Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En omvälvning Analys: Ett protokoll för att bedöma samspelet mellan CNS fagocyter och nervceller

doi: 10.3791/51482 Published: June 8, 2014

Summary

Mikroglia är de bosatta immuna celler i det centrala nervsystemet (CNS) med en hög kapacitet att phagocytose eller uppsluka material i deras extracellulära miljön. Här används en brett tillämpbar, pålitlig och mycket kvantitativ analys för att visualisera och mäta mikroglia medierad omvälvning av synaptiska komponenter beskrivits.

Abstract

Fagocytos är en process i vilken en cell uppslukar material (hela cellen, delar av en cell, debris, etc.) i dess omgivande extracellulära miljön och därefter digererar detta material, vanligen genom lysosomal nedbrytning. Mikroglia är de bosatta immuna celler i det centrala nervsystemet (CNS), vars fagocytos har beskrivits i ett brett spektrum av villkor från neurodegenerativa sjukdomar (t.ex. beta-amyloid clearance vid Alzheimers sjukdom) till utveckling av den friska hjärnan (t.ex. synaptic beskärning) 1-6. Följande protokoll är en omvälvning analys utvecklats för att visualisera och kvantifiera mikroglia-medierad omvälvning av presynaptiska ingångar i utvecklings musen retinogeniculate systemet 7. Även denna analys användes för att bedöma mikroglia funktion i detta sammanhang kan ett liknande tillvägagångssätt användas för att bedöma andra fagocyter hela hjärnan (t.ex., astrocyter) och resten av kroppen(t.ex. perifera makrofager) och andra sammanhang där synaptiska ombyggnad sker (t.ex. hjärnskada / sjukdom).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Synaptic kretsar omforma hela livet av ett djur. I den växande hjärnan, synapser bildas i överskott och måste genomgå synaptiska beskärning som innebär selektivt borttagande av en delmängd av synapser samt att bevara och stärka de synapser som fortfarande 8-10. Denna process är nödvändig för att uppnå den exakta konnektivitet karakteristisk för den vuxna nervsystemet. I vuxen, kan synapser också vara plast, särskilt i samband med inlärning och minne. De strukturella korrelat till denna plasticitet är tänkt att inkludera tillägg och / eller eliminering av Dendritutskotten och presynaptiska boutons 11-13. Utöver dessa roller i friskt nervsystem, är synaptic ombyggnad också inblandad i nervsystemet sjukdom / skada 12,14,15. Till exempel, efter ryggmärgsskada, avhuggna axoner måste därefter renovera och bilda nya synapser att uppnå funktionell återhämtning 16-19.

nt "> Fram som en viktig aspekt av synaptisk plasticitet är processen för fagocytos eller omvälvning av synapser som är avsedda för borttagning 3,5,20. Vi visade nyligen detta fenomen i samband med synaptisk beskärning i den friska, postnatal mushjärna 7. Specifikt , mikroglia de bofasta CNS-immunceller och fagocyter, visades att uppsluka presynaptiska ingångar under en period med hög belastning och i en region av utvecklings synaptisk beskärning, den postnatala dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) av thalamus. Genetisk eller farmakologisk blockad av denna omvälvning resulterade i varaktiga underskott i synaptiska uppkoppling.

I detta protokoll, beskriver vi en pålitlig och mycket kvantitativ analys för att mäta phagocyte-medierad omvälvning av presynaptiska ingångar. Vid tillämpningen av denna artikel, kommer denna analys att presenteras i samband med utvecklings retinogeniculate systemet, vilket inkluderar näthinneganglieceller (RGC) bosatta i näthinnan somprojicera presynaptiska ingångar till dLGN (Figur 1A). Till att börja med kommer en lysosomal nedbrytning resistent anterostrategi märkningen beskrivas, som används för att visualisera RGC-specifika presynaptiska ingångar i dLGN (Figur 1) 7,21. Efter denna beskrivning, en detaljerad metod för avbildning och kvantitativt mäta omvälvning med hjälp av konfokalmikroskopi i kombination med 3 dimensionell (3D) yta volymrendering kommer att ges. Denna metod bygger på förberedelse fast vävnad men kan även anpassas för användning i live-imaging studier. Viktigt, medan analysen har validerats i samband med den friska, postnatal retinogeniculate systemet skulle man kunna tillämpa samma metoder för att bedöma andra phagocyte-neuron interaktioner i hela hjärnan och under sjukdom samt fagocytfunktionen i andra organsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Antero Märkning av RGC Presynaptiska ingångar

OBS: Alla experiment som innebär användning av djur granskades och övervakas av den institutionella djurvård och användning kommittén (IACUC) i enlighet med alla NIH riktlinjer.

  1. Sterilisera fält och instrument.
  2. Söva musen med 4 vol% isofluran i en plexiglasinduktionskammare (denna volym% isofluran fungerar för neonatal-vuxna möss). Observera möss noga för att undvika över anesthetizing. VARNING: Undvik inandning med ett vakuum avfallsgaser evakuering.
  3. Efter 1-3 minuter, (äldre möss kräver mindre tid) säkerställa en lämplig nivå av anestesi uppnås genom att klämma svansen (ingen reaktion bör observeras) och observera andning (kurs bör vara långsam och stadig).
  4. Placera musen under stereomikroskop på sidan och plats noskon levererar 3-4 vol% isofluran under nosen (nyfödda <postnatal dag 10 (P10) ~ 4 vol%,> P10 ~ 3 vol%).
  5. Exponera sklera. För injektion av nyfödda före öppna ögonen, använd ett par små våren sax för att öppna ögonlocket och dra tillbaka huden att exponera sklera. För äldre möss, använd fingrarna för att dra tillbaka huden kring ögat för att exponera sklera. VARNING: Hos nyfödda, ibland en annan vinkelräta snitt i hörnet av ögat är nödvändig. Var försiktig när du klipper hörnet av ögonlocket som det finns ett blodkärl att om klippa, kommer att blöda överdrivet.
  6. Använd en steril 30,5 G nål för att punktera ett litet hål i sidan av ögat vid den linje där senhinnan börjar. Var försiktig för att undvika skador på linsen genom att sätta in nålen bara tillräckligt långt att vinkel går in i ögat.
  7. Tillåt glaskroppen att strömma ut ur hålet och använda en steril bomullspinne för att absorbera vätskan.
  8. När glaskroppen har slutat flöda ut ur hålet, sätt in en trubbig nål fäst vid en Hamilton spruta förladdad med antero spårning färgämnei hålet. VARNING: För in nålen långsamt för att undvika att punktera den andra sidan av ögat och skador på linsen.
  9. Injicera långsamt färgämne i ögat. Normalt är koleratoxin β subenhet konjugerat till Alexa 594, 647 eller 488 (CTB-594, CTB-647, eller CTB-488, 5-6 mikrogram / l) används för att anterogradely spår RGC ingångar. För nyfödda (≤ P10) 1-2 pl är tillräcklig och för möss> P10 ~ 3 l räcker. OBS: Alexa färgämnen är särskilt motståndskraftiga mot lysosomal nedbrytning
  10. Låt nålen i hålet i några sekunder och sedan sakta ut.
  11. Använd en bomullspinne för att absorbera överflödig vätska och förhindrar färgen från att läcka ut.
  12. Applicera en liten mängd antibiotisk salva i ögat. Om ögat var kirurgiskt öppnade försiktigt flytta ögonlocken ihop.
  13. Om injicera båda ögonen, upprepa proceduren på andra ögat.
  14. Efter injektion (s), lämnar musen under en värmelampa eller på en värmedyna tills den börjar återhämta sig från AnesthESIA.
  15. Återgå musen till ett rent hem bur och övervaka att se till att det är fullt vaken innan han återvände till kolonin.

2. Förbered Mjukpapper för Imaging

Denna vävnad förberedelse protokollet används för reporter möss där fagocyter är märkta med fluorescerande markörer (t.ex. CX3CR1-EGFP för mikroglia). Om en reporter linjen inte är tillgänglig, kan undersökaren immunostain vävnadssnitt (se Diskussion).

  1. ~ 24 timmar efter injektion, offra musen och dissekera hjärnan.
  2. Drop fixa hjärnan på ett Falcon-rör fyllt med 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 ° C. VARNING: PFA är giftig. Undvik inandning och hudexponering genom att i ett dragskåp eller på en utsugsbord och bära personlig skyddsutrustning. Anmärkningar: Fixering kan vara kortare (≥ 4 h). Dessutom, i stället för att släppa fastställande, 4% PFA perfusion kan användas följt av en 2-24 tim droppe fix. Emellertid jämförelse av GJUTAd att släppa fasta neonatala och vuxna hjärnor visade ingen skillnad i bildkvalitet eller kvantifiering.
  3. Skölj hjärn 3x i fosfat-buffrad saltlösning (PBS).
    1. Häll hjärnan och PFA i en tom väga båt.
    2. Använd en stekspade för att flytta hjärnan till en annan väga båt fylld med PBS.
    3. Tvätta hjärna två gånger i PBS (överföring hjärna till ytterligare två väga båtar fyllda med PBS).
  4. Överför hjärnan till ett Falcon-rör fyllt med en 30% sackaroslösning. Lämna hjärnan i sackaros vid 4 ° C tills hjärnan sjunker till botten av röret (24-48 h).
  5. När hjärnan sjunker, förbereder hjärnan för sektionering. Följande steg är förberedelse av 40 ìm flytande sektioner med hjälp av en glidande mikrotom med en frys stadium (en kryostat kan också användas).
    1. Använd ett rakblad för att ta bort delar av hjärnan som inte behövs (för dLGN, ta bort rostralt och caudal delar av hjärnan).
    2. Frysa behåni på aluminiumfolie över torris. Under denna tid, fryst mikrotomen scenen och fylla varje brunn i en 24-brunnar med 0,5 ml av 0,1 M fosfatbuffert (PB).
  6. Montera den frusna hjärna (det ska visas ogenomskinliga) om frysning scenen.
    1. Applicera en liten mängd av en optimal skärtemperaturen föreningen (oktober) till scenen.
    2. När oktober börjar frysa, lägga hjärnan i oktober Slutet av hjärnan som kommer att klippas ska vara vänd uppåt (t.ex. för dLGN, inför den näst sista sidan uppåt).
    3. Täck hjärnan och oktober med mycket fint krossad torris.
    4. Lämna torris på hjärnan / oktober för ~ 30 sekunder.
    5. Använd en stor pensel för att ta bort torris. Hjärnan och oktober bör frysas till scenen.
  7. Begin sektione genom vävnaden till dess att regionen av intresse (ROI) är nådd.
  8. När ROI uppnås, använd en liten pensel för att ta bort delar från bladet och överföra dem till 24-bra plate innehållande 0,1 M PB (steg 2.5.2). Håll pensel fuktig genom att blöta den i 0,1 M PB innan du tar bort delar från kniven. Anm: Sektioner kan lämnas i 0,1 M fosfatbuffert över natten vid 4 ° C.
  9. När avsnitten har samlats in, visualisera antero märkning enligt en fluorescerande dissekera mikroskop och välja avsnitt som innehåller ROI.
  10. Montera delarna i en bild med en liten pensel.
    1. Applicera en liten pool av 0,1 M PB till ett laddat objektglas.
    2. Överför vävnadssnittet till poolen av PB.
    3. Använd PB och pensel att orientera och sprida vävnaden.
    4. Använd en Kimwipe att sugas bort överflödigt PB. Var försiktig för att undvika fuktspridande bort avsnittet.
    5. Tillåt att helt lufttorka.
    6. Applicera en liten droppe monteringsmedium till varje avsnitt och montera på ett täckglas på toppen (22 x 50 mm, nr 1,5).
    7. Täta kanterna på bilden med nagellack och förvara vid -20 ° C tills avbildning session. OBS: Även om bildbehandling medi en vecka efter beredning rekommenderas kan diabilder hållas vid -20 ° C under flera veckor före avbildning.

3. Imaging Tissue

Alla bilder förvärvas på en snurrande skiva konfokalmikroskop (Ultra Vox snurrande skiva konfokalmikroskop utrustad med diodlasrar (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm och 640 nm)). Bilder kan också förvärvas på något mikroskop med förmågan att skaffa högupplösta z-stackar (t.ex. laserskanning konfokalmikroskop, epifluorescent mikroskop följt av deconvolution, etc.). Ramstorlek är typiskt 1000 x 1000 bildpunkter.

  1. Hitta ROI på 10X förstoring och skaffa sig en bild. För avbildning mikroglia i retinogeniculate systemet, är ROI de mest mediala dLGN sektioner.
  2. Växla till högre förstoring (en 60X Plan Apo objektiv, NA = 1,4, används normalt).
  3. Förvärva första synfält som innehåller fagocyter använda 0,2 ìm z-steger.
  4. Förvärva 15-19 fler fält innehåller fagocyter per djur.

4. Förbered bilder för Kvantifiering (ImageJ)

  1. Öppna z-stack i ImageJ.
  2. Gå till menyn Bild, välj färg och Split kanaler.
  3. Subtrahera bakgrund från kanalen (-erna) som innehåller det uppslukade materialet.
    1. Välj kanalfönstret innehåller det uppslukade material (t.ex. presynaptiska ingångar).
    2. Gå till Process-menyn och välj Subtrahera bakgrund. Använd en rullande boll radie på 10 pixlar för antero spårning av presynaptiska ingångar i dLGN. Obs: Den rullande boll radie bestäms empiriskt. Emellertid bör det i allmänhet vara så stor som radien av den största objektet i bilden som inte är en del av bakgrunden.
  4. Jämna kanalen innehåller fagocytsystemet.
    1. Välj kanalfönstret innehåller fagocytsystemet (t.ex. mikroglia).
    2. Gå till menyn Process och select Filter, Mean. Använd ett medelvärde filter på 1,5 (detta jämnar ut bilden för ytrendering i senare steg).
  5. Subtrahera bakgrund från den kanal som innehåller det fagocyt.
    1. Välj kanalfönstret innehåller fagocytsystemet (t.ex. mikroglia).
    2. Gå till Process-menyn väljer Subtrahera bakgrund (inställningar måste bestämmas empiriskt). Använd en rullande boll radie på 50 pixlar för EGFP-positiva mikroglia.
  6. Merge kanaler genom att gå till Bild-menyn och välja färg, Merge kanaler.
  7. Beskär ROI innehåller phagocyte från sammanslagna filen (detta gör yta rendering snabbare, se steg 5).
    1. Rita en ruta runt ROI med hjälp av rektangulära markeringar verktyget i verktygsfältet.
    2. Gå till menyn Image och välj Beskär.
  8. Split kanaler igen (se steg 4.2).
  9. Spara varje kanal som sin egen TIFF-fil.

5. Förbered Bild för kvantifieringi Imaris

  1. Öppna Imaris och se till att ikonen Volym väljs i det övre vänstra menyn (Figur 2).
  2. Öppna första kanal för beskurna bilden (någon av kanalerna kan öppnas först, bara vara konsekvent).
  3. Lägg till den andra kanalen (er). Gå till Redigera-menyn, välj Lägg till kanaler och välja nästa kanal i filen. (Upprepa detta steg för eventuella återstående kanaler). OBS: För att ändra färg, gå till Visa justeringsfönstret och klicka på kanalnamnet (Figur 3A). Då visas en dialogruta för att justera färgen. Om Display Justering fönstret inte syns, gå till menyn Redigera och välj Display justering.
  4. Justera pixelvärdena. Gå till menyn Redigera och välj Bildegenskaper. I detta fönster, justera x, y-och z-pixelvärden (Dessa värden beror på mikroskop, objektiv, kamera, och z-steg förvärv och finns i den programvara som används för att hämta bilden).
  5. Steg 5.5 kommer att resultera i en mycketliten bild. För att ändra storlek, klicka på Anpassa ikonen i det nedre högra hörnet (figur 2).
  6. I Display justeringsfönstret, justera ljusstyrka och kontrast för varje kanal med vänster och mitten trianglar.

6. 3-dimensionell (3D) Surface rendering av fagocytsystemet

  1. I det övre verktygsfältet, se till att Surpass läget är valt (figur 3C).
  2. I Display justeringsfönstret, avmarkera alla kanaler utom fagocytsystemet kanalen. Detta kommer att ta bort dem från synfältet.
  3. Klicka på Surface Rendering ikonen (Figur 2).
  4. En skapa fönster visas i det nedre vänstra (Figur 4A), se till Segment ROI är avmarkerat i denna första fönstret. Klicka på den blå framåt knappen längst ner.
  5. Justera utjämning.
    1. I nästa fönster väljer du fagocytsystemet kanal från rullgardinsmenyn (Figur 4B). Detta justerarmycket detaljer som ska vara klädda och bör bestämmas empiriskt (0,1 ìm utjämning används normalt för mikroglia).
    2. Välj Absolute tröskling.
    3. Klicka på den blå framåt knappen längst ner.
  6. Tröskel bilden.
    1. Klicka på histogram och dra tills bilden har dykt upp på lämpligt sätt (Figur 4C). Detta bestäms empiriskt genom att vrida på bilden för att se de grå ytor som lagts över den fluorescerande bilden är en exakt yta representation. Obs: Om du vill rotera, väljer Navigera på Pointer-menyn uppe till höger på skärmen (Figur 3B), klicka och håll bilden för att rotera. För att återgå bild till ursprunglig orientering väljer Ursprung nedre vänstra menyn Visa.
    2. Klicka på den blå framåt knappen längst ner.
  7. I nästa fönster, det finns ett alternativ för att filtrera ut alla ytor genom storlek etc. Om inte bilden är mycket bullriga, inte filtrera och ta bort eny filter som automatiskt visas. Klicka på den gröna pilen längst ner för att avsluta ytan vilket gör att fagocytsystemet. En ny uppsättning flikar kommer att visas (Figur 5)
  8. Om det behövs, ta bort alla ytor som inte ingår i fagocytsystemet av intresse.
    1. Se till att Välj alternativet är valt i Pointer-menyn (Figur 3B).
    2. Klicka på någon yta som ska tas bort så att den blir gul. För att ta bort flera ytor, klicka på ytorna medan du håller ned kontrollknappen.
    3. Klicka på Ta bort under fliken Penna.
  9. Välj och slå samman alla ytor fagocytsystemet till en yta.
    1. Klicka på (dvs. fliken Filter, figur 5C) Tratt.
    2. Klicka på Lägg till.
    3. Välj något filter drar histogrammet längst till vänster (alla ytor ska vara gul).
    4. Gå tillbaka till fliken Penna och klicka Unify.
  10. Gå till fliken graf (Figur 5A (Figur 5D). För visning av flera parametrar, gå till ikonen Wrench längst ner till vänster (figur 2) och välja parametrar för att spela in.
  11. Anteckna volymen på fagocytsystemet och spara filen innan du fortsätter.

7. 3D Surface rendering av Engulfed Material

  1. Skapa en ny kanal för material som har uppslukas av fagocytsystemet.
    1. Medan fagocytsystemet ytan är markerad klickar du på fliken penna.
    2. Klicka Mask All.
    3. I dialogen som visas väljer du den kanal som motsvarar uppslukas material (t.ex., antero spårning av presynaptiska ingångar; Figur 5B).
    4. Kontrollera dubbletter kanal innan du applicerar masken och slå på OK.
    5. En ny kanal kommer att visas i displayen justeringsfönstret som innehåller endast material som har uppslukat och är inne ifagocyt.
  2. Ytans render kanalen innehållande totalt Engulfed och nonengulfed material.
    1. Avmarkera alla kanaler i Display justeringsfönstret förutom den kanal som skall dykt och avmarkera ytan skapats för fagocytsystemet.
    2. Klicka på återgivningsikon ytan igen (se steg 6.3) och skapa en yta för kanalen genom att använda samma steg som beskrivits för fagocyt (steg från 6,4 till 6,11). Obs: Se till att välja rätt kanal innan utjämning och tröskel (steg 6.5, Figur 4B). Anteckna tröskelvärdet (se steg 6.6, Figur 4C). Detta värde kan också erhållas efter ytrendering är fullständig (fliken Wand, fig. 5A).
  3. Anteckna volymen av den totala uppslukas och icke-uppslukas material och spara filen innan du fortsätter.
  4. Surface render uppslukat material (material inom fagocytsystemet).
    1. Visualisera fluorescensen hos endastden nya kanalen på uppslukas material (se steg 7.2.1).
    2. Följ samma steg som ovan (steg 7,2-7,3). Obs: Se till att välja rätt kanal från rullgardinsmenyn innan utjämning (välj den nya kanalen som skapades i steg 7.1). På tröskeln fönstret anger tröskelvärdet som var inställd för att göra den totala uppslukas och icke-uppslukas material (se steg 7.2.2) manuellt.
  5. Anteckna volymen på uppslukas materialet och spara filen innan du fortsätter.

8. Beräkna den totala volymen av synfältet

  1. Skapa en ny yta för varje kanal.
  2. I tröskel fönster (steg 6,6), skjut histogrammet hela vägen till vänster så att hela området är till ytan.
  3. Avsluta beläggningsarbeten hela fältet och spela in volymen (steg från 6,7 till 6,11).
  4. Spara filen.

9. Beräkna mängden fagocyteras Material

  1. Beräkna densiteten för dentotalt uppslukade och icke-uppslukas material kanal med följande algoritm:
    Volymen av total Engulfed och icke-Engulfed Material (steg 7,3) / volym Field (steg 8).
  2. Beräkna% engulfment per cell med användning av följande algoritm:
    (Volym av Engulfed Material (steg 7,5) / total volym av fagocyten (steg 6,11)) x 100
    Obs: För att ta hänsyn till variationer i cellstorlek, är uppgifterna normaliseras till den totala volymen av fagocytsystemet. Om tal från steg 9,1 är mycket variabla över fälten, kan det vara nödvändigt att normalisera data från steg 9,2 till beräkningen i 9,1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nyligen använde vi denna omvälvning analys för att visualisera och kvantifiera mikroglia-medierad omvälvning av presynaptiska ingångar i utvecklings retinogeniculate systemet (figur 1) 7. RGC från CX3CR1-EGFP heterozygota möss anterogradely spåras med CTB-594 och CTB-647 in i vänster och höger öga, respektive. Efter denna spårning, var EGFP-positiva mikroglia inom dLGN avbildas. Dessa bilder har därefter ytan-renderade för volymmätningar.

Med denna teknik, fann vi att under en topp tid av utvecklings synaptiska ombyggnad inom dLGN (P5), är presynaptiska ingångar uppslukas av mikroglia (Figur 6). Så få som fyra dagar senare när en stor mängd av ombyggnad är nästan fullständig (P9), finns det en dramatisk minskning i mängden av engulfed ingångar. Dessutom är omvälvning och beskärning avbryts i mus med brist på proteiner som hör till den klassiska komplementkaskaden(Figur 6) liksom efter manipulering av neuronaktivitet (data ej visade) 7.

Figur 1
Figur 1. Strategi för att bedöma mikroglia-medierad omvälvning av RGC presynaptiska ingångar 7. A) Schematisk bild av antero spåra strategi. Vänster och höger öga RGC ingångar spåras med CTB-647 (blå) och CTB-594 (röd), respektive. Mikroglia-medierad (grön) omvälvning av insatsvaror därefter utvärderas. B) En representant låg förstoring bild av postnatal dag 5 (P5) mus dLGN efter antero spårning av vänster (blå) och höger (röd) ögon ingångar. Skala bar = 100 ìm. Ci) En mikroglia (EGFP, grön) samplad från gränsområdet till vänster (blå) och höger (röd) ögon ingångar (infälld i B). CII) CIII) ytrendering av mikroglia och slukade RGC ingångar. Steg Grid line = 5 nm. Di) En representant mikroglia (grön, EGFP) från P5 dLGN. RGC ingångar är märkta med CTB-594 (röd) och lysosomer är märkta med anti-CD68 (blå). Dii) Alla CTB fluorescens utanför mikroglia volymen har tagits bort avslöjande uppslukas RGC ingångar (röd) och lysosomer (blå) i mikroglia . (grön) DIII) Mest RGC ingångar (röd) är helt lokaliserad inom CD68-positiva lysosomer (blå, vita pilar) Div-v) CD68 (Div) och CTB (Dv) kanaler ensam.. Skala bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.


Figur 2. Imaris programikoner.

Figur 3
Figur 3. Allmänna navigeringsfönster i programvara. A) Bildskärmsjusteringsfönstret. B) Pointer Window. Välj möjliggör val av specifika ytor. Navigera gör att rotationen av en bild i synfältet. C) Det är nödvändigt att vara i Surpass läget för ytan gör volymen.

Figur 4
Figur 4. Surface rendering i program. A) Skapa fönstret. B) Smoothningsfönstret. Välj den kanal till ytan från rullgardinsmenyn (gulmarkerat). C) tröskling ytan till fluorescerande bild. Markerat vid den röda rutan är det gränsvärde som bör registreras för totalt uppslukade och icke-uppslukas material. Detta nummer kommer att tillämpas senare för att tröskeln och ytan den slukade materialet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Skaffa volymmätningar i programvara. A) Flikar som visas följande yta rendering. Notera Wand, Pencil, tratt, och Graph flikar som identifieras i texten. B) The Mask alla har att visualisera uppslukas material inom fagocytsystemet. Notera den valda kanalen (yellow ruta). C) Funktionen under fliken tratt / filter möjliggör val av alla ytor på området genom att skjuta histogrammet hela vägen till vänster så att det ser gult. Varje filter kan väljas för detta. D) Under fliken Diagram, kan volymmätningar erhållas och registreras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Representativa uppgifter 7. A) representant yta-renderade mikroglia från P5 (fluorescerande bild visas i figur 1), P9 och P30 mus dLGN. Förstorade infällningar betecknas med en svart prickad linje.Steg Grid line = 5 nm. B) omvälvning av RGC ingångar ökar väsentligt under topp beskärning i dLGN (P5) kontra äldre åldrar (P9 och P30). * P <0,001 med envägs ANOVA, n = 3 möss / ålder. C) Mikroglia från mus med brist på komplementreceptor 3 (KO, svart streck) uppsluka betydligt färre RGC ingångar jämfört med WT kullsyskon (vit bar). Alla data är normaliserade till WT kontrollvärden. * P <0,04 med Students t-test, n = 3 möss / genotyp. Alla felstaplar representerar sem Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att noggrant mäta fagocytos, måste uppslukas material märkas på ett sådant sätt att forskaren kan visualisera det en gång lysosomal nedbrytning har skett. Dessutom är högupplösande avbildning krävs, följt av användning av programvara som gör det möjligt för forskare att visualisera volymen av hela cellen och kvantifiera dess innehåll. I detta protokoll, beskriver vi en mycket tillförlitlig och kvantitativ metod för att mäta phagocyte-medierad omvälvning använder CTB konjugerat till Alexa färgämnen att märka uppslukas material i kombination med hög upplösning konfokalmikroskopi och 3D-rekonstruktion. Denna metod har använts i vårt labb för att framgångsrikt analysera mikroglia medierad omvälvning av presynaptiska ingångar genomgår synaptiska ombyggnad i utvecklings mushjärna (retinogeniculate systemet) 7. Dessutom har det visat sig vara en mycket känslig teknik som kan särskilja subtila förändringar i omvälvning mellan olika åldrar utvecklingsstörningar under icke-sjukliga tillstånd och mellan vildtyp och knockoutmöss. Med mindre justeringar, kan detta protokoll anpassas för att studera omvälvning i levande vävnader genom tidsförlopp avbildning. Dessutom kan detta protokoll användas för att studera phagocyte-neuron interaktioner i sjukdomen.

Förbehåll

En av de mest användbara aspekterna av denna analys är möjligheten att märka neuronala prognoser på ett sådant sätt att de förblir synliga efter att en lysosomala nedbrytningsvägen. Eftersom neuronen är märkt, kan det vara svårt att särskilja vilken del av cellen har fagocyteras. Detta kräver en mycket noggrann regional analys (t.ex. synaptiska region jämfört med en icke-synaptiska regionen av dLGN) kombinerat med elektronmikroskopi 7. Dessutom kan det visa sig vara svårare i andra delar av hjärnan där neuronala cellkroppar och prognoser bosatta i samma område. Emellertid kan alternativa strategier märkning användas (se below). Vidare, på grund av de högupplösta gränserna för Ijusmikroskopi, finns det en möjlighet att en kan överskatta mängden uppslukade materialet. Som ett resultat, måste man för att validera att uppslukas materialet är inom lysosomer. Därför använder vi anti-CD68 för att märka lysosomer inom mikroglia, 3D-rendering, och ortogonala vyer för att validera parametrar för analysen.

Celltyper

Förutom att mikroglia kan denna metod även användas för att analysera rollen av andra fagocyter i hjärnan (t ex astrocyter), och i de perifera nerv-och immunsystem (t.ex., perisynaptic Schwann-celler, makrofager, etc.). Dessutom, eftersom CTB konjugerat till Alexa färgämnen är så lätt tas upp av de flesta celler, en liknande strategi märkning kan användas för att märka uppslukat ämne i hela andra organsystem i hjärnan och.

Märkning av Engulfed Material

Som ett alnativ till CTB konjugerad till Alexa-färgämnen, har vi använt följande strategier för att märka uppslukade materialet 7: 1) fluorescerande reporter möss där RGC märktes med ett fluorescerande protein (t.ex. tdTomato, EGFP, etc.). 2) Antero märkning med en pHrodo färgämnet konjugerat till dextran, ett färgämne som bara fluorescerar när det är i en lysosom. Med hjälp av dessa olika strategier, kan visualisering och kvantifiering av uppslukade presynaptiska ingångar inom mikroglia vara performedwith samma avbildning och kvantifiering tekniker. Emellertid Alexa färgämneskonjugat de mest robusta på grund av den höga resistansen hos Alexa dye till lysosomala hydrolaser 7,21. Dessutom har märkningen av engulfed material med antikroppar (t ex anti-Vglut2, en presynaptisk vesikulär protein) försökts. Detta är dock en relativt osäker metod för upptäckt med tanke på att de flesta proteiner bryts snabbt ner en gång i lysosomer. Det är svårt att skilja låg fluorescens på grundtill proteinnedbrytning över bakgrunden.

Använda djur

I det nuvarande protokollet, är mikroglia fluorescerande genetiskt med hjälp av fluorescerande reporter möss (CX3CR1-EGFP) 22. Emellertid finns det fall i vilka antikroppsmärkning kontra genetiskt uttryck av fluorescerande reporterkonstruktioner är nödvändig. Till exempel, när fluorescerande reporter möss är inte tillgängliga för den fagocyt av intresse, är användningen av råttor nödvändigt eller forskaren önskar titta på knockoutmöss utan att korsa dem till en fluorescerande reporter mus linje. För fall som dessa, kan fagocyter märkas med hjälp av immunohistokemi och data är jämförbara med resultat från experiment med fluorescerande reporter möss 7. Efter vävnadssnittning, använder vi oftast en standardimmunfärgning protokoll för flytande avsnitt 7. Det är viktigt att välja en antikropp som tagits fram mot ett protein som kommer att märka hela cellen ochdess processer. Till exempel, för att märka mikroglia, anti-Iba1 kan användas.

Bredare Användningsområden: Live Imaging och sjukdom

Även om detta protokoll bygger på analys av fast vävnad, skulle smärre ändringar möjliggör samma analys i bilder förvärvats av levande avbildning. Efter en tid lapse avbildning session, kan de efterföljande z-stackar behandlas identiskt med steg 4-9 i detta protokoll. Dessutom, samtidigt som vi har tillämpat detta protokoll för att visualisera omvälvning av synapser under utvecklings synaptiska ombyggnad i friska CNS, detta protokoll kan också appliceras i sjukdomsmodeller. I synnerhet kan detta protokoll användas för att studera sjukdomar i vilka synapses genomgår väsentlig ombyggnad, såsom i fallet med synapsförlust och regenerering efter skada på ryggmärgen, tidig synaps förlust i samband med Alzheimers sjukdom, etc 12,14-19,23 - 26. Dessutom kan en även anpassa denna teknik för att studera sjukdomar i vilka Phagocytosis av andra material än synapser har beskrivits, såsom mikroglia / makrofag-medierad omvälvning av myelin i demyeliniserande sjukdom (t.ex. multipel skleros) och omvälvning av beta-amyloid i Alzheimers sjukdom 5,6,27-29.

Sammanfattningsvis engulfment analysen beskriven här erbjuder ett bekvämt, reproducerbart och känslig teknik för att studera fagocyt interaktioner med deras extracellulära miljön. Huvudsakligen har denna analys ett brett spektrum av användningsområden och funktioner som kommer att tjäna på neurovetenskap samhället samt de som arbetar i andra organsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Arbetet har finansierats med bidrag från Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07.100.801, BS), NRSA (F32-NS-066.698, DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat pad Vet Equip, Inc. 965500 
Warm water source for heat pad Kent Scientific TP-700
Stereo microscope DSC Optical Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
Sliding microtome with freezing stage Leica SM2010 R
Microtome blade Leica 14021607100
Fluorescent dissecting microscope Nikon SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
Spinning disk confocal microscope Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton gas tight syringes Hamilton 80030 Use a different syringe for each color dye/tracer
Hamilton needles Hamilton 7803-05, specifications: blunt, 1.5"
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) Invitrogen 488: C22841 Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647)
594: C22842
647: C34778
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-50TAB
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) Bausch & Lomb 24208-780-55
30.5 G needle Becton Dickinson 305106
Spring scissors Roboz RS-5630
Cotton-tipped applicator Fisher 23-400-125
Paraformaldeyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.
Dissection tools – scissors, forceps, spatula Small scissors: Fine Science Tools Small scissors:14370-22
Large scissors: Roboz Large scissors: RS-6820
#55 forceps: Fine Science Tools #55 forceps: 11255-20
Spatula: Ted Pella, Inc. Spatula: 13504
Sucrose Sigma S8501-5KG Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)
OCT Compound VWR 25608-930
Weigh boat USA Scientific 2347-1426
24-well plates BD Biosciences 353047
Sodium phosphate monobasic Sigma S6566-500G Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O
Sodium phosphate dibasic  Sigma S5136-500G
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 VWR 48393 194
Charged microscope slide VWR 48311-703
Vectasheild Vector Laboratories H-1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339, (6116), 156-161 (2013).
  3. Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31, (45), 16064-16069 (2011).
  4. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10, (11), 1387-1394 (2007).
  5. Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  6. Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14, (11), 1189-1197 (2007).
  7. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  8. Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274, (5290), 1133-1138 (1996).
  9. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  10. Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7, (4), 327-332 (2004).
  11. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10, (9), 647-658 (2009).
  12. Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60, (2), 287-305 (2009).
  13. Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13, (5), 492-505 (2007).
  14. Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38, (2), 476-481 (2010).
  15. Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
  16. Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235, (1), 133-141 (2012).
  17. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
  18. Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235, (1), 142-151 (2012).
  19. Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
  20. Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61, (1), 24-36 (2013).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21, (7), 1282-1292 (2010).
  22. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  23. Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37, (1), 73-82 (2008).
  24. Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
  25. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53, (3), 337-351 (1016).
  26. Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33, (11), 513-523 (2010).
  27. Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. (2012).
  28. Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21, (1), 65-72 (2003).
  29. Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24, (2), 261-268 (1999).
En omvälvning Analys: Ett protokoll för att bedöma samspelet mellan CNS fagocyter och nervceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).More

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter