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Neuroscience

कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विवो optogenetic उत्तेजना में

Published: January 15, 2015 doi: 10.3791/51483

Introduction

Optogenetics सामान्य और रोग-प्रासंगिक व्यवहार राज्यों ड्राइविंग तंत्रिका सर्किट तत्वों के लिए अपनी खोज में सिस्टम स्तर के तंत्रिका विज्ञान में क्रांति ला दी है। प्रकाश के प्रति संवेदनशील माइक्रोबियल opsins एक कार्यात्मक स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है कि खोज के उच्च स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता 2 के साथ तंत्रिका गतिविधि के अभूतपूर्व नियंत्रण हासिल करने के लिए प्रकाश के उपयोग के लिए मंच प्रदान किया। तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के लिए परंपरागत electrophysiological या औषधीय दृष्टिकोण के विपरीत, optogenetics विषम आबादी के भीतर और physiologically प्रासंगिक समयमानों में (पहचान आनुवंशिक या स्थानिक प्रक्षेपण के आधार पर) विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। एक तंत्रिका-ऑप्टिकल इंटरफ़ेस के बाद परिचय जानवरों 3 बर्ताव करने के लिए प्रकाश की डिलीवरी के लिए एक व्यावहारिक उपकरण प्रदान की है। इस कारणतः का परीक्षण करने के क्रम में जाग बर्ताव कृन्तकों में परिभाषित तंत्रिका सर्किट के वास्तविक समय मॉडुलन के लिए अनुमति दी गई हैतंत्रिका विज्ञान और मनोरोग बीमारी 4-6 के लिए प्रासंगिक व्यवहार राज्यों के शासन में इन तंत्रिका सर्किट की भूमिका। Optogenetics, इसलिए, मस्तिष्क गतिविधि और पशु मॉडल में व्यवहार या शारीरिक उपायों के बीच कार्यात्मक संबंध की जांच करने में रुचि किसी भी प्रयोगशाला में शुरूआत के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

एक optogenetic प्रयोग के सफल डिजाइन और पूरा विभिन्न चरणों और विचारों (चित्रा 1 देखें) शामिल है। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य जाग बर्ताव कृन्तकों में optogenetic उत्तेजना प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सैद्धांतिक और व्यावहारिक ज्ञान के साथ साथ, उपकरणों और घटकों के साथ व्यक्तियों को प्रदान करने के लिए है। वर्तमान में, माइक्रोबियल opsin चैनलों को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल दो प्रमुख तरंग दैर्ध्य श्रेणियों हैं: नीले स्पेक्ट्रा में (आमतौर पर 473 एनएम) और हरे-पीले स्पेक्ट्रा (आमतौर पर 532 या 591 एनएम)। पराबैंगनीकिरण और प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) दोनों विकास के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैमस्तिष्क के ऊतकों के लिए प्रकाश की विशिष्ट तरंग दैर्ध्य eliver। इन विवो कृंतक उत्तेजना के लिए आवश्यक छोटे कोर तंतुओं में युग्मन जब एल ई डी द्वारा उत्सर्जित गैर सुसंगत प्रकाश, हालांकि, प्रकाश मुश्किल से प्रभावी संचरण बनाता है। उपयुक्त लेजर विधानसभा पर निर्णय लेना एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है और प्रयोगशाला में optogenetics के उपयोग पर निर्भर करेगा। एकल प्री-युग्मित लेज़रों और दोहरी लेजर प्रणाली (देखें चित्र 2): मौजूदा प्रोटोकॉल दो विधानसभा और उपयोग के अपने आसानी में मतभेद है कि बुनियादी विन्यास का वर्णन है। निर्माता द्वारा पूर्व मिलकर कर रहे हैं कि एक लेजर प्रणाली को अनिवार्य रूप से तैयार करने के लिए जाने के लिए आवश्यक कोई सेट अप करने के लिए थोड़ा के साथ आगमन पर कर रहे हैं, लेकिन कम से कम अंत उपयोगकर्ता अनुकूलन के नुकसान है। एक दोहरी लेजर प्रणाली एक ही फाइबर नीचे दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य के वितरण के लिए सक्षम बनाता है। अलग तरंग दैर्ध्य को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिससे इस भेद को बाधित / मिश्रित optogenetics के आगमन के साथ तेजी से महत्वपूर्ण हो जाएगास्थानिक सह स्थानीयकृत हैं कि टी सेल प्रकार के। यह भी photocurrents शुरू की है और क्रमश: 7,8, नीले और पीले रंग की रोशनी से समाप्त कर रहे हैं, जहां द्वि-स्थिर कदम समारोह opsins के साथ प्रयोग के लिए आवश्यक है। उपयोगकर्ता को जोड़ने या आवश्यकता के रूप में किरण पथ से घटक (जैसे, बाहरी बंद, किरण फिल्टर, इनलाइन बिजली मीटर) दूर कर सकते हैं के रूप में दोहरी लेजर प्रणाली भी विकसित कर रहे हैं। कारण अपनी बहुमुखी प्रतिभा को दोहरी लेजर सेट अप optogenetics प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता जारी एक उपकरण होने जा रहा है अगर सिफारिश की है। पराबैंगनीकिरण के युग्मन, हालांकि, एक चुनौती पेश कर सकते हैं और इसलिए एक त्वरित, आसान और विश्वसनीय युग्मन तंत्र इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाती है। इस प्रोटोकॉल ऑप्टिकल घटकों के विधानसभा विवरण और एक 200 माइक्रोन कोर और 0.22 की एक संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ कदम-सूचकांक बहुपद्वति फाइबर के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि पैच तार और घटकों इस्तेमाल करता है, ध्यान दें। अलग कोर आकार और एनए हालांकि सभी घटकों को आदर्श कोर के मामले में मैच चाहिए, खरीद के लिए उपलब्ध हैंआकार और एनए फाइबर कनेक्शन बिंदुओं पर प्रकाश नुकसान से बचने के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक फाइबर कनेक्शन पर, प्रकाश एक बड़ा मूल आकार के लिए एक छोटे से पारित कर सकते हैं; और / या एक कम एनए से अतिरिक्त हानि के बिना एक उच्च एनए फाइबर के लिए।

Tethering रणनीतियों उच्च throughput व्यवहार के परीक्षण के लिए कई चूहों के साथ उत्तेजना के लिए अनुमति प्रदान की है कि कर रहे हैं। उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल व्यवहार के परीक्षण के लिए पुरानी प्रत्यारोपण फाइबर के उपयोग के मान लेकिन तीव्र उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक ही प्रवेशनी दवाओं और एक ही स्थान पर एक ऑप्टिकल फाइबर की नोक वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से तीव्रता से प्रत्यारोपित फाइबर, औषधीय हेरफेर के साथ optogenetic उत्तेजना के संयोजन के लिए फायदेमंद हैं। यह फाइबर के दोहराया प्रविष्टि और हटाने के साथ जुड़े ऊतकों को नुकसान को कम करता है और फाइबर के अनुरूप नियुक्ति के लिए के मामले में सटीकता बढ़ जाती है के रूप में लंबे समय से-प्रत्यारोपित फाइबर का उपयोग करते हैं, हालांकि, अत्यधिक बहु-दिन व्यवहार के परीक्षण के लिए सिफारिश की हैऊतक रोशनी 3। यहाँ वर्णित tethering के विन्यास के साथ संयुक्त, व्यवहार मज़बूती से अधिक दिनों पर दर्ज किया जा सकता है। फाइबर आरोपण के बाद दरअसल, विश्वसनीय प्रकाश संचरण सूचित किया गया है महीने 9 पुरानी उत्तेजना और व्यवहार परीक्षण मानदंड, सैद्धांतिक रूप से, कई दिनों और हफ्तों के पार से बाहर किया जा सकता है कि इस तरह के। हार्डवेयर घटकों पर अतिरिक्त नोट्स घर में बनाया जा सकता है कि लागत प्रभावी विकल्प और उत्पादों सहित, अपनी व्यक्तिगत जरूरतों के अनुरूप होगा कि सबसे अच्छा उत्पाद में पाठक पसंद अनुमति देने के लिए प्रोटोकॉल के लिए जोड़ दिया गया है। सेटअप और कार्यान्वयन के दौरान उपयोगी होते हैं कि महत्वपूर्ण सुझाव भी प्रदान की जाती हैं।

Protocol

! चेतावनी: इस प्रोटोकॉल वर्ग -3 बी लेसरों का इस्तेमाल शामिल है और पीछा किया जाना उचित प्रशिक्षण और सुरक्षा के दिशा निर्देशों की आवश्यकता होगी। लेज़रों ऑपरेटिंग जब सुरक्षा चश्मे संरेखण प्रक्रियाओं एक विशेष रूप से उच्च जोखिम पेश करने के साथ हर समय पहना जाना चाहिए। एक दिया लेजर के लिए अधिक से अधिक क्षीणन प्रदान करेगा कि Eyewear निर्धारित करने के लिए लेजर प्रदाता से संपर्क करें। यदि उपलब्ध हो तो, एक संस्थागत लेजर सुरक्षा प्रशिक्षण पाठ्यक्रम में दाखिला लिया। उचित सुरक्षा eyewear और प्रशिक्षण के बिना एक लेजर संचालित कभी नहीं।

1. लेजर उपकरण सेट-अप

जहां उपयुक्त हो, धारा 1 में दिए चरणों में क्रमश: एकल या दोहरी लेजर प्रणाली के बीच अंतर करने के लिए (ए) या (बी) के रूप में नामित कर रहे हैं।

  1. संलग्न और breadboard के लिए लेज़रों सुरक्षित। Breadboards उत्कृष्ट गर्मी कंडक्टर हैं और लंबे समय तक इस्तेमाल के साथ आंतरिक लेजर उपकरणों को नुकसान को रोकने के लिए एक गर्मी सिंक के रूप में काम करते हैं।
  2. (ए) के पूर्व युग्मित लास को सुरक्षितएर ¼ छोटा-20 "टोपी शिकंजा और वाशर (2A चित्रा) का उपयोग कर एक 10" X 12 "breadboard है (या आवश्यकता के रूप में) करने के लिए। Breadboard के छेद लेजर बढ़ते छेद के साथ पंक्ति में नहीं है, तो breadboard करने के लिए लेजर को सुरक्षित करने के लिए छोटे 'तालिका clamps के' का उपयोग करें।
  3. दो लेज़रों इस्तेमाल किया जाएगा, तो (बी), बहुत अलग किरण हाइट्स (> ~ 1 सेमी) है लेज़रों से एक के लिए एक मंच बनाने के लिए छोटे 4 "एक्स 6" breadboards का उपयोग करें। चित्रा 2B में दिखाया गया के रूप में मुख्य बड़े 12 "एक्स 18" करने के लिए इन बोर्डों संलग्न breadboard वाशर के साथ ¼ छोटा-20 "टोपी शिकंजा का उपयोग करते हुए, तो टोपी शिकंजा या मेज clamps का उपयोग कर छोटे बोर्डों के लिए लेजर देते हैं। टोपी शिकंजा या एक चर ऊंचाई तालिका क्लैंप का उपयोग कर breadboard के लिए सीधे अन्य लेजर संलग्न।
    महत्वपूर्ण कदम: breadboards, शिकंजा, और ऑप्टिकल घटकों वस्तुओं की खरीद तो जब अनुरूप होना शाही या मीट्रिक के रूप में खरीदा जा सकता है; इस प्रोटोकॉल के लिए डिफ़ॉल्ट शाही है।
  4. (ए)युग्मक के लिए एक मोटी तख्ताबंदीवाला फ्लैट फोड़ना / शारीरिक संपर्क (एफसी / पीसी) पैच कॉर्ड संलग्न (एक युग्मक की हड्डी के रूप में भेजा, चित्रा 3 देखें) शारीरिक रूप से लेजर (2A चित्रा) के सामने से जुड़ा हुआ है कि।
  5. (बी) तो प्रयोग के दौरान ढीला और misalignment को रोकने के लिए, युग्मक और जेबी क्विक, या इसी तरह की epoxy का उपयोग कर पोस्ट के शीर्ष के बीच संयुक्त epoxy, एक ¾ "ऑप्टिकल पद पर युग्मक थ्रेड। (Breadboard के छेद हमेशा ऑप्टिकल घटकों, एक पोस्ट धारक, कुरसी आधार एडाप्टर के लिए आवश्यक स्थान के साथ रेखा से ऊपर नहीं जाएगा, और कांटा clamping जगह में युग्मक ऑप्टिकल पद सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में) breadboard के लिए पोस्ट संलग्न। युग्मक के पीछे करने के लिए एक मोटी तख्ताबंदीवाला पैच कॉर्ड (युग्मक कॉर्ड) संलग्न।
  6. (बी) विज्ञान सम्बन्धी धारक में नीले लेजर के लिए पहली स्टीयरिंग दर्पण डालें, और एक ¾ "ऑप्टिकल पद का उपयोग कर breadboard को देते हैं। एक आधार adap करने के लिए इस पद संलग्न करेंआतंकवाद और clamping कांटा। क्लेम्पिंग कांटा स्थिति और dichroic दर्पण की ओर लेजर बधिया करने के लिए 45 डिग्री पर angled आईने के साथ नीले लेजर के सामने सीधे विधानसभा पोस्ट। किसी न किसी संरेखण गाइड के रूप में breadboard पर छेद की ग्रिड पैटर्न का उपयोग करें। एक बार मोटे तौर पर तैनात है, (सी आंकड़े 2B देखें) breadboard के लिए क्लेम्पिंग कांटा सुरक्षित करने के लिए एक ¼ "-20 टोपी पेंच का उपयोग करें।
  7. (बी) एक कीनेमेटीक्स धारक में dichroic दर्पण डालें और एक एक "ऑप्टिकल पोस्ट करने के लिए देते हैं और breadboard के लिए सीधे सुरक्षित। अब तक की बाईं करने के लिए dichroic दर्पण स्थिति, और नीले लेजर दर्पण, के साथ लाइन में। नीले रंग की रोशनी पहले दर्पण से परिलक्षित होता है कि इस तरह के एक 45 डिग्री के कोण पर dichroic दर्पण युग्मक में परिलक्षित होता है कोण, तो (सी आंकड़े 2B देखें) पोस्ट करने के लिए विज्ञान सम्बन्धी धारक संलग्न पेंच कस लें।
  8. (बी) के एक ¾ "ऑप्टिकल पोस्ट करने के लिए पीले रंग की लेजर के लिए पहली स्टीयरिंग दर्पण संलग्न। OPTI संलग्न करेंएक आधार अनुकूलक और clamping कांटा करने के लिए कैलोरी पोस्ट। पीली रोशनी दूसरा स्टीयरिंग दर्पण की ओर निर्देशित किया जाएगा कि इस तरह के एक 45 डिग्री के कोण पर क्लेम्पिंग कांटा और पीले रंग की लेजर और कोण दर्पण के सामने सीधे पोस्ट-कलाकारों की टुकड़ी स्थिति। "एक ¼ साथ -20 टोपी पेंच और वॉशर जगह में क्लेम्पिंग कांटा सुरक्षित।
  9. (बी) के एक एक "ऑप्टिकल पोस्ट करने के लिए पीले रंग की लेजर के लिए दूसरा स्टीयरिंग दर्पण संलग्न। कोण पहली दर्पण से पीले प्रकाश किरण dichroic के माध्यम से और युग्मक (चित्रा -2) में परिलक्षित होगा कि आईने में इस तरह के। Breadboard के लिए सीधे पोस्ट को सुरक्षित और दर्पण उचित angled है एक बार बढ़ते पेंच कस लें। ललित दर्पण समायोजन बाद में एक चरण में विज्ञान सम्बन्धी दर्पण mounts का उपयोग किया जा जाएगा।
  10. (बी) के एक ¾ "ऑप्टिकल पोस्ट करने के लिए एक तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया देते हैं और एक बढ़ते आधार से जुड़ी एक पद धारक में पद जगह है। पहली और एसई के बीच breadboard के लिए कलाकारों की टुकड़ी को सुरक्षितएक एकल ¼ "-20 टोपी पेंच का उपयोग कर cond के पीले दर्पण। यह पहिया युग्मक तक पहुँचने पीला लेजर प्रकाश की शक्ति को समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    युक्ति: व्यक्तिगत आधार करने के लिए उन्हें संलग्न करने से पहले (जैसे पदों के शीर्ष करने के लिए विज्ञान सम्बन्धी दर्पण धारकों पकड़े शिकंजा, और पदों की तह तक आधार एडेप्टर पकड़े धागे के रूप में) सभी घटकों को कस लें। पर्याप्त टोक़ पाने के लिए ऑप्टिकल पदों में उपलब्ध कराई के माध्यम से छेद में एक छोटे से हेक्स रिंच की एक शाफ्ट का प्रयोग करें। इस घटक फिर से संगठित करना जरूरत महसूस प्रयोग के दौरान ढीला आ रही रोकने जाएगा।
  11. Breadboard के लिए एफसी / पीसी एल ब्रैकेट एडाप्टर के लिए एक एफसी / पीसी संलग्न।
  12. वैकल्पिक: दो या दो से अधिक जानवरों के एक साथ vivo में उत्तेजना के लिए breadboard के लिए सीधे एक एक एक्स 2 50/50 मिनी घन फाइबर फाड़नेवाला सुरक्षित। इसके अतिरिक्त, संभालती है (2A चित्रा के रूप में देखा) breadboard के विधानसभा के आंदोलन में सहायता करने के लिए जोड़ा जा सकता है।

2. लेजर युग्मन (गैर संपर्क शैली युग्मन)

यह खंड दोहरे लेजर सेट अप (चित्रा 2B) से संबंधित है। बाहरी पीला लेजर पथ aligning से पहले आंतरिक नीले लेजर पथ संरेखित करें।

! चेतावनी: नेत्र सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए एक कम रोशनी बिजली युग्मन (~ 1 मेगावाट) का प्रयोग करें। लेजर पर और प्रकाश की तीव्रता मापा जाता है और सुरक्षित करने के लिए समझा जाता है जब तक सत्ता में सुरक्षा चश्मे पहनें।

  1. लेजर की पीठ पर स्विच सेट करने के लिए "कुर" (वर्तमान) और ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क मोड (टीटीएल) + लगातार रोशनी के लिए (एनालॉग मोड के लिए विरोध के रूप में)। चालक के मोर्चे पर बिजली घुंडी शून्य पर सेट है कि सुनिश्चित करें। पहले और उसके बाद ड्राइवर पर लेजर महत्वपूर्ण मोड़ से लेजर चालू करें।
  2. धीरे धीरे ~ 1 मेगावाट लेजर प्रकाश उत्सर्जित किया जा रहा है ताकि लेजर चालक के मोर्चे पर स्थित शक्ति घुंडी समायोजित करें। 15 मिनट (या निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में) लेजर के लिए गर्म करने के लिए - 10 रुको।
  3. Fre के लिए सीधे फाइबर ऑप्टिक केबल परीक्षक कनेक्टई युग्मक पैच कॉर्ड के अंत और केबल परीक्षक (चित्रा 3A) पर बारी। लाल किरण सीधे वापस dichroic दर्पण के केंद्र की ओर यात्रा करता है, ताकि युग्मक के कोण समायोजित करें। केबल परीक्षक से उत्सर्जित लाल बत्ती की किरण पथ आने वाली लेजर प्रकाश लेजर में युग्मित किया जा क्रम में पालन करना होगा कि वह सही मार्ग है।
  4. एक मोटे संरेखण का पालन: युग्मक में लेजर प्रकाश की किरण बधिया करने के लिए विज्ञान सम्बन्धी दर्पण पर पार्श्व और क्षैतिज knobs के लिए उपयोग करें। कुरसी clamps के थोड़ा दर्पण और युग्मक स्थान बदलने के लिए ढीला होना पड़ सकता है। विज्ञान सम्बन्धी आरोह को अभी भी आगे ठीक समायोजन के लिए उपलब्ध कुछ यात्रा करनी चाहिए थी। कोई नीले प्रकाश इस समय युग्मक संलग्न पैच कॉर्ड से बाहर उत्सर्जित किया जा रहा है, तो चिंता मत करो।
  5. Dichroic और युग्मक के बीच में, सीधे dichroic दर्पण के सामने अर्द्ध पारदर्शी कागज का एक टुकड़ा रखें। वहाँ हो जाएगा एक नीले और ए.आर. दोनोंक्रमशः लेजर और केबल परीक्षक, से इस कागज पर एड डॉट। पर्याप्त कागज के एक ही तरफ से एक साथ लाल और नीले रंग के धब्बे दोनों को देखने के लिए पारदर्शी है कि कागज का प्रयोग करें।
  6. पहले स्टीयरिंग दर्पण के लिए ठीक समायोजन करें (यानी, लेजर, नहीं dichroic के लिए एक करीब) ध्यान से नीले डॉट के साथ लाल बिंदी के केंद्र के लिए पंक्ति में पार्श्व और क्षैतिज knobs के समायोजन करके।
  7. यह युग्मक के सामने सीधे इतना है कि युग्मक की ओर वापस कागज ले जाएँ और लाल किरण के साथ लेजर बीम संरेखित करने के लिए दूसरे पर (यानी, dichroic) दर्पण knobs के समायोजित करें।
  8. (लाल और नीले रंग की मुस्कराते हुए colinear हैं जब तक, यानी) / नीले, पीले और लाल मुस्कराते हुए केंद्र वास्तव में दोनों पदों में गठबंधन कर रहे हैं जब तक 2.6 और 2.7 कदमों पर पुनरावृति।
  9. युग्मक की हड्डी से केबल परीक्षक निकालें। लेजर प्रकाश अब युग्मक पैच कॉर्ड के अंत से उत्सर्जित किया जाना चाहिए।
  10. Determiएक बिजली मीटर का उपयोग कर युग्मक पैच कॉर्ड के फाइबर सिरे से उत्सर्जित प्रकाश की शक्ति को मापने के द्वारा पूर्वोत्तर के युग्मन दक्षता। बिजली मीटर की फोटोडायोड पर 500 मेगावाट सेटिंग का उपयोग करें और इस्तेमाल किया जा रहा ब्लू (473 एनएम) या लेजर के आधार पर पीले (635 एनएम) स्पेक्ट्रम प्रकाश में तरंगदैर्ध्य सेटिंग (λ) बदल जाते हैं।
  11. एक शक्ति पढ़ने प्राप्त करने के लिए फोटोडायोड सीधा करने के लिए फाइबर टिप रखें। फाइबर अंत से उत्सर्जित प्रकाश की शक्ति के लिए युग्मक प्रवेश करने वाले प्रकाश शक्ति की तुलना करें। > 80% की एक युग्मन दक्षता बहुत अच्छा माना जाता है। दूसरा स्टीयरिंग दर्पण की बहुत छोटी आगे समायोजन कभी कभी थोड़ा युग्मन सुधार कर सकते हैं। सामान्य में, युग्मन फाइबर के अंत से बीम पैटर्न फाइबर कोर में दक्षता युग्मन (इसके आसपास कोई छल्ले के साथ) एक छोटे, तंग, केंद्रीय स्थान है, जब इष्टतम है।
  12. दोहराएँ 2.1 कदम - पीले रंग की लेजर के लिए दो स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग को छोड़कर, पीला लेजर युग्मन के लिए 2.11 (चित्रा -2 देखें)। क्या कोईटी dichroic दर्पण या नीले लेजर के संरेखण की स्थिति खो जाएगा समायोजित करें।

3. में vivo optogenetic उत्तेजना

पशु इस्तेमाल को शामिल किसी भी प्रक्रिया इसी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा स्थानीय और राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुसार आयोजित की और अनुमोदित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें।

  1. ऑप्टिक फाइबर सेट अप (पैच तार के विभिन्न प्रकारों की पहचान के लिए 3B चित्रा को देखने के नीचे करने के लिए कहा गया है)। , एक माउस को प्रोत्साहित सीधे breadboard से जुड़ी एफसी / एफसी एल ब्रैकेट अनुकूलक का उपयोग कर एक मोटी तख्ताबंदीवाला पैच कॉर्ड के लिए युग्मक पैच कॉर्ड कनेक्ट करने के लिए (चित्रा -4 ए देखें)। , एक लेजर से दो जानवरों को प्रोत्साहित 1 एक्स 2 50/50 मिनी घन का उपयोग करते हुए दो मोटी तख्ताबंदीवाला पैच तार के लिए युग्मक पैच कॉर्ड कनेक्ट करने के लिए (4B चित्रा देखें)। 1 एक्स 2 मीटर का उपयोग कर एक बहुपद्वति फाइबर फाड़नेवाला के लिए युग्मक कॉर्ड देते हैं, तीन या अधिक जानवरों को प्रोत्साहित करने के लिएपहल घन पहले से ही breadboard से जुड़ी (चित्रा 4C देखें)।
  2. मोटी तख्ताबंदीवाला पैच कॉर्ड / फाइबर फाड़नेवाला से मुक्त छोर तक एक कम्यूटेटर / रोटरी संयुक्त संलग्न। वे पैच कॉर्ड पर टोक़ के संचय को रोकता है जो कृंतक के आंदोलन के साथ फाइबर के रोटेशन की अनुमति के रूप में commutators आवश्यक हैं। बहुत ज्यादा टोक़, तार मोड़ टूटना करने के लिए नेतृत्व, और परीक्षण के दौरान पशु की प्राकृतिक आंदोलन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  3. कम्यूटेटर करने के लिए पशु पैच कॉर्ड संलग्न।
  4. पशु पैच कॉर्ड (चित्रा 5) से मुक्त धातु सामी अंत करने के लिए एक जोड़ने के विभाजन आस्तीन संलग्न। सभी तरह से ऊपर सामी आस्तीन मजबूर मत करो; इस जानवर से चिपका प्रत्यारोपित फाइबर ऑप्टिक (चित्रा 6) को जोड़ता है क्या है के रूप में ~ आस्तीन के 0.5 सेमी उजागर छोड़ दें।
    महत्वपूर्ण कदम: हमेशा कनेक्शन के दौरान प्रत्यारोपित फाइबर सामी के ऊपर आस्तीन के विस्तार की अनुमति के लिए एक विभाजित होते हैं कि आस्तीन खरीद औरनिकालना। प्रत्यारोपण से आस्तीन डिस्कनेक्ट करने का प्रयास करते समय प्रत्यारोपण खोपड़ी से dislodges अगर एक फिट की भी तंग जानवर को गंभीर आघात हो सकता है। इस होती है, तो जानवर अध्ययन से हटा दिया है और तत्काल पशुचिकित्सा देखभाल प्राप्त किया जाना चाहिए। इसी तरह, पहली बार के लिए एक नया आस्तीन उपयोग करने से पहले, plugging और यह बल के वांछित राशि के साथ डिस्कनेक्ट जब तक एक सामी unplugging द्वारा 'इसमें तोड़ने'।
    टिप: कसकर एक सामी से जुड़ा हुआ है कि एक आस्तीन हटाने के दौरान यह एक फाइबर तोड़ने के लिए आसान है। इससे बचने के लिए, आस्तीन (एक मानक कपास झाड़ू की संभाल सही आकार है) के खुले अंत में एक छोटे से लकड़ी की छड़ी डालने से सामी बाहर धक्का।
  5. एक BNC केबल का उपयोग कर एक पल्स जनरेटर के लिए नीले लेजर चालक कनेक्ट और पर पल्स जनरेटर की बारी है।
  6. पर उचित सुरक्षा चश्मे रखो। लेजर के लिए "कुर" और "टीटीएल + 'मोड की पीठ पर स्विच सेट करें। यकीन था बनाओचालक के मोर्चे पर बिजली घुंडी शून्य पर सेट andturn पर लेजर (प्रथम पर ड्राइवर और फिर लेजर महत्वपूर्ण मोड़ है) टी।
  7. एक प्रकाश बिजली मीटर का उपयोग कर के रूप में मापा 10 मेगावाट पशु पैच कॉर्ड फाइबर सिरे से उत्सर्जित किया जा रहा है - 5 इतना है कि लेजर के मोर्चे पर बिजली घुंडी समायोजित करें। 5 - 10 मेगावाट एक सामान्य दिशानिर्देश है - ऊतक का एक निश्चित मात्रा में Aravanis एट अल, के रूप में प्रयोग के शुरू करने से पहले गणना की जानी चाहिए प्रभावित करने के लिए आवश्यक सटीक शक्ति तीव्रता 3।
  8. इन विवो उत्तेजना के लिए नीले लेजर "के अनुरूप" मोड स्विच। नोट: पीला DPSS लेज़रों लगातार रोशनी के लिए टीटीएल + मोड में संचालित कर रहे हैं। लेजर को गर्म करने के लिए 10-15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  9. धीरे माउस को नियंत्रित और जीर्ण प्रत्यारोपण फाइबर करने के लिए पशु पैच कॉर्ड पर विभाजित आस्तीन कनेक्ट (6 चित्रा देखें)। दोनों तंतुओं के सिरों को एक दूसरे के साथ शारीरिक संपर्क बनाने के लिए सुनिश्चित करें। एक के रूप में जोड़ने बांह पर विभाजन का प्रयोग करेंखिड़की दोनों के बीच सीधा संपर्क कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण कदम:। कभी कभी मलबे जानवर के प्रत्यारोपण फाइबर की धातु सामी पर इकट्ठा करने और उचित कनेक्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस मामले में, धीरे कुर्की करने से पहले जानवर के सिर पर सामी साफ करने के लिए मिटा एक इथेनॉल का उपयोग करें। इस जानवर को गंभीर आघात पैदा कर सकता है के रूप में सामी पर एक जोड़ने के आस्तीन मजबूर कभी नहीं। फाइबर सिरों के बीच एक शारीरिक संबंध की सफाई के बाद नहीं किया जा सकता है, तो अध्ययन से पशु हटा दें।
    टिप: प्रकाश रिसाव प्रत्यारोपित फाइबर और पशु पैच कॉर्ड के बीच कनेक्शन बिंदु पर हो सकता है। कृन्तकों द्वारा इस रोशनी के दृश्य एक प्रयोगात्मक उलझाना 10 उपस्थित हो सकता है। गर्मी टयूबिंग हटना पैच तार से जुड़ी है और बाहरी प्रकाश को कम से कम करने के लिए जोड़ने के बिंदु पर खिसक जा सकता है।
  10. माउस व्यवहार परीक्षण की शुरुआत करने से पहले कुछ मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें।
    टिप: डीहैंडलिंग तनाव प्रेरित और व्यवहार परीक्षण उलझाना सकता है पशु कनेक्ट करने के लिए आवश्यक के रूप में, 3 दिन पहले - व्यवहार परीक्षण पर epending यह 2 कनेक्शन और tethering प्रक्रिया को चूहों अभ्यस्त करने के लिए सबसे अच्छा है, प्रशासित किया जाना है।
  11. कनेक्टर की हड्डी snags के लिए स्वतंत्र है यह सुनिश्चित करना कि व्यवहार परीक्षण उपकरण में माउस रखें। उत्तेजना के दौरान नायाब एक जानवर कभी नहीं छोड़ना। यहां तक ​​कि commutators के उपयोग के साथ, पैच तार समय की विस्तारित अवधि के दौरान मोड़ करने के लिए एक प्रवृत्ति है और व्यवहार परीक्षण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  12. पसंद के opsin सक्रिय करेंगे कि एक पूर्व निर्धारित आवृत्ति पर नीले लेजर पल्स करने के लिए एक पल्स जनरेटर का उपयोग करें। पीले रंग की लेजर उपयोग के लिए: बाहरी बंद के साथ या बस एक अपारदर्शी, गैर चिंतनशील, गैर ज्वलनशील वस्तु के साथ किरण पथ को अवरुद्ध करके पीले लेजर पल्स।

4. पोस्ट में vivo उत्तेजना संबंधी बातें

यह खंड एक पूरा आद्य होने का इरादा नहीं हैकर्नल लेकिन इन विवो optogenetic उत्तेजना के बाद विचार किया जाना चाहिए कि अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए मार्गदर्शन के रूप में की पेशकश की है।

  1. एक प्रयोग के पूरा होने पर, व्यवहार परिणाम की सटीक व्याख्या के लिए वायरल और फाइबर नियुक्ति histologically की पुष्टि करें। संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पशु euthanize और बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 4% पीबीएस में (डब्ल्यू / वी) paraformaldehyde के साथ पशु छिड़कना।
  2. मजबूती से सरौता या hemostats के साथ उजागर धातु सामी लोभी द्वारा प्रत्यारोपित फाइबर ऑप्टिक निकालें। एक चिकनी, अभी तक तेज गति में ऊपर खींचो। यह एक प्रयोग के अंत में प्रकाश उत्पादन को मापने के द्वारा प्रत्यारोपित फाइबर की अखंडता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. ब्याज के क्षेत्र के माध्यम से सेक्शनिंग से 48 घंटा - कम से कम 24 के लिए paraformaldehyde में दिमाग पोस्ट-ठीक। (एक ठंड सूक्ष्म का उपयोग अगर, सेक्शनिंग से पहले कई दिनों के लिए एक 30% sucrose के समाधान में दिमाग सेते हैं)। Standa का उपयोग कर immunohistochemistry के प्रदर्शन करनाउपयुक्त opsin टैग fluorophores का पता लगाने के लिए आरडी प्रोटोकॉल यानी, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) या mCherry।
  4. एक खुर्दबीन के नीचे opsin अभिव्यक्ति और फाइबर प्रत्यारोपण की साइट की जाँच करें और नेत्रहीन चुना निर्देशांक पर आधारित वायरस इंजेक्शन और प्रत्यारोपण के उपयुक्त नियुक्ति की पुष्टि करें।

Representative Results

इन विवो optogenetic उत्तेजना के साथ प्राप्त व्यवहार परिणामों का उपयोग किया था पशु मॉडल, और मॉडुलन मापदंडों निशाना बनाया जा रहा तंत्रिका सर्किट पर पूरी तरह से निर्भर हैं। Tyrosine hydroxylase की वर्तमान प्रदर्शनात्मक प्रयोजनों, डोपामाइन उदर tegmental क्षेत्र में न्यूरॉन्स, या वीटीए के लिए :: Cre चूहों एक स्थिर कदम समारोह opsin (SSFO) 8, या नियंत्रण वायरस (EYFP) के साथ transduced, और एक फाइबर प्रत्यारोपण लंबे समय से था प्रत्यारोपित किया। गु :: Cre ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अभिव्यक्ति वीटीए वें + कोशिकाओं (डोपामाइन) तक ही सीमित है opsin। 7 कई चूहों के साथ उत्तेजना के लिए वर्तमान में वर्णित लेजर सेट-अप का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि व्यवहार परिणामों को दर्शाया गया है कि यह आंकड़ा सुनिश्चित करता है। इधर, चूहों सीमित थे और (चित्रा 4C में के रूप में तीन चूहों / लेजर) अलग लेसरों का उपयोग एक ही समय में प्रेरित और हरकत व्यवहार 1 घंटे के लिए दर्ज की गई थी। वीटीए में डोपामाइन न्यूरॉन्स की दोहराया उत्तेजना एक में हुईउत्तेजना की अवधि के दौरान कायम है कि अति सक्रिय फेनोटाइप। हरकत व्यवहार में कोई परिवर्तन EYFP चूहों में देखा गया था (1 वीडियो देखें)। व्यवहार परीक्षण के बाद, immunohistochemistry के नेत्रहीन पुष्टि की गई वीटीए डोपामिन न्यूरॉन्स और फाइबर प्लेसमेंट (7 चित्रा देखें) के लिए सटीक वायरल लक्ष्यीकरण सत्यापित करने के लिए किया गया था।

चित्रा 1
इन विवो optogenetic उत्तेजना के लिए चित्रा 1. प्रायोगिक कदम। डिजाइन और इन विवो optogenetic उत्तेजना में प्रदर्शन शामिल जब चार सामान्य कदम उठाए हैं। इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से बर्ताव कृंतक में गहरी मस्तिष्क संरचना करने के लिए एक लेजर प्रकाश स्रोत से प्रकाश की डिलीवरी में शामिल कदम का विवरण और 1) लेजर प्रणाली विधानसभा और प्रकाश युग्मन शामिल हैं; सी के लिए 2) tethering की रणनीतियोंडेटा व्याख्या के लिए आवश्यक है कि एक कदम - निर्देशों उच्च throughput व्यवहार के परीक्षण के लिए एक प्रकाश स्रोत के लिए कई जानवरों onnecting और 3) प्रदान करता है प्रकाश वितरण के लिए लक्षित कर रणनीति पुष्टि करने के लिए। नोट: इस प्रोटोकॉल tethering के प्रयोजनों के लिए पुरानी प्रत्यारोपण तंतुओं को विशेष नहीं है, हालांकि, यह सिफारिश की है और व्यवहार परीक्षण के साथ optogenetic उत्तेजना के संयोजन जब ग्रहण किया। Ung और Arenkiel, 2012 में 18 और दोनों स्पार्टा एट अल। देखिए, घर में उत्पादन और जीर्ण ऑप्टिकल फाइबर के आरोपण के लिए 2012 9। ठोस लाइनों = इस प्रोटोकॉल में शामिल कदम।

चित्रा 2
इन विवो optogenetic उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया चित्रा 2. लेजर प्रणाली। (ए) में विवो उत्तेजना के लिए सिंगल लेजर प्रणाली। इस लेजर पीएच है ysically निर्माता द्वारा पूर्व-युग्मित और थोड़ा अंत उपयोगकर्ता के सेट-अप की आवश्यकता है। (बी) दोहरी लेजर प्रणाली। दो लेज़रों एक गैर संपर्क शैली युग्मक में प्रत्येक किरण पथ बधिया करने के लिए काम करते हैं कि दर्पण के उपयोग के माध्यम से एक भी फाइबर में मिलकर कर रहे हैं। यह (बी) में दिखाया गया दोहरी लेजर प्रणाली के सबसे बहुमुखी सेट अप के रूप में ऑप्टिकल घटकों या हटाया जरूरत है, लेकिन और अधिक कुशल लेजर युग्मन के मामले में एक चुनौती के तोहफे के रूप में जोड़ा जा सकता है। (सी) योजनाबद्ध लेज़रों और दर्पण का संकेत है नियुक्ति है इसी लेजर प्रकाश किरण पथ (तीर) के साथ दर्शाया गया है। इधर, dichroic दर्पण 'डी' युग्मक "सी" के लिए और संलग्न युग्मक पैच कॉर्ड में के माध्यम से पीले रंग की तरंग दैर्ध्य संचारण जबकि प्रकाश के नीले तरंग दैर्ध्य से ध्यान हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है। बी = नीले लेजर; सी = गैर संपर्क शैली युग्मक; डी = dichroic दर्पण; परिवार कल्याण = फिल्टर पहिया; एम = मिरर; वाई पीला लेजर =।= "_blank" पाने> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा गैर भौतिक युग्मन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 3. (ए) केबल परीक्षक नीचे:। केबल परीक्षक सीधे एक पैच कॉर्ड से जुड़ा। सम्मिलित करें केबल करने के लिए परीक्षक के कनेक्शन बिंदु को दर्शाया गया है (बी) पैच तार प्रोटोकॉल भर में करने के लिए भेजा बाहर से भीतर की करने के लिए:।। फ्लैट फोड़ना से जुड़ी सफेद zirconia के विभाजन आस्तीन के साथ काले रंग की जैकेट पशु पैच कॉर्ड (एफसी) अंत, बहुपद्वति फाइबर फाड़नेवाला, (यह भी एक "युग्मक की हड्डी" के रूप में करने के लिए कहा गया है) मोटी तख्ताबंदीवाला पैच कॉर्ड। मोटी तख्ताबंदीवाला पैच तार अतिरिक्त सुरक्षा के लिए polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) टयूबिंग के साथ लेपित हैं। इन केबलों के लिए, उद्योग मानक रंग कोड अलग फाइबर प्रकार, जहां नारंगी = बहुपद्वति फाइबर के बीच भेद करने के लिए उपयोग किया जाता है। पशु पैच तार कर रहे हैं पतली व्यवहार परीक्षण के दौरान जानवरों की आवाजाही के लिए लचीलेपन की अनुमति के लिए तख्ताबंदीवाला। केबल के उपयोग में नहीं हैं जब / पीसी समाप्त होता है टोपियां एफसी पर रखा जाता है कि धूल ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
(ए) के एक भी पशु, (बी) के दो जानवरों के vivo optogenetic उत्तेजना के लिए चित्रा 4. Tethering रणनीतियों; । (सी) के तीन या चार जानवरों संभावित विन्यास ऊपर दिखाए गए उन लोगों के लिए सीमित नहीं हैं - एकाधिक विन्यास व्यावसायिक तौर पर या कस्टम आदेश से उपलब्ध हैं कि एडेप्टर, फाइबर से splitters, और शाखाओं में बंटी पैच तार के अद्वितीय संयोजन के माध्यम से संभव हो रहे हैं। नोट: पैच तार और फाइबर splitters के दोनों सिरों पर एफसी / पीसी कनेक्टर्स होते हैं (केवल एक अंत में दिखाया गया है)।ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5। एक विभाजन आस्तीन का उपयोग कर एक implantable फाइबर ऑप्टिक के लिए एक पैच कॉर्ड का सही और गलत (लाल) x कनेक्शन। (बाएं पैनल) विभाजन आस्तीन zirconia के एक एक implantable फाइबर ऑप्टिक (यहाँ दिखाया गया है एक जानवर से चिपका नहीं) की सामी के लिए एक पैच कॉर्ड कनेक्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीर पैच कॉर्ड और implantable फाइबर ऑप्टिक के बीच कनेक्शन बिंदु की ओर इशारा कर रहा है। जोड़ने आस्तीन के विभाजन के माध्यम से कल्पना के रूप में एक अंतर है, पैच कॉर्ड और implantable फाइबर ऑप्टिक के बीच मौजूद है, जहां (सही पैनल) से तुलना करें। एक अनुचित कनेक्शन (नीचे सही) के साथ हो सकता है कि प्रकाश रिसाव ध्यान दें। U पर नीचे डालनेpper बाएं पैनल का इस्तेमाल किया व्यक्तिगत घटकों को दर्शाया गया है। देहाती प्रत्यारोपण फाइबर ऑप्टिक प्रवेशनी, सफेद zirconia के विभाजन आस्तीन, एक काले रंग की जैकेट पशु पैच कॉर्ड के फ्लैट Cleeve (एफसी) अंत (चित्रा 3 बी में दर्शाया पूर्ण पैच कॉर्ड): ऊपर से डालने की तह तक। सभी पैनलों में, जोड़ने आस्तीन पैच कॉर्ड के एफसी अंत के साथ फ्लश नहीं है कि ध्यान दें। छोड़ दो ~ 0.5 सेमी एक-पर लटका पशु से चिपका प्रत्यारोपण फाइबर ऑप्टिक के लिए कनेक्शन के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 साइड (बाएं) और ललाट एक पैच कॉर्ड से जुड़ा एक प्रत्यारोपित फाइबर ऑप्टिक के साथ एक माउस के (दाएं) देखें। पैच कॉर्ड टी के उचित कनेक्शन कल्पना में मदद करने के लिए जोड़ने बांह पर विभाजन का प्रयोग करेंप्रत्यारोपित फाइबर ऑप्टिक के सामी हे। कनेक्शन बिंदु एक लाल धराशायी बॉक्स से प्रकाश डाला और भी ऊपरी डालने में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
7. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा। (बाएं) में vivo optogenetic उत्तेजना के व्यवहार से readout। वर्णित लेजर सेट अप और tethering प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि व्यवहार का उदाहरण। या तो एक कदम समारोह opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP साथ transduced - हरकत गतिविधि उदर tegmental क्षेत्र tyrosine hydroxylase में (वीटीए) (ध) :: Cre चूहों (8 / समूह N = 7) के optogenetic उत्तेजना के दौरान दर्ज की गई थी ) या नियंत्रण वायरस वीटीए में (AAV5-DIO-EYFP)। तीन चूहों के समूह एक साथ एक एकल के लिए सीमित कर रहे थेचित्रा 4C में दिखाया गया है और 447 या 473 एनएम प्रकाश की एक 5 सेकंड पल्स के साथ प्रेरित के रूप में लेजर एक बार हर 15 मिनट दिया। दो-तरफा दोहराया उपायों एनोवा optogenetic उत्तेजना हरकत गतिविधि में वृद्धि हुई है जिससे एक महत्वपूर्ण समूह एक्स समय बातचीत (एफ 3,39 = 15.27, पी <.0001) और समय का एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव (एफ 3,39 = 4.67, पी = 0.007) से पता चला केवल (सापेक्ष Bonferroni पोस्ट-हॉक पी <.0001, = 0 करने के लिए टी - 15 समय बिन) SSFO चूहों में EYFP चूहों (समूह का मुख्य प्रभाव के साथ तुलना में हरकत गतिविधि में एक समग्र वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप: एफ 1,39 = 10.69, पी = 0.0061, टी = 15 पर Bonferroni पोस्ट-हॉक पी <0.01 - टी पर 30 और पी <0.001 = 30-45 और टी = 45-60)। फाइबर चश्मा: 200 माइक्रोन कोर, 0.22 एनए। पूर्व tethering के लिए फाइबर नोक पर उत्सर्जित 5 मेगावाट प्रकाश शक्ति के साथ वायरल इंजेक्शन साइट से 0.6 मिमी - लाइट विकिरण = 6 - 0.1 की फाइबर टिप दूरी को इसी 66 मेगावाट / 2 मिमी,। त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। EYFPSSFO बनाम: ** पी <0.01; *** पी <0.001; समय प्रभाव: #### पी <.0001 वायरल और फाइबर ऑप्टिक नियुक्ति की (सही) Histological पुष्टि।। एक Leica टीसीएस SP5 लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन पर हासिल कर लिया confocal प्रतिदीप्ति छवि फाइबर प्लेसमेंट (डॉटेड लाइन) और इन विवो optogenetic उत्तेजना के बाद माउस उदर tegmental क्षेत्र में वायरल की मध्यस्थता अभिव्यक्ति (हरा) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डोपामाइन न्यूरॉन्स (गु +) नीले रंग में देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विवो optogenetic उत्तेजना में वीडियो: 1.। सक्रियता वें :: Cre चूहों में SSFO का उपयोग कर वीटीए उत्तेजना के दौरान इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. लाइट irradiances आमतौर पर इस्तेमाल किया opsins को सक्रिय करने की आवश्यकता है।
Opsin संस्करण λ ऊर्जा घनत्व (/ 2 मिमी) गुण
/ बंद कैनेटीक्स पर
ऑप्टिकल उत्तेजना: तेजी से अभिनय channelrhodopsins
ChR2 2 470 1 - 5mW 1.21 / 12 मिसे 40 हर्ट्ज के लिए आग
ChETA 19 490 5 मेगावाट 0.86 / 8.5 मिसे 200 हर्ट्ज के लिए आग
मुख्यमंत्री 20 450 1.65 मेगावाट 1.62 / 12 मिसे ChR2 की गैर-desensitizing प्रपत्र
C1V 18 540-630 8 मेगावाट (540nm) 54 में 5/34 मिसे0nm लाल स्थानांतरित
3.2 मेगावाट (630nm) 67 मिसे (पर) 630nm पर
ऑप्टिकल उत्तेजना: धीमी गति से अभिनय चैनल rhodopsins
स्थिर कदम समारोह opsin (SFO) 8 470/590 8 μW (470nm) 20 मिसे / 29 मिनट नई SFO के संस्करण; अब खुले राज्य। 590 एनएम द्वारा बंद कर दिया, 470 एनएम द्वारा खोला
ऑप्टिकल निषेध
eNpHR3.0 21 560-630 3-5 मेगावाट 2.5 मिसे / <10 मिसे लगातार प्रकाश के साथ 30 मिनट 22 के लिए निरंतर निषेध *
ArchT3.0 11, 23 520-560 1-5 मेगावाट 2 / <10 मिसे ENpHR3.0 <से बड़ा photocurrents के साथ और अधिक संवेदनशील/ टीडी>
इस तालिका में केवल एक गाइड के रूप में प्रदान की जाती है; तंत्रिका मॉडुलन के लिए आवश्यक विशिष्ट प्रकाश irradiances स्वतंत्र रूप से पुष्टि की जानी चाहिए।
प्रयोगात्मक सत्यापन opsin, लक्षित कर रणनीति, और प्रकाश उत्तेजना मापदंडों इरादा ढंग 5 में तंत्रिका फायरिंग मिलाना कि सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
ऊर्जा घनत्व (मेगावाट / 2 मिमी) मस्तिष्क के ऊतकों की एक दिए गए क्षेत्र पर प्रबुद्ध प्रकाश की शक्ति को संदर्भित करता है और फाइबर सिरे से उत्सर्जित प्रकाश की शक्ति का उल्लेख नहीं है।
* हमेशा विशेष रूप से लंबे समय तक प्रकाश उत्तेजना के साथ, संभव सबसे कम प्रकाश की तीव्रता का उपयोग करें।

तालिका 1. लाइट irradiances आमतौर पर इस्तेमाल किया opsins को सक्रिय करने की आवश्यकता है।
संकेताक्षर
एएवी एडिनो से जुड़े वायरस =
DPSS = डायोड पंप ठोस राज्य
एफसी / पीसी = फ्लैट फोड़ना / शारीरिक संपर्क
GFP के = हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन
पीबीएस = फॉस्फेट बफर खारा
पीवीसी polyvinyl क्लोराइड =
मेगावाट = milliwatt
एनए = संख्यात्मक एपर्चर
SSFO स्थिर कदम समारोह opsin =
गु = tyrosine hydroxylase
टीटीएल = ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क
वी = वोल्टेज
वीटीए = उदर tegmental क्षेत्र

Discussion

वर्तमान में वर्णित लेजर सेट अप और tethering रणनीतियों कृंतक व्यवहार परीक्षण की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत कर रहे हैं। दरअसल, व्यवहार परीक्षण की एक किस्म निम्नलिखित इस्तेमाल किया, या साथ किया गया है, भावनात्मक व्यवहार कार्यों, व्यवहार में वातानुकूलन, सीखने और स्मृति लद, नींद, उत्तेजना, और भूख बढ़ाने वाला कार्य शामिल है कि इन विवो optogenetic उत्तेजना के लिए कुछ नाम (Nieh एट अल देखें। 6 एक व्यापक समीक्षा के लिए)। Optogenetics पारंपरिक व्यवहार परीक्षण है कि कई दिन की पढ़ाई में आयोजित की जाती हैं जिस तरह से अब व्यवहार की तुलना में है, जिसमें एक ही सत्र में सघन किया जा सकता है बदल गया है, बनाम 'बंद' 'पर' प्रकाश की अलग युगों के दौरान,-विषयों के भीतर 5। ध्यान से, दरवाजे होते हैं कि व्यवहार apparatuses, बंद डिब्बों या अन्य अवरोधों सीमित फाइबर के पारित होने को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

वर्णित tethering की रणनीतियों परमिट एसआईएक लेजर से कई चूहों के multaneous उत्तेजना। उच्च throughput optogenetic व्यवहार परीक्षण इसलिए कई लेज़रों और परीक्षण उपकरणों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। एक साथ प्रेरित किया जा सकता है कि पशुओं की संख्या, हालांकि, प्रत्येक फाइबर नोक पर प्राप्त किया जा सकता है कि अधिक से अधिक प्रकाश की शक्ति से सीमित हो जाएगा। फाइबर नोक पर अधिकतम बिजली उत्पादन लेजर की 1) शुरू करने की शक्ति पर निर्भर है; 2) युग्मन दक्षता और किरण विभाजन के 3) की संख्या। 200 माइक्रोन कोर, 0.22 एनए फाइबर पैच तार का उपयोग करते समय ~ 80% युग्मन दक्षता के साथ और (चित्रा 4C में दर्शाया के रूप में) 4 किरण फूट, फाइबर नोक पर औसत शक्ति अप करने के लिए एक 100 मेगावाट नीले लेजर के लिए 5-10 मेगावाट के बीच लेकर कर सकते हैं (नायब <हो 15% करने के लिए रोटरी जोड़ों से पारेषण हानि की उम्मीद है)। Opsins इसलिए प्रकाश और प्रकाश ऊर्जा घनत्व को उनकी संवेदनशीलता में मतभेद के रूप में फाइबर नोक पर प्रकाश उत्पादन मापने मेगावाट (opsin सक्रियण के लिए पर्याप्त प्रकाश की शक्ति का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है/ 2 मिमी) सक्रियण 11 के लिए जरूरी है। उदाहरण के लिए, स्थिर चरण-समारोह opsin (SSFO) एक फोटान संचायक के रूप में कार्य करता है और इसलिए सक्रियण के लिए बहुत कम प्रकाश ऊर्जा घनत्व (<8 μW / 2 मिमी) की आवश्यकता है 8। कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना करने के लिए प्रकाश की एक मेगावाट / 2 मिमी की एक न्यूनतम आवश्यकता है कि पारंपरिक चैनल rhodopsin (ChR2) के लिए इस की तुलना में 2। तालिका 1 में वर्तमान में सबसे आम opsins को सक्रिय करने के लिए आवश्यक जाना जाता न्यूनतम प्रकाश irradiances के लिए एक त्वरित संदर्भ के रूप में प्रदान की जाती है यूज़। अन्त में, एक कि प्रकाश scatters पर विचार करें और इसे और अधिक प्रकाश बिजली गहरी मस्तिष्क संरचना 3 के लिए आवश्यक है कि इस तरह के मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से यात्रा के रूप में अवशोषण चाहिए। एक उपयोगी ऑनलाइन संसाधन पर उपलब्ध है http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php में लेने से मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से विभिन्न गहराई में प्रकाश की तीव्रता की गणना करेगा किफाइबर कोर आकार, संख्यात्मक एपर्चर, प्रयोग प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, और फाइबर नोक पर शुरू होने वाले प्रकाश की शक्ति खाते। इन गणनाओं अंतर्निहित सैद्धांतिक सिद्धांतों का एक उत्कृष्ट अवलोकन के लिए, Foutz एट अल देखें। (2012) 12। प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए इन सिद्धांतों और गणना कैसे लागू करने के उदाहरण (2007) 3। Aravanis एट अल में प्रदर्शन किया और Tye एट अल। (2012) 13 कर रहे हैं। एक प्रयोग के शुरू करने से पहले इन गणना प्रदर्शन opsin सक्रियण के लिए पर्याप्त प्रकाश विकिरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन बातों को देखते हुए यह पर्याप्त बिजली उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए उच्च संचालित पराबैंगनीकिरण खरीद करने के लिए लाभदायक है। 100-200 मेगावाट के बीच एक बिजली उत्पादन के साथ लेजर छोटे कोर फाइबर, कई फाइबर बंटवारे, युग्मन अक्षमता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आम तौर पर पर्याप्त हैं और पारेषण 7 खो देता है। उच्च शक्ति लेजर का उपयोग अगर, हालांकि, देखभाल तंत्रिका क्षति या गर्मी और प्रकाश सहयोगी से बचने के लिए लिया जाना चाहिएलंबे समय तक और / या उच्च शक्ति प्रकाश रोशनी 7 के साथ हो सकता है कि डी कलाकृतियों। Vivo में प्रयोगों के लिए एक सुरक्षित सीमा 75 मेगावाट / 2 मिमी तक है। 14

खरीद करने के लिए लेजर के प्रकार पर निर्णय लेना कई कारकों पर विचार कर रहे हैं के रूप में एक जटिल मामला हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्रत्यक्ष लेजर डायोड डायोड पंप ठोस राज्य (DPSS) पराबैंगनीकिरण करते हैं, और एक प्रयोगशाला वातावरण में समय के साथ और अधिक विश्वसनीय हैं और अधिक से अधिक स्थिर और repeatable स्पंदित उत्पादन प्रदान करते हैं। कुछ मामलों में, हालांकि, प्रत्यक्ष लेजर डायोड आदेश वोल्टेज की वजह से लेजर के नियंत्रण इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा डायोड के लिए भेजा जा रहा है वर्तमान में एक निरंतर पक्षपात करने के 0 वी है, तब भी जब एक कम प्रकाश की शक्ति, ~ 0.1 मेगावाट का उत्सर्जन हो सकता है। इस 'सहज' उत्सर्जन एक ही लेजर से लेजर उत्सर्जन करता है की तुलना में एक व्यापक स्पेक्ट्रम है, इसलिए विशेष रूप से लेजर और युग्मक के बीच एक संकीर्ण बैंड-पास (या 'सफाई') फिल्टर (भागों की सूची देखें) की स्थापना के द्वारा कम किया जा सकता है। इस फिल्टर भी होगाlasing जब 50% ~ से बिजली उत्पादन कम है, इसलिए तदनुसार एक उच्च स्तरीय लेजर खरीद। यह पीले DPSS लेज़रों अत्यंत संवेदनशील होते हैं और अनिश्चित व्यवहार कर सकते हैं और तेजी से एक पल्स जनरेटर द्वारा संग्राहक अगर उम्र को कम कर दिया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। पीले रंग की लेजर शक्ति का समायोजन टीटीएल + मोड में लेजर ऑपरेटिंग जबकि किरण पथ (धारा 1.7) में रखा बाहरी घनत्व फिल्टर पहियों के माध्यम से किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, एक हरे रंग की 532 एनएम DPSS लेजर क्रय halorhodopsins और archaerhodopsins दोनों सक्रिय कर सकते हैं कि एक लागत प्रभावी विकल्प है।

एक फाइबर की संख्यात्मक एपर्चर (एनए) डिजाइन और लेजर विधानसभा सेट अप के लिए फाइबर घटक जब क्रय विचार करना जरूरी है। एक ऑप्टिकल फाइबर के एनए स्वीकार कर लिया और एक फाइबर की नोक पर उत्सर्जित किया जा सकता है कि प्रकाश की किरणों का कोण निर्धारित करता है। एक उच्च एनए फाइबर एक कम एनए फाइबर के लिए mated है, तो महत्वपूर्ण नुकसान कि इंटरफेस में घटित होगा, तो यह लगातार वाई होना जरूरी है एक भी सेटअप के भीतर वें फाइबर एनए (या एनए प्रकाश मार्ग के किनारे बढ़ जाती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए)। प्रबुद्ध मस्तिष्क के ऊतकों की मात्रा पर फाइबर एनए के प्रभाव मस्तिष्क के ऊतकों के बाद से अत्यधिक बिखरने, और एक लेजर स्रोत से युग्मित प्रकाश करने के लिए 'underfill' उच्च एनए फाइबर करते हैं जाएगा, के बाद से कम महत्वपूर्ण नहीं है; 0.22 और 0.37 की एक एनए के साथ हालांकि ऑप्टिकल फाइबर आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है। इसी तरह, एक छोटे-कोर फाइबर के लिए एक बड़ा-कोर से युग्मन भी महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम है, इसलिए हमेशा पशु प्रत्यारोपण करने के लिए लेजर स्रोत से प्रगति जब बढ़ाने या बराबर कोर व्यास का उपयोग सुनिश्चित किया जाएगा। एक सामान्य नोट पर, फाइबर समाप्त होता है हमेशा उपयोग में नहीं धूल और कण का निर्माण हुआ रोकने के लिए जब छाया किया जाना चाहिए। यह एक अच्छा विचार है करने के लिए नियमित रूप से साफ फाइबर समाप्त होता है और कनेक्टर्स (70% isopropyl शराब अच्छी तरह से काम करता है) अधिक से अधिक प्रकाश बिजली उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, और प्रत्येक दिन के प्रयोगों की शुरुआत से पहले एक 'डमी प्रत्यारोपण' के माध्यम से प्रकाश बिजली उत्पादन का परीक्षण करने के लिए।

"> व्यवहार परीक्षण के दौरान, यह चरणों वायरल संक्रमण, बहिर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति, दृश्य प्रकाश, और पशुओं के व्यवहार पर संभव ऊतक हीटिंग प्रभाव और कलाकृतियों के प्रभावों के लिए नियंत्रित करने के लिए ले जाया जा आवश्यक है। इसलिए, उचित नियंत्रण समूह जानवरों से मिलकर चाहिए एक नियंत्रण वायरस के साथ transduced (जैसे, GFP, EYFP, mCherry) समान प्रकाश उत्तेजना मापदंडों प्राप्त करते हैं। प्रायोगिक सत्यापन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल व्यवहार डेटा के रूप में एक महत्वपूर्ण अंतिम कदम ब्याज के क्षेत्र में उचित opsin और फाइबर ऑप्टिक नियुक्ति पर पूरी तरह से निर्भर है संकेत या फाइबर की नियुक्ति के हित के क्षेत्र में नहीं है, जहां। विशेष रूप से, कोई immunohistochemical संकेत का पता चला है, जहां पशुओं में, या, कि पशुओं के लिए तो व्यवहार डेटा प्रयोग से हटा दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, इस पर प्रकाश उत्पादन का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है दोनों शल्य आरोपण और फिर पोस्टमार्टम से पहले फाइबर टिप opsin सक्रियण के लिए पर्याप्त प्रकाश की शक्ति सुनिश्चित करने के लिए। एनिमा मेंगंभीर प्रकाश नुकसान प्रयोगों के बाद फाइबर के माध्यम से हुआ है, जहां लोकसभा (> 30%) 9, कि पशुओं के लिए डेटा को हटाने के लिए विचार किया जाना चाहिए। हटाने के लिए मानदंड एक प्राथमिकताओं की स्थापना की जानी चाहिए। अंत में, एक निशाना बनाया जा रहा है मस्तिष्क संरचना और neuronal उप-प्रकार पर निर्भर करेगा जो तंत्रिका फायरिंग मिलाना करने के लिए आवश्यक पल्स आवृत्ति, विचार करना चाहिए। प्रकाशित optogenetic प्रकाश उत्तेजना मापदंडों हालांकि, तंत्रिका फायरिंग मिलाना करने की क्षमता स्वतंत्र रूप से इन विवो या मस्तिष्क टुकड़ा electrophysiological रिकॉर्डिंग के माध्यम से पुष्टि की जानी चाहिए कई न्यूरोनल उप-प्रकार, के लिए मौजूद हैं।

एक लेजर का उपयोग करें और लेजर सेट अप के संशोधन के साथ निपुण हो जाता है, अलग अलग तरंग दैर्ध्य के संयोजन एक भी पशु पर कई तंतुओं को सीमित या मिश्रित optogenetics 8 के लिए वही फाइबर नीचे दिया जा सकता है। बहु तरंगदैर्ध्य उत्तेजना लाल पारी का तेजी से विकास को देखते हुए तेजी से महत्वपूर्ण हो जाएगाएड 8 channelrhodopsins, नीली स्थानांतरित कर दिया hyperpolarizing opsins 15 के इंजीनियरिंग, bistable कदम समारोह opsins 8,16,17 का उपयोग करते हैं, और विशिष्ट सक्रियण स्पेक्ट्रा 11 के साथ opsins के सामान्य विस्तार की सूची। Optogenetic उपकरण बॉक्स के इस विस्तार जटिल व्यवहार राज्यों गवर्निंग में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के भीतर और मस्तिष्क क्षेत्रों में दोनों कई तंत्रिका उप-प्रकार की अभूतपूर्व नियंत्रण की अनुमति होगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1) Omicron Luxx/Phoxx 473/488-100 Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1) Colbolt 0594-04-01-0100-300 04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1) Shanghai Lasers GL532T3-200 Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1) OZ Optics HPUC-23-400/700-M-20AC-11 For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) Thorlabs MB1213 For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) Thorlabs MB1012 For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2) Thorlabs MB4 For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4) Thorlabs CL3
3/4" stainless post (quantity: 1) Thorlabs TR075
1" stainless post (quantity: 4) Thorlabs TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2) Thorlabs PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3) Thorlabs BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3) Thorlabs CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3) Thorlabs KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1) Thorlabs NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1) Thorlabs DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1) Thorlabs KM100 For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1) Thorlabs TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1) Thorlabs HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1) Thorlabs BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2) Thorlabs ADAFCB1 Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3) Thorlabs BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1) Thorlabs FB450-10 For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength) Various ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1) Eclipse 902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1) Thorlabs FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1) Thorlabs 0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1) Thorlabs 0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2) DORIC DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1) Thorlabs PM100D Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1) Thorlabs S130C Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2) FONT Canada Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1) Rigol DG1022 Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8) DORIC* FRJ_1X1_FC-FC *Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8) DORIC MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1) Precision fiber Products SM-CS1140S1 Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1) Thorlabs CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1) Thorlabs CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4) Thorlabs 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering

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References

  1. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  3. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).
  4. Sidor, M. M. Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders. J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).
  5. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  6. Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors. Brain Res. 1511, 73-92 (2013).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477, 171-178 (2011).
  9. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).
  10. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Res. 1511, 21-32 (2013).
  11. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nat Methods. 9, 159-172 (2012).
  12. Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron. J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).
  13. Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
  14. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).
  15. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, 98-102 (2010).
  16. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).
  17. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).
  18. Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. J Vis Exp. , e50004 (2012).
  19. Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).
  20. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).
  21. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
  22. Goshen, I., et al. Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell. 147, 678-689 (2011).
  23. Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 95 optogenetics कृंतक व्यवहार opsin channelrhodopsin मस्तिष्क फाइबर ऑप्टिक्स लेजर तंत्रिका सर्किट
कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के <em>विवो</em> optogenetic उत्तेजना <em>में</em>
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Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye,More

Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., McClung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J. Vis. Exp. (95), e51483, doi:10.3791/51483 (2015).

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