Summary
Modellen van spontane gemetastaseerd niercelcarcinoom (RCC) ziekteprogressie kan worden gebruikt voor het evalueren behandelingen klinisch relevante omgeving. Dit protocol toont verschillende procedures voor orthotopic nier tumorcelimplantatie, goede nefrectomie, en ten slotte schetst een necropsy gids voor visuele en bioluminescente scoren van metastatische last en lokalisatie.
Abstract
Een van de belangrijkste uitdagingen voor een betere testen van nieuwe experimentele therapieën in niercelcarcinoom (RCC) is de ontwikkeling van modellen die trouw recapituleren progressie vroeg-en laat-stadium gemetastaseerde ziekte. Typische tumorimplantatie modellen maken gebruik van een buitenbaarmoederlijke of orthotopic primaire tumor implantatie, maar weinigen onder systemische spontane gemetastaseerde ziekte die de klinische setting nabootst. Dit protocol beschrijft de belangrijkste te ontwikkelen RCC ziekteprogressie stadia vergelijkbaar patiënten. Ten eerste gebruikt een zeer metastatische muizen tumor cellijn in syngene orthotope model tumorcel implantatie vertonen. Methoden omvatten oppervlakkige en inwendige implantatie in de sub-capsulaire ruimte met cellen gecombineerd met matrigel om lekkage en vroege verspreiding te voorkomen. Daarna worden procedures voor excisie van tumordragende nier (nefrectomie), met kritische pre-en post-operatieve zorg muis. Ten slotte beschrijft de stappen die nodig zijn om toezicht te houden en te beoordelenmicro-en macro-metastatische progressie van de ziekte, met inbegrip van bioluminescentie beeldvorming en geeft een gedetailleerde visuele necropsy gids voor systemische ziekte distributie scoren. Het doel van dit protocol beschrijving is om het wijdverbreide gebruik van klinisch relevante gemetastaseerd niercelcarcinoom modellen om de voorspellende waarde van toekomstige therapeutische testen verbeteren vergemakkelijken.
Introduction
De belangrijkste oorzaak van mortaliteit bij patiënten met niercelcarcinoom (RCC) is systemische gemetastaseerde ziekte die meestal optreedt na chirurgische verwijdering van een primaire tumor groeit in de nier. Maar heel weinig preklinische tumor modellen evalueren experimentele therapieën in muizen onder gemetastaseerde ziekte, en nog minder trouw recapituleren de klinische stadia van gelokaliseerde groei, chirurgie, en spontane micro-metastatische initiatie en progressie 1-3. Deze kloof in tests steeds belangrijker in de evaluatie van nieuwe therapieën soms opvallende anti-tumor effecten bij dierlijke modellen niet altijd vertaald soortgelijke succesvolle behandeling van patiënten 4 worden. Dergelijke verschillen in resultaten kunnen het gevolg zijn van differentiële drug efficacies tussen gelokaliseerde buitenbaarmoederlijke of orthotopic primaire tumor modellen en laat stadium gemetastaseerde ziekte 5-7. In het geval van RCC, hebben slechts een paar studies in dienst werd eennimal protocollen die spontane terugkerende ziekte die nabootst patiënten die typisch zijn tumor-dragende nieren hadden geheel of gedeeltelijk verwijderd 2,3 omvatten. De redenen voor dit gebrek in muismodel testen variëren. Ten eerste is er de hoge kosten en dier natuurlijke schommelingen van tumorcel selectie en metastatisch potentieel. Bijvoorbeeld, menselijke nier cellijnen neiging om zelden metastaseren, en moet worden gekozen over meerdere rondes van orthotopic primaire implantatie en metastatische selectie naar varianten die consequent verspreiden en vormen verre laesies ontlenen (zie beschrijving van een dergelijke humane cellijn afleiding 8-10) . Omgekeerd, muis cellen in immunocompetente modellen hebben de neiging om agressief te gedragen, en de lage cel aantallen moeten worden geïnjecteerd met matrigel onmiddellijke systemische verspreiding 3 verminderen. Ten tweede, technische problemen bij het uitvoeren van de juiste implantatie, chirurgische resectie (nefrectomie), en het bijhouden (en bepalen) spontane metastatic groei kan een uitdaging zijn en een aantal kritische variabelen moeten houden bij het gebruik van deze techniek (zie Overleg voor details). Het doel van dit protocol is om de essentiële stappen (evenals mogelijke valkuilen) van orthotopic implantatie, resectie (nefrectomie), en monitoring van spontane gemetastaseerde ziekte RCC beschrijven en een richtlijn voor gestandaardiseerde (en meer verspreid) bieden gebruiken onder wetenschappelijke laboratoria dat de werkzaamheid van experimentele therapeutiek beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Orthotope Kidney tumorimplantatie
- Celkweek
- Vóór orthotope implantatie groeien muis Renca LUC cellen als een monolaag tot 75% confluentie.
- Na behandeling met trypsine en opnieuw suspenderen in 5% FBS bevattende media, centrifuge cellen bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 min, het herhalen 3 keer wassen in PBS. Resuspendeer vervolgens de cellen in serum-vrij medium tot een concentratie van 5 x 10 4 Renca LUC / 5 ul serumvrij medium.
Opmerking: Afhankelijk van de variant of cellijn gebruikt kunnen cellen worden gesuspendeerd in een 01:01 verhouding van matrigel en serum vrije media om zeer agressieve muis celgroei en de verspreiding te vertragen na implantatie.
- Chirurgie en celimplantatie
Opmerking: Alle dierstudies daarin beschreven, waaronder het onderhoud en de bepaling van de experimentele eindpunten, werden uitgevoerd volgens een Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) pROTOCOL goedgekeurd door Roswell Park Cancer Institute.- Verdoven een Balb / C muis met behulp van isofluraan (2-3%). Pinch voet en controleer reflex om voldoende verdoving zorgen. Solliciteer dierenarts zalf voor de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis in de rechter laterale decubitus en scheren linkerkant tussen voor-en achterpoten ledematen. Solliciteer alcohol en jodium langs dorsale lumbale gebied om aseptisch gebied voor te bereiden incisie.
- Gebruik chirurgische schaar een 1 cm incisie initiëren langsrichting tussen de rib en het heupgewricht. Draai bindweefsel onder de huid met behulp van een stompe dissectie schaar. Gebruik chirurgische schaar een 0,5 cm incisie in langsrichting in de buikwand. Gebruik gebogen pincet voorzichtig naar beneden duwen rond open wond - dit zal de nier exterioriseren en zorgen voor zachte immobilisatie van orgaan voorafgaand aan de injectie.
- Laad de Hamilton spuit met 5 pi de voorbereide celmengsel. Voor sub-capsulaire implantatiewachtingen kunnen twee implantatiemethoden worden gebruikt:
- Oppervlakkige: Parallel aan de lengterichting georiënteerde nier, insert naald onder de nier capsule (maar boven de parenchym) met de afgeschuinde rand omhoog. Zodra de naald is op zijn plaats, injecteren alle cellen tot kleine witte bubble vormen. Verwijder langzaam de naald uit de capsule en dep ze direct via injectie met een steriel wattenstokje om lekkage te absorberen en voorkomen verspreiding cel.
- Intern: Met afgeschuinde rand op en vanaf de kant van de nieren tegenover uiteindelijke implantatie, steek de naald door het interieur van de nieren tot naald zichtbaar is (maar niet prikken) de sub-capsulaire ruimte. Injecteer alle cellen tot witte zeepbel vormen en wattenstaafje injectieplaats om lekkage te voorkomen.
- Voorzichtig terug de nieren de lichaamsholte. Sluit de buik lichaam muur met absorbeerbare 5-0 Vicryl hechtdraad. Eenmaal voltooid, trek de huid lagen samen en zet 2-3 wound clips. Zorg ervoor clips zijn stevig en gelijkmatig verdeeld tot geen wond blootstelling te garanderen. Vóór herstel beheren 500 ui 0,9% NaCl en 100 ui buprenorfine (0,01 mg / ml) subcutaan met een 25 G naald. Routinematig monitoren clip plaatsing en stabiliteit, en verwijder na 10 dagen.
2. Nephrectomy / Primaire Tumor Removal
- Volg identiek protocol voor muis verdoving, immobilisatie, insnijding en blootstelling van de nieren, zoals beschreven in sectie 1.2.1 en 1.2.2 (boven).
- Gebruik een tweede tang naar de nieren isoleren door voorzichtig verwijderen van de verbindende vetweefsel van het staarteinde en de bijnier van het craniale einde van de nier. Terwijl voorzichtig grijpen de nier, gebruiken absorbeerbare 5-0 Vicryl hechtdraad om een dubbele knoop rond de urineleider, nierslagader, en ader te maken. Langzaam veilige en snijd boven de knoop om de nier te verwijderen. Indien enig teken onmiddellijk bloedverlies of er een risico onvoldoende greepvan hechtdraad op urineleider, slagader en ader, gebruik dan cauterizer plaats van een schaar boven knoop te snijden.
- Zodra nier wordt verwijderd, zorgvuldig controleren op eventuele bloeden van de bond slagader en gebruiken cauterizer indien nodig. Sluit de buik lichaam muur met 5-0 Vicryl. Trek de huidlaag samen en plaats 2-3 wondklemmen volgende Dezelfde voorzorgsmaatregelen zoals beschreven in 1.2.4. Dier nauwlettend volgen dagelijks na de operatie voor tekenen van nood, bloeden, of beperkte mobiliteit. Volg de institutionele richtlijnen voor dierlijke veilig.
3. Monitoring metastatische progressie en lokalisatie bij Endpoint
- Gemetastaseerde ziekte kwantificering: Bioluminescent bewaking
- Zie methodologie eerder in JOVE beschreven voor het toezicht op het gebruik van metastase cellen getransfecteerd met luciferase en gekwantificeerd met behulp van de Xenogen IVIS imaging systeem 11,12.
- Visual necropsy gids voor een vergelijkende evaluatie van metastatische distributietie
- Sacrifice dieren volgens de institutionele richtlijnen met behulp van eindpunten, waaronder tekenen van nood, moeizame ademhaling, gewichtsverlies, enz.
Opmerking: Zorgvuldige controle van de dieren is van cruciaal belang als spontane metastatische progressie zeer variabel en snel kan zijn. - Gebruik chirurgische schaar om een incisie boven de plasbuis dat gaat door tot de borstholte om onderkaak initiëren. Gebruik stompe schaar om de huid te scheiden van de spieren van de buikwand.
- Initiëren incisies langs armen en benen. Schil de huid weg. Nauwkeurig onderzoeken de huid fascia en buikwand voor knobbeltjes, dan de oppervlakkige lymfeklieren: lies, brachialis, oksel en oppervlakkige cervicale.
- Maak een insnijding in de buikwand en snijd langs de linker en rechter zijkanten van het membraan. Met een horizontale snede verwijder het voorste gedeelte van de buikwand om de ingewanden te ontbloten.
- Onderzoek de ongestoorde uiterlijk van de ingewanden fof grove opmerkelijke tumoren. Let ook op de inhoud van de maag en darmen; als ze leeg zijn, de muis mogelijk niet in staat om te eten geweest. Als de inhoud zijn donker, kan dit bewijs van hoofdletters / kleine gastro-intestinale bloeding geven.
- Visueel score elk orgaan voor aanwezigheid tumor of afwezigheid, het toewijzen van een totale score voor elke muis groep (4 dieren per groep wordt gebruikt als voorbeeld in Figuur 1D-i).
Opmerkingen: 1) Uitbreiding van de lymfeklieren hoeft niet te betekenen dat het een groei van de tumor; als het zeer groot, zeer stevig, en een witachtige kleur, is het waarschijnlijk een uitgezaaide knobbeltje. 2) Overmatige melkachtige of troebele vloeistof in de buik geeft ascites. Ascites kunnen omvatten vaste ophopingen op de abdominale organen, met name tussen de lobben van de lever en de maag. 3) naar organen zoals de longen, kunnen meerdere knobbeltjes aanwezig en geteld voor vergelijkingen tussen individuele dieren (zie 13 bijvoorbeeld). - Identificeer grove tumoren of afwijkingen van de individuele buikorganen: lever, milt, nieren en pancreas door zorgvuldig verwijderen en wassen met PBS uit een spuitfles.
- Na het verwijderen van de buikorganen, inspecteren de abdominale lymfeklieren, met inbegrip van de lumbale, sacrale, nier-, en mesenteriale lymfeklieren.
- Beoordelen diafragma voor bewijs van metastatische verspreiding.
Opmerking: Uitgebreide uitgespreid op het membraan kan veroorzaken zijn contractiliteit verliezen, waardoor moeizame of verlies van ademhaling. - Verwijder membraan en maken twee zijdelingse insnijdingen in de borstholte, het verwijderen van het voorste deel naar de longen en het hart bloot.
- Verwijder de longen en het hart door voorzichtig vast te pakken en het opheffen van de slokdarm en het snijden van de luchtpijp boven het hart. Beoordelen weefsels voor knobbeltjes. Knijp hart. Gebrek aan veerkrachtige consistentie kan tumor aanwezig te geven.
- Gebruik chirurgische schaar om lineair doorsnijden schedel. Verwijder voorzichtig kleine stukjes schedel tot thij hele brein wordt blootgesteld. Kijk hele hersenen voor zichtbare knobbeltjes of afwijkingen verkleuringen.
- Sacrifice dieren volgens de institutionele richtlijnen met behulp van eindpunten, waaronder tekenen van nood, moeizame ademhaling, gewichtsverlies, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een schematisch overzicht van de procedures beschreven in deze samenvatting protocol. Een aantal belangrijke factoren moeten worden overwogen voor elke stap. Bijvoorbeeld, in stap 1 toont twee methoden voor sub-capsulaire tumorcel implantatie in de nier. Tumorcellen kunnen worden ingeplant in het sub-capsulaire ruimte met een klein wit-bubble bevestiging van de gelokaliseerde plaatsing van cellen met lekkage voorkomen door het voorzichtig verwijderen van de naald en het zwabberen overtollig ontsnappende vloeistof (Figuur 1B-i). Om lekkage te voorkomen, kunnen cellen eerst intern worden geïmplanteerd om de sub-capsulaire ruimte (Figuur 1B-ii) te bereiken, en gecombineerd met Matrigel de initiële verdeling van tumorcellen in de bloedsomloop voorkomen. Voor chirurgische verwijdering van nier, exacte timing is afhankelijk van de groei en metastatische potentiaal van de gebruikte cellijn. Optimale nefrectomie praktijk omvat een snelle, maar beheerste, chirurgische procedure om de muis nood en herstel zoveel mogelijk te beperken. Techts en veilige knopen van Vicryl te sluiten urineleider, nierslagader en ader is de sleutel om te voorkomen bloedingen (zie figuur 1C). Cauterisatie worden gebruikt, maar alleen als mogelijke overtollige bloeden interventie vereist. Tenslotte volgen van spontane ziekte door niet-invasieve bioluminescente evaluatie maakt voortdurende controle occulte laesies en groei, en kwantificering op eindpunt (zie figuur 1D). Echter, het gebruik van luciferase gelabelde cellen in spontane metastase modellen soms leiden tot klonale tumorcel selectie van varianten die niet kunnen drukken de getransfecteerde gen, en daarom niet altijd getoond na verschillende selectieronden of langdurige tumorgroei. In dit geval kunnen klinisch relevante histologische analyse uitgevoerd om micro-metastatische laesies of, indien technisch (financieel) haalbaar, kan een visuele scoring methode visuele macro-metastatische ziekte te beoordelen worden als een oppervlakkige maat preseNVU / afwezigheid van laesies in orgaanweefsel (figuren 1D-i en 1D-ii).
Figuur 1. A) Schematische van chirurgische procedures zoals implantatie (stap 1), chirurgische resectie / nefrectomie (stap 2) en evaluatie van postchirurgische metastatische ziekte (Stap 3. B)) Voorbeeld van sub-capsulaire implantatie waaronder (i) oppervlakkig en (ii) interne techniek. C) Voorbeeld van chirurgische nefrectomie procedure (i) en representatief beeld van weggesneden nier met geïmplanteerde tumor (ii). d) evaluatie van post-operatieve spontane gemetastaseerde ziekte met behulp van i) een visuele scoresysteem te beoordelen ziekte distributie (representatieve resultaten uit 5 groepen van 4 dieren) en ii) bioluminescente gegevens onmiddellijk vóór en na offeren quantitatively beoordelen micro-en macro-metastatische laesies. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit protocol is om klinisch relevante spontane gemetastaseerde ziekte te beoordelen met behulp van een syngeen tumor muismodel implantatie / resectie technieken beschrijven. Momenteel hebben de meerderheid van de preklinische studies die nieuwe experimentele therapieën niet inbegrepen studie van gemetastaseerde ziekte en slechts enkele recapituleren de stadia van de primaire tumorgroei, chirurgische resectie, en eventuele spontane metastatische verspreiding. Tot op heden, genetisch gemanipuleerde muis modellen (GEMMs) gegenereerd om spontane renale progressie cel ziekte (zie 14 voor overzicht) omvatten niet laat stadium metastase en chirurgische interventie strategieën te lokken tot nu toe niet gemeld. Daarom is de studie van spontane metastatische RCC momenteel beperkt tot modellen van orthotope tumorcel implantatie. Hoewel deze modellen zijn eerder ontwikkeld 2,3 Dit protocol wordt niet veel gebruikt bij de evaluatie van nieuwe behandelingen, vooral in deperioperatieve setting waar het het meest voorspellende waarde kan hebben. Dit protocol is gericht op detail van een stap-voor-stap handleiding van de noodzakelijke procedures die meer algemeen gebruik in therapeutische evaluaties kan vergemakkelijken. In termen van mogelijke valkuilen bij het uitvoeren van de technieken zoals beschreven, zijn er een aantal belangrijke overwegingen die de resultaten kunnen beïnvloeden. Ten eerste kan de tumorcel lekkage na implantatie leiden tot peritoneale verspreiding ziekte en dus niet de eerste gelokaliseerde primaire groei vertegenwoordigen. Ten tweede moet een optimale resectie tijden worden vastgesteld voor elke cellijn gebruikt. Dit is belangrijk omdat chirurgische nefrectomie van tumordragende nier te vroeg wellicht niet toelaat verspreiding ziekte (dwz kan curatief zijn), en chirurgie te laat kan leiden tot niet-gelokaliseerde ziekte en organisaties fusing (doorgaans naar milt), waardoor chirurgie en de eerste muis herstel niet haalbaar. Tot slot, het toezicht op spontane gemetastaseerde ziekte met bioluminescentie moet gelijktijdig met s zijntrict aanhankelijkheid aan institutionele richtlijnen bewaking tekenen van dieren morbiditeit als de ziekte kan zeer variabel zijn in termen van zowel de lokalisatie en de algehele impact. Goede statistische aandrijven van dierproeven zal zorgen voor alle variabiliteit op te nemen en zal meer getrouw recapituleren klinische progressie van de ziekte en de behandeling reacties. Samengevat, in dit artikel hebben we aangetoond technieken met succes herhalen gelokaliseerde orthotope RCC en postchirurgische ziekteherhaling de verbetering van klinische relevantie in preklinische tumormodellen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor het laboratorium van Dr Robert S. Kerbel (Universiteit van Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) voor technische hulp en expertise in de ontwikkeling van deze procedure. Wij zouden ook graag Dr Sandra Sexton en het Roswell Park Cancer Institute Ministerie van Laboratory Animal Resources bedanken. Dit werk werd ondersteund door een award van het Roswell Park Alliance Foundation (tot JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
