Summary
Modeller av spontan metastaserande njurcellscancer (RCC) sjukdomsutveckling kan användas för utvärdering av behandlingar i en kliniskt relevant miljö. Detta protokoll visar olika förfaranden för orthotopic njurtumörcells implantation, lämplig nefrektomi, och slutligen beskriver en obduktion guide för visuell och självlysande poängsättning av metastaserande börda och lokalisering.
Abstract
En av de viktigaste utmaningarna för förbättrad testning av ny experimentell terapi i njurcellscancer (RCC) är att utveckla modeller som troget rekapitulera tidiga och sena skedet metastaserad sjukdom fortgång. Typiska tumörimplantation modeller använder ektopisk eller orthotopic primär tumör implantation, men få innefattar systemisk spontan metastatisk sjukdom som efterliknar den kliniska inställningen. Detta protokoll beskriver de viktigaste stegen för att utveckla njurcancer sjukdomsprogression steg liknar patienter. Först, använder den en mycket metastatiska mustumör cellinje i en syngen modell för att visa orthotopic tumör cell implantation. Metoder inkluderar ytlig och intern implantering i underkapsel utrymme med celler i kombination med matrigel för att förhindra läckage och tidig spridning. Därefter beskrivs de förfaranden för excision av tumör-bärande njuren (nefrektomi), med kritisk pre-och postoperativ mus vård. Slutligen innehåller det nödvändiga åtgärder för att följa upp och utvärderamikro-och makrometastasersjukdomsprogression, inklusive självlysande bildbehandling samt ger en detaljerad visuell obduktion guide att göra mål systemisk distribution sjukdom. Målet med detta protokoll beskrivningen är att underlätta den utbredda användningen av kliniskt relevanta metastaserande RCC modeller för att förbättra det prediktiva värdet av framtida terapeutiska tester.
Introduction
Den största orsaken till dödlighet hos patienter med njurcellscancer (RCC) är systemisk metastatisk sjukdom som vanligen uppträder efter kirurgiskt avlägsnande av en primär tumör växer i njuren. Men mycket få prekliniska tumörmodeller utvärderar experimentell terapi i möss innefattar metastatisk sjukdom, och ännu färre troget rekapitulera de kliniska stadierna av lokal tillväxt, kirurgi och spontan mikrometastatisk initiering och progression 1-3. Denna lucka i tester har blivit allt viktigare i utvärderingen av nya behandlingsmetoder som ibland slående antitumör effekt i djurmodeller har inte alltid översatta till på liknande framgångsrik behandling av patienter 4. Sådana skillnader i resultat kan bero på differentialläkemedelsutbyte mellan lokala ektopisk eller orthotopic primära tumörmodeller och sena stadium metastaserad sjukdom 5-7. I fallet med RCC, har endast ett fåtal studier som anställd etablerat enNimal protokoll som inkluderar spontana återkommande sjukdom som härmar patienter som ofta har haft tumörbärande njurarna helt eller delvis bort 2,3. Orsakerna till denna brist i musmodell provning varierar. För det första finns det höga djur kostnader och normala variationer av tumörcellmarkeringen och metastatisk potential. Till exempel, njurcellinjer brukar sällan metastaser, och måste väljas över flera rundor av orthotopic primära implantation och metastatisk val att härleda varianter som konsekvent sprider och bildar avlägsna lesioner (se beskrivning av en sådan human cellinje härledning 8-10) . Omvänt, mus celler i immunkompetenta modeller tenderar att bete sig aggressivt, och låga cellantal måste injiceras med matrigel att minska omedelbar systemisk spridning 3. För det andra, tekniska svårigheter att utföra korrekt implantation, kirurgisk resektion (nefrektomi), och spårning (och kvantifiera) spontan metastatic tillväxten kan vara utmanande och flera kritiska variabler måste beaktas vid användning av denna teknik (se diskussion för detaljer). Syftet med detta protokoll är att beskriva de viktigaste stegen (och potentiella fallgropar) i orthotopic implantation, resektion (nefrektomi), och övervakning av spontan metastaserad RCC sjukdom och för att erbjuda en riktlinje för standardiserad (och mer utbredd) använder bland vetenskapliga laboratorier att bedöma effekten av experimentell terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Orthotopic Kidney tumörimplantation
- Cellodling
- Innan orthotopic implantation, växa mus RENCA LUC celler som ett monolager till 75% sammanflytning.
- Efter trypsinering och återsuspension i 5% FBS innehållande medier, Centrifugera cellerna vid 1000 rpm, 4 ° C under 5 min, upprepa tre gånger för att tvätta i PBS. Resuspendera sedan cellerna i serumfritt medium till en koncentration av 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 | il serumfritt medium.
Anmärkning: Beroende på vilken variant eller cellinje som används, kan cellerna suspenderas i ett 1:1 förhållande av matrigel och serum fria medier att bromsa mycket aggressiv mus celltillväxt och spridning efter implantation.
- Kirurgi och cellimplantation
OBS: Alla djurstudier som beskrivs däri, inklusive underhåll och bestämning av experimentella ändpunkter, utfördes enligt en Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protocol godkänd av Roswell Park Cancer Institute.- Bedöva en Balb / C-mus med hjälp av isofluran (2-3%). Nyp foten och kontrollera reflex för att säkerställa tillräcklig bedövning. Applicera veterinär salva till ögonen för att förhindra torkning. Placera musen i högra sidoliggande och raka vänster sida mellan främre-och hind-lem. Applicera alkohol och jod längs rygg ländregionen att aseptiskt förbereda området för snittet.
- Använd kirurgisk sax för att initiera en 1 cm snitt i huden i en längdriktning mellan den sista revbenet och höftleden. Lossa bindväven under huden med användning av en trubbig dissektion sax. Använd kirurgisk sax för att göra ett 0,5 cm snitt i en längdriktning i bukväggen. Använd böjd pincett för att försiktigt trycka ner runt öppet sår - detta kommer exteriorize njuren och möjliggöra skonsam fixering av organ före injektion.
- Fyll på Hamilton-spruta med 5 pl det beredda cellblandningen. För sub-kapsel implanningar, kan två implantation metoder användas:
- Ytlig: Köra parallellt med längdriktningen orienterade njure, infoga nålen under njurkapseln (men framför parenkymet) med den fasade kanten uppåt. När nålen är på plats, injicera alla celler tills små vita bubbla former. Sakta tar bort nålen från kapseln och omedelbart blot över injektion med en steril bomullspinne för att absorbera eventuella läckage och förhindra cellspridning.
- Internt: med avfasad kant upp och börjar från sidan av njure motsatt slutlig implanteringsstället, infoga nålen genom inre av njure tills nålen är synlig (men inte punktera) sub-kapsulära utrymme. Injicera alla celler tills vita bubbla former och kompress på injektionsstället för att förhindra läckage.
- Tillbaka försiktigt njuren till kroppshålan. Stäng buken kroppsväggen med hjälp av absorber 5-0 Vicryl sutur. När du är klar, dra hudlagret ihop och placera 2-3 wound clips. Se till klipp är fast och jämnt fördelade för att säkerställa att inget sår exponering. Före återvinning administrera 500 pl av 0,9% NaCl och 100 | il av Buprenorfin (0,01 mg / ml) subkutant med användning av en 25 G nål. Rutinmässigt övervaka klipp placering och stabilitet, och ta bort efter 10 dagar.
2. Nefrektomi / Primär tumör borttagning
- Följ identiska protokoll för mus bedövning, immobilisering, snitt, och exponering av njure som beskrivs i avsnitten 1.2.1 och 1.2.2 (ovan).
- Använd en andra pincett för att isolera njuren genom att försiktigt avlägsna förbindelse fettvävnad från svansänden och binjuren från den kraniala änden av njuren. Medan försiktigt tag i njuren, använd absorber 5-0 Vicryl sutur för att göra en dubbelknut runt urinledaren, njurartären, och ven. Långsamt säker och sedan klippa ovanför knuten för att ta bort njuren. Om några tecken på omedelbart blodförlust, eller det finns risk för otillräcklig greppav sutur på urinledaren, artär och ven, sedan använda cauterizer istället för sax för att klippa ovanför knut.
- När njuren tas bort, kontrollera noga för någon blödning från bundna artär och använda cauterizer vid behov. Stäng buk kroppen väggen med 5-0 Vicryl. Dra hudlagret ihop och placera 2-3 sårklämmor efter samma försiktighetsåtgärder som beskrivs i 1.2.4. Noga övervaka djur dagligen efter operation för tecken på ångest, blödning eller begränsad rörlighet. Följ institutionens riktlinjer för djur på ett säkert sätt.
3. Övervakning metastasutvecklingen och lokalisering på Endpoint
- Metastassjukdom kvantifiering: Bioluminescent övervakning
- Se metod som tidigare beskrivits i JOVE för övervakning av metastaser med hjälp av celler transfekterade med luciferas och kvantifieras med hjälp av Xenogen IVIS Imaging System 11,12.
- Visuell obduktion guide för jämförande bedömning av metastaser distributiontion
- Offra djur enligt lokala behandlingsrekommendationer använder endpoints inklusive tecken på ångest, ansträngd andning, viktminskning, etc.
Observera: Noggrann övervakning av djur är avgörande eftersom spontan metastasutvecklingen kan vara mycket varierande och snabb. - Använd kirurgisk sax för att initiera ett snitt ovanför urinröret som fortsätter upp brösthålan till undernäbben. Använd trubbiga ändar sax för att separera huden från muskeln i bukväggen.
- Initiera snitt längs armar och ben. Peel hud bort. Närmare undersöka huden fascia och bukväggen för knölar, då de ytliga lymfkörtlar: ljumsk, brachialis, armhålan och ytliga livmoderhalscancer.
- Gör ett snitt i bukväggen och skär längs de vänstra och högra laterala sidor fram till membranet. Med en horisontell klippa bort den främre delen av bukväggen på rena inälvorna.
- Undersök ostört utseende inälvorna feller grovt noter tumörer. Observera också innehållet i magsäcken och tarmarna; om de är tomma, kanske inte musen har kunnat äta. Om innehållet är mörk, kan detta tyda tecken på övre / nedre gastrointestinal blödning.
- Poäng Visuellt varje organ för tumör närvaro eller frånvaro, tilldela en totalpoäng för varje mus grupp (4 djur per grupp används som exempel i figur 1D-i).
Anmärkningar: 1) Utvidgningen av lymfkörtlar betyder inte nödvändigtvis att det är ett tumörtillväxt; om den är kraftigt limmat, mycket fast, och en vitaktig färg, är det sannolikt en metastatisk knöl. 2) Överdriven mjölkaktig eller grumlig vätska i buken indikerar ascites. Ascites kan omfatta fasta ansamlingar på bukorganen, särskilt mellan lober i levern och magen. 3) för organ såsom lungor, kan flera knölar vara närvarande och räknas för jämförelser mellan enskilda djur (se 13 till exempel). - Identifiera brutto tumörer eller abnormaliteter hos de individuella bukorganen: lever, mjälte, njurar och pankreas genom att försiktigt avlägsna och tvättning med PBS från en sprutflaska.
- Efter avlägsnande bukorganen, inspektera buken lymfkörtlar, inklusive länd, sakrala, renal, och mesenterial lymfkörtel.
- Bedöm membran för tecken på metastasering.
OBS: Omfattande spridning på membranet kan få den att förlora sin kontraktilitet, vilket leder till arbetade eller förlust av andning. - Ta bort membranet och göra två laterala snitt i brösthålan, ta bort den främre delen för att exponera lungorna och hjärtat.
- Ta bort lungor och hjärta genom att försiktigt att lyfta den i matstrupen och skära luftstrupen ovanför hjärtat. Utvärdera vävnader för knölar. Krama hjärta. Brist på fjädrande konsistens kan tyda på tumör närvarande.
- Använd kirurgisk sax för att klippa linjärt genom skallen. Ta försiktigt bort små bitar av kraniet till than hela hjärnan utsätts för. Leta i hela hjärnan för synliga knölar eller avvikelser missfärgningar.
- Offra djur enligt lokala behandlingsrekommendationer använder endpoints inklusive tecken på ångest, ansträngd andning, viktminskning, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en schematisk beskrivning av de förfaranden som anges i detta protokoll sammanfattning. Flera viktiga faktorer måste beaktas för varje steg. Till exempel, i steg 1 visar två metoder för sub-kapsulära tumör cell implantation i njuren. Tumörceller kan implanteras i sub-kapsel plats med en liten vit-bubblan som bekräftar den lokala placeringen av celler med läckage förhindras genom noggrann borttagning av nål och badda överflödig utströmmande vätska (Figur 1B-i). För att förhindra läckage, kan cellerna implanteras internt först att nå sub-kapselutrymme (Figur 1B-ii), och i kombination med matrigel för att förhindra den initiala fördelningen av tumörceller i blodet. För kirurgiskt avlägsnande av njure, exakta tidpunkten beror på tillväxt och metastatisk potential av cellinjen användas. Optimal nefrektomi praktiken omfattar en snabb, men kontrollerad, kirurgiskt ingrepp för att minimera musen nöd och återhämtning. Tight och säkert knyta av Vicryl att stänga urinledare, renal artär och ven är nyckeln till att undvika blödning (se figur 1C). Cauterization bör användas, men endast om potentialen i överskott blödning kräver ingripande. Slutligen, spårning av spontan sjukdom av icke-invasiv självlysande utvärdering möjliggör en fortsatt övervakning av ockulta lesioner och tillväxt, samt kvantifiering vid slutpunkten (se figur 1D). Däremot kan användningen av luciferas-märkta celler i spontana metastaser modeller ibland leda till klonal tumörcell urval av varianter som inte kan uttrycka den transfekterade genen, och därför kanske inte alltid vara synliga efter flera omgångar av val eller långsiktig tumörtillväxt. I detta fall kan utföras kliniskt relevant histologisk analys för att identifiera mikro metastaser eller, om det inte är tekniskt (finansiellt) genomförbart, kan en visuell scoring metod för att bedöma visuell makro metastaserad sjukdom användas som ett ytligt mått på preseiou / frånvaro av lesioner i organvävnad (fig. 1D-i och 1D-ii).
Figur 1. A) Schematisk bild av kirurgiska procedurer inklusive implantation (Steg 1), kirurgisk resektion / nefrektomi (steg 2), och utvärdering av postkirurgisk metastatisk sjukdom (steg 3). B) Exempel på sub-kapsulära implantation innefattande (i) ytlig och (ii) interna teknik. C) Exempel på kirurgisk nefrektomi förfarande (i) och representativ bild av utskurna njure med implanterad tumör (ii). D) Bedömning av postoperativ spontan metastatisk sjukdom med hjälp av i) ett visuellt poängsystem för att bedöma distributions sjukdom (representativa resultat från fem grupper om 4 djur), och ii) självlysande uppgifter omedelbart före och efter offer för quantitatively bedöma mikro-och makro metastaser. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med detta protokoll är att bedöma kliniskt relevant spontan metastatisk sjukdom med hjälp av en syngent tumör musmodell för att beskriva implantation / resektion tekniker. För närvarande gör de flesta av prekliniska studier som utvärderar nya experimentell terapi inte omfatta studier av metastaserad sjukdom och endast några få sammanfatta de olika stadierna i primär tumörtillväxt, kirurgisk resektion, och eventuell spontan metastasering. Hittills genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) genereras för att framkalla spontana njurcellssjukdomsprogression (se 14 för sammanfattning) inkluderar inte sen metastaser och kirurgiska interventionsstrategier har hittills inte rapporterats. Därför är studiet av spontana metastaserad RCC närvarande begränsad till modeller av orthotopic tumörcells implantation. Även dessa modeller har tidigare utvecklat 2,3, är detta protokoll som inte används i stor utsträckning i utvärderingen av nya behandlingar, särskilt iperioperativ miljö där den kan ha den mest prediktiva värdet. Detta protokoll syftar till att i detalj en steg-för-steg guide för de förfaranden som är nödvändiga som kan underlätta en mer utbredd användning i terapeutiska bedömningar. När det gäller potentiella fallgropar i att utföra de tekniker som beskrivs, det finns flera viktiga faktorer som kan påverka resultaten. För det första kan tumörcellen läckage efter implantation leda till peritoneal spridning av sjukdomar och därför inte representerar initialt lokaliserade primär tillväxt. För det andra måste optimala resektion tider fastställas för varje cellinje som används. Detta är viktigt eftersom kirurgisk nefrektomi för tumörbärande njure för tidigt inte kan tillåta spridning sjukdom (dvs. det kan vara läkande), och operation för sent kan leda till icke-lokaliserad sjukdom och orgel-fusing (vanligen till mjälte), vilket gör kirurgi och initial mus återhämtning inte är möjlig. Slutligen måste övervaka spontan metastatisk sjukdom med mareld vara samtidig med sdistrikts följsamhet till institutionella riktlinjer för övervakning tecken på djurens sjuklighet som sjukdomen kan vara mycket varierande både vad gäller lokalisering och totala effekten. Korrekt statistisk drivning av djurförsök kommer att möjliggöra för alla variationer som ska ingå och mer troget rekapitulera kliniska sjukdomsutveckling och behandlingssvar. Sammantaget, i den här artikeln har vi visat tekniker som används för att framgångsrikt rekapitulera lokaliserad orthotopic RCC och postoperativ återfall i sjukdomen med syfte att förbättra den kliniska relevansen i prekliniska tumörmodeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till laboratoriet av Dr Robert S. Kerbel (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Kanada) för teknisk hjälp och expertis i utvecklingen av denna procedur. Vi vill också tacka Dr Sandra Sexton och Roswell Park Cancer Institute Institutionen för Laboratorie Animal Resources. Detta arbete stöddes av en utmärkelse från Roswell Park Alliance Foundation (till JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
