Introduction
Optogenetics har revolutioneret systemer-niveau neurovidenskab i sin søgen efter de neurale kredsløbselementer køre normale og sygdomsrelaterede relevant adfærdsmæssige tilstande. Opdagelsen af, at lysfølsomme mikrobielle opsiner 1 kan udtrykkes funktionelt i mammale celler billede platformen for at bruge lys til at opnå en hidtil uset kontrol af neural aktivitet med høj rumlig og tidsmæssig præcision 2. I modsætning til traditionelle elektrofysiologiske eller farmakologiske metoder til manipulation af neural aktivitet, optogenetics giver mulighed for kontrol af specifikke celletyper (baseret på genetisk identificere eller fysisk projektion) inden heterogene populationer og fysiologisk relevante tidshorisonter. Den efterfølgende indførelse af en neural-optisk interface forudsat et praktisk redskab til levering af lys til at opføre dyr 3. Det har givet mulighed for real-time modulation af definerede neurale kredsløb i vågen opfører gnavere for at kausalt testerolle af disse neurale kredsløb i styringen af adfærdsmæssige tilstande relevante for neurologiske og psykiatriske sygdomme 4-6. Optogenetics derfor er et effektivt redskab til indføring i alle laboratorier interesseret i at undersøge den funktionelle sammenhæng mellem hjernens aktivitet og adfærdsmæssige eller fysiologiske foranstaltninger i dyremodeller.
Vellykket design og afslutning af en optogenetic eksperiment involverer forskellige trin og overvejelser (se figur 1). Målet med den nuværende protokol er at give den enkelte med de værktøjer og komponenter, sammen med den teoretiske og praktiske viden, som er nødvendig for at udføre optogenetic stimulation i vågen opfører gnavere. I øjeblikket er der to dominerende bølgelængdeområder beregnet til aktivering mikrobielle opsin kanaler: i det blå spektre (almindeligvis 473 nm) og grøn-gul spektre (almindeligvis 532 eller 591 nm). Begge lasere og lysemitterende dioder (LED), kan anvendes som lyskilder til deliver specifikke bølgelængder af lys til hjernevæv. Den ikke-kohærent lys, der udsendes af lysdioder, gør det imidlertid effektiv lystransmission svært, når kobling ind i de små kerne fibre, der er nødvendige til in vivo gnaver stimulation. Om passende laser samling er et afgørende første skridt og vil afhænge af den tilsigtede anvendelse af optogenetics i laboratoriet. Den nuværende protokol beskriver to grundlæggende konfigurationer, der afviger i deres lette montering og brug: single pre-koblede lasere og dobbelt lasersystemer (se figur 2). Enkelt laser systemer, der er præ-koblet af fabrikanten er i det væsentlige klar til at gå ved ankomst med lidt at ingen opsætning nødvendig, men har den ulempe, minimal slutbruger tilpasning. En dobbelt lasersystem muliggør levering af to forskellige bølgelængder ned i samme fiber. Dette vil blive stadig vigtigere med fremkomsten af kombinatorisk optogenetics hvorved forskellige bølgelængder kan bruges til at aktivere / hæmme sondringt celletyper, der er rumligt co-lokaliseret. Det er også vigtigt til brug med bi-stabile trinfunktion opsiner hvor fotostrømmen indledes og afsluttes ved blå og gule lys henholdsvis 7,8. Dual laser systemer er også tilpasses som brugeren kan tilføje eller fjerne komponenter (fx eksterne skodder, beam filtre, inline power meter) fra strålebanen efter behov. På grund af sin alsidighed, anbefales den dobbelte laser opsætning hvis optogenetics bliver en fortsat redskab i laboratoriet. Kobling af lasere kan dog være en udfordring og så en hurtig, nem og pålidelig kobling mekanisme er fastsat i denne protokol. Bemærk, denne protokol detaljer samling af optiske komponenter og udnytter patchkabler og komponenter, der er optimeret til trin-indeks multimode fibre med en 200 um kerne og en numerisk åbning (NA) på 0,22. Forskellige centrale størrelser og NA kan købes, men alle komponenter bør ideelt set passer i form af kernestørrelse og NA at undgå lystab på fiber forbindelsespunkter. Alternativt, ved en fiberforbindelse kan lys passere fra en mindre til en større kerne størrelse; og / eller fra et lavere-NA til en højere NA fiber uden yderligere tab.
Tethering strategier forudsat at mulighed for samtidig stimulering af flere mus for high-throughput adfærdsmæssig testning. De protokoller antager brug af kroniske implanterbare fibre til adfærdsmæssige test, men kan ændres til akutte stimulationsregimer. Akut implanterede fibre er fordelagtige til at kombinere optogenetic stimulering med farmakologisk manipulation, eftersom den samme kanyle kan anvendes til at levere lægemidler og spidsen af en optisk fiber til den samme placering. Anvendelsen af kronisk implanteret fibre, dog anbefales til flere dages adfærdsmæssig testning, så det reducerer vævsbeskadigelse forbundet med gentagen indføring og fjernelse af fibre og forøger nøjagtigheden i form af ensartet placering af fibre tilvæv belysning 3. Når det kombineres med at tøjre konfigurationer der er beskrevet her, kan adfærd registreres pålideligt på tværs af flere dage. Faktisk har pålidelig lystransmission er rapporteret måneder efter fiber implantation 9 sådan, at kronisk stimulering og adfærdsmæssige test paradigmer kan teoretisk set blive udført på tværs af flere dage og uger. Supplerende bemærkninger vedrørende hardwarekomponenter er blevet tilføjet til protokollen for at tillade læseren valg i det bedste produkt, der passer til deres individuelle behov, herunder omkostningseffektive alternativer og produkter, der kan gøres in-house. Vigtige tips, der er nyttige under opsætning og implementering er også til rådighed.
Protocol
! ADVARSEL: Denne protokol indebærer anvendelse af klasse 3B lasere og vil kræve ordentlig uddannelse og retningslinjer for sikkerhed, der skal følges. Beskyttelsesbriller skal bæres på alle tidspunkter, når de opererer lasere, procedurer justering præsentere en særlig høj risiko. Kontakt laser udbyder for at bestemme den brille, der vil give maksimal dæmpning for en given laser. Hvis det er tilgængeligt, tilmelde en institutionel laser sikkerhed-kursus. Brug aldrig en laser uden passende sikkerhed briller og uddannelse.
1. Laserapparater Opsætning
Hvor det er relevant, er trinene i afsnit 1 betegnet som (A) eller (B) at skelne mellem enkelt eller dobbelt lasersystemer hhv.
- Vedhæft og fastgør lasere til breadboard. Breadboards er fremragende varmeledere og fungere som en køleplade for at forhindre skader på interne laser komponenter med længere tids brug.
- (A) Fastgør pre-koblede lasER til en 10 "x 12" breadboard (eller efter behov) med ¼-20 "cap skruer og skiver (figur 2A). Hvis breadboard huller ikke passer med laser monteringshuller, bruge små 'bordklemmer' for at sikre laser til breadboard.
- (B) Hvis de 2 lasere, der skal anvendes har meget forskellige stråle højder (> ~ 1 cm), bruge små 4 "x 6" Koblingsdæk at skabe en platform for en af lasere. Vedhæft disse bestyrelser til de vigtigste store 12 "x 18" breadboard hjælp ¼-20 "cap skruer med skiver, og sæt laseren til de mindre plader ved hjælp af cap skruer eller bordklemmer som vist i figur 2B. Sæt den anden laser direkte til breadboard hjælp cap skruer eller en variabel højde bordklemme.
Kritisk Trin: Koblingsdæk, skruer, og optiske komponenter kan købes som kejserlig eller metrisk så være konsekvent, når de køber varer; standard for denne protokol er imperial. - (A)Vedhæft en tyk-dobbeltvægget fladskærms-spalter / fysisk kontakt (FC / PC) patch kabel til kobling (omtalt som en ledningen til, se figur 3), som er fysisk knyttet til forsiden af laseren (figur 2A).
- (B) Tråd kobling på en ¾ "optisk stilling, så epoxy samlingen mellem koblingen og toppen af stolpen ved hjælp af JB Kwik eller lignende epoxy, for at forhindre at løsne og forskydning under brug. Fastgør post til breadboard (som breadboard hullerne ikke altid vil line op med den nødvendige placering af optiske komponenter, en stillingsindehaver, søjlefod adapter, og fastspænding gaffel anvendes til at sikre koblingen optiske stilling på plads). Vedhæft en tyk-dobbeltvægget patch kabel (ledningen til) til bagsiden af koblingen.
- (B) Indsæt den første styring spejl for den blå laser i den kinematiske holder, og fastgør den til breadboard hjælp af en ¾ "optisk indlæg. Vedhæft dette indlæg til en base ADAPter og fastspænding gaffel. Placer fastspænding gaffel og skrive montage direkte foran den blå laser med spejl vinklet ved 45 ° for at styre laseren mod dichroic spejl. Brug gittermønster af huller på breadboard som en grov tilpasning guide. Når groft placeret, skal du bruge et ¼ "-20 cap skruen for at fastgøre fastspænding gaffel til breadboard (se figur 2B, C).
- (B) Sæt dichroic spejl i en kinematisk holder og vedhæft den til en 1 "optisk post og sikre direkte til breadboard. Placer dichroic spejl længst til venstre af, og i overensstemmelse med den blå laser spejl. Vinkel det dikroiske spejl i en 45 ° vinkel, således at blåt lys reflekteres fra det første spejl reflekteres ind i koblingen, stram derefter skruen fastgørelse af kinematiske holder til stillingen (se figur 2B, C).
- (B) Sæt den første styring spejl for den gule laser til en ¾ "optisk indlæg. Fastgør optical post til en base adapter og fastspænding gaffel. Placer fastspænding gaffel og post-ensemble direkte foran den gule laser og vinkel spejlet i en 45 ° vinkel, så gult lys vil være rettet mod den anden styring spejl. Fastgør fastspænding gaffel på plads med et ¼ "-20 cap skrue og spændeskive.
- (B) Sæt den anden styring spejl for den gule laser til en 1 "optisk indlæg. Vinkel spejlet, således at det gule lys stråle fra det første spejl vil blive reflekteret gennem den dikroiske og ind i koblingen (figur 2C). Fastgør indlæg direkte til breadboard og spænd monteringsskruen når spejlet er vinklet korrekt. Justeringer Fin spejl vil blive foretaget ved hjælp af de kinematiske spejl mounts i et senere trin.
- (B) Sæt en neutral tæthed filter hjul til en ¾ "optisk indlæg og placere stillingen til en stillingsindehaver fastgjort til et monterings base. Fastgør ensemble til breadboard mellem den første og second gule spejle ved hjælp af en enkelt ¼ "-20 cap skrue. Dette hjul bruges til at justere styrken af gul laserlys nå koblingsanordningen.
Tip: før fastgørelse dem til basen Individuelt stram alle komponenter (såsom skruer, der holder kinematiske spejl holdere til toppen af stillinger, og trådene holder basen adaptere til bunden af stillinger). Brug en aksel af en lille unbrakonøgle i de leveres gennem huller i optiske stillinger for at få nok moment. Dette vil forhindre komponenter kommer løs under brug, hvilket nødvendiggør kursjustering. - Vedhæft en FC / PC til FC / PC L-beslag adapteren til breadboard.
- Valgfrit: Fastgør en 1 x 2 50/50 mini terning fiber splitter direkte til breadboard til samtidig in vivo stimulering af to eller flere dyr. Derudover kan håndtag tilsættes for at hjælpe med bevægelsen af breadboard samling (som set i figur 2A).
2. Laser Kobling (Berøringsfri Style Coupling)
Dette afsnit angår dual-laser set-up (figur 2B). Juster den indre blå laser sti før tilpasse den ydre gule laser sti.
! ADVARSEL: Brug en lav lys effekt kobling (~ 1 mW) for at sikre øjet sikkerhed. Brug beskyttelsesbriller for at tænde laseren, og indtil lysintensiteten måles og vurderes at være sikker.
- Sæt kontakterne på bagsiden af laseren til "Curr" (strøm) og transistor-transistor logiske tilstand (TTL) + for konstant belysning (i modsætning til analog tilstand). Sørg for, at strømmen knop på forsiden af føreren står på nul. Tænd laseren ved at tænde føreren først og derefter laser tasten.
- Langsomt justere effekten knop placeret på forsiden af laserdriveren så ~ 1 mW laserlys bliver udsendt. Vent 10 - 15 min (eller som angivet af fabrikanten) til laser til at varme op.
- Slut fiberoptiske kabel tester direkte til free ende af kobling patch kabel og tænd for kabeltester (figur 3A). Juster vinklen af kobler således at den røde stråle bevæger lige tilbage mod midten af det dikroiske spejl. Strålegangen af det røde lys, der udsendes fra kablet testeren er den præcise sti, som den indkommende laserlys skal følge for at blive koblet til laseren.
- Udfør en grov justering: Brug laterale og horisontale knapper på de kinematiske spejle til at styre strålen af laserlys ind i koblingen. Kan være nødvendigt at løsnes lidt repositionere spejle og kobleren soklen klemmer. De kinematiske mounts skal stadig have nogle rejser til rådighed for yderligere finjusteringer. Må ikke være bekymret, hvis der ikke blåt lys der udsendes fra koblingen-påmonterede kabel på dette tidspunkt.
- Placer et enkelt stykke halvgennemsigtigt papir direkte foran det dikroiske spejl, mellem den dikroiske og kobler. Der vil være både en blå og ared prik på dette papir fra laseren og kabeltester, hhv. Brug papir, der er gennemsigtig nok til at se både de røde og blå pletter samtidig fra samme side af papiret.
- Foretag fine justeringer af første styretøj spejl (dvs. den ene tættere på laser, ikke dichroic) ved forsigtigt at justere de laterale og horisontale knapper for at tilpasse midten af den røde prik med den blå prik.
- Flyt papiret tilbage mod koblingen, således at det er direkte foran kobleren og justere knapper på den anden (dvs. dikroisk) spejl at tilpasse laserstrålen med rød stråle.
- Gentage over trin 2.6 & 2.7 indtil midten af de blå / gule og røde bjælker er flugte i begge stillinger (dvs. indtil de røde og blå bjælker er kolineære).
- Fjern kabeltester fra ledningen til. Laserlys skal nu udsendes fra slutningen af koblingen patch kabel.
- Determine koblingseffektivitet ved at måle lyset udstråles fra fiber spidsen af koblingen patch kabel ved hjælp af en energimåler. Brug 500 mW indstilling for strømmen målerens fotodiode og ændre bølgelængden indstilling (λ) til blå (473 nm) eller gul (635 nm) spektrum lys afhængig af laser, der anvendes.
- Anbring fiberspidsen vinkelret fotodioden at opnå en effekt læsning. Sammenlign lyseffekten ind i kobleren til lys, der udstråles fra fiberenden. En kobling effektivitet> 80% betragtes som meget god. Meget små yderligere tilpasninger af den anden styring spejl kan nogle gange lidt bedre kobling. I almindelighed, når lyskeglen fra enden af koblingen fiber er en lille, stram, central stedet (uden ringe omkring det), kobling effektivitet i fiberkernen er optimal.
- Gentag trin 2,1-2,11 for gul laser kobling, undtagen bruge de to styrespejlene for gul laser (se figur 2C). Gør ikket justere placeringen af dichroic spejl eller tilpasning af den blå laser vil gå tabt.
3. In vivo optogenetic Stimulation
Sørg for, at procedurer, der involverer brug af dyr gennemføres i overensstemmelse med lokale og nationale retningslinjer og godkendes af den tilsvarende Institutional Animal Care og brug Udvalg.
- Optic fiber opsætning (se figur 3B til identifikation af de forskellige typer af patchkabler er nævnt nedenfor). For at stimulere en enkelt mus, tilslut koblingen patch kabel til en tyk-med kappe patch kabel ved hjælp af FC / FC L-beslag adapter direkte knyttet til breadboard (se figur 4A). For at stimulere to dyr fra en laser, tilslut koblingen patch kabel til to tykke med kappe patchkabler hjælp af 1 x 2 50/50 mini terning (se figur 4B). At stimulere tre eller flere dyr, fastgøre ledningen til en multimode fiber splitter ved hjælp af 1 x 2 mini terning allerede fastgjort til breadboard (se figur 4C).
- Vedhæft en kommutator / drejeled til de frie ender af den tykke med kappe patch kabel / fiber splitter. Kommutatorer er afgørende, da de tillader rotation af fiberen med gnaver bevægelse, som forhindrer ophobning af drejningsmoment på patch kabel. For meget moment kan vride ledningerne føre til brud, og forstyrre dyrets naturlige bevægelse under testen.
- Sæt dyret patch kabel til kommutatoren.
- Sæt en tilslutning split muffe til den frie metalferul ende af animalske patch kabel (figur 5). Tving ikke manchetten hele vejen op ferulen; forlade ~ 0,5 cm muffen udsættes da dette er hvad forbinder til den implanterede fiberoptiske fastgjort til dyret (figur 6).
Kritisk Trin: altid købe ærmer, der indeholder en split til at tillade en udvidelse af ærmet over implanteret fiber dupsko ved til- ogfjernelse. For stramt af en fit kan forårsage alvorlige skader på dyrene, hvis implantatet løsner fra kraniet, når man forsøger at afbryde muffen fra implantatet. Hvis dette sker, bør dyret fjernes fra undersøgelsen og modtage øjeblikkelig dyrlæge pleje. Tilsvarende før du bruger en ny bøsning for første gang, "bryde det i" ved at tilslutte og frakoble en rørring, indtil den afbryder med den ønskede mængde af kraft.
Tip: Det er nemt at bryde en fiber og samtidig fjerne en muffe, som er tæt knyttet til en ferul. For at undgå dette, skubbe rørringen ved at indsætte en lille træ stang i den åbne ende af muffen (håndtaget af en standard vatpind er den rigtige størrelse). - Tilslut den blå laser driver til en puls generator ved hjælp af et BNC-kabel og drej impulsgeneratoren på.
- Put passende beskyttelsesbriller på. Sæt kontakterne på bagsiden af laseren til "Curr" og "TTL +" mode. Sørg that strømmen knop på forsiden af føreren står på nul andturn laseren på (drej driveren på først og derefter laser-tasten).
- Juster EFFEKT på forsiden af laseren, således at 5 - 10 mW der udsendes fra dyret patch kabel fiber tip som målt ved anvendelse af en let strøm meter. 5 - 10 mW er en generel retningslinje - den nøjagtige effekt intensitet kræves for at påvirke et givet volumen af væv skal beregnes forud for starten af eksperimentet, som i Aravanis et al 3.
- Skift den blå laser til "Analog" mode til in vivo stimulering. Bemærk: Gule DPSS lasere drives TTL + mode for konstant belysning. Vent 10-15 min for laser til at varme op.
- Forsigtigt begrænse musen og tilslut split-bøsning på dyret patch kabel til den kroniske implanterbare fiber (se figur 6). Sørg enderne af begge fibre gør fysisk kontakt med hinanden. Brug split på forbindelsesmanchetten somvinduet for at visualisere direkte kontakt mellem de to kritiske trin:. Undertiden snavs kan samle sig på metalferul af dyrets implanterbare fiber og forstyrre korrekt forbindelse. I dette tilfælde skal du bruge en ethanol tørre til forsigtigt at rengøre rørringen på dyrets hoved før fastgørelse. Tving aldrig en forbindende ærmet over rørringen da dette kan forårsage alvorlige skader på dyret. Hvis der ikke kan foretages en fysisk forbindelse mellem fiber ender efter rengøring, skal du fjerne dyret fra undersøgelsen.
Tip: Let lækage kan forekomme ved forbindelsen punkt mellem den implanterede fiber og dyrs patch kabel. Visualisering af dette lys af gnavere kan udgøre en eksperimentel forvirre 10. Varmekrymperør kan knyttes til patchkabler og gled over tilslutningspunktet for at minimere udefra kommende lys. - Lad musen til at restituere i et par minutter før starten af adfærdsmæssig testning.
Tip: Depending på adfærdsmæssige test, der skal indgives, er det bedst at vænne musene for tilslutning og tethering proces 2 - 3 dage før, da håndtering kræves for at forbinde dyret kan fremkalde stress og forvirre adfærdsmæssig testning. - Placer musen i adfærdsmæssige test apparat sikrer, at stikket ledningen er uden ulemper. Lad aldrig et dyr uden opsyn under stimulation. Selv med anvendelse af kommutatorer, behøver patchkabler har en tendens til at vride i længere tid og kan interferere med adfærdsmæssig testning.
- Brug en impulsgenerator til at pulsere den blå laser ved en forudbestemt frekvens, der vil aktivere opsin valg. For gul laser brug: puls gule laser med eksterne skodder eller ved blot at blokere strålevejen med en uigennemsigtig, ikke-reflekterende, ikke-brændbar genstand.
4. Indlæg In vivo Stimulation Overvejelser
Dette afsnit er ikke beregnet til at være en komplet protocol men tilbydes som vejledning for yderligere procedurer, der bør overvejes efter in vivo optogenetic stimulation.
- Ved afslutningen af et forsøg, bekræfter viral og fiber placering histologisk for præcis fortolkning af adfærdsmæssige resultater. Aflive dyr ifølge institutionelle retningslinier og perfundere dyret med iskold phosphatpufret saltvand (PBS) og 4% (w / v) paraformaldehyd i PBS.
- Fjern implanterede fiberoptiske ved fast greb den udsatte metal ferrule med en tang eller hemostats. Træk op i en jævn og alligevel hurtig, bevægelse. Det er vigtigt at teste integriteten af den implanterede fiber ved måling af lys-output ved afslutningen af hvert forsøg.
- Post-fix hjernerne i paraformaldehyd i mindst 24-48 timer før sektionering gennem området af interesse. (Hvis du bruger en indefrysning mikrotom, inkuberes hjerner i en saccharoseopløsning 30% i flere dage før sektionering). Udfør immunhistokemi hjælp stanrd protokoller til påvisning af de relevante opsin-mærkede fluorophorer, dvs. grønt fluorescerende protein (GFP), forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) eller mCherry.
- Tjek stedet for opsin udtryk og fiber implantat under et mikroskop og visuelt bekræfte passende placering af virus indsprøjtning og implantat baseret på udvalgte koordinater.
Representative Results
Adfærdsmæssige resultater opnået med in vivo optogenetic stimulation er helt afhængige af den neurale kredsløb bliver målrettet, dyret anvendte model, og graduering parametre. For nuværende demonstrative formål, dopamin neuroner i det ventrale tegmentale område eller VTA, tyrosin hydroxylase :: Cre mus blev transduceret med en stabil trin-funktion opsin (SSFO) 8 eller kontrol-virus (EYFP), og en fiber implantat var kronisk implanteret. Anvendelsen af TH :: Cre transgene mus sikrer, at opsin ekspression er begrænset til TH + celler (dopamin) i VTA. Figur 7 viser repræsentative adfærdsmæssige resultater opnået ved anvendelse af den nuværende beskrevne laser opsætning til samtidig stimulering af flere mus. Her mus var bundet og stimuleret på samme tid ved hjælp af separate lasere (3 mus / laser som i figur 4C) og lokomotorisk adfærd blev registreret i 1 time. Gentagen stimulering af dopamin neuroner i VTA resulterede i enhyperaktiv fænotype, der varede under hele stimulation. Ingen ændring i lokomotorisk adfærd blev set i EYFP mus (se Video 1). Efter adfærdsmæssig testning, blev immunhistokemi udført for at verificere korrekt viral målretning til VTA dopaminneuroner og fiber placering visuelt bekræftet (se figur 7).
Figur 1. Eksperimentelle skridt til in vivo optogenetic stimulation. Der er fire generelle trin, der er involveret, når designe og udføre in vivo optogenetic stimulation. Denne protokol specifikt beskriver de trin, der er involveret i leveringen af lys fra en laser lyskilde til dybe hjernens strukturer i opfører gnaver og inkluderer 1) lasersystem samling og lys kobling; 2) tøjring strategier for connecting flere dyr til en lyskilde for high-throughput adfærdsmæssige test og 3) indeholder retningslinjer for at bekræfte målretning strategi for let levering - et skridt, der er afgørende for fortolkningen af data. Bemærk: selv om denne protokol er ikke eksklusivt til kroniske implanterbare fibre til at binde formål, anbefales det og antog, når man kombinerer optogenetic stimulation med adfærdsmæssige test. Se både Ung & Arenkiel 2012 18 og Sparta et al., 2012 9 for egenproduktion og implantation af kroniske optiske fibre. Solid linjer = trin er dækket i denne protokol.
Figur 2. Laser systemer, der anvendes til in vivo optogenetic stimulering. (A) enkelt laser system for in vivo stimulation. Denne laser er pH ysically pre-koblet af fabrikanten og kræver lidt slutbrugeren set-up. (B) Dobbelt lasersystem. To lasere er koblet til en enkelt fiber ved brug af spejle, der virker til at styre hver strålegangen i en ikke-kontakt stil kobler. Dette er den mest alsidige set-up som optiske komponenter kan fjernes eller tilføjes efter behov men præsenterer mere af en udfordring i form af en effektiv laser kobling. (C) Skematisk af dobbelt lasersystem vist i (B), der angiver placering af lasere og spejle med den tilsvarende laserlysstråle sti (pile) afbildet. Her er det dikroiske spejl "D" anvendes til at aflede blå bølgelængder af lys under transmission gule bølgelængder igennem til koblingen "C" og i vedlagte kobler patch kabel. B = blå laser; C = berøringsfri stil kobling; D = dichroic spejl; FW = filter hjul; M = Spejl; Y = gul laser.få = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. (A) Kabel tester anvendes i ikke-fysisk kobling protokol Nederst:. Kabeltester direkte forbundet til en patch kabel. Indsæt afbilder forbindelsespunkt af tester til kabel (B) patchkabler er nævnt i hele protokollen Fra ydre til indre:.. Multimode fiber splitter, sort med kappe dyr patch kabel med hvid zirkon split ærme knyttet til den faste spalter (FC) ende, tykke dobbeltvægget patch kabel (også henvist til som en "kobler snor"). Tykke-dobbeltvægget patchkabler er belagt med polyvinylchlorid (PVC) rør til ekstra beskyttelse. For disse kabler, der anvendes industristandard farvekoder til at skelne mellem forskellige fibertyper, hvor appelsin = multimode fiber. Animal patchkabler er tyndere kappe at sikre fleksibilitet til dyr bevægelse under adfærdsmæssige test. Bemærk, at støv hætter er placeret på FC / PC slutter, når kablerne ikke er i brug. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. tethering strategier for in vivo optogenetic stimulering af (A) et enkelt dyr, (B) to dyr; . (C) tre eller fire dyr mulige konfigurationer er ikke begrænset til dem, der er vist ovenfor - flere konfigurationer er mulige gennem den unikke kombination af adaptere, fiber splittere og forgrenede patchkabler som er kommercielt tilgængelige eller sædvane orden. Bemærk: patchkabler og fiber splittere indeholder FC / PC stik i begge ender (kun den ene ende er afbildet).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Korrekt og forkert (rødt X) tilslutning af en patch kabel til en implanterbar fiberoptiske ved hjælp af en split-ærme. (Venstre panel) A zirconia split-bøsning bruges til at forbinde en patch kabel til rørringen af en implanterbar fiberoptiske (vist her ikke er anbragt på et dyr). Pilen peger på forbindelsen punkt mellem patch kabel og implanterbar fiberoptiske. Sammenlign med (højre panel), hvor der findes en kløft mellem patch kabel og implanterbar fiberoptiske, som visualiseret gennem opdelingen af forbindelsesmuffe. Bemærk lyset lækage, der kan opstå med en forkert tilslutning (nederst til højre). Bottom insert på upper venstre panel viser de enkelte komponenter, der anvendes. Fra top til bund af indsatsen: doriske implanterbar fiberoptiske kanyle, hvid zirconia split-ærme, fladskærms-Cleeve (FC) ende af en sort med kappe dyr patch kabel (fuld patch kabel afbildet i figur 3B). I alle paneler, bemærke, at forbindelsesmuffe ikke flugter med FC enden af patch kabel. Lad ~ 0,5 cm af en over-hænge for tilslutning til den implanterbare fiberoptiske fastgjort til dyret. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Side (til venstre) og frontal (højre) visning af en mus med en implanteret fiberoptiske tilsluttet en patch kabel. Brug split på forbindelsesmuffe at hjælpe visualisere korrekt forbindelse af patchkabler to rørringen af den implanterede fiberoptiske. Forbindelsen punkt er fremhævet med en rød stiplet boks og også afbildet i den øvre skær. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Repræsentative resultater. (Venstre) Behavioral udlæsning af in vivo optogenetic stimulation. Eksempel på adfærd, der kan opnås ved anvendelse af den beskrevne laser opsætning og tethering protokol. Bevægelsesaktivitet blev optaget under optogenetic stimulering af ventrale tegmentalområde (VTA) i tyrosinhydroxylase (TH) :: Cre mus (n = 7-8 / gruppe) transduceret med enten en trin-funktion opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) eller kontrol-virus (AAV5-DIO-EYFP) i VTA. Grupper af tre mus blev samtidigt bundet til en enkeltlaser som vist i figur 4C og stimuleret med 5 sek puls af 447 eller 473 nm lys afgivet en gang hver 15 min. To-vejs gentagne målinger ANOVA viste en betydelig gruppe x tid interaktion (F 3,39 = 15,27, p <0,0001) og en signifikant hovedvirkning af tid (F 3,39 = 4,67, p = 0,007), hvorved optogenetic stimulation øget bevægelsesaktivitet kun i SSFO mus (Bonferroni post-hoc p <0,0001, i forhold til t = 0 - 15 gang bin), hvilket resulterer i en samlet stigning i bevægelsesaktivitet forhold EYFP mus (væsentligste virkning af gruppe: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p <0,01 ved t = 15 til 30 og p <0,001 ved t = 30 til 45 og t = 45 til 60). Fiber specs: 200 um kerne, 0,22 NA. Lys irradians = 6-66 mW / mm2, svarende til fiber spids afstand på 0,1-0,6 mm fra viral injektionsstedet med 5 mW lys udstråles ved fiber spids før tethering. Error søjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. EYFPvs. SSFO: ** p <0,01; *** P <0,001; tid effekt: #### p <0,0001 (Højre) Histologisk bekræftelse af viral og fiberoptiske placering.. Konfokal fluorescens billede erhverves på et Leica TCS SP5 scanning laser mikroskop blev anvendt til at visualisere fiber placering (stiplet linje) og viral-medieret ekspression (grøn) i mus ventrale tegmentalområde efter in vivo optogenetic stimulation. Dopaminneuroner (TH +) ses i blåt. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Video 1. I vivo optogenetic stimulation:. Hyperaktivitet under VTA stimulation ved hjælp SSFO i TH :: Cre mus Klik her for at se denne video.
| Tabel 1. Lette bølgelængder for at aktivere almindeligt anvendte opsiner. | ||||
| Opsin Variant | λ | Effekttæthed (/ mm 2) | Egenskaber | |
| On / off Kinetics | ||||
| Optisk excitation: Hurtigt virkende channelrhodopsins | ||||
| CHR2 2 | 470 | 1 - 5mW | 1.21 / 12 ms | Brande op til 40 Hz |
| Cheta 19 | 490 | 5 mW | 0.86 / 8.5 ms | Brande op til 200 Hz |
| CHIEF 20 | 450 | 1,65 mW | 1.62 / 12 ms | Manglende desensitiverende form af CHR2 |
| C1V 18 | 540-630 | 8 mW (540 nm) | 5/34 msek ved 540nm | Rød-skiftet |
| 3.2 mW (630 nm) | 67 msek (ON) 630 nm | |||
| Optisk excitation: træg kanal rhodopsiner | ||||
| Stabil trinfunktion opsin (SFO) 8 | 470/590 | 8 uW (470 nm) | 20 ms / 29 min | New SFO variant; længere åben tilstand. Åbnet af 470 nm, lukket af 590 nm |
| Optisk Inhibition | ||||
| eNpHR3.0 21 | 560-630 | 3. - 5. mW | 2,5 ms / <10 msek | Vedvarende hæmning i 30 min 22 med konstant lys * |
| ArchT3.0 11, 23 | 520-560 | 1-5 mW | 2 / <10 msek | Mere følsom med større fotostrømmen end eNpHR3.0 </ Td> |
| Denne tabel er da kun en vejledning; specifikke lys bølgelængder, der kræves for neural graduering, bør uafhængigt bekræftet. | ||||
| Eksperimentel validering er vigtigt at kontrollere, at opsin, målrettet strategi, og lette stimuleringsparametre modulerer neurale fyring i den tilsigtede måde 5. | ||||
| Effekttæthed (mW / mm2) henviser til magt lys belyst på et givet areal af hjernevæv og henviser ikke til lys, der udstråles fra fiberspidsen. | ||||
| * Brug altid den lavest lysintensitet muligt, især med langvarig lys stimulation. | ||||
Tabel 1. Lette bølgelængder for at aktivere almindeligt anvendte opsiner.
Forkortelser
AAV = adeno-associeret virus
DPSS = diode-pumpet solid state
FC / PC = flad spalter / fysisk kontakt
GFP = grøn fluorescerende protein
PBS = phosphatpufret saltvand
PVC = polyvinylchlorid
mW = milliwatt
NA = blændetal
SSFO = stabil trin-funktion opsin
TH = tyrosinhydroxylase
TTL = transistor-transistor logik
V = spænding
VTA = ventral tegmentalområde
Discussion
De nuværende beskrevne laser set-ups og tøjre strategier er kompatible med en bred vifte af gnaver adfærdsmæssige tests. Faktisk har en række adfærdsmæssige tests blevet brugt efter eller ledsager, at in vivo optogenetic stimulation, der omfatter følelsesladet adfærdsmæssige opgaver, adfærdsmæssige conditioning, indlæring og hukommelse paradigmer, søvn, ophidselse og appetitforstyrrelser opgaver nævne et par stykker (se Nieh et al. 6 for en omfattende gennemgang). Optogenetics har ændret den måde traditionelle adfærdsmæssige test udføres ved, at flere dages studier kan nu koges ned til en enkelt session, hvor adfærd sammenlignes, inden-fag, under forskellige epoker af brændetid 'versus' off »5. Notatet, adfærdsmæssige apparater, der indeholder døråbninger, lukkede rum eller andre forhindringer måske skal modificeres for at passage af bundne fibre.
Den beskrevne tøjre strategier tillader siøde- stimulering af multipel mus fra en enkelt laser. High throughput optogenetic adfærdsmæssige test kan derfor opnås ved anvendelse af flere lasere og testudstyr. Antallet af dyr, der samtidig kan stimuleres, vil imidlertid være begrænset af den maksimalt lys effekt, der kan opnås ved hver fiber spids. Maksimal udgangseffekt ved fiberspidsen er afhængig af 1) startkraft af laseren; 2) kobling effektivitet og 3) antal beam splits. For en 100 mW blå laser med ~ 80% koblingseffektivitet og op til 4 beam splits (som vist i figur 4C), gennemsnitlige styrke ved fiber spids kan variere mellem 5-10 mW, når du bruger 200 um kerne, 0,22 NA fiber patchkabler (nb forventer transmissionstab fra roterende leddene at være <15%). Måling lysudbytte på fiberspidsen er afgørende for at bestemme tilstrækkelig lys strøm til opsin aktivering som opsiner forskellige i deres følsomhed over for lys og dermed lyset effekttæthed (mW/ Mm 2), der kræves til aktivering 11. For eksempel den stabile trin-funktion opsin (SSFO) fungerer som en foton akkumulator og derfor kræver meget lidt lys effekttæthed for aktivering (<8 pW / mm 2) 8. Sammenlign dette med den traditionelle kanal rhodopsin (CHR2), der kræver et minimum på 1 mW / mm2 af lys til at fremkalde aktionspotentialer 2. Tabel 1 er tilvejebragt som en hurtig reference til kendte minimum lys bølgelængder, der er nødvendige for at aktivere de mest almindelige opsiner øjeblikket brug. Endelig må man overveje at lette scatters og absorberer som det rejser gennem hjernevæv sådan, at der kræves mere lys magt for dybere hjernens strukturer 3. En nyttig online ressource er tilgængelig på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php der vil beregne lysintensitet ved forskellige dybder gennem hjernevæv ved at tagetegner fiberkernen størrelse, numerisk åbning, bølgelængde af lys, der anvendes, og udgangsmaterialet lyseffekt på fiberspidsen. For en fremragende overblik over de teoretiske principper bag disse beregninger, se Foutz et al. (2012) 12. Eksempler på, hvordan at anvende disse principper og beregninger til eksperimentelle design er demonstreret i Aravanis et al. (2007) 3 og Tye et al. (2012) 13. Udførelse af disse beregninger forud for starten af et forsøg er afgørende for at sikre tilstrækkelig lys bestråling for opsin aktivering. I betragtning af disse overvejelser er det fordelagtigt at købe højere-drevne lasere til at sikre tilstrækkelig effekt. Lasere med en effekt mellem 100-200 mW er generelt tilstrækkelige til at kompensere for lille kerne fibre, flere fibre opdeling, kobling ineffektivitet og transmission taber 7. Hvis du bruger højeffektlasere skal dog være opmærksom på at undgå neural skade eller varme og lys-associeretU-artefakter, der kan opstå med langvarig og / eller høj powered lys belysning 7. En sikker række til in vivo eksperimenter er op til 75 mW / mm2. 14
Beslutning om den type laser til køb kan være en kompliceret sag, som der er mange faktorer at overveje. For eksempel direkte diodelasere give mere stabil og reproducerbar pulserende output end gør diode-pumpet solid-state (DPSS) lasere, og er mere pålidelige over tid i et laboratoriemiljø. I nogle tilfælde kan imidlertid direkte diodelasere udsender en lavere lyseffekt, ~ 0,1 mW, selv når kommandoen spænding er 0 V på grund af en konstant biasstrøm sendes til diode af laserens styreelektronik. Dette "spontane" emission har et bredere spektrum, end laser emission fra samme laser, så kan specifikt reduceres ved at installere et snævert bånd-pass (eller "oprydning") filter mellem laseren og kobling (se stykliste). Dette filter vil ogsåreducere effekt af ~ 50%, når laseraktive, så købe en højere-drevne laser i overensstemmelse hermed. Det skal bemærkes, at gule DPSS lasere er ekstremt følsomme og kan opføre sig uregelmæssigt og har reduceret levetid hvis hurtigt moduleres af en impulsgenerator. Justering af gul laser magt bør ske gennem eksterne tæthed filter hjul placeret i strålegangen (afsnit 1.7), mens du fører laseren i TTL + mode. Alternativt købe en grøn 532 nm DPSS laser er et omkostningseffektivt alternativ, der kan aktivere både halorhodopsins og archaerhodopsins.
Den numeriske blænde (NA) af en fiber er vigtigt at overveje, når designe og købe fiber komponenter til laser montage set-up. NA for en optisk fiber bestemmer vinklerne af lysstråler, der kan accepteres, og udsendes på spidsen af en fiber. Hvis en højere NA fiber er parret med en lavere NA fiber, vil betydeligt tab forekomme ved denne grænseflade, så det er vigtigt at være konsistent wi th fiber NA inden for et enkelt setup (eller for at sikre, at NA stiger langs strålegangen). Virkningen af fiber NA på mængden af hjernevæv belyst er mindre vigtigt, da hjernevæv er meget spredning, og da lyset koblet fra en laserkilde vil have tendens til "underfill" high-NA fibre; dog optiske fibre med en NA på 0,22 og 0,37 er almindeligt anvendt. Ligeledes vil kobling fra en større kerne til en mindre kerne fiber også resultere i betydelige tab, så altid sørg for at bruge stigende eller lig kerne diametre når skrider fra laserkilden til dyret implantat. Som en generel bemærkning, bør fiber ender altid udjævnet, når den ikke er i brug for at forhindre støv og partikler oprustning. Det er en god idé regelmæssigt at rene fiber ender og stik (70% isopropylalkohol fungerer godt) for at sikre maksimal lys effekt, og for at teste lys effekt gennem en "dummy implantat", før du begynder hver dag eksperimenter.
"> Under adfærdsmæssige test, er det bydende nødvendigt, at der tages skridt til at kontrollere for effekten af virusinfektion, exogent proteinekspression, synligt lys, og mulige virkninger opvarmning af væv og artefakter på dyrs adfærd. Derfor bør den rette kontrolgruppe består af dyr transduceret med en kontrol-virus (f.eks GFP, EYFP, mCherry), som modtager samme lys stimuleringsparametre. Eksperimentel verifikation er et afgørende sidste skridt som de adfærdsmæssige data, der anvendes til analyse er helt afhængig af en ordentlig opsin og fiberoptiske placering i området af interesse . Specifikt i dyr, hvor der ikke detekteres immunhistokemisk signal, eller hvis placering af signal finhed ikke er i området af interesse, så adfærdsmæssige data for dette dyr bør fjernes fra forsøget. Derudover er det vigtigt at teste lysudbytte på fiberspidsen både før kirurgisk implantation og igen post-mortem at sikre tilstrækkelig lys strøm til opsin aktivering. I animals hvor alvorligt lystab er indtruffet gennem fiberen efter eksperimenter (> 30%) 9, bør data for dette dyr overvejes til fjernelse. Kriterier for udsendelse bør der oprettes på forhånd. Endelig må man overveje impulsfrekvensen kræves for at modulere neural fyring, som vil afhænge af hjernens struktur og neuronale undertyper bliver målrettet. Udgivet optogenetic lys stimuleringsparametre eksisterer for flere neuronale undertyper, bør dog evnen til at modulere neurale fyring uafhængigt bekræftet gennem in vivo eller hjerne skive elektrofysiologiske optagelser.Som man bliver dygtig med laser brug og ændring af laser set-ups, kan kombinationer af forskellige bølgelængder opbindes til flere fibre på et enkelt dyr eller leveres ned samme fiber for kombinatorisk optogenetics 8. Multi-bølgelængde stimulation vil blive stadig vigtigere i betragtning af den hurtige udvikling af rød-skifted channelrhodopsins 8, engineering af blå-skiftet hyperpolarisering opsiner 15, brug af bistabile trin-funktion opsiner 8,16,17, og den generelle voksende liste over opsiner med tydelig aktivering spektre 11. Denne udvidelse af optogenetic værktøjskasse vil tillade hidtil uset kontrol af flere neurale undertyper både inden for og på tværs af hjerneområder til at bestemme deres rolle i regulerer komplekse adfærdsmæssige tilstande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Laser Set-up | |||
| 100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1) | Omicron | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
| 100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1) | Colbolt | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers |
| 200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1) | Shanghai Lasers | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
| Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1) | OZ Optics | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11 |
| Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) | Thorlabs | MB1213 | For dual laser system |
| Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) | Thorlabs | MB1012 | For single laser system |
| Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2) | Thorlabs | MB4 | For blue laser; dual laser system |
| Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4) | Thorlabs | CL3 | |
| 3/4" stainless post (quantity: 1) | Thorlabs | TR075 | |
| 1" stainless post (quantity: 4) | Thorlabs | TR1 | |
| Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2) | Thorlabs | PH1 | |
| Pedestal Base Adapter (quantity: 3) | Thorlabs | BE1 | |
| Small Clamping Fork (quantity: 3) | Thorlabs | CF1253 | |
| Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3) | Thorlabs | KM100-E02 | |
| Neutral filter density wheel (quantity: 1) | Thorlabs | NDC-50C-2M | |
| 1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1) | Thorlabs | DMLP505 | |
| Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1) | Thorlabs | KM100 | For dichroic mirror |
| 20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1) | Thorlabs | TC2 | |
| 1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1) | Thorlabs | HW-KIT2 | |
| Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1) | Thorlabs | BA1S | |
| FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2) | Thorlabs | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
| Breadboard lifting handles (quantity: 3) | Thorlabs | BBH1 | |
| Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1) | Thorlabs | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
| 2. Laser Coupling | |||
| ! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength) | Various | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
| Fiber optic cable tester (quantity: 1) | Eclipse | 902-186N | |
| One-step fiber connector cleaner (quantity: 1) | Thorlabs | FBC1 | |
| Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1) | Thorlabs | 0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system | |
| Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1) | Thorlabs | 0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system | |
| Doric mini cube (quantity: 2) | DORIC | DMC_1x2_FC-2FC | |
| Compact power and energy meter console (quantity: 1) | Thorlabs | PM100D | Digital 4" LCD |
| C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1) | Thorlabs | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
| 3. In vivo Optogenetic Stimulation | |||
| Multimode fiber splitters (quantity: 2) | FONT Canada | Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available | |
| Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1) | Rigol | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
| Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8) | DORIC* | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
| Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8) | DORIC | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
| PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1) | Precision fiber Products | SM-CS1140S1 | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
| Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1) | Thorlabs | CAPF | |
| Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1) | Thorlabs | CAPF1 | |
| Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4) | Thorlabs | 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering | |
References
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).
- Sidor, M. M. Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders. J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).
- Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors. Brain Res. 1511, 73-92 (2013).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477, 171-178 (2011).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Res. 1511, 21-32 (2013).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nat Methods. 9, 159-172 (2012).
- Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron. J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).
- Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).
- Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, 98-102 (2010).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. J Vis Exp. , e50004 (2012).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Goshen, I., et al. Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell. 147, 678-689 (2011).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).
