभिन्न विकासात्मक उम्र भर घिराव में सूक्ष्म परिवर्तन भेद कर सकते हैं कि एक बेहद संवेदनशील तकनीक साबित हो गया हैआर गैर रोग की स्थिति और wildtype और पीटा चूहों के बीच. मामूली समायोजन के साथ, इस प्रोटोकॉल समय चूक इमेजिंग द्वारा लाइव ऊतकों में घिराव अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल रोग में भक्षककोशिकीय न्यूरॉन बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

निरंतर

इस परख की सबसे उपयोगी पहलुओं की है कि वे एक lysosomal गिरावट मार्ग में प्रवेश करने के बाद दृश्य रहना है कि इस तरह से neuronal अनुमानों लेबल करने की क्षमता है. न्यूरॉन लेबल है क्योंकि हालांकि, यह phagocytosed गया है सेल का क्या हिस्सा अंतर करना मुश्किल हो सकता है. इस इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 7 के साथ संयुक्त (dLGN के एक गैर synaptic क्षेत्र बनाम जैसे, synaptic क्षेत्र) एक बहुत सावधान क्षेत्रीय विश्लेषण की आवश्यकता है. इसके अलावा, इस neuronal सेल निकायों और अनुमानों ही क्षेत्र में रहते हैं, जहां अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में अधिक मुश्किल साबित हो सकता है. हालांकि, वैकल्पिक रणनीतियों लेबलिंग बेल (देखें नियोजित किया जा सकता हैओ). इसके अलावा, के कारण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संकल्प सीमा तक, एक घिरा सामग्री की राशि overestimate सकता है कि वहाँ एक संभावना है. नतीजतन, देखभाल घिरा सामग्री लाइसोसोम भीतर है कि मान्य करने के लिए लिया जाना चाहिए. इस कारण से, हम, microglia भीतर 3 डी प्रतिपादन, और परख के मापदंडों को मान्य करने के लिए orthogonal देखा गया लाइसोसोम लेबल करने के लिए विरोधी CD68 उपयोग करें.

सेल प्रकार

Microglia के अलावा, इस पद्धति भी मस्तिष्क (जैसे, astrocytes) में और परिधीय तंत्रिका और प्रतिरक्षा प्रणाली (उदाहरण के लिए, perisynaptic श्वान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, आदि) में अन्य फ़ैगोसाइट की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है. एलेक्सा रंगों संयुग्मित CTB इतनी आसानी से सबसे कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है क्योंकि इसके अलावा, एक समान लेबलिंग रणनीति मस्तिष्क और अन्य अंग प्रणालियों भर में घिरा सामग्री लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

घिरा सामग्री की लेबलिंग

एक अल के रूप मेंएलेक्सा रंगों संयुग्मित CTB को ternative, हम घिरा सामग्री 7 लेबल करने के लिए निम्नलिखित रणनीति का इस्तेमाल किया है: 1) RGCs एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, आदि tdTomato, EGFP,) के साथ लेबल रहे थे जिसमें फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों. Dextran संयुग्मित एक pHrodo डाई के साथ 2) अग्रगामी लेबलिंग, यह एक lysosome में एक बार ही fluoresces कि एक डाई. इन विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करना, दृश्य और microglia भीतर घिरा presynaptic आदानों की मात्रा का ठहराव एक ही इमेजिंग और मात्रा का ठहराव तकनीक performedwith हो सकता है. हालांकि, एलेक्सा डाई conjugates कारण हाइड्रोलिसिस 7,21 lysosomal करने एलेक्सा डाई के उच्च प्रतिरोध करने के लिए सबसे मजबूत कर रहे हैं. इसके अलावा, एंटीबॉडी (जैसे, विरोधी VGlut2, एक presynaptic vesicular प्रोटीन) के साथ घिरा सामग्री की लेबलिंग का प्रयास किया गया है. बहरहाल, यह सबसे अधिक प्रोटीन तेजी से लाइसोसोम में एक बार टूट रहे हैं यह देखते हुए कि पता लगाने की एक अपेक्षाकृत अविश्वसनीय तरीका है. यह कम होने के कारण प्रतिदीप्ति अंतर करना मुश्किल हैपृष्ठभूमि पर प्रोटीन गिरावट के लिए.

प्रयुक्त जानवर

वर्तमान प्रोटोकॉल में, microglia fluorescently फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों (CX3CR1-EGFP) 22 का उपयोग आनुवंशिक रूप से चिह्नित कर रहे हैं. हालांकि, फ्लोरोसेंट संवाददाता निर्माणों की आनुवंशिक अभिव्यक्ति बनाम एंटीबॉडी लेबलिंग आवश्यक है जो ऐसे मामले हैं. फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों ब्याज की भक्षककोशिकीय के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जब उदाहरण के लिए, चूहों का उपयोग आवश्यक है, या शोधकर्ता एक फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस लाइन में उन्हें पार करने के बिना पीटा चूहों पर देखने के लिए करना चाहती है. इन जैसे उदाहरण के लिए, फ़ैगोसाइट immunohistochemistry का उपयोग लेबल किया जा सकता है और डेटा फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों 7 का उपयोग कर प्रयोगों से परिणाम के लिए तुलना कर रहे हैं. ऊतक सेक्शनिंग के बाद, हम आम तौर पर चल वर्गों 7 के लिए एक मानक immunostaining प्रोटोकॉल का उपयोग करें. यह पूरे सेल लेबल होगा कि एक प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एक एंटीबॉडी का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण हैइसकी प्रक्रियाओं. उदाहरण के लिए, लेबल microglia के लिए, विरोधी Iba1 इस्तेमाल किया जा सकता है.

व्यापक आवेदन: लाइव इमेजिंग और रोग

इस प्रोटोकॉल तय ऊतक के विश्लेषण पर आधारित है, मामूली संशोधनों के रहते इमेजिंग द्वारा अधिग्रहीत छवियों में एक ही विश्लेषण के लिए सक्षम होगा. एक समय चूक इमेजिंग सत्र के बाद, बाद में Z-ढेर इस प्रोटोकॉल में 4-9 चरणों के लिए समान कार्रवाई की जा सकती. हम स्वस्थ सीएनएस में विकासात्मक synaptic remodeling के दौरान synapses के घिराव कल्पना करने के लिए इस प्रोटोकॉल लागू की गई है, जबकि इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी रोग मॉडल में लागू किया जा सकता है. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी की चोट, अल्जाइमर रोग, आदि 12,14-19,23 के साथ जुड़े जल्दी अन्तर्ग्रथन नुकसान के बाद इस तरह के synapse हानि और उत्थान के मामले में synapses पर्याप्त remodeling गुजरना जिसमें रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - 26. इसके अलावा, एक भी जो phag में रोगों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक को अपना सकते हैंsynapses से सामग्री अन्य की ocytosis ऐसे microglia / रोग demyelinating में माइलिन के बृहतभक्षककोशिका की मध्यस्थता घिराव (जैसे, एकाधिक काठिन्य) और अल्जाइमर रोग 5,6,27-29 में बीटा amyloid के घिराव के रूप में वर्णित किया गया है.

अंत में, यहाँ वर्णित घिराव परख उनके बाह्य वातावरण के साथ भक्षककोशिकीय बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, और संवेदनशील तकनीक प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात, इस परख का उपयोग करता है और तंत्रिका विज्ञान समुदाय के साथ ही अन्य अंग प्रणालियों में काम कर रहे लोगों की सेवा करेंगे कि क्षमताओं की एक विस्तृत श्रृंखला है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

,,, एनआरएसए (डीपीएस F32-NS-066698), काम स्मिथ परिवार फाउंडेशन (बी एस), दाना फाउंडेशन (बी एस), जॉन मर्क विद्वान कार्यक्रम (बी एस), NINDS (बी एस RO1-NS-07100801) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया नैन्सी Lurie मार्क्स फाउंडेशन (डीपीएस), एनआईएच (P30-HD-18655, MRDDRC इमेजिंग कोर).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat pad Vet Equip, Inc. 965500 
Warm water source for heat pad Kent Scientific TP-700
Stereo microscope DSC Optical Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
Sliding microtome with freezing stage Leica SM2010 R
Microtome blade Leica 14021607100
Fluorescent dissecting microscope Nikon SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
Spinning disk confocal microscope Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton gas tight syringes Hamilton 80030 Use a different syringe for each color dye/tracer
Hamilton needles Hamilton 7803-05, specifications: blunt, 1.5"
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) Invitrogen 488: C22841 Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647)
594: C22842
647: C34778
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-50TAB
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) Bausch & Lomb 24208-780-55
30.5 G needle Becton Dickinson 305106
Spring scissors Roboz RS-5630
Cotton-tipped applicator Fisher 23-400-125
Paraformaldeyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.
Dissection tools – scissors, forceps, spatula Small scissors: Fine Science Tools Small scissors:14370-22
Large scissors: Roboz Large scissors: RS-6820
#55 forceps: Fine Science Tools #55 forceps: 11255-20
Spatula: Ted Pella, Inc. Spatula: 13504
Sucrose Sigma S8501-5KG Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)
OCT Compound VWR 25608-930
Weigh boat USA Scientific 2347-1426
24-well plates BD Biosciences 353047
Sodium phosphate monobasic Sigma S6566-500G Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O
Sodium phosphate dibasic  Sigma S5136-500G
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 VWR 48393 194
Charged microscope slide VWR 48311-703
Vectasheild Vector Laboratories H-1200

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References

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एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल
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Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).More

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).

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