Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

doi: 10.3791/51482 Published: June 8, 2014

Summary

Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir.

Abstract

Fagositoz bir hücre kendi çevre hücre dışı ortamda malzeme (tüm hücre, bir hücre, kir, vb parçaları) yutar ve daha sonra genel olarak lızozomal bozulma ile, bu malzemenin sindirir edildiği bir süreçtir. Mikroglia fagositik işlevi, nörodejeneratif hastalık, sağlıklı beyin gelişimine (Alzheimer hastalığında, örneğin, beta-amiloid açıklık) (örneğin, sinaptik gelen geniş bir koşullar aralığı içinde tarif edilmiştir, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri budama) 1-6. Aşağıdaki protokol, gelişmekte olan fare retinogeniculate sisteminde 7 presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiş bir yutulma deneyidir. Bu deney, bu özel bağlamda mikroglia fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır iken, benzer bir yaklaşım, beyin (örneğin, astrositler) ve vücudun geri kalanı boyunca diğer fagositler değerlendirmek için kullanılabilirler(Örneğin, periferik makrofajlar) hem de sinaptik yeniden cereyan ettiği diğer bağlamlarda (örneğin, beyin hasarı / hastalığı).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sinaptik devreler bir hayvanın ömrü boyunca pişmanlık. Gelişmekte olan beyindeki sinapslar aşan formu ve sinapsların bir alt kümesinin seçici çıkarılması ve 8-10 kalır bu sinapsların bakım ve güçlendirilmesini içeren sinaptik budama geçmesi gerekir. Bu işlem, yetişkin sinir sisteminin kesin bağlantı özelliği elde etmek için gereklidir. Yetişkinde, sinaps, özellikle öğrenme ve hafıza bağlamında, plastik olabilir. Bu plastisite yapısal bağıntılar dendritik dikenler ve presinaptik boutons 11-13 ve buna ek olarak ve / veya eleme düşünülmektedir. Sağlıklı bir sinir sisteminin bu rollerinin yanı sıra, aynı zamanda yeniden sinaptik sinir sistemi hastalığı / yaralanması 12,14,15 katılır. Örneğin, omurilik yaralanması sonrasında, kopmuş akson sonradan pişmanlık ve fonksiyonel iyileşme 16-19 ulaşmak için yeni sinaps oluşturmak gerekir.

nt "> sinaptik plastisite önemli bir yönü olarak Yükselen fagositoz veya kaldırılması 3,5,20 için mukadder sinaps yutulma sürecidir. Biz son zamanlarda sağlıklı, doğum sonrası fare beyninde 7 sinaptik budama bağlamında bu olayı göstermiştir. Özellikle , mikrogliya, ikamet MSS bağışıklık hücreleri ve fagositler, bir zirve döneminde ve gelişimsel sinaptik budama, talamus doğum sonrası sırt yanal genikülat çekirdek (DLGN) bir bölgede presinaptik girdiler yutmak için gösterildi., bu yutulma genetik veya farmakolojik blokajı sinaptik bağlantı sürdürülebilir açıkları sonuçlandı.

Bu protokol, biz presinaptik girişlerin phagocyte aracılı yutulmasına ölçmek için güvenilir ve yüksek kantitatif analiz tanımlamaktadırlar. Bu makalenin amaçları için, bu deney, retinada bulunan retinal ganglion hücreleri içeren gelişmekte retinogeniculate sistemi (RGCs) bağlamında sunulan olacakDLGN (Şekil 1A) presinaptik girdiler proje. Öncelikle, bir lizozomal bozulma dayanıklı ileriye etiketleme strateji DLGN RGC spesifik presinaptik giriş (Şekil 1) 7,21 görselleştirmek için kullanılan, tarif edilecektir. Bu açıklama, görüntüleme için detaylı bir yöntem izlenerek ve kantitatif olarak 3 boyutlu (3D) bir yüzey işleme hacmi ile kombine konfokal mikroskopi kullanılarak yutulmasına ölçüm verilecektir. Bu yöntem, sabit bir doku terkibi göre değil, aynı zamanda, canlı görüntüleme çalışmaları içinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Tahlil, sağlıklı, doğum sonrası retinogeniculate sistemi bağlamında doğrulandıktan ise Önemli olarak, başka bir beyin boyunca ve hastalığı sırasında fagosit-nöron etkileşimler, hem de diğer organ sistemlerinde fagosit fonksiyonunu değerlendirmek için aynı teknikler uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RGC Presinaptik Girişler 1. Anterograd Etiketleme

Not: hayvanların kullanımını içeren tüm deneyler tüm NIH kurallarına uygun olarak gözden ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından denetlenecektir edildi.

  1. Alanını ve aletleri sterilize edin.
  2. Bir pleksiglas indüksiyon odasında 4 hacim% izofluran (bu hacimce% izofluran yenidoğan yetişkin fareler için çalışır) ile fare anestezisi. Aşırı anestezi önlemek için yakından fareler gözlemleyin. DİKKAT: Bir vakum atık gaz tahliyesi ile solumaktan kaçının.
  3. 1-3 dakika sonra, (eski fareler daha az zaman gerektirir) anestezi uygun düzey kuyruk kısma (hiçbir tepki dikkate alınmalıdır) ve solunum hızı (oranı yavaş ve istikrarlı olmalıdır) gözlemleyerek elde sağlamak.
  4. Burun üzerinde 3-4 hacimce% izofluran teslim yan ve yer burun konisi üzerindeki stereo mikroskop altında fare yerleştirin (yenidoğan <postnatal günde 10 (P10) ~ 4 hacimce%;> P10 ~ 3 vol%).
  5. Sklera Açığa. Yenidoğanların enjeksiyon için önce göz açma, göz kapağı açın ve sklera maruz cilt geri çekmek için küçük yaylı bir makas kullanın. Yaşlı farelerin için, sklera açığa göz çevresindeki cilt geri çekmek için parmaklarınızı kullanın. DİKKAT: yenidoğanlar, bazen gözün köşesinde dik bir kesim gereklidir. , Kesersek, aşırı kanama bir kan damarı olduğu gibi göz kapağı köşe keserken dikkat edin.
  6. Sklera başlayan çizgisinde gözün tarafında küçük bir delik delmek için steril bir 30.5 G iğne kullanın. Sadece şimdiye kadar konik göz içine gider iğne sokarak lens zarar vermemek için dikkat edin.
  7. Camsı delikten dışarı akar ve sıvıyı emmek için steril bir pamuk uçlu bir uygulama aleti kullanmak izin verin.
  8. Vitreus deliğinden akan durduktan sonra, anterograd izleme boya ile önceden yüklenmiş bir Hamilton şırınga bağlı künt uçlu iğne takındeliğe. DİKKAT: yavaş yavaş gözün diğer tarafında delinme veya lens zarar görmesini önlemek için iğne takın.
  9. Yavaşça göz içine boya enjekte. Tipik olarak, Alexa 594, 647 ya da 488 (CTB-594, CTB-647 veya CTB-488, 5-6 mg / ml) konjuge β kolera toksin alt-biriminin anterogradely iz RGC girişleri için kullanılır. Doğanlarda (≤ P10) için 1-2 ul yeterlidir ve fareler için> P10-3 ul yeterlidir. Not: Alexa boyalar lizozomal bozulmaya karşı özellikle dayanıklıdır
  10. Bir kaç saniye için deliğe iğne bırakın ve daha sonra yavaş yavaş çıkarın.
  11. Aşırı sıvı emer ve dışarı sızmasını önlemek için boya bir pamuklu çubuk kullanın.
  12. Göze antibiyotik merhemli bir miktar uygulanır. Göz cerrahi açıldı, hafifçe birlikte göz kapaklarını yeniden konumlandırmak.
  13. Iki gözü enjekte ederseniz, diğer göz yordamı tekrarlayın.
  14. Bu Anesth kurtarmak için başlayana kadar aşağıdaki enjeksiyon (ler), bir ısı lambası altında veya ısı pad üzerinde fare bırakınÇSED.
  15. Temiz bir ev kafes fare dönün ve koloni dönmeden önce tamamen uyanık olduğundan emin olmak için monitör.

2.. Görüntüleme Doku hazırlayın

Bu doku hazırlanması protokol fagositler fluoresan işaretleri (örneğin, mikroglia için CX3CR1-EGFP) ile etiketlenmiş olduğu raportör fareler için kullanılır. Bir muhabir satır mevcut değilse, araştırmacı (Tartışma) doku bölümleri immunostain olabilir.

  1. ~ 24 saat enjeksiyondan sonra, fare kurban ve beyin teşrih.
  2. Gece boyunca 4 ° C 'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile dolu bir Falcon tüpüne beyin düzeltmek bırakın DİKKAT: PFA toksiktir. Bir davlumbaz veya bir aşağı doğru masaya kullanarak ve kişisel koruyucu ekipman giyerek solumaktan ve cilt maruz kalmaktan kaçınınız. Notlar: Fixation (≥ 4 saat) daha kısa olabilir. Yerine damla sabitleme Buna ek olarak,% 4 PFA perfüzyon kullanılan bir 2-24 saat damla düzeltme ile takip edilebilir. Bununla birlikte, perfüze karşılaştırılmasıSabit yenidoğan ve yetişkin beyin düşmesi d görüntü kalitesi veya nicellendirmesinde fark saptandı.
  3. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde beyin 3 kez yıkayın.
    1. Boş bir tartmak tekne içine beyin ve PFA dökün.
    2. Başka beyin aktarmak için bir spatula kullanın PBS ile dolu tekne tartın.
    3. Iki kez daha PBS yıkama beyin (transfer beyin iki PBS ile dolu tekneler tartın).
  4. % 30 sukroz çözeltisi ile doldurulmuş bir Falcon tüpüne beyin aktarın. Beyin borunun (24-48 saat) dibine batar kadar 4 ° C de sakaroz beyin bırakın.
  5. Beyin lavabolar kez, kesit için beyin hazırlamak. Aşağıdaki adımlar, dondurma aşaması ile bir kayar mikrotom kullanılarak 40 um Yüzen kesitlerin hazırlanması (a kriyostat da kullanılabilir) vardır.
    1. (DLGN için, beynin rostral ve kaudal parçaları kaldırmak) gerekli değildir beynin parçalarını kaldırmak için bir jilet kullanın.
    2. Sutyen FreezeKuru buz üzerine alüminyum folyo üzerine. Bu süre boyunca, mikrotom sahne dondurma ve 0.5 mi 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) ile, 24 oyuklu plakanın her doldurun.
  6. Dondurma sahnede (opak görünmelidir) dondurulmuş beyni monte edin.
    1. Sahneye optimum kesim sıcaklık bileşik (OCT) küçük bir miktar uygulayın.
    2. Ekim dondurmak başladığında, OCT beyin yatıyordu. Kesilecek beynin ucu (kuyruk tarafı yukarı bakacak DLGN için, örneğin) yukarı bakacak şekilde olmalıdır.
    3. Çok ince ezilmiş kuru buz ile beyin ve Ekim örtün.
    4. ~ 30 sn için beyin / Ekim kuru buz bırakın.
    5. Kuru buz kaldırmak için büyük bir boya fırçası kullanın. Beyin ve Ekim sahneye dondurulmuş olmalıdır.
  7. Ilgi (ROI) bölgesi ulaşana kadar dokusu ile kesit başlayın.
  8. ROI ulaşıldığında, bıçak bölümler çıkarmak ve 24-iyi plat bunları aktarmak için küçük bir boya fırça kullanınE 0.1 M PB (adım 2.5.2) içeren. Önce bıçak bölümleri çıkarılması için 0.1 M PB içinde ıslatarak ıslak boya fırçası tutun. Not: Bölümler, 4 ° C de bir gece boyunca 0.1 M PB bırakılabilir
  9. Bölümlerde toplanmıştır sonra, bir floresan mikroskop altında anterograd etiketleme görselleştirmek ve yatırım getirisini içeren bölümler seçmek.
  10. Küçük bir boya fırçası ile bir slayt bölümleri monte edin.
    1. Bir ücret mikroskop lamı 0.1 M PB küçük bir havuz uygulayın.
    2. PB havuzuna doku bölümü aktarın.
    3. Şark için PB ve boya fırça kullanın ve doku yayıldı.
    4. Aşırı PB fitil için bir Kimwipe kullanın. Bölümü kapalı esneklik önlemek için özen gösterin.
    5. Tamamen kurumaya bırakın.
    6. Her bölüme montaj orta küçük bir damla uygulamak ve (22 x 50 mm, No 1.5) üstünde bir lamel monte.
    7. Görüntüleme oturumu kadar -20 ° C'de oje ve mağaza ile slayt kenarları mühür. Not: görüntüleme ile beraberhazırlanması tavsiye edilir bir hafta içinde, saydam görüntüleme önce birkaç hafta boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

3.. Görüntüleme Doku

Tüm görüntüler dönen bir disk konfokal mikroskop (ultraview Vox dönen disk diyot lazer (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm ve 640 nm) ile donatılmış konfokal mikroskop) üzerinde elde edilir. Görüntüler de (örneğin, lazer tarama konfokal mikroskop, deconvolution, vb izledi epifluorescent mikroskop) yüksek çözünürlüklü z-yığınları elde etmek için yeteneği ile herhangi bir mikroskop üzerinde elde edilebilir. Çerçeve boyutu genellikle 1,000 x 1,000 piksel.

  1. 10X büyütme ROI bulun ve bir görüntü kazanır. Retinogeniculate sistemde mikroglianın görüntüleme için, ROI en medial DLGN bölümleri olduğunu.
  2. Yüksek büyütme Shift (60X Planı Apo amacı, NA 1.4, genellikle kullanılır =).
  3. 0.2 mikron z-adımı kullanarak fagositler içeren görüş ilk alan Edinmes.
  4. Hayvan başına fagositler içeren 15-19 daha fazla alan kazanmak.

4. Kantitasyonu (ImageJ) Görüntülerini hazırlayın

  1. ImageJ Open z-yığını.
  2. Görüntü menüsünde, Renk ve bölünmüş Kanalları gidin.
  3. Sardı malzemeyi içeren kanal (lar) için bir arka plan çıkarın.
    1. Yuttu malzeme (örneğin, presinaptik girdiler) içeren kanal penceresini seçin.
    2. İşlem menüsünden gidin ve Çıkart Arkaplan seçin. DLGN presinaptik girdilerin anterograde izleme için 10 piksel yuvarlanan bir top yarıçapı kullanın. Not: yuvarlanan topu yarıçapı ampirik olarak belirlenir. Bununla birlikte, genel olarak arka parçası olmayan görüntüde en nesnenin yarıçapı kadar büyük olmalıdır.
  4. Fagosit içeren kanalı Smooth.
    1. Fagosit (örneğin, mikrogliya) içeren kanal penceresini seçin.
    2. İşlem menüsünden ve sel gitEKT Filtreler, ortalama. 1.5 'lik bir ortalama filtre (bu sonraki adımda yüzey sunumuna için görüntüyü yumuşatır) kullanın.
  5. Fagosit içeren kanaldan arka plan çıkarın.
    1. Fagosit (örneğin, mikrogliya) içeren kanal penceresini seçin.
    2. (Ayarları ampirik kararlı olmak gerekir) çıkarma arka plan seçin, İşlem menüsünden gidin. EGFP-pozitif mikrogliada için 50 piksel yuvarlanan bir top yarıçapı kullanın.
  6. Görüntü menüsüne gidip Renk, Kanallar Birleştirme seçerek kanalları birleştirmek.
  7. (Bu hızlı render yüzey yapar, adım 5) birleşti dosyadan phagocyte içeren kırpma ROI.
    1. Araç çubuğunda dikdörtgen seçimleri aracını kullanarak ROI çevresinde bir kutu çizin.
    2. Görüntü menüsüne gidin ve Kırp seçeneğini seçin.
  8. (Adım 4.2) tekrar kanal bölünmüş.
  9. Kendi TIFF dosyası olarak her kanalı kaydedin.

5. Nicelik için resim hazırlamaImaris içinde

  1. Açık Imaris ve Ses simgesi sol üst menüde (Şekil 2) seçili olduğundan emin olun.
  2. Kırpılmış resmin açık ilk kanal (kanal herhangi sadece tutarlı olması ilk açılabilir).
  3. Diğer kanal (lar) ilave edin. Düzen menüsüne gidin, Ekle Kanallar ve dosyasında sonraki kanalı belirleyin. (Kalan kanallar için bu adımı tekrarlayın). Not:, rengini değiştirmek Display Ayarları penceresine gidin ve kanal adı (Şekil 3A) üzerine tıklayın. Bu rengi ayarlamak için bir diyalog kutusu açılacaktır. Görüntü Ayarı penceresi görünmüyorsa, Düzen menüsüne gidin ve Display Ayarı seçin.
  4. Piksel değerlerini ayarlayın. Düzen menüsüne gidin ve Görüntü Özellikler seçeneğini seçin. Bu pencerede, x, y, ve z piksel değerlerini (Bu değerler, mikroskop, objektif, kamera, ve z-adım edinimi bağlıdır ve görüntü elde etmek için kullanılan yazılım bulunabilir) ayarlayın.
  5. Adım 5.5 'a çok neden olurküçük resim. Yeniden boyutlandırmak için, sağ alt köşedeki Fit simgesi (Şekil 2) tıklayın.
  6. Görüntü Ayarı penceresinde, sol ve orta üçgenler kullanarak her kanal için parlaklık ve kontrastı ayarlayın.

Fagosit 6. 3 Boyutlu (3D) Yüzey Rendering

  1. Üst araç çubuğunda, aşmak modu (Şekil 3C) seçili olduğundan emin olun.
  2. Görüntü Ayarı penceresinde, fagosit kanal hariç tüm kanalları işaretini kaldırın. Bu görüş alanında bunları kaldıracağız.
  3. Yüzey Rendering simgesini (Şekil 2) tıklayın.
  4. Bir oluşturmak pencere sol alt (Şekil 4A) görüntülenir, emin Segment ROI bu ilk pencerede işaretlenmemiş olun. Altındaki mavi ileri düğmesini tıklatın.
  5. Yumuşatma ayarlayın.
    1. Bir sonraki pencerede, aşağı açılır menüden (Şekil 4B) den fagosit kanal seçin. Bu ayarlaryüzeyli olacak ve (0,1 mikron süzme genellikle mikrogliada için kullanılır) ampirik olarak tespit edilmelidir ayrıntı miktarı.
    2. Mutlak eşikleme seçin.
    3. Altındaki mavi ileri butonuna tıklayın.
  6. Eşik görüntü.
    1. Görüntü (Şekil 4C) uygun şekilde su yüzüne kadar histogram ve sürükleme tıklayın. Bu floresan resmi üzerine bindirilmiş gri yüzeyler doğru bir yüzey gösterimi sağlamak için görüntü çevirerek ampirik olarak belirlenir. Notlar: döndürme, ekran (Şekil 3B) sağ üst tarafındaki Pointer menüde navigasyon seçeneğini tıklatın ve döndürmek için görüntüyü basılı tutun. Orijinal yönüne Görüntüyü döndürmek için, öğesini seçin Origin Alttan Görünüm menüsünden Sol.
    2. Altındaki mavi ileri butonuna tıklayın.
  7. Bir sonraki pencerede, görüntü çok gürültülü olmadıkça vb büyüklüğü, herhangi yüzeyleri süzmek için bir seçenek var, filtre ve bir silmeyinotomatik olarak görünür y filtreler. Fagosit render yüzeyini bitirmek için altındaki yeşil oku tıklatın. Sekmeleri yeni bir dizi (Şekil 5) görünecektir
  8. Gerektiğinde, ilgi konusu fagosit bir parçası olmayan herhangi bir yüzey silme.
    1. Seç seçenek Pointer menüsünde (Şekil 3B) seçili olduğundan emin olun.
    2. O sarı döner böylece silinecek herhangi bir yüzey tıklayın. Ctrl tuşunu basılı tutarak birden fazla yüzeyleri silmek için, yüzeyler üzerine tıklayın.
    3. Kalem sekmesi altında Sil'i tıklatın.
  9. Seçip bir yüzeyi içine fagosit tüm yüzeyleri birleştirme.
    1. Huni (; Şekil 5C yani Filtre sekmesi) tıklayın.
    2. Ekle 'yi tıklatın.
    3. , Herhangi bir filtre seçin kadar (tüm yüzeyler sarı olmalı) sola histogramı sürükleyin.
    4. Geri Kalem sekmesine gidin ve birleştirmek tıklayın.
  10. Grafik sekmesine gidin (Şekil 5A (Şekil 5D) seçin. Birden parametreleri görüntülemek için, sol alt Anahtarı simgesini (Şekil 2) gidin ve kaydetmek için parametreleri seçin.
  11. Fagosit hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin.

Yuttu Malzeme 7. 3D Yüzey Rendering

  1. Fagosit tarafından yutulmuş olan malzeme için yeni bir kanal oluşturun.
    1. Fagosit yüzey seçili iken, kalem sekmesine tıklayın.
    2. Tüm Maske tıklayın.
    3. Görünen diyalog, yuttu malzeme (; Şekil 5B örneğin, presinaptik girişlerin anterograde izleme) karşılık kanalı seçin.
    4. Maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanalını kontrol ve Tamam'a basın.
    5. Yeni bir kanal sardı olmuştur yalnızca materyali içeren ve içinde olan Görüntü Ayarı penceresinde görüntülenirphagocyte.
  2. Yüzey işlemek toplam sardı ve nonengulfed malzeme içeren kanal.
    1. Yüzüne edilecek kanal hariç Görüntü Ayarı penceresinde tüm kanalları işaretini kaldırın ve fagosit için oluşturulan yüzey işaretini kaldırın.
    2. Yine Yüzey işleme ikonuna tıklayın (adım 6.3) ve (6,4-6,11 adımlar) fagosit için anlatıldığı gibi aynı adımları kullanarak kanal için bir yüzey oluşturmak. Notlar: önce (adım 6.5; Şekil 4B) yumuşatma ve eşikleme için doğru kanalı seçmek için emin olun. Eşik değerini not edin (; Şekil 4C adım 6.6). Bu değer aynı zamanda yüzey sunumuna sonra elde edilebilir (Wand sekmesi; Şekil 5A) tamamlandı.
  3. Toplam sardı ve non-yuttu malzemenin hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin.
  4. Yüzey yuttu malzeme (fagosit içinde malzeme) vermekteyiz.
    1. Sadece floresan görselleştirmesardı malzemenin yeni bir kanal (adım 7.2.1.)
    2. Yukarıdaki gibi aynı adımları (7,2-7,3 adımları) izleyin. Notlar: (adım 7.1 oluşturulan yeni kanalı seçin) öncesinde yumuşatma çekme menüden doğru kanalı seçmek için emin olun. Eşik penceresinde, el toplam sardı ve non-sardı malzeme (adım 7.2.2 bakınız) render için kuruldu eşik değerini girin.
  5. Yuttu malzemenin hacmini kaydedin ve devam etmeden önce dosyayı kaydedin.

8. View Alan Toplam Hacim hesaplayın

  1. Herhangi bir kanal için yeni bir yüzey oluşturmak.
  2. Tüm alan yüzüne böylece eşikleme penceresinin (adım 6.6), histogram sola doğru kaydırın.
  3. Tüm alan yüzey bitirmek ve (6,7-6,11 adımlar) hacmi rekor.
  4. Dosyayı kaydedin.

9. Fagosite Malzeme Tutar Hesapla

  1. Yoğunluğunu hesaplamakaşağıdaki algoritmayı kullanan toplam sardı ve non-sardı malzemesi kanal:
    Field (adım 8) Toplam yuttu ve Non-sardı Malzeme hacmi (7.3 adım) / Cilt.
  2. Aşağıdaki algoritmayı kullanarak, hücre başına% yutulmasına hesaplayın:
    (Sardı Malzeme hacmi (7.5 adım) / fagosit (adım 6.11) Toplam Hacmi) x 100
    Notlar: hücre boyutuna farklılaşmaların hesaba katılması için, veriler, fagosit toplam hacmine göre normalize edilir. Aşama 9.1 numaralar alanları arasında oldukça değişkendir, bu 9.1 'de hesaplamaya adım 9.2 verileri normalize etmek için gerekli olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Son zamanlarda biz, gelişmekte olan retinogeniculate sisteminde presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına (Şekil 1) 7 görselleştirmek ve ölçmek için bu yutulma deneyi kullanılmıştır. CX3CR1-EGFP heterozigot farelerin RGCs anterogradely sırasıyla, sol ve sağ gözlerinin içine CTB-594 ve CTB-647 ile takip edildi. Bu izleme takiben, DLGN içinde EGFP-pozitif mikrogliya görüntülendi. Bu görüntüler daha sonra hacim ölçümleri için yüzey render edildi.

Bu tekniği kullanarak, DLGN (P5) gelişimsel sinaptik biçimlenme bir zirve döneminde, presinaptik girişler mikroglialar (Şekil 6) tarafından yutulmuş olduğunu bulundu. Yeniden büyük bir miktarda (P9) hemen hemen tamamlandığında gibi az 4 gün sonra gibi, girişlerin sardı miktarında dramatik bir azalma yoktur. Buna ek olarak, yutulma ve budama klasik tamamlayıcı kademeli ait proteinler mice defıcient in bozulduğu(Veriler gösterilmemiştir), nöronal ateşleme manipülasyonu aşağıdaki gibidir (Resim 6) hem de 7.

Şekil 1
RGC presinaptik girdilerin 7 mikrogliya aracılı yutulmasına değerlendirmek için Şekil 1.. Stratejisi. A) anterograd izleme stratejisinin şematik. Sol ve sağ göz RGH girişler sırasıyla CTB-647 (mavi) ve CTB-594 (kırmızı), ile takip edilmektedir. Girdilerin mikroglia-aracılı (yeşil) yutulma sonra değerlendirilir. B) doğum sonrası 5. gün (P5) fare DLGN temsilcisi düşük büyütme görüntüyü sol (mavi) ve sağ (kırmızı) göz girişler arasında anterograde izleme takip. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Ci) A mikrogliya (EGFP, yeşil) sol (mavi sınır bölgesinden örneklenmiş) ve sağ (kırmızı) göz girişi (B inset). Cii) ciii) Yüzey işleme çıkarılır ve RGH girdiler sardı olmuştur. P5 DLGN dan Grid çizgisi artışlarla = 5 mm. Di) bir temsilci mikrogliya (yeşil, EGFP). RGC girişler CTB-594 (kırmızı) ile etiketli ve lizozomlar, anti-CD68 (mavi) ile etiketli. Dii) mikrogliya hacmi dışında tüm CTB floresan kaldırıldı açığa mikrogliada içinde RGC girişleri (kırmızı) ve lizozomları (mavi) yuttu . beyaz oklar) Div-v) CD68 (Div) ve CTB (DV) kanal başına;. (yeşil) Dlll) En RGH girişleri (kırmızı) tamamen CD68-pozitif lizozomlarında (mavi içinde lokalize. Ölçek çubuğu = 10 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.


Şekil 2.. Imaris yazılımı simgeler.

Şekil 3,
Şekil 3. Yazılımı Genel navigasyon pencereler. A) Ekran Ayar Penceresi. B) Pointer Penceresi. Seçin spesifik yüzeylerinin seçim sağlayacaktır. Gezinmek görüş alanında bir görüntünün dönme. C) Bu içinde olması için gerekli olan hacim render yüzey için modu Aşan sağlayacaktır.

Şekil 4,
Yazılım Şekil 4. Yüzey işleme. A) penceresi oluşturun. B) Pürüzsüzpenceresi ing. . C) floresan görüntü yüzeyi eşiklendirilmesi (sarı renkte) açılır menüden yüzey kanalı seçin. Kırmızı kutu ile vurgulanır toplam yuttu ve non-sardı malzeme için kaydedilmesi gereken eşik değerdir. Bu sayı eşik daha sonra uygulanan ve yuttu malzeme yüzey olacaktır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Yazılımında hacim ölçümlerini elde edilmesi. Aşağıdaki yüzey sunumuna görünür A) Sekmeler. Maske tüm fagosit içinde yuttu malzemeyi görselleştirmek özelliğini metin. B'de tanımlanan Değnek, Kalem, Huni ve Grafik sekmeleri) Not. Seçilen kanalı Not (yekutusunda llow). C) Huni / Filtre sekmesi altında özellik sarı görünür böylece sola histogram tüm yol kaydırarak alanında tüm yüzeylerin seçimi sağlar. Herhangi bir filtre Grafik sekmesi altında bu. D) için seçilebilir, hacim ölçümleri elde ve kaydedilebilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 6,
(Floresan görüntü, Şekil 1 'de gösterilmiştir P5 ikinci Şekil 6,. Örnek veriler 7. A) Örnek yüzey-işlenmiş mikroglia), P9, P30 ve fare DLGN. Büyümüş takmalar siyah noktalı çizgi ile gösterilen.RGC girdilerin Grid çizgisi artışlarla = 5 um. B) yutulma anlamlı ileri yaşlarda (P9 ve P30) karşı DLGN (P5) pik Budama sırasında artar. * Tamamlayıcı alıcısı 3 defıcient farelerin P <0.001 tek yönlü ANOVA, n = 3 fareler / yaş. C) Mikroglia (KO, siyah bar) WT littermates (beyaz çubuk) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az RGH girişleri yutmak. Tüm veriler WT kontrol değerleri normalize edilmiştir. * P <Student t-testi ile 0.04, n = 3 fare / genotip. Tüm hata çubukları sem temsil resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Doğru fagositoz ölçmek amacıyla, yuttu malzeme lizozomal bozulma oluştu kez araştırmacı bunu görselleştirmek şekilde etiketlenmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü görüntü tüm hücre hacmini görselleştirmek ve içeriğini ölçmek için araştırmacı sağlayacak bir yazılım kullanımı ile, ardından gereklidir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon ile birlikte yuttu malzemeyi etiketlemek için Alexa boyalar konjuge CTB kullanarak phagocyte-aracılı yutulmasına ölçmek için son derece güvenilir ve kantitatif yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir şekilde gelişen fare beyin (retinogeniculate sistemi) 7 sinaptik yeniden geçiren presinaptik girişlerin mikroglia aracılı yutulmasına analiz etmek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Buna ek olarak, unde farklı gelişim çağlar boyunca yutulma ince değişiklikleri ayırt edebilir, son derece hassas bir teknik olduğu kanıtlanmıştırr olmayan patolojik durumlar ve vahşi tipli ve nakavt fareler arasında. Küçük ayarlamalar ile, bu protokol time lapse görüntüleme canlı dokularda yutulmasına çalışmaya adapte edilebilir. Buna ek olarak, bu protokol hastalıkta fagosit-nöron etkileşimleri incelemek için uygulanabilir.

Uyarılar

Bu deneyde en yararlı yönlerinden biri, bir lizozomal bozunma yolağı girdikten sonra görünür kalır bir şekilde nöronal projeksiyonları etiket yeteneğidir. Nöron etiketli çünkü Ancak, fagosite edilmiş hücrenin hangi kısmını ayırt etmek zor olabilir. Bu elektron mikroskobu 7 ile birlikte (DLGN olmayan bir sinaptik bölgesine karşı, örneğin, sinaptik bölge) çok dikkatli bir şekilde bölgesel analiz gerektirir. Buna ek olarak, bu nöronal hücre gövdeleri ve çıkıntılar aynı bölgede bulunan diğer beyin bölgelerinde daha zor olabilir. Ancak, alternatif etiketleme stratejiler bel (bkz. istihdam edilebilirow). Üstelik, ışık mikroskobu çözünürlük sınırları, tek bir sardı malzeme miktarını olduğundan fazla ihtimali vardır. Bunun bir sonucu olarak, bakım sardı malzeme lizozomlara içinde olduğunu doğrulamak için dikkat edilmelidir. Bu nedenle biz, mikroglia içinde 3 boyutlu işleme ve tahlil parametrelerini doğrulamak için ortogonal incelemeler lizozomlar etiketlemek için anti-CD68 kullanın.

Hücre Türleri

Mikroglia ek olarak, bu yöntem aynı zamanda beyin (örneğin, astrositler) ve periferal sinir sistemi ve bağışıklık sistemi (örneğin, perisynaptic Schwann hücreleri, makrofajlar, vb) Diğer fagositoz rolünü analiz etmek için uygulanabilir. Alexa boya CTB konjuge çok çabuk en hücreler tarafından alınır, Buna ek olarak, benzer bir etiketleme strateji, beyin ve diğer organ sistemleri boyunca sardı malzeme etiketlemek için kullanılabilir.

Yuttu Malzeme Etiketleme

Bir al olarakAlexa boyalar konjuge CTB için ternatif, biz yuttu malzeme 7 etiketlemek için aşağıdaki stratejiler kullanmışlardır: 1) RGCs bir floresan protein (örneğin, vb tdTomato, EGFP,) ile etiketlenmiş edildiği Floresan muhabiri fareler. Dekstran konjüge edilmiş bir pHrodo boya ile 2) anterograd işaretleme, bir lizozom olan sadece bir kez floresant bir boya. Bu farklı stratejiler kullanarak, görselleştirme ve mikroglialar içinde yuttu presinaptik girişlerin ölçümü aynı görüntüleme ve sayısallaştırma teknikleri performedwith olabilir. Ancak, Alexa boya konjugeler nedeniyle hidrolizları 7,21 lizozomal Alexa boyanın yüksek direnci en sağlam vardır. Buna ek olarak, antikorlar (örn. anti-VGlut2, bir presinaptik veziküler protein) ile sardı malzemenin teşebbüs etiketleme edilmiştir. Ancak bu çoğu proteinler hızla lizozomlarında kez bozuldu ki verilen algılama nispeten güvenilir bir yöntemdir. Bu düşük olması nedeniyle floresan ayırt etmek zordurarka plan üzerinde protein bozulması.

İkinci Hayvanlar

Mevcut protokolde, mikrogliya floresan floresan muhabiri fareler (CX3CR1-EGFP) 22 kullanılarak genetik olarak etiketlenir. Ancak flüoresan raportör yapılan genetik ifadesinin karşı antikor etiketleme gerekli olduğu durumlar vardır. Floresan muhabiri fareler ilgi fagosit için mevcut değildir Örneğin, farelerin kullanılması gerekli, ya da araştırmacı bir floresan raportör fare hattı içine geçmeden nakavt fareler bakmak istiyor. Bu gibi durumlar için, fagositler immünohistokimya kullanılarak etiketlenebilir ve veri flüoresan raportör fareler 7 kullanılarak yapılan deneylerden elde edilen sonuçlar kıyaslanabilir. Doku kesit ardından, biz genellikle yüzen bölümler 7 için bir standart immünoboyama protokolünü kullanır. Bu, tüm hücre etiket bir proteine ​​karşı bir antikor ve seçmek önemlidirOnun süreçler. Örneğin, etiket mikroglia için, anti-Iba1 kullanılabilir.

Geniş Uygulamalar: Canlı Görüntüleme ve Hastalık

Bu protokol, sabit doku analizine dayalı iken, hafif değişiklikler canlı görüntüleme tarafından satın görüntülerde aynı analizi sağlayacak. Bir zaman atlamalı görüntüleme oturumu takiben, sonraki z-yığınlar, bu protokolde 4-9 adımlarının aynısı işlenebilir. Biz sağlıklı CNS'de gelişim sırasında sinaptik yeniden sinaps yutulmasına görselleştirmek için bu protokolü uyguladık iken Ayrıca, bu protokol, aynı zamanda hastalık modellerinde uygulanabilir. Özellikle, bu protokol, omurilik yaralanması, Alzheimer hastalığı, vb 12,14-19,23 ilişkili erken sinaps kaybı aşağıdaki gibi sinaps kaybı ve yenilenme durumunda olduğu gibi sinaps önemli yeniden tabi ettiği hastalıklar, çalışma için kullanılabilir - 26. Buna ek olarak, bir de ki phag hastalıkların incelemek için bu teknik adapte edebilirsinaps başka malzemeden ocytosis bu mikroglia / miyelin kılıfını bozan hastalık miyelin makrofaj aracılı yutulma (örneğin, multipl skleroz) ve Alzheimer hastalığı 5,6,27-29 beta-amiloid yutulma gibi, tarif edilmiştir.

Sonuç olarak, burada açıklanan yutulma deney, bunların hücre içi ortam ile phagocyte etkileşimleri çalışmak için uygun, tekrarlanabilir ve hassas bir teknik sunuyor. Önemlisi, bu tahlil kullanımlar ve nörobilim topluluğu yanı sıra diğer organ sistemlerinde çalışan bu hizmet edecek yetenekleri geniş bir yelpazesine sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

,,, NRSA (DPS F32-NS-066698); Çalışma Smith Aile Vakfı (BS), Dana Vakfı (BS), John Merck Bilginleri Programı (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) hibe tarafından desteklenmiştir Nancy Lurie Marks Vakfı (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Görüntüleme Çekirdek).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat pad Vet Equip, Inc. 965500 
Warm water source for heat pad Kent Scientific TP-700
Stereo microscope DSC Optical Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
Sliding microtome with freezing stage Leica SM2010 R
Microtome blade Leica 14021607100
Fluorescent dissecting microscope Nikon SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
Spinning disk confocal microscope Perkin Elmer UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton gas tight syringes Hamilton 80030 Use a different syringe for each color dye/tracer
Hamilton needles Hamilton 7803-05, specifications: blunt, 1.5"
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) Invitrogen 488: C22841 Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647)
594: C22842
647: C34778
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-50TAB
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) Bausch & Lomb 24208-780-55
30.5 G needle Becton Dickinson 305106
Spring scissors Roboz RS-5630
Cotton-tipped applicator Fisher 23-400-125
Paraformaldeyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute 16% to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment.
Dissection tools – scissors, forceps, spatula Small scissors: Fine Science Tools Small scissors:14370-22
Large scissors: Roboz Large scissors: RS-6820
#55 forceps: Fine Science Tools #55 forceps: 11255-20
Spatula: Ted Pella, Inc. Spatula: 13504
Sucrose Sigma S8501-5KG Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)
OCT Compound VWR 25608-930
Weigh boat USA Scientific 2347-1426
24-well plates BD Biosciences 353047
Sodium phosphate monobasic Sigma S6566-500G Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH2O and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH2O. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH2O
Sodium phosphate dibasic  Sigma S5136-500G
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 VWR 48393 194
Charged microscope slide VWR 48311-703
Vectasheild Vector Laboratories H-1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339, (6116), 156-161 (2013).
  3. Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31, (45), 16064-16069 (2011).
  4. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10, (11), 1387-1394 (2007).
  5. Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  6. Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14, (11), 1189-1197 (2007).
  7. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, (4), 691-705 (2012).
  8. Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274, (5290), 1133-1138 (1996).
  9. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
  10. Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7, (4), 327-332 (2004).
  11. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10, (9), 647-658 (2009).
  12. Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60, (2), 287-305 (2009).
  13. Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13, (5), 492-505 (2007).
  14. Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38, (2), 476-481 (2010).
  15. Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
  16. Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235, (1), 133-141 (2012).
  17. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
  18. Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235, (1), 142-151 (2012).
  19. Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
  20. Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61, (1), 24-36 (2013).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21, (7), 1282-1292 (2010).
  22. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  23. Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease. Mol Neurobiol. 37, (1), 73-82 (2008).
  24. Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
  25. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53, (3), 337-351 (1016).
  26. Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci. 33, (11), 513-523 (2010).
  27. Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. (2012).
  28. Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21, (1), 65-72 (2003).
  29. Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24, (2), 261-268 (1999).
Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).More

Schafer, D. P., Lehrman, E. K., Heller, C. T., Stevens, B. An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (88), e51482, doi:10.3791/51482 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter