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Neuroscience

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

doi: 10.3791/51482 Published: June 8, 2014

Summary

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

Abstract

식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 - 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) 1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 7 연접 입력 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).

Introduction

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시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS 11 ~ 13의 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다.

NT는 "> 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 7 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (dLGN)의 영역에서 시냅스 입력을 삼켜 표시했다.이 말림의 유전자 또는 약물 봉쇄 시냅스 연결의 지속적인 적자로 만들었습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 시냅스 입력 식세포 매개 말림을 측정하는 신뢰성 높은 정량 분석​​에 대해 설명합니다. 이 문서의 목적을 위해,이 분석에서는 망막에 존재하는 망막 신경절 세포를 포함 현상 retinogeniculate 시스템 (망막 신경절)의 맥락에서 제시 될 것이라는dLGN (그림 1A)에 시냅스 입력을 전망이다. 시작하기 위해, 리소좀 분해 내성 선행 성 라벨 전략 dLGN에서 RGC 특정 시냅스 입력 (도 1) 7,21를 시각화하는데 사용되는, 설명한다. 이 설명, 이미징을위한 세부 방법론에 따라 정량적으로 3 차원 (3D) 표면의 볼륨 렌더링과 결합 된 공 초점 현미경을 사용하여 말림을 측정하는 받게 될 것입니다. 이 방법론은 고정 티슈 제조에 기반뿐만 아니라 라이브 영상 연구에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 분석은 건강한, 출생 후의 retinogeniculate 시스템의 맥락에서 검증되었지만 중요한 하나는 다른 뇌로 걸쳐 질병 중에 식세포 신경 세포의 상호 작용뿐만 아니라 다른 장기 시스템의 식세포 기능을 평가하기 위해 동일한 기술을 적용 할 수있다.

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Protocol

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RGC 시냅스 입력의 1. 선행 성 라벨

주 : 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 모든 NIH의 지침에 따라 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 감독되었다.

  1. 필드와 악기를 소독.
  2. 플렉시 유도 챔버에서 4 부피 %의 이소 플루 란 (이 부피 %의 이소 플루 란 신생아 - 성인 마우스 작동)와 마우스를 마취. 오버 마취 방지하기 위해 밀접하게 쥐를 관찰합니다. 주의 : 진공 배기 가스 배출과 흡입을 피할 것.
  3. 1-3 분 후, (이전 마우스는 적은 시간이 필요합니다) 마취의 적절한 수준이 꼬리를 곤란하게 (아무 반응이 관찰 될 수 없습니다)와 호흡 속도 (속도가 느리고 꾸준한해야한다) 관찰에 의해 달성되어 있는지 확인합니다.
  4. 주둥이에 3-4 부피 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 제공하는 측면과 장소 코 콘 스테레오 현미경으로 마우스를 놓습니다 (신생아 <생후 10 (P10) ~ 4 부피 %;> P10 ~ 3 부피 %).
  5. 공막을 노출합니다. 신생아의 주입 전에 아이 오프닝에, 눈꺼풀을 열고 공막을 노출 피부를 뒤로 당겨 작은 봄 가위를 사용합니다. 나이가 쥐의 경우, 공막을 노출하는 눈 주위의 피부를 뒤로 당겨 손가락을 사용합니다. 주의 : 신생아에서, 때로는 눈의 구석에 또 다른 수직 절단이 필요합니다. 절단하는 경우, 과도 출혈하는 혈관이 있기 때문에 눈꺼풀의 모서리를 절단 할 때주의하십시오.
  6. 공막이 시작되는 줄에서 눈의 측면에 작은 구멍을 천공 멸균 30.5 G 바늘을 사용합니다. 다만 충분히 경사가 눈에가는 것을 바늘을 삽입하여 렌즈가 손상되지 않도록주의하십시오.
  7. 유리체는 구멍의 흐름과 액체를 흡수하기 위해 멸균 면봉을 사용할 수 있습니다.
  8. 유리체는 구멍에서 흐르는 중지되면, 선행 성 추적 염료로 사전로드 해밀턴 주사기에 부착 된 무딘 엔드 바늘을 삽입구멍에. 주의 : 천천히 눈의 다른면을 천공이나 렌즈의 손상을 방지하기 위해 바늘을 삽입합니다.
  9. 천천히 눈에 염료를 주입. 일반적으로, 알렉사 594, 647, 또는 488 (CTB-594, CTB-647, 또는 CTB-488, 5-6 ㎍ / μL)에 접합 된 서브 유닛 β 콜레라 독소 anterogradely 추적 RGC 입력하는 데 사용됩니다. 신생아 (≤의 P10)의 경우 1 ~ 2 μL는 충분하며, 마우스의 경우> P10 ~ 3 μL 충분하다. 참고 : 알렉사 염료 리소좀 저하에 특히 저항
  10. 몇 초 동안 구멍에 바늘을두고 천천히 제거합니다.
  11. 과잉 유동성을 흡수하고 밖으로 누출 염료를 방지하기 위해 면봉을 사용합니다.
  12. 눈에 항생제 연고의 작은 금액을 적용합니다. 눈이 수술 열린 경우 모두 살짝 눈꺼풀의 위치를​​ 변경.
  13. 두 눈을 주입하는 경우, 다른 눈에 절차를 반복합니다.
  14. 이 anesth에서 회복하기 시작 때까지 다음과 같은 주사 (들), 열 램프 아래 또는 열 패드에 마우스를 남겨ESIA.
  15. 깨끗한 집 케이지에 마우스를 반환하고 식민지로 돌아 가기 전에 잠에서 깨어 있는지 확인하기 위해 모니터링 할 수 있습니다.

2. 이미징 조직 준비

이 조직 준비 프로토콜은 식세포가 형광 마커 (예, 미세 아교 세포에 대한 CX3CR1-EGFP)으로 표시되는 기자 마우스에 사용됩니다. 기자 라인을 사용할 수없는 경우, 조사 (토론 참조) 조직 섹션을 immunostain 수 있습니다.

  1. ~ 24 시간 주사 후 마우스를 희생하고 두뇌를 해부하다.
  2. 밤새 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 채워진 팔콘 튜브에 뇌를 해결 하락 주의 : PFA는 독성이다. 흄 후드 또는 하강 기류 테이블에 사용 및 개인 보호 장비를 착용하여 흡입 및 피부 노출을 피하십시오. 주의 사항 : 고정은 (≥ 4 시간) 단축 될 수 있습니다. 대신 드롭 고정 또한, 4 % PFA 관류 사용 2-24 시간 드롭 수정 올 수 있습니다. 그러나 perfuse의 비교고정 신생아와 성인의 두뇌를 드롭 D는 이미지 품질이나 정량에 차이를 보이지 않았다.
  3. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 뇌의 3 배를 씻어.
    1. 빈 무게 배에 뇌와 PFA를 붓는다.
    2. 다른 두뇌를​​ 전송하기 위해 주걱을 사용하여 PBS로 가득 보트의 무게.
    3. 두 번 더 PBS에 세척 뇌 (전송 뇌의 두 개 더로는 PBS로 가득 보트의 무게).
  4. 30 % 자당 용액으로 채워진 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. 뇌가 튜브 (48 시간)의 바닥에 침몰 할 때까지 4 ° C에서 자당의 두뇌를 남겨주세요.
  5. 뇌가 싱크되면 절편의 두뇌를 준비합니다. 다음 단계는 냉동 스테이지 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 40 ㎛의 부동 부분의 제조 (저온 유지 장치도 사용될 수있다)이다.
    1. (dLGN를 들어, 뇌의 주동이의와 꼬리 부분을 제거) 필요하지 않은 뇌의 일부를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
    2. 브래지어를 고정드라이 아이스에 알루미늄 호일에있는. 이 시간 동안, 마이크로톰 스테이지를 고정하고 0.5 ㎖의 0.1 M 인산 완충액 (PB)를 24 - 웰 플레이트의 각 웰을 채운다.
  6. 냉동 무대에서 (이 불투명 나타납니다) 냉동 뇌를 탑재합니다.
    1. 무대에 최적의 절단 온도 화합물 (10 월)의 작은 금액을 적용합니다.
    2. OCT를 동결하기 시작하면, OCT의 두뇌를 놓는다. 절단됩니다 뇌의 끝은 (꼬리 쪽을 얼굴 dLGN 위해, 예를 들어)을 위로 향하게해야합니다.
    3. 매우 미세하게 분쇄 된 드라이 아이스와 뇌와 OCT를 포함한다.
    4. ~ 30 초 동안 뇌 / on 10 월 드라이 아이스를 남겨주세요.
    5. 드라이 아이스를 제거하는 큰 페인트 브러시를 사용합니다. 뇌와 OCT를 무대에 고정되어야한다.
  7. 또한 (ROI)의 영역에 도달 할 때까지 조직을 통해 구획 시작한다.
  8. ROI에 도달하면, 블레이드의 부분을 제거하고 24 - 웰 플랫폼로 전송할 작은 페인트 솔을 이용E 0.1 M PB (단계 2.5.2)를 포함. 이전의 블레이드에서 섹션을 제거하는 0.1M의 PB에 적셔서 촉촉한 페인트 붓을 유지합니다. 참고 : 섹션 4 ℃에서 하룻밤 0.1 M PB에 남아있을 수 있습니다
  9. 섹션가 수집되고 나면, 형광 해부 현미경 선행 성 라벨을 시각화하고 투자 수익 (ROI)을 포함하는 섹션을 선택합니다.
  10. 작은 페인트 브러시와 슬라이드 섹션을 탑재합니다.
    1. 충전 된 현미경 슬라이드에 0.1 M PB의 작은 수영장을 적용합니다.
    2. PB의 풀에 조직 섹션을 전송합니다.
    3. 방향을 PB 및 페인트 브러시를 사용하여 조직을 확산.
    4. 초과 PB를 윅 킴 와이프를 사용합니다. 섹션을 심지 않도록주의하십시오.
    5. 완전히 건조 공기 수 있습니다.
    6. 각 섹션에 장착 매체의 작은 방울을 적용하고 (22 × 50 mm의 1.5 호) 상단에 커버 슬립을 탑재합니다.
    7. 영상 세션 때까지 -20 ° C에서 매니큐어 및 저장소와 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 참고 : 이미징하지만준비가 좋습니다 일주일에 슬라이드 이전 영상에 몇 주 동안 -20 ° C로 유지 될 수있다.

3. 이미징 조직

모든 이미지는 회전 디스크 공 초점 현미경 (UltraView 복스 회전 디스크 다이오드 레이저 (405 nm의, 445 nm의, 488 nm의, 514 nm의, 561 nm의, 640 nm의)을 갖춘 공 ​​초점 현미경)에 인수됩니다. 이미지는 또한 (예를 들면, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, 디콘 볼 루션 등 뒤에 epifluorescent 현미경)은 고해상도 Z-스택을 획득하는 능력을 가진 임의의 현미경에 취득 할 수있다. 프레임 크기는 일반적으로 1,000 X 1,000 픽셀입니다.

  1. 10 배 배율로 투자 수익 (ROI)을 찾아 이미지를 획득. retinogeniculate 시스템에서 미세 아교 세포 이미징의 경우, 투자 수익 (ROI)이 가장 내측 dLGN 섹션입니다.
  2. 높은 배율로 이동 (60X 계획 아포 목적, NA 1.4는 일반적으로 사용되는 =).
  3. 0.2 μm의 Z-단계를 사용하여 식세포를 포함하는 뷰의 첫 번째 필드 획득의.
  4. 동물 당 식세포를 포함하는 15-19 더 많은 필드를 취득.

4. 정량화 (ImageJ에)에 대한 이미지를 준비

  1. ImageJ에있는 열기 Z-스택.
  2. 이미지 메뉴에서 색상 및 분할 채널로 이동합니다.
  3. 가득 채우고 재료를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다.
    1. 가득 채우고 재료 (예를 들면, 시냅스 입력)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
    2. 프로세스 메뉴로 이동 빼기 배경을 선택합니다. dLGN에있는 시냅스 입력의 선행 성 추적 10 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. 참고 : 롤링 볼 반경이 경험적으로 결정된다. 그러나, 일반적으로 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 개체의 반​​경만큼 커야한다.
  4. 식세포를 포함하는 채널을 부드럽게.
    1. 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
    2. 프로세스 메뉴 및 셀프로 이동요법 필터, 평균. 1.5의 평균 필터 (이것은 이후 단계에서 표면의 렌더링 이미지를 부드럽게)를 사용합니다.
  5. 식세포를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다.
    1. 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다.
    2. (설정은 경험적으로 결정해야합니다) 빼기 배경을 선택, 프로세스 메뉴로 이동합니다. EGFP 양성 미세 아교 세포에 대한 50 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다.
  6. 이미지 메뉴로 이동하고 색상, 채널 병합을 선택하여 채널을 병합합니다.
  7. (이것은 빠른 렌더링 표면을 만드는 5 단계 참조) 병합 파일에서 식세포를 포함 자르기 ROI.
    1. 도구 모음에서 직사각형 선택 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 주위에 상자를 그립니다.
    2. 이미지 메뉴로 이동하여 자르기를 선택합니다.
  8. (단계 4.2 참조) 다시 채널을 분할합니다.
  9. 자신의 TIFF 파일로 각 채널을 저장합니다.

5. 정량화를 위해 이미지를 준비Imaris에

  1. 열기 Imaris과 볼륨 아이콘이 왼쪽 상단 메뉴 (그림 2)에 선택되어 있는지 확인합니다.
  2. 잘라낸 이미지의 열기 첫 번째 채널 (채널 중 하나, 그냥 일관성이 처음 열릴 수 있습니다.)
  3. 다른 채널을 추가합니다. 편집 메뉴로 이동하여 채널을 추가하고 파일의 다음 채널을 선택을 선택합니다. (나머지 채널에 대해이 단계를 반복합니다.) 참고 : 색상을 변경하려면 표시 조정 창으로 이동하여 채널 이름 (그림 3A)을 클릭합니다. 이 색상을 조정하는 대화 상자가 나타납니다. 화면 조정 화면이 표시되지 않는 경우, 편집 메뉴로 이동하여 디스플레이 조정을 선택합니다.
  4. 픽셀 값을 조정합니다. 편집 메뉴로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 이 창에서, x, y 및 z 픽셀 값 (이 값은 현미경 대물, 카메라, 및 z 단계 취득에 의존하여 이미지를 획득하는 데 사용되는 소프트웨어에서 찾아 볼 수있다)를 조정.
  5. 단계 5.5은 매우 발생합니다작은 이미지. 의 크기를 조절하려면, 오른쪽 하단 모서리에있는 맞춤 아이콘 (그림 2)을 클릭합니다.
  6. 화면 조정 창에서 왼쪽과 가운데 삼각형을 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다.

식세포의 6. 3 차원 (3D) 표면 렌더링

  1. 상단 도구 모음에서 능가 ​​모드 (그림 3C)를 선택해야합니다.
  2. 화면 조정 창에서 식세포 채널을 제외한 모든 채널을 선택 취소합니다. 이 시야에서 제거됩니다.
  3. 표면 렌더링 아이콘 (그림 2)를 클릭합니다.
  4. 작성 창 왼쪽 아래 (그림 4A) 표시됩니다 반드시 세그먼트의 ROI는이 첫 번째 창에서 선택을 취소합니다. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
  5. 스무딩을 조정합니다.
    1. 다음 창에서 풀다운 메뉴 (그림 4B)에서 식세포 채널을 선택합니다. 이것은 조정표면화되고 (0.1 μm의 다듬기는 일반적으로 미세 아교 세포에 사용되는) 경험적으로 결정되어야한다 세부 금액입니다.
    2. 절대 임계 값을 선택합니다.
    3. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
  6. 임계 이미지.
    1. 이미지 (그림 4C) 적절하게 표면화 될 때까지 막대 그래프 및 드래그를 클릭합니다. 이것은 형광 이미지 위에 겹쳐 회색 표면은 정확한 표면 표현 보장하기 위해 이미지를 회전하여 실험적으로 결정된다. 참고 : 회전 화면 (그림 3B)의 상단 오른쪽에있는 포인터 메뉴에서 이동을 선택, 클릭하고 회전 할 이미지를 누릅니다. 원래 방향으로 이미지를 반환하려면 원점을 선택하면 하단보기 메뉴에서 왼쪽.
    2. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오.
  7. 다음 창에서 이미지가 매우 잡음이되지 않는 등의 크기에 의해 모든 표면을 필터링 할 수있는 옵션이있어, 필터링을 삭제하지 마십시오자동으로 표시 Y 필터. 식세포를 렌더링 표면을 완료 아래에있는 녹색 화살표를 클릭합니다. 탭의 새로운 세트는 (그림 5)가 나타납니다
  8. 필요한 경우, 그 식세포의 일부가 아닌 모든면을 삭제합니다.
    1. 선택 옵션이 포인터 메뉴 (그림 3B)에 선택되어 있는지 확인합니다.
    2. 이 노란색으로 변하도록 삭제 될 모든 표면을 클릭합니다. 제어 버튼을 누른 상태에서 여러 개의 표면을 삭제하려면 표면을 클릭합니다.
    3. 연필 탭에서 삭제를 클릭합니다.
  9. 를 선택하고 한면에 식세포의 모든 표면을 병합합니다.
    1. 유입 경로 (; 그림 5C, 필터 탭)을 클릭합니다.
    2. 추가를 클릭합니다.
    3. 어떤 필터를 선택까지 (모든 표면은 황색이어야한다) 왼쪽에있는 막대 그래프를 드래그합니다.
    4. 다시 연필 탭으로 이동하여 통일을 클릭합니다.
  10. 그래프 탭으로 이동합니다 (그림 5A (그림 5D)을 선택합니다. 여러 매개 변수를 표시, 왼쪽 아래에있는 렌치 아이콘 (그림 2)로 이동하고 기록하는 매개 변수를 선택합니다.
  11. 식세포의 볼륨을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다.

가득 채우고 소재의 7. 3D 표면 렌더링

  1. 식세포에 의해 침몰 된 재료를위한 새로운 채널을 만듭니다.
    1. 식세포 표면이 선택한 상태에서 연필 탭을 클릭합니다.
    2. 모든 마스크를 클릭합니다.
    3. 표시되는 대화 상자에서 침몰 자료 (; 그림 (b) 예를 들어, 시냅스 입력의 선행 성 추적)에 해당하는 채널을 선택합니다.
    4. 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택하고 확인을 누르십시오.
    5. 새로운 채널이 침몰 된 소재만을 포함하고 내부 디스플레이 조정 창에 나타납니다식세포.
  2. 표면 렌더링 총 빨아 nonengulfed 물질을 포함하는 채널입니다.
    1. 표면 할 채널을 제외하고 표시 조정 창에있는 모든 채널의 선택을 취소하고 식세포에 대해 생성 된 표면을 취소합니다.
    2. 다시 표면 렌더링 아이콘을 클릭합니다 (단계 6.3 참조) (6.4-6.11 단계) 식세포에 대해 설명한 것과 동일한 단계를 사용하여 채널의 표면을 만들 수 있습니다. 참고 : 이전에 (단계 6.5, 그림 (b))을 부드럽게하고 임계 값에 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 값을 적어 두십시오 (; 그림 4C 단계 6.6 참조). 이 값은 또한 표면 렌더링 후 얻을 수있는 것은 (지팡이 탭, 그림 5A) 완료됩니다.
  3. 총 침몰과 비 가득 채우고 재료의 양을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다.
  4. 표면 가득 채우고 재료 (식세포 내 소재)를 렌더링합니다.
    1. 만의 형광을 시각화침몰 재료의 새로운 채널 (단계 7.2.1 참조).
    2. 상기와 같은 단계를 (7.2-7.3 단계)에 따라. 참고 : (단계 7.1에서 만든 새 채널을 선택) 이전 평활화 풀다운 메뉴에서 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 창에서 수동 다운로드 잠겼 비 잠겼 재료 (단계 7.2.2 참조) 렌더링 설정된 임계 값을 입력한다.
  5. 침몰 물질의 양을 기록하고 계속 진행하기 전에 파일을 저장합니다.

8.보기의 필드의 총 양을 계산

  1. 모든 채널의 새로운면을 만듭니다.
  2. 전체 필드가​​ 표면화되도록 임계 창 (단계 6.6)에서, 막대 그래프를 왼쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다.
  3. 전체 필드를 부상 완료하고 (6.7-6.11 단계) 양을 기록한다.
  4. 파일을 저장합니다.

9. 포식 재료의 양을 계산

  1. 의 농도를 계산다음과 같은 알고리즘을 사용하여 총 침몰과 비 가득 채우고 재료 채널 :
    필드 (8 단계)의 총 가득 채우고과 비 가득 채우고 재료의 양 (7.3 단계) / 볼륨.
  2. 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 셀 당 %의 말림를 계산
    (가득 채우고 재료의 양 (7.5 단계) / 식세포 (단계 6.11)의 총 양이) × 100
    노트 : 셀의 크기의 변동을 고려하여이 데이터는 식세포의 총 부피로 정규화된다. 단계 9.1에서 숫자 필드에 걸쳐 매우 가변적 인 경우 9.1로 계산 단계 9.2에서 데이터를 정규화 할 필요가있다.

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Representative Results

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최근에, 우리는 개발 retinogeniculate 시스템의 시냅스 입력의 미세 아교 세포 - 매개 말림 (그림 1) 7을 시각화하고 정량화이 말림 분석을 사용했다. CX3CR1-EGFP 이형 쥐에서 망막 신경절은 anterogradely 각각 왼쪽과 오른쪽 눈에 CTB-594 및 CTB-647으로 추적했다. 이 추적에 이어, dLGN 내에서 EGFP 양성 미세 아교 세포가 몇 군데 있었다. 이러한 이미지는 이후에 볼륨 측정을 위해 표면 렌더링되었다.

이 기술을 사용하여, 우리는 dLGN (P5) 내에서 개발 시냅스 리모델링의 피크 기간 동안, 시냅스 입력이 미세 아교 세포 (그림 6)에 의해 침몰되는 것으로 나타났습니다. 리모델링 다량 (P9) 거의 완료 될 때 적은 AS 4 일 후, 잠겼 입력의 양의 극적인 감소가있다. 또한, 말림과 가지 치기는 고전적인 보완 폭포에 속하는 단백질이 결핍 된 생쥐에서 중단됩니다(데이터 미도시) 신경원 발화 조작 다음 (도 6)뿐만 아니라, 7.

그림 1
RGC 시냅스 입력 (7)의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 평가하기 위해 그림 1. 전략.) 선행 성 추적 전략의 개략도. 왼쪽과 오른쪽 눈 RGC 입력은 각각 CTB-647 (블루)와 CTB-594 (레드)로 추적됩니다. 입력의 미세 아교 세포 - 매개 (녹색) 말림은 이후 평가된다. B) 출생 후 5 일 (P5) 마우스 dLGN의 대표 낮은 배율 이미지를 왼쪽 (파란색), 오른쪽 (빨간색) 눈 입력의 선행 성 추적 다음. 스케일 바 = 100 μm의. 실라) 미세 아교 세포 (EGFP, 녹색) 왼쪽 (파란색의 국경 지역에서 샘플링)과 오른쪽 (빨간색) 눈의 입력 (B에 삽입). CII) CIII) 표면 렌더링을 뺀 RGC 입력을 가득 채우고있다. P5 dLGN에서 그리드 선 간격 = 5 μm의. 디) 대표 미세 아교 세포 (녹색, EGFP). RGC 입력이 CTB-594 (적색)으로 표시되어 리소좀이 항 CD68 (파란색)으로 표시되어 있습니다. DII) 미세 아교 세포 볼륨 이외의 CTB 형광가 제거 된 공개는 미세 아교 세포 내에서 RGC 입력 (빨간색)와 리소좀 (파란색)을 가득 채우고 . 흰색 ​​화살표) 사업부-V) CD68 (사업부)와 CTB (DV) 채널 만;. (녹색) Ⅲ ·) 대부분의 RGC 입력 (빨간색)은 완전히 CD68 양성 리소좀 (파란색에서 지역화됩니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 2. Imaris 소프트웨어 아이콘.

그림 3
그림 3. 소프트웨어의 일반 탐색 창. A) 화면 조정 창. B) 포인터 창. 선택 특정 표면을 선택하실 수 있습니다. 탐색보기의 분야에서 이미지의 회전. C) 그것은 될 필요가있다 볼륨 렌더링 표면 모드를 능가 수 있습니다.

그림 4
소프트웨어의 그림 4. 표면 렌더링합니다.) 창을 만듭니다. B) 부드러운창을 보내고. . C) 형광 이미지의 표면을 임계 값 (노란색으로 강조 표시) 풀다운 메뉴에서 표면에 채널을 선택합니다. 빨간색 상자에 의해 강조 총 침몰과 비 가득 채우고 재료에 기록되어야한다 임계 값입니다. 이 숫자는 임계 값을 나중에 적용 가득 채우고 재료 표면 될 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 소프트웨어의 볼륨 측정을 얻을 수있다. 다음 표면 렌더링을 표시) 탭. 마스크는 모든 식세포 내에 가득 채우고 재료를 시각화하는 기능을 텍스트입니다. B에서 식별 된 지팡이, 연필, 깔때기, 및 그래프 탭을) 참고. 선택한 채널을 참고 (YE상자 llow). C) 깔때기 / 필터 탭에서이 기능은 노란색으로 표시되도록 왼쪽에있는 막대 그래프를 끝까지 밀어 필드의 모든면의 선택을 할 수 있습니다. 모든 필터가 그래프 탭에서이. D)을 위해 선택 될 수있다, 볼륨 측정을 얻을 기록 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
(형광 이미지를 그림 1에 나타내었다 P5에서 그림 6. 대표 데이터 7.) 대표 표면 렌더링 된 미세 아교 세포), P9 및 P30 마우스 dLGN. 확대 인 ​​세트는 검은 색 점선으로 표시.RGC 입력의 그리드 선 간격 = 5 μm의. B) 말림은 크게 세 연령대 (P9 및 P30) 대 dLGN (P5)에 피크 치기 동안 증가한다. * 보완 수용체 3 결핍 된 생쥐에서 P <0.001 일원 분산 분석, N = 3 마우스 / 세. C) 소교 (KO, 검은 색 막대가) WT의 한배 새끼 (흰색 막대)에 비해 훨씬 적은 RGC 입력을 삼켜. 모든 데이터는 WT 제어 값으로 정규화된다. * P <학생의 T-테스트 0.04, N = 3 마우스 / 유전자형. 모든 오차 막대는 SEM을 대표하는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하세요.

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Discussion

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식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하여 식세포 매개 말림을 측정하는 매우 안정적이고 정량적 인 방법을 설명합니다. 이 방법은 성공적으로 개발 마우스의 뇌 (retinogeniculate 시스템) 7 시냅스 리모델링을받은 시냅스 입력의 미세 아교 세포 매개-말림을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 또, unde 다른 발달 연령대 걸쳐 말림의 미묘한 변화를 구분할 수있는 매우 민감한 기술로 입증R 비 병적 인 조건과 야생형과 녹아웃 마우스 사이. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 시간 경과 영상 살아있는 조직에서 말림을 연구에 적용 할 수 있습니다. 또,이 프로토콜은 질병 식세포 - 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 적용될 수있다.

주의 사항

이 분석의 가장 유용한 측면 중 하나는 그들이 리소좀 분해 경로를 입력 한 후 계속 표시하는 방식으로 신경 돌기 레이블을 할 수있는 능력이다. 신경 세포가 표시되어 있기 때문에, 그것은 포식 된 세포의 어떤 부분을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 전자 현미경 (7)과 결합 (dLGN의 비 ​​시냅스 지역 대 예를 들어, 시냅스 지역) 매우 신중 지역 분석을 필요로한다. 또한,이 신경 세포의 세포체와 돌기 같은 지역에있는 다른 뇌 영역에서 더 어려울 수 있습니다. 그러나, 다른 라벨 전략은 벨을 참조 (이용 될 수있다우). 게다가 의한 광학 현미경의 해상도 한계에, 하나가 잠겼 물질의 양을 과대 우려가있다. 그 결과, 치료는 침몰 물질이 리소좀 내에 있는지 확인하기 위해주의해야합니다. 이러한 이유로, 우리는, 미세 아교 세포 내에서 3D 렌더링 및 분석의 매개 변수의 유효성을 확인하기 위해 직교 전체보기 리소좀에 라벨을 방지 CD68을 사용합니다.

세포 유형

미세 아교 세포에 더하여,이 방법은 또한 뇌 (예를 들어, 성상 세포)와 말초 신경계 및 면역계 (예 perisynaptic 슈반 세포, 대 식세포 등)의 다른 식세포의 역할을 분석하기 위해 적용될 수있다. 알렉사 염료에 접합 CTB가 너무 쉽게 대부분의 세포에 의해 촬영되어 있기 때문에, 비슷한 라벨링 전략은 뇌와 다른 장기 시스템 전체에 가득 채우고 재료 레이블을 사용할 수있다.

가득 채우고 재료의 라벨링

알 등알렉사 염료에 접합 CTB에 대안책, 우리는 가득 채우고 재료 7 레이블을 다음과 같은 전략을 사용하고 있습니다 : 1) 망막 신경절이 형광 단백질 (예를 들어, 등 tdTomato, EGFP)로 표지 된 형광 리포터 생쥐. 덱스 트란에 접합 pHrodo 염료 2) 선행 성 라벨, 그것은 리소좀에 한 번만 형광 염료. 서로 다른 전략을 사용하여, 시각화 및 미세 아교 세포 내에서 침몰 시냅스 입력의 정량화는 같은 이미징 및 정량화 기술 performedwith 수 있습니다. 그러나, 알렉사 염료 접합체 인해 가수 분해 7,21을 리소좀 알렉사 염료의 높은 저항에 가장 강력한있다. 또한, 항체 (예를 들어, 안티 VGlut2, 시냅스 소포 단백질)를 가득 채우고 재료의 표시가 시도되고있다. 그러나, 대부분의 단백질이 급속 리소좀 번 세분화되어 관련 검출 비교적 불안정한 방법이다. 이 때문에 낮은 형광을 구별하기 어렵다배경 위에 단백질 분해한다.

사용 동물

현재 프로토콜에서, 미세 아교 세포가 형광 형광 기자 마우스 (CX3CR1-EGFP) 22를 사용하여 유전자 표시되어 있습니다. 그러나, 형광 기자 구조의 유전자 발현 대 항체 라벨이 필요하는 경우가있다. 형광 기자 마우스는 관심 식세포에 사용할 수없는 경우 예를 들어, 쥐의 사용이 필요하다, 또는 연구원은 형광 기자 마우스 라인에 그들을 교차하지 않고 녹아웃 마우스를보고하고자합니다. 이와 같은 사례의 경우, 식세포는 면역 조직 화학 염색을 이용하여 표시 할 수 있으며 데이터는 형광 리포터 생쥐 7을 사용하여 실험 결과와 비교합니다. 조직 절편에 따라, 우리는 일반적으로 부동 섹션 7에 대한 표준 면역 염색 프로토콜을 사용합니다. 그것은 전체 셀에 레이블을하는 단백질에 대해 제기 항체를 선택하는 것이 중요합니다그 과정. 예를 들어, 라벨 미세 아교 세포에, 안티 Iba1가 사용될 수있다.

넓은 신청 : 라이브 영상과 질병

이 프로토콜은 고정 된 조직의 분석을 기반으로하면서, 약간의 수정은 라이브 촬상하여 획득 된 영상에서 동일한 분석을 가능하게한다. 시간 경과 영상 세션에 이어, 후속 Z-스택은이 프로토콜의 4-9 단계와 동일한 처리 할 수​​ 있습니다. 우리가 건강한 CNS에서 개발 시냅스 리모델링 동안 시냅스의 말림을 시각화하는이 프로토콜을 적용한 동안 또한,이 프로토콜은 질병 모델에 적용 할 수 있습니다. 특히,이 프로토콜은 척수 손상, 알츠하이머 병 등 12,14-19,23와 연관된 초기 시냅스 손실 다음과 같은 시냅스 손실 및 재생의 경우와 시냅스 실질적인 개조를 받아야하는 질병을 연구하기 위해 이용 될 수있다 - 26. 또 하나는 어떤 phag에서 질병을 연구하기 위해이 기술을 적용 할 수시냅스보다 다른 재료의 ocytosis는 미세 아교 세포 / 질병을 탈수 초성에있는 수초의 대식 세포 - 매개 말림 (예를 들면, 다발성 경화증)와 알츠하이머 병 5,6,27-29에서 베타 - 아밀로이드의 말림과 같이 설명하고있다.

결론적으로, 여기에서 설명하는 말림 분석은 세포 외 환경 식세포의 상호 작용을 연구 할 수있는 편리하고 재현성, 민감한 기술을 제공합니다. 중요한 것은,이 분석은 사용 및 신경 과학 사회뿐만 아니라 다른 장기 시스템에서 이러한 작업이 될 것입니다 기능의 넓은 범위를 가지고 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

,,, NRSA (DPS F32-NS-066698) 작업은 스미스 가족 재단 (BS), 다나 재단 (BS), 존 머크 학자 프로그램 (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801)에서 교부금에 의해 지원되었다 낸시 루리 마크 재단 (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC 이미징 코어).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat pad Vet Equip, Inc. 965500 
Warm water source for heat pad Kent Scientific TP-700
Stereo microscope DSC Optical Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
Sliding microtome with freezing stage Leica SM2010 R
Microtome blade Leica 14021607100
Fluorescent dissecting microscope Nikon SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
Spinning disk confocal microscope Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton gas tight syringes Hamilton 80030 Use a different syringe for each color dye/tracer
Hamilton needles Hamilton 7803-05, specifications: blunt, 1.5"
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) Invitrogen 488: C22841 Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647)
594: C22842
647: C34778
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-50TAB
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) Bausch & Lomb 24208-780-55
30.5 G needle Becton Dickinson 305106
Spring scissors Roboz RS-5630
Cotton-tipped applicator Fisher 23-400-125
Paraformaldeyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.
Dissection tools – scissors, forceps, spatula Small scissors: Fine Science Tools Small scissors:14370-22
Large scissors: Roboz Large scissors: RS-6820
#55 forceps: Fine Science Tools #55 forceps: 11255-20
Spatula: Ted Pella, Inc. Spatula: 13504
Sucrose Sigma S8501-5KG Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)
OCT Compound VWR 25608-930
Weigh boat USA Scientific 2347-1426
24-well plates BD Biosciences 353047
Sodium phosphate monobasic Sigma S6566-500G Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O
Sodium phosphate dibasic  Sigma S5136-500G
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 VWR 48393 194
Charged microscope slide VWR 48311-703
Vectasheild Vector Laboratories H-1200

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References

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말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜
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Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).More

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