Summary
Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.
Abstract
Um dos desafios chave para melhorar o teste de novas terapias experimentais em carcinoma de células renais (CCR) é o desenvolvimento de modelos que recapitulam fielmente evolução precoce e tardia da fase da doença metastática. Modelos de implantação do tumor típicos utilizar implantação do tumor primário ectópica ou ortotópico, mas poucos incluem doença metastática espontânea sistêmica que imita o ambiente clínico. Este protocolo descreve os principais passos para desenvolver RCC progressão da doença estágios semelhantes aos pacientes. Primeiro, ela usa um mouse linha de células tumorais altamente metastático em um modelo singênico para mostrar a implantação de células tumorais ortotópico. Os métodos incluem a implantação superficial e interna para o espaço sub-capsular com células combinadas com matrigel a evitar fugas e disseminação precoce. Em seguida, ele descreve os procedimentos para a excisão do rolamento de tumor de rim (nefrectomia), com crítica cuidados pré e pós-cirúrgico mouse. Finalmente, descreve as etapas necessárias para monitorar e avaliarmicro e macro-evolução da doença metastática, incluindo a imagem de bioluminescência também fornece um guia de necropsia visual detalhada para marcar distribuição da doença sistêmica. O objetivo desta descrição protocolo é facilitar o uso generalizado de modelos RCC metastático clinicamente relevantes para melhorar o valor preditivo do futuro teste terapêutico.
Introduction
A causa principal de mortalidade em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) é a doença metastática sistémica que ocorre normalmente depois da remoção cirúrgica de um tumor primário em crescimento nos rins. No entanto, muito poucos modelos de tumores pré-clínicos que avaliaram terapêutica experimental em ratos incluem doença metastática, e menos ainda recapitular fielmente os estágios clínicos de crescimento localizado, cirurgia e iniciação micro-metástases espontânea e progressão 1-3. Esta diferença nos testes tornou-se cada vez mais importante na avaliação de novas terapias como às vezes impressionantes efeitos anti-tumorais observados em modelos animais nem sempre traduzidos para o tratamento da mesma forma bem-sucedida de pacientes 4. Tais diferenças nos resultados pode decorrer de eficácias de drogas diferenciais entre os modelos de tumor localizado ectópica ou ortotópico primárias e em estágio final de doença metastática 5-7. No caso da RCC, poucos estudos têm empregado estabeleceu umnimal protocolos que incluem a doença recorrente espontânea que imita os pacientes que têm, tipicamente, tinham rins portadores de tumor total ou parcialmente removidos de 2,3. As razões para essa falta de testes de modelo de rato variar. Em primeiro lugar, há o custo elevado dos animais e variabilidade inerente de selecção de células de tumor e o potencial metastático. Por exemplo, as linhas de células renais humanas tendem a raramente metástase, e devem ser selecionados ao longo de várias rodadas de implantação primário ortotópico e seleção metastático para derivar variantes que sempre divulgar e formam lesões distantes (ver descrição de tal linha celular uma derivação humana 8-10) . Por outro lado, células de ratos em modelos imunocompetentes tendem a se comportar de forma agressiva, e os números de celulares de baixa deve ser injetado com matrigel para reduzir a disseminação sistêmica imediato 3. Em segundo lugar, as dificuldades técnicas na realização de implantação adequada, a ressecção cirúrgica (nefrectomia) e rastreamento (e quantificação) metastati espontâneac crescimento pode ser desafiador e várias variáveis críticas precisam de consideração quando se emprega essa técnica (veja a discussão para mais detalhes). O objectivo deste protocolo é o de descrever os passos essenciais (bem como armadilhas potenciais) de implantação ortotópico, a ressecção (nefrectomia), e monitoramento da doença RCC metastático espontânea e para oferecer uma orientação para padronizada (e mais generalizada) use entre laboratórios científicos que avaliar a eficácia de terapêuticas experimentais.
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Protocol
1. Rim ortotópico Implantação do Tumor
- Cultura de Células
- Antes da implantação ortotópico, cultivar células do rato RENCA LUC como uma monocamada a 75% de confluência.
- Seguindo tripsinização e re-suspensão em 5% de FBS contendo meio, as células de centrifugação a 1.000 rpm, 4 ° C durante 5 minutos, repetindo três vezes para lavar em PBS. Em seguida, voltar a suspender as células em meio isento de soro para uma concentração de 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 meios livres de soro ul.
Nota: Dependendo da variante, ou linha celular utilizada, as células podem ser ressuspendidas numa proporção de matrigel e meio livre de soro de 1:1 a retardar o crescimento de células do rato altamente agressivo e difusão após a implantação.
- Cirurgia e implantação de células
Nota: Todos os estudos com animais aqui descritos, incluindo a manutenção e determinação de terminais experimentais, foram realizados de acordo com um Comitê Animal Care e Use Institucional (IACUC) protocolo aprovado pelo Roswell Park Cancer Institute.- Anestesiar um rato Balb / C utilizando isoflurano (2-3%). Aperte o pé e verificar se há reflexo para garantir anesthetization suficiente. Aplicar veterinário pomada para os olhos para evitar a secagem. Coloque o mouse em decúbito lateral direito e fazer a barba do lado esquerdo entre fore-e traseiras-membro. Aplicar álcool e iodo ao longo da área dorsal lombar para preparar assepticamente área de incisão.
- Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão de pele um centímetro no sentido longitudinal entre a última costela ea articulação do quadril. Solte o tecido conjuntivo sob a pele usando uma tesoura de dissecção romba. Use tesouras cirúrgicas para fazer incisão de 0,5 cm na direcção longitudinal na parede abdominal. Use uma pinça curva para empurrar suavemente para baixo em torno de ferida aberta - isso vai exteriorizar o rim e permitem a imobilização suave do órgão antes da injeção.
- Coloque a seringa de Hamilton com 5 uL da mistura de células preparada. Para implante sub-capsularesções, dois métodos de implantação podem ser empregados:
- Superficial: Em paralelo com o rim, a agulha de inserção orientada longitudinalmente sob a cápsula renal (mas acima do parênquima) com a borda chanfrada para cima. Uma vez que a agulha está no lugar, injetar todas as células, até formas pequenas bolhas brancas. Lentamente, retire a agulha da cápsula e apagar imediatamente sobre injeção com um algodão aplicador derrubado estéril para absorver qualquer vazamento e evitar a disseminação de células.
- Interno: Com borda chanfrada para cima e a partir do lado oposto do rim definitivo ao local de implantação, inserir a agulha através do interior do rim, até agulha é visível (mas não perfurar) o espaço sub-capsular. Injetar todas as células, até formas de bolhas brancas e local da injeção cotonete para evitar fugas.
- Suavemente retornar o rim para a cavidade do corpo. Feche a parede abdominal do corpo usando sutura absorvível 5-0 Vicryl. Uma vez completo, puxar a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 wound clips. Assegurar clips são firmes e uniformemente espaçados para garantir que não haja exposição ferida. Antes de se administrar a recuperação de 500 ul de NaCl a 0,9% e 100 ul de buprenorfina (0,01 mg / mL) por via subcutânea utilizando uma agulha G 25. Rotineiramente monitorar colocação clipe e estabilidade, e retire depois de 10 dias.
2. Nephrectomy / remoção do tumor primário
- Siga o protocolo idêntico para anesthetization mouse, imobilização, incisão e exposição do rim, conforme descrito nas seções 1.2.1 e 1.2.2 (acima).
- Usar um segundo par de fórceps para isolar o rim suavemente a remoção do tecido de gordura de ligação da extremidade caudal e da glândula supra-renal a partir da extremidade craniana do rim. Ao segurar delicadamente o rim, use absorvível sutura Vicryl 5-0 para fazer um nó duplo ao redor do ureter, artéria renal e veia. Lentamente, seguro e, em seguida, cortada por cima do nó para remover o rim. Se qualquer sinal de perda de sangue imediatamente, ou se houver um risco de retenção insuficientede sutura no ureter, artéria e veia, então use cauterizador em vez de tesoura para cortar acima nó.
- Uma vez rim é removido, verifique cuidadosamente para qualquer sangramento da artéria amarrado e usar cauterizador se necessário. Feche a parede abdominal do corpo usando Vicryl 5-0. Puxe a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 clips ferida após mesmas precauções, conforme descrito no 1.2.4. Acompanhar de perto animais diariamente após cirurgia para sinais de sofrimento, sangramento, ou mobilidade limitada. Siga as orientações institucionais para animais com segurança.
3. Monitoramento metastático Progressão e localização em Endpoint
- Quantificação doença metastática: monitoramento Bioluminescent
- Ver metodologia previamente descrita na JOVE para monitorar metástase usando células transfectadas com luciferase e quantificados utilizando o sistema de imagem 11,12 Xenogen IVIS.
- Guia Visual necropsia para avaliação comparativa de distribuição metastáticoção
- Sacrificar animais de acordo com as diretrizes institucionais, utilizando endpoints, incluindo sinais de angústia, dificuldade para respirar, perda de peso, etc
Nota: Fechar o monitoramento de animais é fundamental como progressão metastática espontânea pode ser altamente variável e rápida. - Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão acima da uretra, que continua até a cavidade torácica a mandíbula inferior. Use uma tesoura sem corte-ended para separar a pele do músculo da parede abdominal.
- Iniciado incisões ao longo dos braços e pernas. Peel pele de distância. Examine cuidadosamente a pele e fáscia da parede abdominal para nódulos, em seguida, os linfonodos superficiais: inguinal, braquial, axilar e cervical superficial.
- Faça uma incisão na parede abdominal e corte ao longo das laterais esquerda e direita, até o diafragma. Com um corte horizontal remover a parte frontal da parede abdominal a nu as vísceras.
- Examine a aparência imperturbável das vísceras fou grosseiramente tumores notáveis. Além disso, note o conteúdo do estômago e dos intestinos; se eles estão vazios, o rato pode não ter sido capaz de comer. Se o conteúdo for escuro, isto pode indicar evidência de hemorragia gastrointestinal superior / inferior.
- Visualmente marcar cada órgão para a presença ou ausência de tumor, a atribuição de uma pontuação total para cada grupo de rato (4 animais por grupo é usado como exemplo na Figura 1D-i).
Notas: 1) alargamento dos gânglios linfáticos, não significa necessariamente que é um crescimento do tumor; se é muito porte, muito firme, e uma cor esbranquiçada, é provável um nódulo metastático. 2) leitoso excessivo ou líquido turvo no abdômen indica ascite. Ascite podem incluir sólidos acumulações nos órgãos abdominais, particularmente entre os lóbulos do fígado e do estômago. 3) para os órgãos, tais como os pulmões, nódulos múltiplos podem estar presentes e contadas para comparações entre animais individuais (ver 13, por exemplo). - Identificar tumores brutas ou anormalidades dos órgãos abdominais individuais: fígado, baço, rins e pâncreas, removendo cuidadosamente e lavagem com PBS a partir de uma garrafa de esguicho.
- Depois de retirar os órgãos abdominais, inspecionar os linfonodos abdominais, incluindo lombar, sacral, renal e linfonodos mesentéricos.
- Avaliar diafragma para a evidência de metástase.
Nota: Ampla propagação sobre o diafragma pode fazer com que perca sua contratilidade, levando ao trabalhado ou perda da respiração. - Remover diafragma e fazer duas incisões laterais na cavidade torácica, retirando a parte frontal para expor os pulmões eo coração.
- Remover pulmões e coração delicadamente segurando e levantando o esôfago eo corte na traquéia acima do coração. Avaliar tecidos para os nódulos. Esprema coração. A falta de consistência elástica pode indicar presente tumor.
- Use uma tesoura cirúrgica para cortar linearmente através do crânio. Remova cuidadosamente pequenos pedaços de crânio até ttodo ele cérebro está exposto. Olhe ao longo do cérebro para nódulos visíveis ou anomalias descolorações.
- Sacrificar animais de acordo com as diretrizes institucionais, utilizando endpoints, incluindo sinais de angústia, dificuldade para respirar, perda de peso, etc
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Representative Results
Figura 1A mostra um esquema que define os procedimentos detalhados neste resumo protocolo. Vários fatores importantes devem ser considerados para cada etapa. Por exemplo, no Passo 1 que mostra dois métodos para a implantação de células de tumor sub-capsular para o rim. As células tumorais podem ser implantados no espaço sub-capsular com um pequeno branco-bolha confirmando a colocação localizada de células com fugas impedido por remoção cuidadosa da agulha e limpando o excesso de escape de fluidos (Figura 1B-i). Para evitar fugas, as células podem ser primeiro implantado internamente, para alcançar o espaço sub-capsular (Figura 1B-ii), e combinado com matrigel a impedir a distribuição inicial de células de tumor para a circulação sanguínea. Para a remoção cirúrgica do rim, momento exacto depende do crescimento e potencial metastático da linha celular utilizada. Prática nefrectomia Optimal inclui um procedimento rápido, mas controlado, cirúrgica para minimizar o sofrimento do mouse e recuperação. Tatar ight e segura de Vicryl para fechar ureter, artéria e veia renal é a chave para evitar a hemorragia (ver Figura 1C). Cauterização deve ser usado, mas apenas se o potencial de excesso de sangramento requer intervenção. Finalmente, o controle de doença espontânea pelo bioluminescente avaliação não invasiva permite a monitorização contínua de lesões ocultas e crescimento, bem como a quantificação no ponto final (ver Figura 1D). No entanto, a utilização de células marcadas por luciferase em modelos de metástases espontâneas pode por vezes conduzir a selecção clonal de células de tumor de variantes que não expressam o gene transfectado, e, portanto, pode não estar sempre visível após vários ciclos de selecção ou o crescimento do tumor a longo prazo. Neste caso, a análise histológica clinicamente relevante pode ser realizada para identificar lesões micro-metastáticos ou, se não tecnicamente (financeiramente) viável, um método de avaliação visual para avaliar a macro-doença metastática visual pode ser usado como uma medida de superfície de presence / ausência de lesões no tecido do órgão (Figuras 1E e 1D-i-ii).
Figura 1. A) Esquema de procedimentos cirúrgicos, incluindo o implante (Passo 1), a ressecção cirúrgica / nefrectomia (Passo 2), e avaliação da doença metastática pós-cirúrgica (Passo 3). B) Exemplo de implantação sub-capsular, incluindo (i) superficial e (ii) técnica interna. C) Exemplo de procedimento cirúrgico nefrectomia (i) e imagem representativa do rim retirado com tumor implantado (ii). D) Avaliação da doença metastática espontâneo pós-cirúrgico usando i) um sistema de pontuação visual para avaliar distribuição da doença (resultados representativos de 5 grupos de 4 animais), e ii) os dados bioluminescentes imediatamente antes e após o sacrifício para quantitatively avaliar lesões micro e macro-metastáticos. Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
O objectivo deste protocolo é o de avaliar a doença metastática espontâneo clinicamente relevantes usando um modelo do rato tumor singênico para descrever técnicas de implantação / ressecção. Actualmente, a maioria dos estudos pré-clínicos de novas terapêuticas experimentais avaliando não incluir o estudo de doença metastática e apenas poucos recapitulam as fases de crescimento do tumor primário, a ressecção cirúrgica, e eventual metástase espontânea. Até o momento, modelos de ratos geneticamente modificados (GEMMs) gerado para obter a progressão da doença de células renais espontânea (ver 14 para resumo) não incluem metástase fase tardia e estratégias de intervenção cirúrgica, assim, não muito longe foram relatados. Por conseguinte, o estudo da espontânea RCC metastático é actualmente limitado aos modelos de implante de células tumorais ortotópico. Embora estes modelos têm sido desenvolvidos anteriormente 2,3, este procedimento não é amplamente utilizada para a avaliação de novos tratamentos, particularmente nacenário perioperatório, onde ele pode ter o valor mais preditiva. Este protocolo visa detalhar um guia passo-a-passo dos procedimentos necessários que podem facilitar o uso mais difundido nas avaliações terapêuticas. Em termos de potenciais armadilhas na execução das técnicas, tal como descrito, há várias considerações importantes que poderiam influenciar os resultados. Primeiro, o vazamento de células tumorais após a implantação pode levar a disseminação da doença peritoneal e, portanto, não representam crescimento primário localizada inicial. Em segundo lugar, deve ser estabelecido tempos ótimos de ressecção para cada linha celular utilizada. Isto é importante porque a nefrectomia do rim cirúrgico que possui o tumor muito cedo pode não permitir a disseminação da doença (isto é, pode ser curativa), e cirurgia demasiado tarde pode levar a doença localizada e órgão de fusão (tipicamente de baço), tornando a cirurgia e recuperação inicial do mouse não é viável. Finalmente, o monitoramento doença metastática espontâneo com bioluminescência deve ser concomitante com sdistrital adesão aos sinais de monitoramento diretrizes institucionais de morbidade animais como a doença pode ser altamente variável tanto em termos de localização e impacto global. Alimentação adequada estatística de experimentos com animais vai permitir toda a variabilidade a ser incluído e recapitular mais fielmente progressão da doença e do tratamento respostas clínicas. Tomados em conjunto, neste artigo temos técnicas demonstradas usado para recapitular com sucesso RCC ortotópico localizada e recorrência da doença pós-cirúrgica, com o objetivo de melhorar a relevância clínica em modelos pré-clínicos de tumores
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos ao laboratório do Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Instituto de Pesquisa Sunnybrook, Toronto, Canadá) para obter ajuda técnica e experiência no desenvolvimento deste processo. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Sandra Sexton eo Roswell Park Departamento de Recursos Animais de Laboratório do Instituto do Câncer. Este trabalho foi apoiado por um prêmio da Fundação Aliança Roswell Park (para JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
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