Summary
Modeller af spontan metastatisk renalcellekarcinom (RCC) sygdomsprogression kan anvendes til at evaluere behandlinger i klinisk relevant indstilling. Denne protokol demonstrerer forskellige procedurer for ortotopisk nyre tumor celle implantation, ordentlig nefrektomi, og endelig skitserer en obduktion vejledning for visuel og selvlysende scoring af metastatisk byrde og lokalisering.
Abstract
En af de vigtigste udfordringer for forbedret afprøvning af nye eksperimentelle lægemidler i renalcellecarcinom (RCC) er udviklingen af modeller, der trofast rekapitulere metastatisk sygdomsprogression tidlige og den sene fase. Typiske tumor implantation modeller udnytte ektopisk eller orthotopisk primær tumor implantation, men få indbefatter systemisk spontan metastatisk sygdom, der efterligner det kliniske miljø. Denne protokol beskriver de vigtigste skridt til at udvikle RCC sygdomsprogression stadier tilsvarende patienter. For det første anvender en meget metastatisk musetumor cellelinie i en syngen model til at vise ortotopisk tumorcelle implantation. Metoder omfatter overfladisk og intern implantation i sub-kapsulær rum med celler kombineret med matrigel at forhindre lækage og tidlig spredning. Derefter beskrives procedurerne for excision af tumor-bærende nyre (nefrektomi), med kritisk præ-og post-kirurgisk mus pleje. Endelig skitserer de nødvendige skridt til at overvåge og vurderemikro-og makro-metastatisk sygdomsprogression, herunder selvlysende billedbehandling samt giver en detaljeret visuel obduktion guide til at score systemisk sygdom distribution. Målet med denne protokol beskrivelse er at lette den udbredte brug af klinisk relevante metastatisk RCC modeller til at forbedre den prædiktive værdi af fremtidig terapeutisk test.
Introduction
Den største årsag til dødelighed hos patienter med renalcellecarcinom (RCC) er systemisk metastatisk sygdom, der typisk forekommer efter kirurgisk fjernelse af en primær tumor vokser i nyrerne. Men meget få prækliniske tumormodeller evaluering eksperimentelle lægemidler i mus har metastatisk sygdom, og endnu færre trofast rekapitulere de kliniske stadier af lokaliseret vækst, kirurgi og spontan mikro-metastatisk initiering og progression 1-3. Dette hul i test er blevet stadig vigtigere i evalueringen af nye behandlingsformer, som undertiden slående anti-tumor effekt set i dyremodeller har ikke altid oversat til tilsvarende vellykket behandling af patienter på 4. Sådanne forskelle i resultaterne kan stamme fra differentierede efficacies narkotika mellem lokaliserede ektopiske eller ortotopisk primær tumor modeller og sen-fase metastatisk sygdom 5-7. I tilfælde af RCC, har kun få undersøgelser anvendte etableret enNimal protokoller, der omfatter spontane tilbagevendende sygdom, der efterligner patienter, der typisk har haft tumor-bærende nyrer helt eller delvist fjernet 2,3. Årsagerne til denne mangel i musemodel test varierer. Først er der den høje dyr omkostninger og iboende variabilitet af tumorcelle udvælgelse og metastatisk potentiale. For eksempel humane nyrecellelinier tendens til sjældent metastaserer, og skal udvælges over flere runder af orthotopisk primære implantation og metastatisk valg at udlede varianter, der konsekvent udbrede og danner fjerne læsioner (se beskrivelse af en sådan human cellelinie afledning 8-10) . Omvendt museceller i immunkompetente modeller tendens til at opføre sig aggressivt og lavt celleantal skal injiceres med Matrigel at reducere øjeblikkelig spredes systemisk 3. For det andet, de tekniske vanskeligheder med at udføre korrekt implantation kirurgisk resektion (nephrectomy), og sporing (og kvantificere) spontan metastatic vækst kan være udfordrende og flere kritiske variabler skal tages i betragtning ansætte denne teknik (se Diskussion for detaljer). Formålet med denne protokol er at beskrive de væsentlige skridt (samt potentielle faldgruber) af ortotopisk implantation, resektion (nefrektomi), og overvågning af spontan metastatisk RCC sygdom og tilbyde en guideline for standardiseret (og mere udbredt) bruger blandt videnskabelige laboratorier at vurdere effekten af eksperimentelle lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ortotopisk Nyre Tumor Implantation
- Celledyrkning
- Før orthotopisk implantation vokse muse RENCA LUC-celler som et monolag til 75% konfluens.
- Efter trypsinisering og resuspension i 5% FBS, der indeholder medier, centrifuger cellerne ved 1.000 rpm, 4 ° C i 5 minutter, gentagelse 3 gange for at vaske i PBS. Derefter resuspenderes cellerne i serumfrie medier til en koncentration på 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 pi serum-frie medier.
Bemærk: Afhængig af variant eller cellelinie kan celler resuspenderes i et 1:1-forhold af matrigel og serumfri medier til at bremse stærkt aggressive mus cellevækst og udbredelse efter implantation.
- Kirurgi og celle implantation
Bemærk: Alle dyreforsøg beskrevet deri, herunder vedligeholdelse og bestemmelse af eksperimentelle endpoints, blev udført i henhold til en institutionel Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol godkendt af Roswell Park Cancer Institute.- Bedøver en Balb / C mus ved hjælp af Isofluran (2-3%). Knib fod og tjekke for refleks for at sikre tilstrækkelig bedøvelse. Påfør dyrlæge salve til øjnene for at forhindre udtørring. Placer musen i højre sideleje og barbere venstre side mellem for-og bagben-lemmer. Anvend alkohol og iod langs dorsale lændeområde til aseptisk forberede område for indsnit.
- Brug kirurgiske sakse til at indlede en 1 cm incision i huden i en langsgående retning mellem den sidste ribben og hofteleddet. Løsne bindevæv under huden ved hjælp af en stump dissektion saks. Brug kirurgiske sakse til at gøre en 0,5 cm snit i en langsgående retning i bugvæggen. Brug buede pincet til forsigtigt at presse ned omkring åbne sår - dette vil eksteriorisere nyrerne og give mulighed for skånsom immobilisering af orgel før injektion.
- Indlæse Hamilton sprøjte med 5 pi den forberedte celleblandingen. For sub-kapsulære implanninger kan to implantationsforsøg metoder anvendes:
- Overfladisk: Løb parallelt med længderetningen orienteret nyre, indsætte nålen under nyrekapslen (men især parenkym) med den skrå kant op. Når nålen er på plads, injicere alle cellerne indtil små hvide boble former. Langsomt fjerne kanylen fra kapsel og straks skamplet løbet injektion med en steril bomuld tippes applikator til at absorbere enhver udsivning og forhindre spredning celle.
- Indre: Med skrå kant og ud fra den side af nyre modsat endelige implantationsstedet, indsætte nålen gennem indre af nyre, indtil nålen er synlige (men ikke at punktere) sub-kapsulær rum. Injicer alle cellerne, indtil hvide boble former og svaber injektionsstedet for at forebygge lækage.
- Forsigtigt tilbage nyrerne til kropskaviteten. Luk abdominal krop væggen ved hjælp af resorberbare 5-0 Vicryl sutur. Når du er færdig, trække huden lag sammen og læg 2-3 wound klip. Sørg klip er fast og jævnt fordelt for at sikre, at ingen sår eksponering. Forud for nyttiggørelse administrere 500 ul 0,9% NaCl og 100 pi af buprenorphin (0,01 mg / ml) subkutant ved anvendelse af en 25 G nål. Rutinemæssigt Monitorclip placering og stabilitet, og tag efter 10 dage.
2.. Nephrectomi / Primær Tumor Removal
- Følg identisk protokol for mus bedøvelse, immobilisering, indsnit, og eksponering af nyre, som beskrevet i afsnit 1.2.1 og 1.2.2 (ovenfor).
- Brug en anden tang til at isolere nyren ved forsigtigt at fjerne den forbindende fedtvæv fra den kaudale ende og binyrerne kraniale ende af nyrerne. Mens forsigtigt fat i nyren, brug resorberbare 5-0 Vicryl sutur at gøre en dobbelt knude rundt urinlederen, nyrearterie og vene. Langsomt sikker og derefter skæres over knuden for at fjerne nyren. Hvis nogen tegn på umiddelbart blodtab, eller der er en risiko for utilstrækkelig holdaf sutur på ureter, arterie og vene, og brug derefter cauterizer stedet for saks til at klippe over knude.
- Når nyre er fjernet, omhyggeligt kontrollere blødning fra den bundne arterie og bruge cauterizer om nødvendigt. Luk abdominal krop væggen med 5-0 Vicryl. Træk huden lag sammen og læg 2-3 sårklemmer efter samme forholdsregler som beskrevet i 1.2.4. Nøje overvåge dyr dagligt efter operation for tegn på lidelse, blødning eller begrænset mobilitet. Følg de institutionelle retningslinjer for dyr sikkert.
3.. Overvågning metastaserende progression og lokalisering på Endpoint
- Metastatisk sygdom kvantificering: Bioluminescent overvågning
- Se metode tidligere beskrevet i JOVE til overvågning metastaser hjælp celler transficeret med luciferase og kvantificeres ved hjælp af Xenogen IVIS billedbehandlingssystem 11,12.
- Visuel obduktion guide for sammenlignende vurdering af metastatisk distribution
- Sacrifice dyr efter fastlagte retningslinier hjælp effektmål, herunder tegn på lidelse, besværet vejrtrækning, vægttab, osv.
Bemærk: Tæt monitorering af dyr er kritisk, da spontan metastatisk progression kan være meget varierende og hurtig. - Brug kirurgiske saks til at indlede et snit over urinrøret, der fortsætter op brysthulen til undernæb. Brug stumpendede saks til at adskille huden fra musklen i bugvæggen.
- Igangsætte indsnit langs arme og ben. Peel huden væk. Nøje undersøge huden fascia og bugvæggen for knuder, så de overfladiske lymfeknuder: lyskebrok, brachialis, aksil og overfladisk livmoderhalskræft.
- Lave et snit i bugvæggen og skåret langs venstre og højre laterale sider op til membranen. Med én vandret snit fjerne den forreste del af bugvæggen til bare indvoldene.
- Undersøg uforstyrret udseende indvoldene feller groft bemærkelsesværdige tumorer. Bemærk også indholdet af mave og tarme; hvis de er tomme, kan musen ikke har været i stand til at spise. Hvis indholdet er mørke, kan det være tegn tegn på øvre / nedre gastrointestinal blødning.
- Visuelt score hvert organ for tumor tilstedeværelse eller fravær, tildele en samlet score for hver mus gruppe (4 dyr i hver gruppe bruges som eksempel i figur 1D-i).
Noter: 1) Udvidelse af lymfeknuder betyder ikke nødvendigvis, at det er en tumor vækst; hvis det er stærkt størrelse, meget fast, og en hvidlig farve, er det sandsynligt en metastatisk knude. 2) Overdreven mælkeagtig eller uklar væske i maven indikerer ascites. Ascites kan omfatte faste ophobninger på de abdominale organer, især mellem lapperne på leveren og maven. 3) for organer såsom lungerne, kan flere knuder være til stede og talt for sammenligninger mellem de enkelte dyr (se 13 for eksempel). - Identificere alvorlige tumorer eller abnormiteter i de enkelte abdominale organer: lever, milt, nyrer og bugspytkirtel ved omhyggeligt at fjerne og vask med PBS fra en sprøjteflaske.
- Efter fjernelse af de abdominale organer, inspicere abdominale lymfeknuder, herunder columna, sacral, nyre, og mesenteriallymfeknuderne lymfeknude.
- Vurdere membran for tegn på metastatisk spredning.
Bemærk: Omfattende spredning på membranen kan få det til at miste sin kontraktilitet, hvilket fører til arbejdet eller tab af vejrtrækning. - Fjern membranen og gøre to laterale indsnit i brysthulen, fjerne den forreste del at udsætte lungerne og hjertet.
- Fjern lunger og hjerte ved forsigtigt at gribe og løfte spiserøret og skære luftrøret over hjertet. Vurdere væv til knuder. Klem hjerte. Mangel på fjedrende konsistens kan indikere tumor til stede.
- Brug kirurgisk saks til at klippe lineært gennem kraniet. Forsigtigt fjerne små stykker af kranium indtil than hele hjernen er udsat for. Kig gennem hjernen for synlige knuder eller deformiteter misfarvninger.
- Sacrifice dyr efter fastlagte retningslinier hjælp effektmål, herunder tegn på lidelse, besværet vejrtrækning, vægttab, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en skematisk skitserer de procedurer, der er beskrevet i denne protokol resumé. Flere vigtige faktorer skal overvejes for hvert trin. For eksempel er det i trin 1 viser to metoder til sub-kapsulær tumorcelle implantation i nyrerne. Tumorceller kan implanteres i sub-kapsulær rum med en lille hvid-bubble bekræfter lokaliseret placering af celler med lækage forhindres ved omhyggelig fjernelse af nålen og pensling overskydende væskeudslip (Figur 1B-i). For at forhindre lækage kan celler implanteres internt første til at nå sub kapselintern plads (fig. 1B-ii), og kombineret med Matrigel at forhindre den oprindelige fordeling af tumorceller i blodbanen. Til kirurgisk fjernelse af nyre, nøjagtige timing afhænger af vækst og metastatisk potentiale cellelinie. Optimal nefrektomi praksis omfatter en hurtig, men kontrolleret, kirurgisk procedure for at minimere mus nød og nyttiggørelse. Tøjre og sikker knotting af Vicryl at lukke ureter, renal arterie og vene er nøglen til at undgå hemorrhaging (se figur 1C). Ætsninger skal anvendes, men kun hvis potentiale af overskydende blødning kræver indgriben. Endelig sporing af spontan sygdom ved non-invasive bioluminiscerende vurdering tillader fortsat overvågning af okkulte læsioner og vækst, samt kvantificering ved endpoint (se figur 1D). Dog kan brugen af luciferase-mærkede celler i spontane metastase modeller undertiden føre til klonal tumor celle udvalg af varianter, som måske ikke udtrykker det transficerede gen, og derfor måske ikke altid er synlige efter flere runder af udvælgelse eller langvarig tumorvækst. I dette tilfælde kan klinisk relevant histologisk analyse udføres for at identificere mikro-metastatiske læsioner, eller, hvis det ikke er teknisk (af økonomisk) mulig, kan en visuel scoring metode til at vurdere visuel makro-metastatisk sygdom bruges som en overfladisk mål for presence / fravær af læsioner i organvæv (figur 1D-i og 1D-ii).
Figur 1.. A) Skematisk af kirurgiske procedurer, herunder implantation (trin 1), kirurgisk resektion / nefrektomi (trin 2), og evaluering af post-kirurgisk metastatisk sygdom (trin 3). B) Eksempel på sub-capsular implantation, herunder (i) overfladisk, og (ii) intern teknik. C) Eksempel på kirurgisk nefrektomi procedure (i) og repræsentativt billede af udskåret nyre med implanterede tumor (ii). D) Evaluering af post-kirurgisk spontan metastatisk sygdom ved hjælp af i) en visuel scoring system til at vurdere sygdom fordeling (repræsentative resultater fra 5 grupper af 4 dyr), og ii) bioluminiscerende data umiddelbart før og efter offer til quantitatively vurdere mikro-og makro-metastatiske læsioner. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne protokol er at vurdere klinisk relevant spontan metastatisk sygdom ved hjælp af en syngen tumor musemodel til at beskrive implantation / resektion teknikker. I øjeblikket har de fleste af prækliniske studier, som evaluerede nye eksperimentelle behandlingsformer omfatter ikke undersøgelse af metastatisk sygdom, og kun få rekapitulere stadier af primær tumor vækst, kirurgisk resektion, og eventuel spontan metastatisk spredning. Til dato gensplejsede musemodeller (GEMMs) genereret at fremkalde spontan renal cell sygdomsprogression (se 14 til resumé) omfatter ikke sent metastaser og kirurgisk intervention strategier har hidtil ikke blevet rapporteret. Derfor er studiet af spontan metastatisk RCC øjeblikket begrænset til modeller af ortotopisk tumor celle implantation. Selv om disse modeller er blevet tidligere udviklet 2,3 er denne protokol ikke særlig udbredt i evalueringen af nye behandlinger, især iperioperative omgivelser, hvor den kan have det mest prædiktive værdi. Denne protokol har til formål at detalje en trin-for-trin guide af de nødvendige procedurer, der kan fremme en mere udbredt anvendelse i terapeutiske evalueringer. Med hensyn til potentielle faldgruber i at udføre de teknikker, som er beskrevet, er der flere vigtige overvejelser, der kan påvirke resultaterne. For det første kan tumor celle lækage efter implantation føre til peritoneal udbredelse sygdom og derfor ikke udgør indledende lokaliseret primær vækst. For det andet skal der etableres optimale resektion tider for hver cellelinie anvendes. Dette er vigtigt fordi kirurgisk nefrektomi af tumor-bærende nyre for tidligt ikke kan tillade til formidling sygdom (dvs. det kan være helbredende), og kirurgi for sent kan føre til ikke-lokaliseret sygdom og orgel-fusing (typisk til milt), hvilket gør kirurgi og indledende mus genvinding ikke er mulig. Endelig skal overvåge spontan metastatisk sygdom med bioluminescens være sideløbende med strict tilslutning til de institutionelle retningslinjer for overvågningen tegn af animalsk morbiditet som sygdom kan være yderst variabel i både hvad angår lokalisering og samlede effekt. Korrekt statistisk kraftoverførsel af dyreforsøg vil gøre det muligt for alle variation, der skal indgå, og vil mere trofast rekapitulere klinisk sygdomsprogression og behandling svar. Tilsammen i denne artikel har vi demonstreret teknikker, der anvendes med succes rekapitulere lokaliseret ortotopisk RCC og post-kirurgisk recidiv med det formål at forbedre klinisk relevans i prækliniske tumormodeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for laboratoriet af Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) for teknisk hjælp og ekspertise inden for udvikling af denne procedure. Vi vil også gerne takke Dr. Sandra Sexton og Roswell Park Cancer Institute Department of Laboratory Animal Resources. Dette arbejde blev støttet af en pris fra Roswell Park Alliance Foundation (til JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
