In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

Introduction

Optogenetik har revolution system-nivå neurovetenskap i sitt sökande efter de neurala kretselement som driver normala och sjukdoms relevanta beteende stater. Upptäckten att ljuskänsliga mikrobiella opsins ^{1 började} funktionellt uttryckas i däggdjursceller förutsatt plattformen för att använda ljus för att få oöverträffad kontroll av neural aktivitet med hög spatial och temporal precision ^2. Till skillnad från traditionella elektrofysiologiska eller farmakologiska metoder för manipulering av neural aktivitet, tillåter optogenetik för bekämpning av specifika celltyper (baserat på genetisk identifiera eller rumslig projektion) inom heterogena populationer och vid fysiologiskt relevanta tidsskalor. Den senare införande av en neural-optiskt gränssnitt förutsatt ett praktiskt verktyg för leverans av ljus till beter djur ^3. Detta har gjort det möjligt för realtidsmodulering av definierade neurala kretsar i Vakna beter gnagare för att kausalt testaroll dessa nervbanor i styrningen av beteende stater som är relevanta för neurologisk och psykiatrisk sjukdom ^4-6. Optogenetik därför utgör ett kraftfullt verktyg för införande i alla laboratorier intresserade av att undersöka den funktionella relationen mellan hjärnans aktivitet och beteende eller fysiologiska åtgärder i djurmodeller.

Lyckad design och slutförandet av en optogenetic experiment involverar olika steg och överväganden (se figur 1). Målet med det nuvarande protokollet är att ge personer med de verktyg och komponenter, tillsammans med de teoretiska och praktiska kunskaper, som behövs för att utföra optogenetic stimulans i vaken beter gnagare. För närvarande finns det två dominerande våglängdsområden som används för att aktivera mikrobiella opsin kanaler: i det blå spektrat (vanligen 473 nm) och grön-gul spektra (vanligen 532 eller 591 nm). Både lasrar och lysdioder (LED) kan användas som ljuskällor till deliver specifika våglängder av ljus till hjärnvävnad. Den icke-koherent ljus som avges av lysdioder, gör dock en effektiv överföring av ljus svårt när koppling till de små kärn fibrer som krävs för in vivo gnagare stimulering. Besluta om lämplig laserenheten är en avgörande första steg och kommer att bero på den avsedda användningen av optogenetik i labbet. Den nuvarande protokollet beskriver två grundläggande konfigurationer som skiljer sig i deras enkla montering och användning: enkel pre kopplade lasrar och dubbla lasersystem (se figur 2). Singellasersystem som är pre-kopplade av tillverkaren är väsentligen färdig att gå vid ankomst med liten eller ingen installation krävs men har nackdelen av minimala slutanvändaranpassning. En dubbel lasersystem möjliggör leverans av två olika våglängder ner samma fiber. Detta kommer att bli allt viktigare med tillkomsten av kombinato optogenetik vari olika våglängder kan användas för att aktivera / hämma distincT-celltyper som är rumsligt samlokaliserade. Detta är också viktigt för användning med bistabila Steg Funktion opsins där fotoströmmar initieras och avslutas med blått och gult ljus, respektive ^7,8. Dubbla lasersystem är också anpassnings som användaren kan lägga till eller ta bort komponenter (t.ex. externa jalusier, balk filter, inline power meter) från strålgången efter behov. Tack vare sin mångsidighet, är den dubbla laser installation rekommenderas om optogenetik kommer att bli en fortsatt verktyg som används i labbet. Koppling av lasrarna kan dock innebära en utmaning och så en snabb, enkel och pålitlig kopplingsmekanism finns i detta protokoll. Observera, detta protokoll detaljer montering av optiska komponenter och utnyttjar patchkablar och komponenter som är optimerade för steg-index multimodfibrer med en 200 nm kärna och en numerisk apertur (NA) på 0,22. Olika kärnstorlekar och NA finns att köpa, men alla komponenter bör helst matchas avseende kärnstorlek och NA för att undvika ljusförlust vid fiberanslutningspunkter. Alternativt på en fiberanslutning, kan ljuset passera från en mindre till en större kärna storlek; och / eller från en lägre-NA till en högre-NA-fiber utan ytterligare förlust.

Tjudra strategier förutsatt att möjliggöra samtidig stimulering av flera möss för hög genomströmning beteendetester. De protokoll som förutsätter användning av kroniska implanterbara fibrer för beteendetester men kan modifieras för akuta stimuleringsprotokoll. Akut implanterade fibrer är fördelaktiga för att kombinera optogenetic stimulering med farmakologisk manipulation, eftersom samma kanyl kan användas för att avge läkemedel och spetsen av en optisk fiber till samma plats. Användningen av kroniskt-implanterade fibrerna är dock rekommenderas starkt för multipel-dagars beteendetestning eftersom det minskar vävnadsskada associerad med upprepat införande och avlägsnande av fibrer och ökar noggrannheten när det gäller att konsekvent placering av fiber förvävnads belysning ^3. I kombination med de tjudra konfigurationer som beskrivs här, kan spelas beteende tillförlitligt över flera dagar. Faktum är tillförlitlig ljustransmission rapporterats månader efter fiber implantation ⁹ så att kronisk stimulering och beteendetest paradigm kan, teoretiskt, ske över flera dagar och veckor. Kompletterande information om hårdvarukomponenter har lagts till protokollet för att låta läsaren val i den bästa produkten som passar deras individuella behov, inklusive kostnadseffektiva alternativ och produkter som kan göras i egen regi. Viktiga tips som är användbara under installationen och genomförande finns också.

Protocol

! VARNING: Detta protokoll innebär användning av Klass 3B laser och kommer att kräva en god utbildningsnivå och säkerhetsriktlinjer som ska följas. Skyddsglasögon måste alltid användas vid arbete lasrar, med inriktningsförfaranden presentera en särskilt hög risk. Kontakta laserleverantören att bestämma glasögon som ger maximal dämpning för en given laser. Om tillgängligt, skriva in sig i en institutionell lasersäkerhetsutbildning. Använd aldrig en laser utan lämplig skyddsglasögon och utbildning.

1. Laser Apparater Set-up

I förekommande fall är steg i avsnitt 1 betecknas som (A) eller (B) för att skilja mellan enkla eller dubbla lasersystem, respektive.

1. Fäst och säkra lasrar till bakbord. Kopplingsdäck är utmärkta värmeledare och fungerar som en kylfläns för att förhindra skador på interna laserkomponenter med långvarig användning.
2. (A) fast pre kopplade laser till en 10 "x 12" bakbord (eller som krävs) med ¼-20 "cap skruvar och brickor (Figur 2A). Om kopplingsdäck hål inte i linje med laser monteringshål, använda små "bordsklämmor" för att säkra laser för att bakbord.
3. (B) Om de två lasrar som används har mycket olika balkhöjder (> ~ 1 cm), använda små 4 "x 6" breadboards för att skapa en plattform för en av lasrar. Bifoga dessa styrelser till de viktigaste stora 12 "x 18" bakbord använder ¼-20 "skruvarna med brickor och fäst sedan lasern till de mindre styrelser använder skruvar eller bordsklämmor som visas i figur 2B. Fäst den andra lasern direkt till bakbord med hjälp skruvar eller en variabel höjd bordsfäste.
   Kritisk Step: Bread, skruvar, och optiska komponenter kan köpas som kejserliga eller metriska så vara konsekvent när man köper varor; standard för den här protokollet är imperial.
4. (A)Bifoga en tjock-mantlad platt-klyver / fysisk kontakt (FC / PC) korskopplingskabel till kopplingen (kallas en kopplare sladd, se figur 3) som är fysiskt ansluten till framsidan av lasern (Figur 2A).
5. (B) Trä kopplaren på en ¾ "optisk stolpen, sedan epoxi fogen mellan kopplaren och toppen av stolpen med hjälp av JB Kwik, eller liknande epoxi, för att förhindra lossning och felinriktning under användning. Fäst post till bakbord (som bakbord hålen inte alltid i linje med den nödvändiga placeringen av optiska komponenter, en befattningshavare, piedestal bas adapter, och klämgaffel används för att säkra kopplingen optiska inlägget på plats). Bifoga en tjock-mantlad kablage (kopplare sladd) till baksidan av kopplingen.
6. (B) Sätt den första styrspegel för blå laser i den kinematiska hållaren, och anslut den till bakbord med hjälp av en ¾ "optisk inlägget. Bifoga detta inlägg till en bas ADAPter och klämgaffel. Placera klämgaffeln och publicera montering direkt framför den blå laser med spegel vinklad med 45 ° för att styra lasern mot den dikroiska spegeln. Använd rutmönster av hål på kopplingsdäcket som en grov justeringsledaren. När grovt placerad, använd en ¼ "-20 skruven för att fästa klämgaffel till bakbord (se figurerna 2B, C).
7. (B) Sätt i dikroiska spegeln till en kinematisk hållaren och fäst den på en 1 "optisk inlägg och säkra direkt till bakbord. Placera dikroiska spegeln längst till vänster om, och i linje med den blå laserspegeln. Vinkla dikroiska spegeln i 45 ° vinkel så att blått ljus som reflekteras från den första spegeln reflekteras i koppel, dra åt skruven fäster kinematiska innehavaren till posten (se figurerna 2B, C).
8. (B) Fäst den första styr spegel för den gula lasern till en ¾ "optisk inlägget. Fäst optical post till en bas-adapter och klämgaffel. Placera kläm gaffel och efter ensemble direkt framför den gula laser och vinkel spegeln i 45 ° vinkel så att gult ljus kommer att riktas mot den andra styrspegeln. Säkra klämgaffel på plats med en ¼ "-20 cap skruv och bricka.
9. (B) Fäst den andra styr spegel för den gula lasern till en 1 "optisk inlägg. Vinkel spegeln så att den gula ljusstrålen från den första spegeln kommer att reflekteras genom den dikroiska och in i kopplaren (figur 2C). Säkra inlägget direkt till bakbord och dra åt fästskruven när spegeln är vinklad på lämpligt sätt. Fina spegel justeringar kommer att göras med hjälp av de kinematiska spegelfästen i ett senare steg.
10. (B) Bifoga ett neutralt gråfilter hjulet till en ¾ "optisk inlägget och placera stolpen i ett inlägg hållare monterad på en sockel. Säkra ensemblen till bakbord mellan den första och seAnläggning gula speglar med en enda ¼ "-20 cap skruv. Detta hjul används för att justera effekten på gult laserljus når kopplaren.
    Tips: Individuellt dra åt alla komponenter (t.ex. skruvarna som håller kinematiska spegelhållare till toppen av inlägg och trådar som håller bas adaptrar till botten av inlägg) innan du ansluter dem till basen. Använd en axel av en liten insexnyckel i tillhandahålls genom-hål i optiska inlägg att få tillräckligt vridmoment. Detta kommer att förhindra komponenter lossnar under användning, vilket kräver omläggningen.
11. Bifoga ett FC / PC till FC / PC L-fäste adaptern till bakbord.
12. Tillval: Säkra en 1 x 2 50/50 mini kub fiber splitter direkt till bakbord för samtidig in vivo stimulering av två eller flera djur. Dessutom kan handtagen sättas för att bistå vid förflyttning av kopplingsdäcket aggregat (såsom ses i figur 2A).

2. Laser Koppling (Beröringsfri Style Koppling)

Detta avsnitt avser den dubbla laser set-up (Figur 2B). Rikta den inre blå laser vägen innan rikta den yttre gula laserbana.

! VARNING: Använd en låg ljuseffekt koppling (~ 1 mW) för att säkerställa ögonsäkerhet. Använd skyddsglasögon till makten på lasern och dess ljusintensitet mäts och bedöms vara säker.

1. Ställ omkopplarna på baksidan av lasern för att "Curr" (ström) och transistor-transistor-logik läge (TTL) + för konstant belysning (i motsats till analog-läge). Se till att strömvredet på framför föraren är satt till noll. Sätt på lasern genom att slå på föraren först och sedan laserknappen.
2. Sakta justera strömvredet sitter på framsidan av laser föraren så att ~ 1 mW laserljus avges. Vänta 10 - 15 min (eller fastställs av tillverkaren) för laser att värma upp.
3. Anslut den fiberoptiska kabeln testare direkt till free änden av kopplaren kablage och slå på kabeltestare (Figur 3A). Justera vinkeln på kopplingen så att den röda strålen färdas rakt bakåt mot mitten av den dikroiska spegeln. Balken banan för rött ljus som avges från kabeltestare är exakt väg som det inkommande laserljus måste följa för att kopplas in i lasern.
4. Utför en grov inriktning: Använd sido och horisontella vreden på de kinematiska speglar för att styra strålen av laserljus i koppel. Klämmorna piedestal kan behöva lossas för att något flytta speglarna och kopplingen. De kinematiska fästen bör ändå ha en del resor för ytterligare finjusteringar. Var inte bekymrad om ingen blå ljus emitteras ur kopplingen anslutna kablage vid denna tid.
5. Placera ett enda stycke halv genomskinligt papper direkt framför den dikroiska spegeln, mellan dikroiska och kopplare. Det kommer att finnas både en blå och ared prick på detta papper från lasern och kabeltestare, respektive. Använd papper som är genomskinlig nog att se både de röda och blå prickar samtidigt från samma sida av papperet.
6. Finjustera den första styrspegel (dvs, den ena närmare lasern, inte dikroiska) genom att försiktigt justera sido och horisontella rattar att anpassa mitt på den röda pricken med den blå punkten.
7. Flytta pappers tillbaka mot kopplingen så att det är direkt framför kopplingen och justera vreden på den andra (dvs, dikroiskt) spegel för att rikta laserstrålen med den röda strålen.
8. Iterera över steg 2,6 & 2,7 tills mitten av de blå / gula och röda strålar är exakt i linje i båda lägena (dvs., tills de röda och blå strålar är samlinjära).
9. Ta bort kabeltestare från kopplingen sladden. Laserljus bör nu emitteras från änden av kopplaren korskopplingskabel.
10. Determine kopplingseffektiviteten genom att mäta ljuseffekt som avges från fiberspetsen av koppel kablage med hjälp av en kraftmätare. Använd 500 mW inställningen på strömmen mätarens fotodiod och ändra våglängd inställningen (λ) till blå (473 nm) eller gul (635 nm) spektrum ljus beroende på lasern som används.
11. Placera fiberspetsen vinkelrätt till fotodioden för att erhålla en effekt läsning. Jämför den ljuseffekt som kommer in i kopplaren till ljus utsända effekten från fiberänden. En kopplings effektivitet> 80% anses mycket bra. Mycket små ytterligare justeringar av den andra styrspegeln kan ibland något bättre koppling. I allmänhet när strålmönstret från änden av kopplingsfiber är en liten, tät, central plats (med inga ringar som omger den), kopplingseffektivitet med fiberkärnan är optimal.
12. Upprepa steg från 2,1 till 2,11 för gul laserkoppling, förutom använda de två styr speglar för den gula laser (se figur 2C). Gör ingent justera positionen för dikroisk spegel eller inriktning av den blå lasern kommer att gå förlorade.

3. In vivo optogenetic Stimulering

Se till att alla förfaranden som involverar djur används utförs i enlighet med lokala och nationella riktlinjer och godkänns av motsvarande Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Optisk fiber set-up (se figur 3B för identifiering av de olika typerna av kopplingskablar som anges nedan). För att stimulera en enda mus, anslut kopplingen korskopplingskabel till en tjock-mantlad kablage använder FC / FC L-fäste adaptern direkt knuten till bakbord (se figur 4A). För att stimulera två djur från en laser, anslut kopplingen korskopplingskabel till två tjocka mantlade kablage använder 1 x 2 50/50 mini kub (se figur 4B). För att stimulera tre eller flera djur, fäst kopplingen sladden till ett multimode fiber splitter använder 1 x 2 mini kub som redan finns på bakbord (se Figur 4C).
2. Bifoga en kommutator / roterande koppling till de fria ändarna av den tjocka-mantlade kablage / fiber splitter. Kommutatorer är viktigt eftersom de tillåter rotation av fibern med gnagare rörelse, vilket förhindrar ansamling av vridmoment på kablaget. För mycket vridmoment kan vrida sladdar, leda till brott, och störa djurets naturliga rörelser under testning.
3. Fäst djuret korskopplingskabel till kommutatorn.
4. Fäst en anslut delad hylsa till den fria metallbeslaget ände av djuret korskopplingskabel (Figur 5). Tvinga inte hylsan hela vägen upp hylsan; Lämna ~ 0,5 cm av ärmen exponeras som detta är vad ansluter till den implanterade fiberoptiska fäst på djuret (Figur 6).
   Kritisk Step: Köp alltid ärmar som innehåller en split för att möjliggöra expansion av ärmen över implanterade fiberskon under anslutning ochborttagning. För hårt på en passning kan orsaka allvarliga trauman till djuret om implantatet lösgör från skallen när man försöker koppla bort hylsan från implantatet. Om detta inträffar, ska djuret tas bort från studien och få omedelbar veterinär vård. Likaså före användning av ny hylsa för första gången, "bryta in" genom att i- och urkoppling en hylsa tills den kopplar med önskad mängd kraft.
   Tips: Det är lätt att bryta en fiber och ta av en hylsa som är tätt kopplad till en hylsa. För att undvika detta, tryck på hylsan ut genom att sätta in en liten trä stav i den öppna änden av hylsan (handtaget på en standardbomullspinne är rätt storlek).
5. Anslut den blå laser föraren till en pulsgenerator med hjälp av en BNC-kabeln och stäng pulsgeneratorn på.
6. Sätt lämpliga skyddsglasögon på. Ställ omkopplarna på baksidan av att "Curr" och "TTL +" -läge lasern. Se till that strömvredet på framför föraren är satt till noll andturn lasern på (slå föraren på först och sedan laserknappen).
7. Justera effektratten på framsidan av lasern så att 5-10 mW är emitteras från djuret kablagefiberspetsen mätt med användning av en ljuseffektmätare. 5-10 mW är en allmän riktlinje - exakt effektintensitet som krävs för att påverka en viss volym av vävnad bör beräknas före starten av experimentet, som i Aravanis m.fl. ^3.
8. Slå den blå laser för att "Analog" -läge för in vivo stimulering. Obs: Gula DPSS lasrar drivs i TTL + läge för konstant belysning. Vänta 10-15 min för lasern att värmas upp.
9. Hålla försiktigt musen och anslut delad hylsa på djuret patch sladden till kronisk implanterbara fiber (se figur 6). Se till ändarna av båda fibrerna gör fysisk kontakt med varandra. Använd splittringen på anslutningshylsan som enfönstret för att visualisera direktkontakt mellan de två kritiska steg:. Ibland skräp kan samlas på metallhylsa av djurets implanterbara fiber och störa korrekt anslutning. I det här fallet använder en etanol torka för att försiktigt rengöra hylsan på djurets huvud före fastsättning. Tvinga aldrig en anslutningshylsa över hylsan eftersom detta kan leda till trauma för djuret. Om en fysisk anslutning mellan fiberändarna inte kan göras efter rengöring, ta bort djuret från studien.
   Tips: Lätt läckage kan uppstå vid anslutningspunkten mellan den implanterade fiber och djurkorskopplingskabel. Visualisering av detta ljus från gnagare kan utgöra en experimentell FÖRVÄXLA ^10. Krympslang kan fästas på kablage och gled över anslutningspunkten för att minimera ströljus.
10. Låt musen för att återhämta sig under några minuter före starten av beteendetestning.
    Tips: DBeroende på om beteendetestet som ska administreras, är det bäst att vänja möss till anslutningen och tjudra process 2-3 dagar innan, eftersom hanteringen krävs för att ansluta djuret kan framkalla stress och förbrylla beteendetester.
11. Placera musen i beteendetester apparaten säkerställa att kontakten sladden är fri från torrakor. Lämna aldrig ett djur utan tillsyn under stimulering. Även med användning av kommutatorer, behöver kopplingskablar har en tendens att vrida sig under långa tidsperioder och kan störa beteendetestning.
12. Använd en pulsgenerator för att pulsera blå laser vid en förutbestämd frekvens som aktiverar opsin val. För gul laser användning: puls den gula laser med externa jalusier eller genom att helt enkelt blockera strålgången med en ogenomskinlig, icke-reflekterande, icke brännbar objekt.

4. Lägg upp In vivo Stimulation Överväganden

Detta avsnitt är inte avsedd att vara en komplett protocol men erbjuds som vägledning för ytterligare förfaranden som bör beaktas efter in vivo optogenetic stimulering.

1. Efter avslutad ett experiment, bekräftar viral och fiberplacering histologiskt för noggrann tolkning av beteende resultat. Euthanize djur enligt institutionella riktlinjer och BEGJUTA djuret med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 4% (vikt / volym) paraformaldehyd i PBS.
2. Ta implanterad fiberoptik med ordentligt tag den exponerade metallhylsa med tång eller peanger. Dra upp i en smidig, men ändå snabb, rörelse. Det är viktigt att testa integriteten av den implanterade fibern genom att mäta ljusflöde vid slutet av varje experiment.
3. Post-fix hjärnorna i paraformaldehyd i minst 24-48 timmar innan snitt genom regionen av intresse. (Om du använder en frys mikrotom, inkubera hjärnor i en 30% sackaroslösning i flera dagar innan snitt). Utför immunohistokemi med användning standard protokoll för detektion av lämpliga opsin-taggade fluoroforer, dvs grönt fluorescerande protein (GFP), förbättrad gula fluorescerande protein (EYFP) eller mCherry.
4. Kontrollera platsen för opsin uttryck och implantat fiber i mikroskop och visuellt bekräfta lämplig placering av virusinjektion och implantat baserade på utvalda koordinater.

Representative Results

Beteende resultat som erhållits med in vivo optogenetic stimulering är helt beroende av det neurala kretsen blir måltavla, djurmodell som används, och moduleringsparametrarna. För aktuella demonstra syften, dopaminneuroner i ventrala tegmentala området, eller VTA, av tyrosinhydroxylas :: Cre möss transducerades med en stabil steg-funktions opsin (SSFO) ^8, eller kontrollvirus (EYFP), och en implantatfiber var kroniskt implanteras. Användningen av TH :: Cre transgena möss säkerställer att opsin uttryck är begränsad till TH + celler (dopamin) i VTA. Figur 7 visar representativa beteende resultat som erhållits med den aktuella beskrivna laser set-up för samtidig stimulering av flera möss. Här, möss var tjudrad och stimuleras samtidigt använder separata lasrar (3 möss / laser som i figur 4C) och rörelsebeteende noterades under 1 timme. Upprepad stimulering av dopamin neuroner i VTA resulterade i enhyperaktiva fenotyp som kvarstod under hela stimulans. Ingen förändring av rörelsebeteende sågs i EYFP möss (se video 1). Efter beteendetester, var immunohistokemi utförs för att verifiera korrekt viral inriktning till VTA dopaminneuroner och fiber placering visuellt bekräftade (se figur 7).

Figur 1. Experimentella steg för in vivo optogenetic stimulans. Det finns fyra allmänna steg som ingår när man utformar och utför in vivo optogenetic stimulering. Detta protokoll specifikt beskrivs de steg som ingår i leveransen av ljus från en laser ljuskälla till djupa hjärnstrukturer i beter gnagare och omfattar 1) lasersystem montering och lätta koppling; 2) tjudra strategier för connecting flera djur till en ljuskälla för hög genomströmning beteendetester och 3) ger riktlinjer för att bekräfta inriktning strategi för lätta leverans - ett steg som är avgörande för tolkning av data. Obs: även om detta protokoll är inte exklusivt för kronisk implanterbara fibrer för tjudra ändamål, rekommenderas och antas vid kombination optogenetic stimulering med beteendetester. Se både Ung & Arenkiel 2012 ¹⁸ och Sparta et al., 2012 ⁹ för egen produktion och implantation av kroniska optiska fibrer. Heldragna linjer = steg omfattas av detta protokoll.

Figur 2. Lasersystem används för in vivo optogenetic stimulering. (A) Single lasersystem för in vivo stimulering. Denna laser är ph ysically pre kopplade med tillverkaren och kräver lite slutanvändaren set-up. (B) Dubbla lasersystem. Två lasrar är kopplade till en enda fiber med hjälp av speglar som fungerar för att styra varje strålgången i en beröringsfri stil kopplare. Detta är den mest mångsidiga uppställning som optiska komponenter kan tas bort eller läggas till efter behov, men presenterar mer av en utmaning när det gäller effektiv laserkoppling. (C) Schematisk bild av dubbla lasersystem som visas i (B) indikerar placering av lasrar och speglar med motsvarande laserljusstrålens väg (pilar) avbildade. Här, är den dikroiska spegeln "D" används för att avleda blå ljusvåglängder under sändning gula våglängder genom till kopplaren "C" och i den bifogade kopplaren korskopplingskabel. B = blå laser; C = beröringsfri stil kopplare; D = dikroisk spegel; FW = filterhjulet; M = Spegel; Y = gul laser.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. (A) Kabeltestare används i de icke-fysiska kopplingsprotokoll Botten:. Kabeltestare direkt ansluten till en korskopplingskabel. Insert skildrar anslutningspunkt för testare till kabel (B) Patch sladdar avses hela protokollet från yttre till inre:.. Multimode fiber splitter, svart-mantlad djur korskopplingskabel med vit zirkon delade hylsan fäst vid platt-klyver (FC) slutet, tjock-mantlad kablage (även hänvisad till som en "kopplare sladd"). Tjock-mantlad kablage är belagda med polyvinylklorid (PVC) slang för extra skydd. För dessa kablar är branschstandard färgkoder som används för att skilja mellan olika fibertyper, där apelsin = multifiber. Djur kablage är tunnare mantlade att medge flexibilitet för djurförflyttningar under beteendetester. Observera att dammlock placeras på FC / PC slutar när kablarna inte används. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. tethering strategier för in vivo optogenetic stimulering av (A) ett enda djur, (B) två djur; . (C) tre eller fyra djur Möjliga konfigurationer är inte begränsade till de som visas ovan - flera konfigurationer är möjliga genom den unika kombinationen av adaptrar, fibersplitters och förgreningar patchkablar som finns tillgängliga i handeln eller sedvana ordning. Obs: korskopplingskablar och fiberdelare innehåller FC / PC-kontakter i båda ändar (endast en ände avbildas).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Korrekt och felaktig (röd x) anslutning av ett plåster sladd till en implanterbar fiberoptik med hjälp av en delad hylsa. (Vänster panel) A zirconia delad hylsa används för att ansluta en patch sladd till beslaget av en implanterbar fiberoptik (visas här inte fäst på ett djur). Pilen pekar på anslutningspunkten mellan kablage och implanterbara fiberoptik. Jämför med (höger panel) där det finns ett gap mellan kablage och implanterbara fiberoptik, som visualiseras genom uppdelningen av anslutningshylsan. Notera ljusläckage som kan uppstå med en felaktig anslutning (nere till höger). Botten insatsen på upper vänstra panelen skildrar enskilda komponenter som används. Från toppen till botten av insatsen: Doric implanterbar fiberoptik kanyl, vit zirconia split-hylsa, platt-Cleeve (FC) i slutet av ett svart-mantlad djur kablage (full kablage visas i figur 3B). I alla paneler, notera att anslutningshylsan inte jäms med FC ände kablaget. Lämna ~ 0,5 cm av en över hänga för anslutning till den implanterbara fiberoptiska fästs på djuret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Side (vänster) och frontala (höger) bild av en mus med en inopererad fiberoptik ansluten till en korskopplingskabel. Använd splittringen på anslutningshylsan för att visualisera korrekt anslutning av kablage to hylsan av den implanterade fiberoptik. Anslutningspunkten markeras med en röd streckad ruta och även avbildad i den övre insatsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. Representativa resultat. (Vänster) Beteende avläsning av in vivo optogenetic stimulering. Exempel på beteenden som kan erhållas med hjälp av den beskrivna laser uppsättning och Delning protokoll. Rörelseaktiviteten spelades in under optogenetic stimulering av den ventrala tegmentala arean (VTA) i tyrosinhydroxylas (TH) :: Cre möss (n = 7-8 / grupp) transducerades med antingen ett steg-funktions opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) eller kontroll-virus (AAV5-DIO-EYFP) i VTA. Grupper om tre möss samtidigt bundna till en endalaser som visas i figur 4C och stimulerades med en 5 sek puls av 447 eller 473 nm ljus avges en gång varje 15 min. Tvåvägs upprepade mätningar ANOVA visade en betydande grupp x tid interaktion (F _3,39 = 15,27, p <0,0001) och en signifikant huvudeffekt av tid (F _3,39 = 4,67, p = 0,007), varigenom optogenetic stimulering ökad rörelseaktivitet endast i SSFO möss (Bonferroni post hoc-p <0,0001, jämfört med t = 0-15 tids bin) vilket resulterade i en total ökning av rörelseaktivitet jämfört med EYFP möss (huvudsakliga effekten av grupp: F _1,39 = 10,69, p = 0,0061, Bonferroni post hoc-p <0,01 vid t = 15-30 och p <0,001 vid t = 30 - 45 och t = 45 - 60). Fiber specs: 200 um kärna, 0,22 NA. Ljus irradians = 6-66 mW / ^mm2, motsvarande fiberspets avstånd av 0,1-0,6 mm från viral injektionsstället med 5 mW ljuseffekt som avges vid fiberspetsen före uppbindning. Felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. EYFPvs SSFO: ** p <0,01; *** P <0,001; tidseffekt: #### p <0,0001 (höger) Histologisk bekräftelse av viral och fiberoptisk placering.. Konfokal fluorescens bild förvärvats på en Leica TCS SP5 scanning laser mikroskop användes för att visualisera fiberplacering (streckad linje) och viral-medierad uttryck (grön) i musen ventrala tegmentumområdet efter in vivo optogenetic stimulering. Dopaminneuroner (TH +) ses i blått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1. In vivo optogenetic stimulering:. Hyperactivity under VTA stimulering med hjälp SSFO i TH :: Cre möss Klicka här för att se filmen.

Tabell 1. Ljus irradiances krävs för att aktivera ofta använda opsins.
Opsin Variant	λ	Strömtäthet (/ mm 2)		Egenskaper
			På / Av Kinetics
Optisk excitation: Snabbverkande channelrhodopsins
ChR2 2	470	1 - 5mW	1,21 / 12 ms	Bränder upp till 40 Hz
Cheta 19	490	5 mW	0.86 / 8.5 ms	Bränder upp till 200 Hz
Chief 20	450	1,65 mW	1,62 / 12 ms	Icke desensibiliserande form av ChR2
C1V 18	540-630	8 mW (540 nm)	5/34 ms vid 540nm	Röd-skiftat
		3,2 mW (630nm)	67 ms (på) vid 630nm
Optisk excitation: Långsam verkande kanal rhodopsins
Stabil steg funktion opsin (SFO) 8	470/590	8 pW (470 nm)	20 ms / 29 min	Nya SFO variant; längre öppet läge. Öppnad av 470 nm, stängs med 590 nm
Optisk Inhibering
eNpHR3.0 21	560-630	3 - 5 mW	2,5 msek / <10 ms	Ihållande inhibition i 30 min 22 med konstant ljus *
ArchT3.0 11, 23	520-560	1 - 5 mW	2 / <10 ms	Känsligare med större fotoströmmar än eNpHR3.0 </ Td>
Denna tabell kan användas som en vägledning; specifika ljus irradiances krävs för neural modulering bör oberoende bekräftas.
Experimentell validering är viktigt att kontrollera att opsin, inriktning strategi, och lätta stimuleringsparametrar modulerar neurala bränning på avsett sätt 5.
Effekttäthet (mW / mm2) hänvisar till kraften i ljuset lyser på ett visst område av hjärnvävnad och avser inte ljuseffekt som avges från fiberspetsen.
* Alltid använda den lägsta ljusintensiteten möjligt, särskilt med långvarig ljusstimulering.

Tabell 1. Ljus irradiances krävs för att aktivera ofta använda opsins.
Förkortningar
AAV = adenoassocierat virus
DPSS = diodpumpad solid state
FC / PC = flat klyver / fysisk kontakt
GFP = grön fluorescerande protein
PBS = fosfatbuffrad saltlösning
PVC = polyvinylklorid
mW = milliwatt
NA = numerisk apertur
SSFO = stabilt steg-funktionen opsin
TH = tyrosinhydroxylas
TTL = transistor-transistorlogik
V = spänning
VTA = Ventrala tegmentområdet

Discussion

De nuvarande beskrivna laser uppställningar och tjudra strategier är kompatibla med ett brett utbud av gnagare beteendetester. I själva verket har en mängd olika beteendetester använts efter, eller medföljande, för att in vivo optogenetic stimulering som omfattar känslobeteende arbetsuppgifter, beteende conditioning, inlärning och minne paradigm, sömn, upphetsning och appetitive arbetsuppgifter nämna några (se Nieh et al. ⁶ för en omfattande översyn). Optogenetik har förändrat hur traditionella beteendetester utförs genom att flera dagars studier kan nu kondenseras till en enda session där beteende jämförs, inom-ämnen, under olika epoker av ljus "på" kontra "off" ^5. Notera beteende apparater som innehåller dörröppningar, stängda fack eller andra hinder kan behöva modifieras för att rymma passage av bundna fibrer.

Den beskrivna tjudra strategier tillstånd simultaneous stimulering av multipel möss från en enda laser. Hög genomströmning optogenetic beteendetester kan därför uppnås genom användning av flera lasrar och testutrustning. Antalet djur som kan samtidigt stimuleras, kommer dock att begränsas av den maximala ljuseffekten som kan uppnås vid varje fiberspets. Maximal uteffekt vid fiberspetsen är beroende av 1) startkraft av lasern; 2) kopplingseffektivitet och 3) antal balk splittringar. För en 100 mW blå laser med ~ 80% kopplingseffektivitet och upp till 4 balk split (som visas i figur 4C), medeleffekt på fiberspetsen kan variera mellan 5-10 mW vid användning 200 um kärna, 0.22 NA fiber kablage (nb förväntar transmissionsförluster från roterskarvar vara <15%). Mätning ljusflöde vid fiberspetsen är avgörande för att bestämma lämplig ljuseffekt för opsin aktivering som opsins skiljer sig i sin känslighet för ljus och därmed ljuseffekttäthet (mW/ Mm ²⁾ som krävs för aktivering ^11. Till exempel, den stabila steg-funktionen opsin (SSFO) fungerar som en foton ackumulator och kräver därför mycket lite ljus effekttäthet för aktivering (<8 ^ W / mm ^{2) 8.} Jämför detta med den traditionella kanalen rodopsin (ChR2) som kräver ett minimum av 1 mW / ^mm2 av ljus för att framkalla aktionspotentialer ^2. Tabell 1 tillhandahålls som en snabbreferens för kända minimiljus irradiances krävs för att aktivera de vanligaste opsins närvarande använda. Slutligen måste man överväga att lätta scatters och absorberar när den färdas genom hjärnvävnad så att mer ljus effekt krävs för djupare hjärnstrukturer ^3. En användbar resurs online finns på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php som beräknar ljusintensiteten vid olika djup genom hjärnvävnad genom att ta hänsynkonto fiberkärnan storlek, numerisk apertur, ljusvåglängd som används, och startljuseffekten vid fiberspetsen. För en utmärkt översikt över de teoretiska principer som ligger bakom dessa beräkningar, se Foutz et al. (2012) ^12. Exempel på hur man kan tillämpa dessa principer och beräkningar till experimentell design demonstreras i Aravanis et al. (2007) ³ och Tye et al. (2012) ^13. Utföra dessa beräkningar före starten av ett experiment är avgörande för att säkerställa tillräcklig ljus irradians för opsin aktivering. Med tanke på dessa överväganden, är det fördelaktigt att köpa högre drivna lasrar för att säkerställa tillräcklig uteffekt. Lasrar med en effekt mellan 100-200 mW är generellt tillräckliga för att kompensera för små kärnfibrer, fiber delning multipel, kopplings ineffektivitet och transmission förlorar ^7. Om du använder högeffektlasrar dock måste man vara försiktig för att undvika nervskador eller värme och ljus-associerad artefakter som kan uppstå vid långvarig och / eller hög effekt ljus belysning ^7. Ett säkert område för in vivo experiment är upp till 75 mW / ^{mm2. 14}

Besluta om vilken typ av laser för att köpet kan vara en komplicerad fråga eftersom det finns många faktorer att tänka på. Till exempel, direktdiodlasrar ger stabilare och repeterbar pulsad uteffekt än vad diodpumpade solid-state (DPSS) lasrar, och är mer tillförlitliga över tid i en labbmiljö. I vissa fall kan dock direkta diodlasrar avger en lägre ljuseffekt, ~ 0,1 mW, även när kommandot spänningen är 0 V på grund av en konstant förspänningsström skickas till dioden med laserns styrelektronik. Denna "spontana" emission har ett bredare spektrum än vad laseremission från samma laser, så kan specifikt minskas genom att installera ett smalt bandpass (eller "rensning") filter mellan lasern och kopplare (se lista delar). Detta filter kommer ocksåminska uteffekten med ~ 50% när laser, så köp en högre driven laser därefter. Det bör noteras att de gula DPSS lasrar är extremt känsliga och kan bete sig oregelbundet och har reducerad livslängd om snabbt moduleras av en pulsgenerator. Justering av gula lasereffekt bör ske genom externa densitet filterhjul placerade i strålgången (avsnitt 1.7) medan rörelse lasern i TTL + läge. Alternativt köpa en grön 532 nm DPSS laser är ett kostnadseffektivt alternativ som kan aktivera både halorhodopsins och archaerhodopsins.

Den numeriska bländaröppningen (NA) i en fiber är viktigt att tänka på när man utformar och köpa fiberkomponenter för laserenhet set-up. NA hos en optisk fiber bestämmer vinklarna för ljusstrålar som kan accepteras och avges på spetsen av en fiber. Om en högre NA fiber är parad med en lägre NA fiber, kommer betydande förlust inträffar vid det gränssnittet, så det är viktigt att vara konsekvent wi th fiber NA i en enda installation (eller för att se till att NA ökar längs strålgången). Effekten av fiber NA på volymen av hjärnvävnad belyst är mindre viktigt, eftersom hjärnvävnaden är mycket spridning, och eftersom belysningen kopplad från en laserkälla tenderar att "underfill" high-NA fibrer; Men optiska fibrer med en NA på 0,22 och 0,37 är vanligt förekommande. Likaså koppling från en större kärna till en mindre kärna fiber kommer också att leda till betydande förluster, så alltid se till att använda ökar eller lika kärndiametrar när skrider från laserkällan till implantat djuret. Rent allmänt bör fiberändarna alltid vara maximerad när den inte används för att förhindra damm och partiklar uppbyggnad. Det är en bra idé att regelbundet rena fiberändar och kontakter (70% isopropylalkohol fungerar bra) för att säkerställa maximal ljuseffekt, och att testa ljus uteffekt genom en "dummy implantat" innan varje dags experiment.

"> Under beteendetester, är det absolut nödvändigt att åtgärder vidtas för att kontrollera för effekterna av virusinfektion, exogena proteinuttryck, synligt ljus, och eventuella vävnadsuppvärmningseffekter och artefakter på djurens beteende. Därför bör den riktiga kontrollgruppen består av djur omvandlas med en kontrollvirus (t.ex. GFP, EYFP, mCherry) som tar emot identiska ljusstimuleringsparametrar. Experimentell verifiering är en avgörande sista steget som de beteendedata som används för analys är helt beroende av korrekt opsin och fiberoptisk placering i regionen av intresse . Närmare bestämt i djur där ingen immunhistokemisk signal upptäcks, eller där placering av signal eller fiber inte är i regionen av intresse, då beteendedata för detta djur bör tas bort från experimentet. Dessutom är det viktigt att testa ljusflöde på fiberspetsen både före kirurgisk implantation och igen efter slakt för att säkerställa tillräcklig ljuseffekt för opsin aktivering. I animals där svår ljusförlust har inträffat genom fibern efter experimenterande (> 30%) ^9, data för detta djur bör övervägas för borttagning. Kriterier för avlägsnande bör fastställas på förhand. Slutligen måste man ta hänsyn till pulsfrekvens som krävs för att modulera neural bränning, vilket beror på hjärnans struktur och neuronala subtyper blir måltavla. Publicerade optogenetic ljus stimuleringsparametrar finns för flera neuronala subtyper, bör dock förmågan att modulera neural bränning oberoende bekräftas genom in vivo eller hjärn slice elektrofysiologiska inspelningar.

Som man blir skickliga med laser användning och modifiering av laser uppställningar, kan kombinationer av olika våglängder vara uppbundna till flera fibrer på ett enskilt djur eller levereras ner samma fiber för kombinato optogenetik ^8. Multi-våglängd stimulering kommer att bli allt viktigare med tanke på den snabba utvecklingen av rödförskjutningened channelrhodopsins ^8, verkstads av blå-skiftat hyperpolarizing opsins ^15, användningen av bistabila steg-funktion opsins ^8,16,17, och den allmänna växande listan över opsins med distinkt aktiverings spektra ^11. Denna expansion av optogenetic verktygslåda kommer att möjliggöra oöverträffad kontroll av flera neurala subtyper både inom och mellan hjärnregioner för att fastställa deras roll i styrande komplexa beteende stater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1213	For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1012	For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2)	Thorlabs	MB4	For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" stainless post (quantity: 1)	Thorlabs	TR075
1" stainless post (quantity: 4)	Thorlabs	TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2)	Thorlabs	PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3)	Thorlabs	BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1)	Thorlabs	KM100	For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1)	Thorlabs	FB450-10	For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength)	Various		! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1)	Eclipse	902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1)	Thorlabs	FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1)	Thorlabs	PM100D	Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1)	Thorlabs	S130C	Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2)	FONT Canada		Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1)	Rigol	DG1022	Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8)	DORIC	MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5	Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1)	Precision fiber Products	SM-CS1140S1	Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4)	Thorlabs		200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering