Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

doi: 10.3791/51487 Published: April 4, 2014

Summary

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

Abstract

calorimetry טיטרציה Isothermal (ITC) הוא טכניקה שתוארה היטב שמודדת את החום שמשתחרר או נספג במהלך תגובה כימית, שימוש בו כבדיקה פנימית כדי לאפיין כמעט כל תהליך כימי. כיום, טכניקה זו מיושמת באופן נרחב כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים של שיווי משקל מחייב biomolecular. בנוסף, ITC הודגם להיות מסוגל ישירות מדידת קינטיקה ופרמטרים תרמודינמיים (k חתול, K M, ΔH) של תגובות אנזימטיות, למרות שהיישום הזה הוא עדיין underexploited. כמו שינויים בחום באופן ספונטני להתרחש במהלך קטליזה האנזימטית, ITC אינו דורש כל שינוי או תיוג של המערכת תחת ניתוח וניתן לבצעו בתמיסה. יתר על כן, השיטה זקוקה לכמות קטנה של חומר. תכונות אלו הופכות את ITC כלי רב ערך, רב עוצמה והייחודית ללמוד קינטיקה אנזים במספר יישומים, כגון, למשל, גילוי תרופות.

ילדה = "jove_content"> בעבודה זו שיטה המבוססת על ITC ניסיוני לכמת קינטיקה ותרמודינאמיקה של תגובות אנזימטיות מתוארת ביסודיות. שיטה זו מיושמת על מנת לקבוע k חתול וK M של הידרוליזה אנזימטית של אוריאה על ידי ensiformis Canavalia urease (שעועית שקע). חישוב של אנתלפיה הפנימית טוחנת (int ΔH) של התגובה מתבצע. הערכים וכך השיגו עולים בקנה אחד עם נתונים קודמים שדווחו בספרות, הוכיחו את האמינות של המתודולוגיה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קביעת כמותית של תגובות ביוכימיות מספקת תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים העומדת בבסיס של חיים. Calorimetry מציע מתודולוגיה ללא תווית לאפיין כמעט בכל תגובה כימית בפתרון כמותית. טכניקה זו מודדת את החום שמשתחרר או נספג לאורך זמן, ולכן מערכת זיהוי אוניברסלית ומתודולוגיה נוחה מאוד לכמת את כמות המולקולות מגיבים (כלומר תרמודינמיקה מחייבת), כמו גם על מנת למדוד את קצב התגובה (כלומר קינטיקה). בפרט, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC) כבר אימץ כשיטת בחירה לאפיין את התרמודינאמיקה של שיווי משקל biomolecular, הכולל חלבון ליגנד, חלבונים, יוני חלבון מתכת ואינטראקציות החלבון-DNA 1-6. בנוסף, היכולת של ITC לספק מידע הקינטית הופכת אותו למערכת חזקה מאוד למדוד קטליזה אנזים, למרות שהפוטנציאל של יישום זה הוא עדייןלזלזל 7-9.

משוואת מיכאליס מנטן-10 היא תיאור כמותי של תגובות אנזימטיות, כפי שהוא מספק קשר בין קצב התגובה וריכוז המצע, תלוי בשני פרמטרים הקינטית: קבוע מיכאליס (K M) ושיעור קבוע קטליטי (k חתול) . K החתול / יחס K M הוא כאמור את היעילות הקטליטית של אנזים. בפועל, קביעת K M ו-k חתול לתגובה ספציפית מספק תיאור של קטליזה מלאה.

בתגובה האנזימטית טיפוסית (איור 1), מצע (S) אינטראקציה עם האנזים (E) ויוצר מורכבות אנזים-מצע (ES), שמופעל בהמשך למצב המעבר (ES *). זה האחרון הופך למורכב אנזים תוצר הלוואי (EP) שסופו של הדבר dissociates. צעד הבאיםים מתוארים על ידי התגובה הבאה.

(1)

כאשר k 1 הוא השיעור קבוע להקמת קומפלקס ES, k -1 הוא שיעור קבוע לדיסוציאציה של קומפלקס ES, בעוד k החתול הוא שיעור קבוע קטליטי או מספר מחזור.

לפי משוואת מיכאליס מנטן-10, שיעור התגובה יכול להיות מחושב כ:

(2)

שבו חתול K = M (k -1 + K חתול) / k 1 ו-k = מקסימום v / [E], עם מקסימום v להיות המהירות המקסימלי הגיעה כאשר כל האנזים קשור למצע.

Calorimeter טיטרציה הבידוד התרמית היא הכלי המשמש במחקר זה כדי לאפיין את הידרוליזה אנזימטית של אוריאה. מכשיר זה עשוי ממגן adiabatic המכיל שני תאים בצורת שטבע (איור 1). אלה מחוברים לחלק החיצוני עם צינורות גישה צרים. התא המדגם (בערך 1.4 מיליליטר) טעון עם פתרון האנזים, ואילו תא ההתייחסות הוא בדרך כלל מלא במים או בממסים המשמשים לניתוח. מזרק מסתובב עם מחט ארוכה והנעת מערבבים המצורפות, המכיל בדרך כלל CA. 0.3 מיליליטר של תמיסת מצע, הוא רכוב על התא המדגם. מכשיר תרמואלקטרי מודד את ההבדל בטמפרטורה בין המדגם ותא ההתייחסות ו, באמצעות "רשת משוב סלולרי", הוא שומר על ההבדל הזה באפס על ידי הוספה או הפחתת חום. במהלך הניסוי, המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים בטמפרטורה שנבחרה קבועה. כאשר enתגובת zymatic מתרחשת, כמות החום שמשתחררת או נספגת היא פרופורציונלית למספר מולקולות מצע, שהומרו למולקולות מוצר. בנוסף, שיעור זרימת חום קשור באופן ישיר לשיעור של התגובה. נתונים שנמדדו, המופיע כסטייה של עקבות חום מנקודת ההתחלה ראשונית (איור 1), מייצגים את כוח התרמיות (μcal / sec) המסופק על ידי המכשיר הסלולרי המדגם, שהוא פרופורציונאלי לזרימת החום המתרחשת בתא המדגם לאורך זמן.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של calorimeter טיטרציה בידוד התרמית ללמוד תגובות אנזימטיות. תגובה האנזימטית מתרחשת על טיטרציה של המצע (במזרק להזרקה) לתוך תמיסת האנזים (בתא המדגם) גורם לשינוי של יסכוח mal שפורסם על ידי calorimeter, דרוש כדי לשמור על הפער של טמפרטורה בין תא דגימה וקבוע תא התייחסות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

בסך הכל, השינוי בחום (Q) הוא פרופורציונאלי לאנתלפיה הטוחנות של התגובה (ΔH) ומספר השומות של מוצר שנוצר (n), אשר בתורו ניתן על ידי בסך הכל הפעמים נפח הריכוז:

(3)

היווצרות המוצר לאורך זמן (DP / DT), אשר תואם את קצב התגובה, ולכן יכול להיות קשור לכמות החום שנוצר על אותו הזמן (DQ / dt) דרך היחס:

(4)

על פי משוואה זו, על מנת לקבל מיכאליס-מנטן עלילה יש צורך למדוד i) סך ΔH אנתלפיה טוחנת, וii) את זרימת DQ / dt החום בריכוזים מצע שונים. בדרך כלל, זה מתבצע בשני ניסויים שונים: בניסוי הראשון (שיטת 1, M1), המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים והחום לגיור מצע שלם נמדד; בניסוי השני (השיטה 2, M2), זריקות מרובות של מצע מבוצעות וקצב ייצור חום נמדד בריכוזים מצע שונים. שתי מערכות אלו של נתונים מספיקות כדי לגזור את הפרמטרים הקינטית K M ו-k חתול.

במאמר הנוכחי, פרוטוקול כללי כדי לקבוע את הפרמטרים הקינטית לתגובות אנזימטיות בוצעו באמצעות ITC מתואר. אנחנו יישמנו את השיטה להידרוליזה אוריאה על ידי האוריאה ensiformis Canavaliase, כמערכת התייחסות. ההסכם הטוב בין התוצאות שהתקבלו בשיטה זו ונתונים שדווחו בספרות מדגים את האמינות של גישה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. דוגמאות הכנה

  1. להכין 2 מיליליטר של תמיסת אנזים ו0.5 מיליליטר של תמיסת מצע עבור כל ניסיון ריצה. לדלל פתרונות מניות מרוכזים של אנזים ומצע בפתרונות חיץ שהרכב זהה ללמזער את החום של דילול וערבוב בתוספת המצע.
    1. בחר את תנאי חיץ שמספיקים כדי למנוע שינוי pH במהלך ניסוי. לדוגמא, 20 pH HEPES מ"מ 7 הוא נאות למדידות ב-pH הניטרלי.
      הערה: אם חילופי פרוטון הוא מעורבים, enthalpies protonation של המאגרים בשימוש יש לקחת בחשבון, כי הם משפיעים על ΔH הנמדד של התגובה. השפעות ספציפיות אפשריות של החיץ או מולקולות תוספים על המערכת תחת ניתוח חייבת להילקח בחשבון. אם ממסים אורגניים (למשל DMSO) נכללים בפתרון האנזים, להוסיף אותם בדיוק באותו הריכוז לתוך תמיסת המצע.
    2. לצורך ניסוי M1, להתחילעם ריכוז אנזים בטווח ננומטר (למשל 1 ננומטר) ועם ריכוז מצע גבוה יותר לפחות שלושה סדרי גודל מריכוז האנזים ומעל K M.
    3. לצורך ניסוי M2, להתחיל עם ריכוז אנזים בטווח PM-ננומטר (למשל 15 PM). ריכוז מצע במזרק הוא בטווח מ"מ (למשל 400 מ"מ).
      הערה: בניסוי M1 זריקה אחת, ריכוזים צריכים להיות מספיק כדי להשיג את המרת המצע הכוללת לתוך המוצר לאורך זמן הניסוי. לכן, הריכוז של האנזים תלוי בשיעור האנזים: אם אנזימים עם k חתול נמוך נמצאים תחת מחקר, ריכוזים גבוהים יותר אנזים (עד 10 מיקרומטר) חייבים להיות בשימוש. מצד השני, ריכוזי אנזים המשמשים בניסוי M2 חייבים להבטיח כי המצע שהוחדר הוא שולי בלבד (פחות מ -5%) צרך וכי תגובת האנזים ממשיכה במצב היציב. מסיבה זו, גבוהה יותריעילות אנזים, נמוך יותר ריכוז האנזים הנדרש. בסוף הניסוי, ריכוז מצע בתא המדגם צריך להיות גבוה יותר מאשר K M.
  2. לבדוק היטב אנזים וריכוזי מצע עם הליך מתאים אנליטיים (למשל הספיגה ב 280 ננומטר, מבחני 11 colorimetric, BCA. זה נדרש כדי לקבל חישוב מדויק ומהימן של הפרמטרים תרמודינמיים וקינטית.
  3. מדוד את ה-pH של הפתרונות ולוודא שחוסר ההתאמה ה-pH של שני אנזימים ואת פתרונות שהמצע הוא מינימאלית בתנאי הניסוי (± 0.05 יחידות pH).

2. ביצוע הניסוי

הערה: באותו ההליך חייב להיות מיושם גם עבור M1 ו-M2 הניסוי, המבוצעים אחד אחרי השני.

  1. ודא שהתא המדגם ומזרק ההזרקה ניקו על פי היצרן שלהוראות. מלא את מזרק הטעינה מסופק עם המכשיר במים מזוקקים, בעדינות להכניס את המחט בתא המדגם, למלא את התא ולהסיר את הנוזל תוך שימוש באותו המזרק. באמצעות שיטה זו, לשטוף את התא המדגם פעמיים עם מים מזוקקים ופעמים עם החיץ.
  2. טען את התא המדגם עם 2 מיליליטר של תמיסת אנזים באמצעות מזרק הטעינה, הימנעות היווצרות של בועות אוויר בזהירות. לאט לאט להזריק את הפתרון לתוך התא עד שנשפך החוצה העליון של תאי הגזע. לייצר פרץ של CA. 0.25 מיליליטר של תמיסה אל תוך התא. חזור על פעולה פעמיים. צעד זה מסיר בועות אוויר שנלכדו בתא המדגם.
  3. מניחים את המחט של מזרק הטעינה על המדף בין תאי הגזע ונמל התא ולהסיר כל פתרון עודף.
  4. הפעל את תכנית VP-Viewer ו, מממשק המחשב, לאזן את מכשיר ITC לטמפרטורת 3 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת הניסוי הרצויה. זה נדרש כדי למנוע איזון ארוךתקופות שלפני הניסוי, בשל מכשיר קירור אינסטרומנטלי הפסיבי.
  5. למלא את תא ההתייחסות עם מים מזוקקים עם אותו ההליך מתואר לעיל. כאשר מאגרים עם כוח היוני גבוה או גבוהים osmolality נמצאים בפתרון לדוגמא, יש להשתמש באותו החיץ כפתרון התייחסות.
  6. קישור מזרק פלסטיק לנמל המילוי של מזרק ההזרקה, באמצעות צינור סיליקון דק. מלא את המזרק להזרקת הצבת קצה המחט לתוך מים ועריכה, עד שמים שיוצאים מנמל המילוי העליון, המציינים את המזרק להזרקה הוא מלא. לאחר מכן להעביר את קצה המזרק ממים ולמשוך את אוויר, לרוקן את המזרק להזרקה. עם הליך זה, לשטוף את המזרק להזרקה עם חיץ, ולצייר באוויר דרך המערכת. בהמשך לכך, הנח את מחט הזריקה בצינור צר המכיל 0.5 מיליליטר של תמיסת מצע, בזהירות להכין ולמלא את המזרק להזרקה לחלוטין, ומשאיר כמות קטנה של פתרון בחלק התחתון של הצינור.
  7. מממשק מחשב, "נמל לסגור מילוי" לעיתונות. הסר את צינור טעינת סיליקון. "טיהור ולמלא" לחץ על לחצן כדי לאפשר את המזרק להזרקה כדי לסלק בועות אוויר ולגרש אותם בחזרה לפתרון בתפזורת. חזור על פעולה פעמיים.
  8. הזז את מזרק ההזרקה, לנגב בצדדים כדי להסיר טיפות שום ומניח את המחט של מזרק ההזרקה לתוך התא המדגם.
  9. במחשב, להגדיר את הפרמטרים הריצה המתאימים. יכולים להיות מצויינים האנזים הניסיוני וריכוזי מצע.
    1. בניסוי M1, לקבוע לפחות שתי תוספות (5-30 μl) של מצע כדי לאמת את שחזור. קבע את הזמן המרווח בין כל הזרקה (למשל 1,000 שניות) גדולות מספיק כדי להבטיח כי תשואות אות חום לנקודת ההתחלה לפני התוספת הבאה.
    2. בניסוי M2, להגדיר מספר (למשל 15 x 5-10 μl) זריקות. הגדר את המרווח בין הזריקות (למשל 180 שניות) המאפשרות למערכת של לtabilize כוח התרמיות לנקודת ההתחלה החדשה אחרי כל זריקה.
      הערה: בפעם המרווח בין זריקות בניסוי M2 צריכה להיות קצרה מספיק כדי למנוע את ההמרה של כמות משמעותית של מצע, המאפשר מדידות שיש לבצע בתנאי מצב יציבים.
    3. בניסוי M2, השתמשו בנפחים קטנים (למשל 2 μl) לזריקה הראשונה, שמקבילה ערך נמחק במהלך ניתוח נתונים שלאחר מכן. אכן, לעתים קרובות מציג חפצים בשל דיפוזיה המצע הראשונית ועד קצה המזרק, ואת קיומו של בועות אוויר שנלכדו במחט המזרק.
    4. הגדר את כוח ההתייחסות, ברמה המשוערת שבו הבסיס יוצב לפני התגובה מתחילה, לפי שווי של 20. ואז להגדיר את האנזים הניסויי וריכוזי מצע ובחר שם עבור הניסוי.
    5. הגדר את הטמפרטורה הניסיונית, בדרך כלל ב25 ° C. ITC מאפשר טמפרטורות עבודה בין 2 מעלות צלזיוס ו80 ° C. הניסוי הוא מוכן להפעלה. לחץ על לחצן "התחל" כדי להתחיל את הניסוי.
  10. לאחר שהניסוי הסתיים, לנקות את התא המדגם והמזרק בהתאם להוראות היצרן.
  11. חזור על הניסוי לפחות אחד או שתיים יותר פעמים כדי לבדוק את שחזור של נתונים.

3. ניתוח נתונים

  1. מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור "קראו נתונים", ולנווט לתיקייה שבה קובץ ITC. של הניסוי שבוצע M2 ממוקם. לחץ על החץ למטה גלילה של "הקבצים מסוג" ובחר "האנזים Assay (זה?)". בהמשך לכך, לחץ ולפתוח את קובץ ITC. של ניסוי M2.
  2. השג את ΔH של התגובה משילוב העקומה של ניסוי M1 פי משוואה 5.
    "Width =" 126 "/> (5)
    1. לחץ על הכפתור "קראו נתונים", ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M1 שבוצע. שימוש במקור, לחלק את העקבות בחלקים שונים המכילים שיא אחד אחד ולשמור כל שיא כקובץ opj.. פתח את הקובץ המתאים לשיא הראשון, וכתוצאה מסטייה בסיסית בthermogram של הניסוי הבודד הזרקת M1, לשלב אותו ולחלק את ערך השטח שהושג, באו לידי ביטוי בμcal, על ידי ריכוז המצע הסופי בתא המדגם, המתבטא במיקרומטר, ועל ידי נפח התא מתבטא בליטרים, קביעה, על פי משוואה 5, ΔH של התגובה.
    2. חזור על אותו ההליך לשיא השני של ניסוי M1 ולקבל ערך ממוצע עבור שתי מדידות ΔH.
  3. לקבוע DQ / dt מניסוי M2 מדידת ההבדל בין הבסיס המקורי והבסיס החדש לאחר כל זריקה. להמיר את הדוארנתוני xperimental לשיעורי תגובה לפי משוואת 4, באמצעות ערך אנתלפיה שהושג בניסוי M1 ולהתאים את הנתונים למשוואת מיכאליס-מנטן.
    1. מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור "קראו נתונים", ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M2 שבוצע. לחץ על החץ למטה גלילה של "הקבצים מסוג" ובחר "האנזים Assay (זה?)".
    2. תיבת הדו שיח האנזים Assay נפתחה, המאפשרת בחירה באחת מארבעת הדגמים. בחר "שיטה 2 - מצע רק" מהחלון.
    3. בחלון ΔH, כדי להצביע על שווי ΔH שהושג בשלב 4.2.
    4. לחץ על לחצן "ריכוז" כדי לבדוק את ערכי הריכוז כדי לשמש בהליך המתאים. לחץ על הכפתור "זמן הממוצע (P)". תיבת שיח נפתחת נותנת ההזדמנות לשנות או לקבל את ערך ברירת המחדל. ערך זה מייצג את הזמן לפני כל להזריקיון שבממוצעי מכשיר אות הכוח לקבוע את רמת הכוח בכל ריכוז מצע. לחץ על אישור כדי לאשר את ערך ברירת המחדל.
    5. לחץ על הלחצן "אפס Y הציר". הסמן הופך לשיער צולב המאפשר להכפיל לחץ על נקודה, למקום בy = 0. לחץ לחיצה כפולה ממש לפני נקודת הזריקה הראשונה.
    6. לחץ על לחצן לחשב את השיעור. שיעור הוא להתוות לעומת ריכוז המצע, נגזר על ידי חלוקת המצע הוסיף במהלך טיטרציה למדגם נפח התא (תוך לקיחה בחשבון השפעות דילול). פעולה זו מעניקה לעלילת מיכאליס-מנטן טיפוסי שיכול להיות מצוידת כדי להשיג K M ו-k חתול.
    7. אם יש למחוק כמה נקודות, בחר בלחצן "חתוכים נתונים". הזז את סמני נתונים להוציא נקודות נתונים רעות ולחץ לחיצה כפולה על אחד מהסמנים או לחצו על Enter.
    8. השתמש בפונקצית "התאמה למודל" כדי להתאים את העקומה וללהשיג קבועים קינטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Urease (EC 3.5.1.5; amidohydrolase אוריאה) הוא אנזים המכיל ניקל multisubunit מצא בarchea, חיידקים, אאוקריוטים וצמחים חד תאיים. מעשי חלבון זה בשלב האחרון של מינרליזציה חנקן האורגנית, מזרזות הידרוליזה של אוריאה לאמוניה וcarbamate, אשר מתפרק באופן ספונטני לתת מולקולה שנייה של אמוניה וביקרבונט (משוואה 6) 12.

(6)

תגובה זו גורמת לעלייה כוללת של ה-pH של הסביבה, האחראית להשפעות שליליות על בריאות וחקלאות 13 אנושיות. בצמחים, התפקיד העיקרי של urease הוא למחזר חנקן תזונתי מאוריאה נגזר arginase 14. ureases הצמח הוא בדרך כלל הומו-hexamers 6 עם כל מקטע המכיל אתר פעיל עם שני Ni 2 + יוני 15. ביניהם,urease ensiformis Canavalia (שעועית שקע) (JBU) כבר החלבון הראשון שהתגבש בשנת 1926 16. מאז, מספר מחקרים נרחבים שאפיינו את הפעילות המבנית והאנזימטית של ureases מכמה מקורות 13, 17. לכן, פעילות ureolytic של JBU נבחרה כתגובת נציג כדי להדגים את הישימות של ITC בכמותית קביעת קטליזה האנזימטית. ערך של ΔH = -10.5 קלוריות / mol נמדד בניסוי M1 (איור 2 א) על ידי שילוב כוח התרמיות וכתוצאה מכך על ידי הזרקת מצע אוריאה לתוך תמיסת urease ומאפשר התגובה להמשיך עד לסיום. כוח התרמיות הרשומים בניסוי M2 (איור 2 ב) הוסב לקצב התגובה באמצעות משוואת 4 (איור 2 ג). התאמה של נתונים המתקבלים למשוואת מיכאליס מנטן-סיפקה את הפרמטרים הקינטית לJBU ב20 HEPES מ"מ pH 7 כk cat = 30,200 sec -1 ו K = M 3.45 מ"מ, בהסכם עם שדווחו בעבר נתונים 18, 19.

איור 2
איור 2. הידרוליזה אוריאה ידי urease נקבע על ידי ITC. JBU (C3 סוג) נרכשה כאנזים lyophilized (פעילות נומינלית 1,538 U / מ"ג) ובדילול עם 20 pH HEPES מ"מ 7 לריכוז הסופי. הריכוז של האנזים בתערובת התגובה היה מחושב על ידי השוואת הפעילות הנחושה של המוצר שנרכש לפעילות של האנזים הטהור, דיווח להיות 6,200 U / מ"ג של אנזים טהור 20, ומסה טוחנת של 545 kDa, המקביל ל חלבון ההומו-hexameric. () אנרגית חום שנצפתה בניסוי M1, שבוצעה ב ° C25 עם 2 x 5 injec μltions של 20 אוריאה מ"מ (במזרק להזרקה) ל1 ננומטר JBU (בתא לדוגמא). מרווח של 750 שניות בין הזריקות יושם כדי לאפשר הבסיס חוזר לערך הראשוני. אנתלפיה של התגובה מחושבת מהשילוב של כל שיא וממוצע של שני הערכים, על פי משוואה 5. הערך מדווח בטקסט. (ב) אנרגית חום שנצפתה בניסוי M2, שהושגה על ידי titrating 400 אוריאה מ"מ (20 x 5 זריקות μl) ל15 PM JBU. מרווח של 180 שניות יושם בין זריקות, על מנת לאפשר למערכת כדי להגיע ולשמור על רמת המצב יציבה. DQ / dt בריכוזים מצע שונים מתקבל כתזוזה של נקודת ההתחלה לאחר כל הוספה. החום של דילול מוצג כניסוי ריק (אפור), שבוצע על ידי titrating מצע למאגר לבד. (ג) עקירת הבסיס באיור 2B הוסבה לקצב התגובה באמצעותמשוואה 4. התאמה של הנתונים שהתקבלו (ריבועים מלאים) בוצעה באמצעות משוואה 2, והוא מיוצג כקו יציב. הערך של K M ו-k החתול המתקבל מהכושר מדווחים בטקסט.

שינוי החום הכולל שנמדד בניסוי M1 מייצג את הסכום של כל האירועים המתרחשים במהלך התגובה מתחת לניתוח, ותלוי באנתלפיה הטוחנות של כל התהליכים מעורבים, ובכלל זה, במידת צורך, הודעה לפרוטון או ספיגה מהמאגר. בתהליך כללי שבו המערכת מגיבה רוכשת פרוטונים בתמיסת סליין, החיץ משחרר פרוטונים, ייצור חום נוסף בתוך תא התגובה. לכן, ΔH נמדד הוא לכאורה (האפליקציה ΔH), וכולל את ΔH הפנימי של התגובה (int ΔH), כמו גם את אנתלפיה היינון של החיץ (יון ΔH), וii) מספר לניירות הערךing פרוטונים (n), על פי משוואה 7:

(7)

שימוש במשוואה זו, בניסויי M1, אנו יכולים לקבוע n וint ΔH על ידי ביצוע אותו הניסוי במאגרים עם enthalpies יינון שונה, והתוויית האפליקציה ΔH נמדדת כפונקציה של יון ΔH ספציפי לחיץ. מרגרסיה ליניארית וכתוצאה מכך, n נגזר מהשיפוע: שיפוע שלילי משקף פרוטונים נרכשו על ידי החיץ, ואילו שיפוע חיובי מייצג פרוטונים שוחררו מהחיץ; int ΔH נגזר מהיירוט על ציר ה-Y.

כפי שנצפה במשוואה 6, תוצאות תגובת הידרוליזה אוריאה הכוללת ברכישת + H פרוטון מהמאגר. בהתאם לכך, כמו דהשתואר לעיל, את החום של תגובה כולל את תרומת deprotonation חיץ. על מנת לחשב ΔH הפנימי של תגובת הידרוליזה, שלושה ניסויי M1 בוצעו במאגרים שונים (HEPES, TrisHCl, פוספט), המתאפיינים בשלושה יון ΔH שונה. ΔH int ומספר הפרוטונים שוחרר מהחיץ, מחושב מן חותך ושיפוע המתאים ליניארי של נתוני הניסוי (איור 3) על פי משוואת 7, -14.7 קלוריות / mol ו0.98 היו בהתאמה, בהסכמה מלאה עם הנתונים שדווחו בעבר לאותה התגובה זרזה ידי urease הליקובקטר פילורי 7. למיטב ידיעתנו, אין נתונים תרמודינמיים דווחו לJBU, עד כה.

איור 3
int ΔH של תגובת urease. ערכים של האפליקציה ΔH במאגרים שונים (ריבועים מלאים) נקבעו על ידי ביצוע ניסויי M1 ב20 HEPES מ"מ (ΔH יון = 4.88 קלוריות / mol), 20 מ"מ TrisHCl (ΔH יון = 11.34 קלוריות / mol), ו20 פוספט מ"מ (ΔH יון = 0.86 קלוריות / mol) 21. ניתוח רגרסיה ליניארית (קו מוצק) של הנתונים אפשרו קביעת int ΔH של התגובה, כמו גם את מספר הפרוטונים החליף במהלך מחזור אוריאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

משמעות של ITC ללמוד פעילות האנזימטית ביחס לשיטות קיימות

בנוסף ליישומים הקלאסיים שלה ללמוד שיווי משקל מחייב, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי מספק שיטה מהירה ואמינה לאפיון תגובות אנזימטיות בפתרון באמצעות החום של תגובה כמו בדיקה, ללא צורך בשינוי מערכת או תיוג. הפרמטרים הקינטית k חתול וK M מתקבלים בדרך כלל באמצעות סדרה של ניסויים כמובן זמן, שבו היווצרות של המוצר (או צריכת מצע) מנוטרת במבחנים רציפים או לא רציפים. בדרך כלל, ריכוז המצע או מוצר נמדד על ידי ספיגת אור או הקרינה באורכי גל אופייני. עם זאת, רוב מצעים ו / או מוצרים אינם spectroscopically פעילים, ולכן כרומופור או fluorophore חייב להיות כלול לעקוב התגובה. לחלופין, בשילוב מבחני, עםהמוצר של להיות מצע לתגובה אחרת עם מוצר למדידה קטליזה, יכול להיות מועסק. שיטות אלה, עם זאת, להציג את משתנים נוספים המפחיתים את רמת הדיוק של הערכים שנקבעו של K M ו-k חתול. בנוסף, האפיון של עיכוב אנזים על ידי ligands הקטן תוך שימוש בשיטות מסורתיות יכול להיות מסובך ידי הספיגה או הקרינה של ליגנד הקטן עצמו, אשר עשוי לשנות את האמינות של assay ספקטרוסקופיות. שיטות אלטרנטיביים כוללות שימוש בטכניקות זרימה נעצרו, בהם הסכום של המוצר הוא לכמת באמצעות ספקטרומטריית או כרומטוגרפיה המונית. טכניקות אלה הן מאוד מדויקות ואמינים, אך זמן רב ויקר לניתוח שיגרתי. הבדיקה המיושמת בניסויי ITC, כלומר החום שמשתחרר או נספג, הוא נכס מהותי של כמעט כל תגובות כימיות. לכן ITC אינו דורש כל שינוי או תיוג של המערכת תחת ניתוח. יתר על כן, לאהטכניקה שלו היא פשוטה ומהירה, דורשת כמות קטנה של חומר וניתן לבצעו בפתרון 22, 23.

שלבים קריטיים בשינויי הפרוטוקול ואפשריים

ניתוח התגובה מבוצע בדרך כלל בשני ניסויים שונים, המספקים את אנתלפיה טוחנת הכוללת של התגובה ושינוי החום לאורך זמן בריכוזים מצע שונים. על מנת לקבל נתונים באיכות טובות, הניסוי חייב להיות מתוכנן בפירוט בתחילת החקירה. החלבון וריכוזי מצע צריך להיקבע בזהירות, כערך הנכון שלהם הוא חיוני לחישוב פרמטרים אמינים בניתוח הנתונים. הרכב החיץ ואת ה-pH של שני האנזימים ופתרוני המצע חייב להיות זהים, על מנת למזער את החום של ערבוב בתוספת מצע. זו מובטחת בדרך כלל על ידי ביצוע דיאליזה או exclu גודלצעד כרומטוגרפיה יאון על פתרון האנזים לפני הפעלת הניסוי, ותוך שימוש במאגר משחררי מהעמודה לפזר את המצע. ניסוי שליטה חייבת להתבצע עם פתרונות זהים של מצע שהוחדרו לתוך מאגר התגובה בהיעדר האנזים, כדי להפחית את החום של דילול או כדי לוודא שזה זניח.

ניתוח הנתונים מתבצע בדרך כלל עם תכנית המקור לITC מסופקת על ידי היצרן. יכולה להיות מועסק בתכנית חלופית של בחירה לניתוח נתונים, במקרה צורך.

פתרון בעיות ומגבלות של הטכניקה

יחס אות לרעש טוב מתקבל רק אם התגובה ממשיכה בקצב שמאפשר למערכת כדי לייצר מספיק חום בתא ITC להתגבר על גבול גילוי אינסטרומנטלי. זו מושגת בדרך כלל למערכות עם יותר מ k חתול דקות 1 -1. במקרה זה,תוכנת המקור לITC מחשב באופן אוטומטי את עלילת מיכאליס-מנטן מהנתונים גולמיים, ובאמצעות ניתוח רגרסיה ריבועים הפחות ליניארית, היא מחשבת k חתול וערכי K M. ניתוח זה אינו נוטל על עצמו עיכוב מוצר משמעותי. האחרון הוא בדרך כלל גלוי כאשר הזריקות הבאות בניסוי M1 לייצר פסגות עם צורות שונות, ובפרט, עם העצמה שמץ של השיא השני לוקח זמן רב יותר כדי לחזור לנקודת ההתחלה הראשונית. אם עיכוב המוצר מתרחש, תוכנה אחרת של בחירה, מיושמת עם משוואות מטרה ספציפית, יש להשתמש.

לאור ההבדלים המהותיים של כל מערכת האנזימטית, והחום שונה המיוצר על ידי תגובות שונות, שלא ניתן לכמת מראש, קביעת התנאים אופטימלי ריצה (כלומר אנזים וריכוזי מצע, מספר ובהיקף של זריקות, זמן מרווח, וכו ') עבור מערכת ספציפית לפעמים r equire כמה titrations גישוש.

במהלך הניתוח, טיפול חייב להיות מיושם לבחור את תנאי הניסוי בהתאם למערכת תחת ניתוח. לדוגמא, פוספט מעכב הידרוליזה אוריאה ידי urease, ולכן, ביצוע הניסוי בחיץ פוספט מקטין את השיעור הכולל של התגובה האנזימטית 24, 25.

יישומים

ברגע שקינטיקה של תגובה האנזימטית נקבעה, התגובה יכולה להיות חוזרת ונשנית בנוכחות סוגים וריכוזים של מעכבי אנזים בתא המדגם שונים, על מנת למדוד, באמצעות המשוואה הכללית עיכוב 8 26, תחרותית (ic K) ו (K UIC) קבועים תחרותיים עיכוב, ובכך מאפשרים לנו להבחין בין סוגים שונים של עיכוב,.

"Width =" iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg 284 "/> (8)

לסיכום, שיטה זו יכולה לשמש כדרך מהירה וכלכלית כדי לבחון מספר רב של מעכבי אנזים עבור יישומי תרופות ותעשייתיים, כגון בהקרנת סמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

התמחות מוצרי חברת דשנים (SFP) הוא הודה למתן את הכספים הדרושים למחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma H3375 dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base Sigma T1503 dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate Riedel-de-Haen 4270 dissolving in water
Sodium phosphate dibasic Riedel-de-Haen 30427 dissolving in water
Urea Sigma U4128 dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3) Sigma U0251 dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) SYS13901 instrument 
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) data acquisition software supplied with the instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
  2. Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
  3. Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. 3649-3651 (2007).
  4. Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
  5. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. (2011).
  6. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  7. Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
  8. Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
  9. Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
  10. Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
  11. Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. Cambridge University Press. 312-356 (2000).
  12. Ciurli, S. Nickel and its surprising impact in nature. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).
  13. Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
  14. Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
  15. Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
  16. Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
  17. Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
  18. Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
  19. Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
  20. Hausinger, R. P., Karplus, P. A. Handbook of Metalloproteins. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. John Wiley & Sons. 867-879 (2001).
  21. Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
  22. Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
  23. Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
  24. Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
  25. Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
  26. Segel, I. H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. Wiley, NY. (1993).
הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).More

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter