Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Hot biologisk katalys: Isotermiska Titrering Calorimetry för att karaktärisera enzymatiska reaktioner

Published: April 4, 2014 doi: 10.3791/51487

Summary

Isotermisk titrering kalorimetri åtgärder värmeflöde frigörs eller absorberas i kemiska reaktioner. Denna metod kan användas för att kvantifiera enzym-katalys. I detta dokument, protokoll för instrumentella inställning, experimentera kör, och dataanalys beskrivs generellt och tillämpas på karakterisering av enzymatisk urea hydrolys av jack böna ureas.

Abstract

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) är en väl beskriven teknik som mäter den värme som frigörs eller absorberas under en kemisk reaktion, använder den som en inneboende sond för att karakterisera praktiskt taget varje kemisk process. Numera är denna teknik i stor utsträckning tillämpas för att bestämma termodynamiska parametrar för biomolekylära bindnings jämvikter. Dessutom har ITC visat sig kunna på direkt mätning av kinetik och termodynamiska parametrar (k katt, K M, Ah) av enzymatiska reaktioner, trots att denna ansökan är fortfarande underutnyttjade. Som värme förändringar sker spontant under enzymatisk katalys, kräver ITC inte kräver någon ändring eller märkning av det system som analyseras och kan utföras i lösning. Dessutom behöver metoden lilla mängd material. Dessa egenskaper gör ITC en ovärderlig, kraftfullt och unikt verktyg för att studera enzymkinetik i flera tillämpningar, såsom, till exempel, läkemedelsutveckling.

k katt och K M för enzymatisk hydrolys av urea genom Canavalia ensiformis (jack böna) ureas. Beräkning av inneboende molära entalpin (AH int) av reaktionen utförs. De sålunda erhållna värdena överensstämmer med tidigare data som rapporteras i litteraturen, vilket visar tillförlitligheten hos metoden.

Introduction

Kvantitativ bestämning av biokemiska reaktioner ger insikter i de biologiska processer på grundval av livet. Kalorimetri erbjuder en etikett-fri metod för att kvantitativt karakterisera faktiskt varje kemisk reaktion i lösning. Denna teknik mäter den värme som frigörs eller absorberas över tiden, och är därför en universell detekteringssystemet och en mycket bekväm metod för att kvantifiera mängden av reagerande molekyler (dvs. bindningstermodynamik), såväl som för att mäta reaktionshastigheten (dvs. kinetik). Framför allt har isotermisk titrering kalorimetri (ITC) antagits som metod för valet att karakterisera termodynamik av biomolekylära jämvikter, involverar protein-ligand, protein-protein, joner protein-metall och protein-DNA interaktioner 1-6. Dessutom gör möjligheten för ITC att ge kinetisk information den ett mycket kraftfullt system för att mäta enzymkatalys, även om potentialen i denna ansökan är fortfarandeskattade 7-9.

Michaelis-Menten-ekvationen 10 är en kvantitativ beskrivning av enzymatiska reaktioner, eftersom det ger ett förhållande mellan reaktionshastigheten och substratkoncentrationen, beroende på två kinetiska parametrar: Michaelis konstant (K M) och den katalytiska hastighetskonstant (kcat) . Den kcat / M-förhållandet är kallad den katalytiska effektiviteten hos ett enzym. I praktiken kan bestämningen av K M och kcat för en specifik reaktion ger en fullständig beskrivning av katalys.

I en typisk enzymreaktion (fig 1), ett substrat (S) interagerar med enzymet (E), som bildar den enzymsubstrat (ES)-komplexet, som därefter aktiveras till övergångstillståndet (ES *). Den sistnämnda omvandlas till den enzymprodukt (EP)-komplex som så småningom dissocierar. Dessa stegs är beskrivna med följande reaktion.

(1)

där k 1 är hastighetskonstanten för bildningen av ES-komplex, k -1 är hastighetskonstanten för dissociation av ES-komplex, medan kcat är den katalytiska hastighetskonstanten eller omsättningstalet.

Enligt Michaelis-Menten-ekvationen 10, kan reaktionshastigheten beräknas enligt följande:

(2)

där K M = (k -1 + kcat) / k 1 och kcat = vmax / [E], med v max är den maximala hastigheten uppnås när alla enzym är bundet till substratet.

Den isotermiska titrering kalorimetern är det instrument som används i denna studie för att karaktärisera den enzymatiska hydrolysen av urea. Detta instrument är gjort av en adiabatisk skärm innehållande två präglade formade celler (figur 1). Dessa är anslutna till utsidan med smala accessrören. Provcellen (ca. 1,4 ml) laddas med enzymlösningen, medan referenscellen är i allmänhet fyllda med vatten eller med lösningsmedlet som används för analysen. En roterande spruta med lång nål och en omrörnings paddel fastsatt, som vanligen innehåller ca. 0,3 ml substratlösning, är monterad på provcellen. En termoelektrisk enhet mäter skillnaden i temperatur mellan provet och referenscellen och, med hjälp av en "återkopplingscellnätverk" hävdat denna skillnad på noll genom att lägga till eller dra ifrån värmen. Under experimentet är substratet sprutas in i enzymlösning vid en konstant vald temperatur. När enzymatic reaktion sker, den mängd värme som frigörs eller absorberas är proportionell mot det antal substratmolekyler som omvandlas till produktmolekyler. Dessutom är graden av värmeflöde direkt relaterad till reaktionshastigheten. De uppmätta data, som förekommer som en avvikelse av värme spår från första baslinjen (figur 1), representerar den termiska effekten (μcal / sek) som levereras av instrumentet till provcellen, som är proportionell mot värmeflödet förekommer i provcellen över tiden.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av isoterm titrering kalorimeter för att studera enzymatiska reaktioner. En enzymatisk reaktion som inträffar vid titrering av substratet (i injektionssprutan) i enzymlösning (i provcellen) resulterar i en förändring av thermal ström släpptes av kalorimetern, som behövs för att hålla skillnaden i temperatur mellan provcellen och referenscellen konstant. Klicka här för att visa en större bild.

Totalt sett är det värmeförändringen (Q) som är proportionell mot den molära entalpin för reaktionen (AH) och antalet moler av produkt genereras (n), som i sin tur ges av den totala volymen gånger koncentrationen:

(3)

Den produktbildning över tiden (dP / dt), vilket motsvarar den reaktionshastighet, kan således vara relaterat till den mängd värme som alstras under samma tid (dQ / dt) genom förhållandet:

(4)

Enligt denna ekvation, för att få en Michaelis-Menten rita det är nödvändigt att mäta i) Den totala molära entalpi AH, och ii) värmeflödet dQ / dt vid olika substratkoncentrationer. Vanligtvis utförs detta i två olika experiment: i det första experimentet (Metod 1, M1) är substratet sprutas in i enzymlösning och värmen för fullständig substratomvandling mäts; I det andra experimentet (metod 2, M2), finns flera injektioner av substratet utförs och hastigheten för värmeproduktionen mäts vid olika substratkoncentrationer. Dessa två uppsättningar av data som är tillräcklig för att härleda de kinetiska parametrarna K ^ och kcat.

I denna artikel, är ett generellt protokoll för att bestämma de kinetiska parametrarna för enzymatiska reaktioner som utförs med hjälp av ITC beskrivs. Vi tillämpade metoden att urea hydrolys av Canavalia ensiformis ureaSE, som referenssystem. Den god överensstämmelse mellan de erhållna med denna metod resultat och de uppgifter som rapporteras i litteraturen visar tillförlitligheten i denna strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbereda prover

  1. Bered 2 ml av enzymlösningen och 0,5 ml substratlösning för varje experimentkörning. Späd koncentrerade förrådslösningar av enzym och substrat i buffertlösningar som har identisk sammansättning för att minimera den värme för utspädning och blandning under substrattillsats.
    1. Välj de villkor buffert som är tillräckliga för att förhindra pH-förändring under experimentet. Till exempel är 20 mM HEPES pH 7 tillräcklig för mätningar vid neutralt pH.
      OBS: Om protonutbyte är inblandad, måste proto entalpier av de använda buffertövervägas, eftersom de påverkar den uppmätta AH av reaktionen. Eventuella specifika effekter av buffert eller tillsatser molekyler på systemet under analysen ska beaktas. Om organiska lösningsmedel (t ex DMSO) ingår i enzymlösningen, lägga dem på exakt samma koncentration i substratlösningen.
    2. För M1 experimentet, startamed enzymkoncentrationen i nM-området (t ex 1 nM) och med en substratkoncentration på minst tre tiopotenser högre än den enzymkoncentration och ovanför K M.
    3. För experimentet M2, börja med enzymkoncentrationen i pM-nM intervall (t.ex. 15 pM). Substratkoncentration i sprutan är i mM intervallet (t ex 400 mM).
      OBS: I den enda injektion M1 experiment, bör halterna vara tillräcklig för att uppnå den totala substrat omvandling till produkten under försökstiden. Därför är koncentrationen av enzym beror på enzymhastighet: om enzymer med låg kcat är under studien högre enzymkoncentrationer (upp till 10 | iM) måste användas. Å andra sidan måste enzymkoncentrationer som används i experimentet M2 försäkra att den injicerade substratet är endast marginellt (mindre än 5%) som konsumeras och att enzymreaktionen fortskrider vid det stabila tillståndet. Av denna anledning gäller att ju högreenzymeffektiviteten, lägre erforderlig enzymkoncentrationen. Vid slutet av experimentet, bör substratkoncentration i provcellen vara högre än K M.
  2. Kontrollera noga enzym-och substratkoncentrationer med ett lämpligt analytiskt förfarande (t.ex. absorbans vid 280 nm, kolorimetriska, BCA analyser 11. Detta krävs för att få exakt och tillförlitlig beräkning av termodynamiska och kinetiska parametrar.
  3. Mät pH hos lösningarna och kontrollera att pH obalans både enzymet och substratlösningarna är minimal under de experimentella förhållanden (± 0,05 pH-enheter).

2. Utföra experiment

OBSERVERA: Samma procedur måste tillämpas både för M1 och experimentet M2, som utförs en efter en.

  1. Verifiera att provcellen och injektionssprutan rengörs enligt tillverkarensinstruktioner. Fyll lastning sprutan med instrumentet med destillerat vatten, försiktigt in nålen i provcellen, fylla cellen och ta bort vätskan med hjälp av samma spruta. Med användning av denna metod, tvätta provcellen två gånger med destillerat vatten och två gånger med buffert.
  2. Ladda provet cell med 2 ml av en enzymlösning med hjälp av lastnings spruta, nogsamt undvika bildandet av luftbubblor. Injicera långsamt lösningen i cellen tills det spiller ut toppen av cellstammen. Producera en spurt av ca. 0,25 ml av lösningen in i cellen. Upprepa två gånger. Detta steg avlägsnar luftbubblorna instängda i provcellen.
  3. Placera nålen i last sprutan på avsatsen mellan cellstammen och cellporten och ta bort överskottslösning.
  4. Starta VP-Viewer-programmet och, från datorgränssnitt, jämvikt ITC instrumentet till en temperatur 3 ° C under den önskade försökstemperaturen. Detta krävs för att undvika långa jämviktperioder före försöket, på grund av passiv instrumentkylningsanordning.
  5. Fyll referenscellen med destillerat vatten med samma förfarande ovan. När buffertar med hög jonstyrka eller hög osmolalitet finns i provlösningen bör samma buffert användas som en referenslösning.
  6. Länka en plastspruta till påfyllningsporten av injektionsspruta, med hjälp av en tunn kiselröret. Fyll injektionssprutan att placera nålspetsen i vatten och upprättande, tills vatten kommer ut ur den övre påfyllningsöppning, vilket indikerar att injektionssprutan är fullt. Flytta sedan sprutspetsen från vatten och upprätta luft, för att tömma injektionsspruta. Med detta förfarande, tvätta injektionsspruta med buffert och dra luft genom systemet. Därefter placera injektionsnålen i ett smalt rör innehållande 0,5 ml substratlösning, noggrant upprätta och fullständigt fylla injektionsspruta, lämnande liten mängd lösning i botten av röret.
  7. Fråndatorgränssnitt, tryck på "Stäng påfyllningsöppningen". Avlägsna silikonladdningsröret. Tryck på "Purge och fylla på" för att låta injektionsspruta för att få bort eventuella luftbubblor och utvisa dem tillbaka in i bulklösningen. Upprepa två gånger.
  8. Flytta injektionsspruta, torka på sidorna för att ta bort eventuella droppar och placera nålen i injektionssprutan in i provcellen.
  9. På datorn, ställa in lämpliga driftsparametrarna. Den experimentella enzymet och substratkoncentrationer kan indikeras.
    1. I M1 experiment, ställa minst två tillägg (5-30 l) av substrat för att kontrollera reproducerbarheten. Ställ in avståndet mellan varje injektion (t ex 1000 sek) tillräckligt stor för att säkerställa att värmesignalen återgår till baslinjen före nästa tillsats.
    2. I experimentet M2, satt flera (t.ex. 15 x 5-10 pl) injektioner. Ange intervallet mellan injektionerna (t.ex. 180 sek) gör det möjligt för systemet att stabilize den termiska effekten till den nya baslinjen efter varje injektion.
      OBS: Avståndet tiden mellan injektioner i experimentet M2 bör vara tillräckligt kort för att undvika omvandling av en betydande mängd av substrat, vilket gör att mätningarna utförs under stationära förhållanden.
    3. I experimentet M2, använder små volymer (t ex 2 ^ l) för den första injektionen, vars motsvarande värde kasseras under den efterföljande dataanalys. I själva verket ofta presenteras det artefakter på grund av det initiala substratet diffusion genom sprutspetsen, och för närvaron av luftbubblor som fångats i injektionsnålen.
    4. Ställ in referens elnätet börjar den ungefärliga nivån där baslinjen kommer att placeras före reaktionen, till ett värde av 20. Definiera sedan den experimentella enzym och substratkoncentrationer och valde ett namn på experimentet.
    5. Definiera det experimentella temperatur, typiskt vid 25 ° C. ITC tillåter arbetstemperaturer mellan 2 ° C och 80 ° C. Experimentet är klar att köra. Tryck på "Start"-knappen för att starta experimentet.
  10. När experimentet är klar, rengör provcellen och sprutan enligt tillverkarens anvisningar.
  11. Upprepa försöket åtminstone en eller två gånger för att kontrollera reproducerbarheten av uppgifterna.

3. Dataanalys

  1. Från analysprogrammet, klicka på "Läs data"-knappen och navigera till den mapp där. Itc-filen för utfört M2 experimentet är belägen. Klicka på rullningsnedåtpilen i "Filformat" och välj "Enzyme Assay (den?)". Därefter, klicka och öppna. Itc-filen av experimentet M2.
  2. Erhåll AH av reaktionen från att integrera kurvan av M1 experimentet enligt ekvation 5.
    "Width =" 126 "/> (5)
    1. Klicka på "Läs data"-knappen och välj filen. Itc av utfört M1 experimentet. Med hjälp av Origin, dela upp spår i olika delar som innehåller en topp vardera och spara varje topp som en. OPJ fil. Öppna filen som motsvarar den första toppen, vilket resulterar från baslinjen avvikelse i termogrammet för injektion M1 experiment integrera den och fördela den erhållna område värde, uttryckt i μcal, av den slutliga substratkoncentrationen i provcellen, uttryckt i ^ iM, och genom cellvolymen uttryckt i liter, bestämning, enligt ekvation 5, AH av reaktionen.
    2. Upprepa samma procedur för den andra toppen av M1 experimentet och få ett medelvärde för de två AH mätningarna.
  3. Bestäm dQ / dt från M2 experimentet mäter skillnaden mellan den ursprungliga baslinjen och den nya baslinjen efter varje injektion. Konvertera experimental data till reaktionshastigheter enligt ekvation 4, med hjälp av entalpi värde som erhålls i M1 experimentet och passar data till Michaelis-Menten ekvationen.
    1. Från analysprogrammet, klicka på "Läs data"-knappen och välj filen. Itc av utfört M2 experimentet. Klicka på rullningsnedåtpilen i "Filformat" och välj "Enzyme Assay (den?)".
    2. Den enzymanalys dialogruta öppnas, vilket gör att välja en av de fyra modellerna. Välj "Metod 2 - endast substrat" ​​från fönstret.
    3. I AH-fönstret, anger värdet på AH som erhållits i steg 4.2.
    4. Klicka på "Koncentration" knappen för att kontrollera de koncentrationsvärden som ska användas i det passande förfarande. Klicka på "Genomsnittlig tid (P)"-knappen. Dialogrutan öppnas vilket ger möjlighet att ändra eller acceptera standardvärdet. Detta värde representerar den tid före varje injectjon i vilken medelvärdena instrumenteffektsignalen för att bestämma den effektnivå vid varje substratkoncentration. Klicka på OK för att bekräfta standardvärdet.
    5. Klicka på "Zero Y-axel"-knappen. Markören blir till ett hårkors som gör det möjligt att dubbelklicka på en punkt, att placera vid y = 0. Dubbelklicka strax före den första injektionen punkten.
    6. Klicka på Beräkna Rate knappen. Betyg plottas mot substratkoncentrationen, beräknad genom att dividera underlaget läggs under titreringen för provcellvolymen (med beaktande av utspädningseffekter). Denna operation ger en typisk Michaelis-Menten tomt som kan monteras för att erhålla K M och k katt.
    7. Om vissa punkter bör utgå, väljer "Trunkera Data"-knappen. Flytta brytpunkter för att utesluta de dåliga datapunkter och dubbelklicka på en av markörerna eller tryck Enter.
    8. Använd "Fit att modellera" funktion för att passa kurvan ocherhålla de kinetiska konstanterna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ureas (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolas) är en multisubunit nickelinnehållande enzym som finns i Archea, bakterier, encelliga eukaryoter och växter. Detta protein fungerar i det sista steget av mineraliseringen organiskt kväve, som katalyserar hydrolysen av urea till ammoniak och karbamat, som spontant sönderdelas till bildning av en andra molekyl av ammoniak och bikarbonat (ekvation 6) 12.

(6)

Denna reaktion orsakar en total ökning av pH i miljön, som är ansvarig för negativa effekter för människors hälsa och jordbruk 13. I växter, är den primära rollen av ureas för att återvinna näringsämnen kväve från arginas-härledda urea 14. Växt ureaser är generellt homo-hexamerer en 6 med varje underenhet som innehåller en aktiv plats med två Ni 2 + joner 15. Bland dem,Canavalia ensiformis (jack böna) ureas (JBU) var det första protein som skall kristallis 1926 16. Sedan dess har flera studier i stor utsträckning präglas av strukturella och enzymatiska aktivitet ureaser från flera källor 13, 17. Därför var ureolytic aktivitet JBU vald som representant reaktion att demonstrera tillämpningen av ITC i kvantitativ bestämning av enzymatisk katalys. Värdet AH = -10,5 kcal / mol mättes i en M1 experimentet (Figur 2A) genom att integrera den termiska effekten erhållna genom injicering ureasubstrat in i ureaslösningen och låta reaktionen fortgå till fullbordan. Den termiska effekten som är registrerade i en M2-experiment (figur 2B) omvandlades till reaktionshastigheten med användning av ekvation 4 (figur 2C). Fit av de erhållna data till Michaelis-Menten ekvationen förutsatt de kinetiska parametrarna för JBU i20 mM HEPES pH 7 som k cat = 30,200 sek -1 och K M = 3,45 mM, i samförstånd med tidigare rapporterade uppgifter 18, 19.

Figur 2
Figur 2. Urea hydrolys av ureas bestämdes genom ITC. JBU (typ C3) köptes som lyofiliserat enzym (nominell aktivitet 1538 U / mg) och späddes med 20 mM HEPES pH 7 till den slutliga koncentrationen. Koncentrationen av enzymet i reaktionsblandningen beräknades genom att jämföra den bestämda aktiviteten för den köpta varan till aktiviteten av det rena enzymet, rapporterats vara 6200 U / mg rent enzym 20, och en molär massa av 545 kDa, vilket motsvarar homo-hexamer protein. (A) Termisk effekt observerades i M1 experiment utfördes vid 25 ° C med 2 x 5 ^ il injekningar av 20 mM urea (i injektionssprutan) in 1 nM JBU (i provcellen). Ett avstånd på 750 sek mellan injektionerna påfördes tillåta baslinjen återvänder till det ursprungliga värdet. Entalpi reaktionen beräknas från integrationen av varje topp och medelvärdesbildning av två värden, enligt ekvation 5. Värdet redovisas i texten. (B) Värmekraft observeras i experimentet M2, som erhålls genom att titrera 400 mM urea (20 x 5 il injektioner) till 15 pM JBU. Ett avstånd på 180 sek tillämpades mellan injektioner, så att systemet för att uppnå och bibehålla steady state-nivån. DQ / dt vid olika substratkoncentrationer erhålls som förskjutning av baslinjen efter varje tillsats. Värmen av utspädning visas som ett blankprov (grå), som utförs genom att titrera substratet in i bufferten enbart. (C) Baslinjen förskjutningen i figur 2B omvandlades till reaktionshastigheten med användning avEkvation 4. Fit av de erhållna data (fyllda fyrkanter) utfördes med användning av ekvation 2, och är representerad som en heldragen linje. Värdet på K M och kcat erhållen från passform rapporteras i texten.

Den totala värmeförändringen mätt i M1 experimentet representerar summan av alla händelser som inträffar under reaktionen under analysen, och beror på den molära entalpin för alla processer, inklusive, i tillämpliga fall, proton utsättning eller upptagning från bufferten. I en generisk process i vilken det reagerande systemet förvärvar protoner i en buffrad lösning, frisätter buffert protoner, som producerar ytterligare värme i reaktionscellen. Därför är den uppmätta AH framgår (AH app), och innefattar den inneboende AH av reaktionen (AH int), såväl som jonisering entalpi av bufferten (AH jon), och ii) antalet exchanging protoner (n), enligt ekvation 7:

(7)

Med användning av denna ekvation, i M1 experiment kan vi fastställa n och AH int genom att utföra samma experiment i buffertar med olika jonisering entalpier och plotta uppmätt AH appen som en funktion av AH jonspecifika för bufferten. Från den resulterande linjära regressionen, n härleds från lutningen: en negativ lutning reflekterar protoner som förvärvats av bufferten, medan en positiv lutning representerar protoner som frigörs från buffert; AH int härrör från skärningen på y-axeln.

Som observerats i ekvation 6, den totala urea hydrolys reaktion resulterar i förvärv av en proton H + från bufferten. Följaktligen, såsom debeskrivs ovan, reaktionsvärmet innefattar bidraget av buffert deprotonering. För att beräkna den inneboende AH av hydrolysreaktionen var tre M1 experiment utfördes i olika buffertar (HEPES, Tris-HCl, fosfat), som kännetecknas av tre olika AH jon. AH int och antalet protoner frigöras från bufferten, beräknas från den intercept och lutningen på den linjära passa på experimentella data (Figur 3) enligt ekvation 7, var -14,7 kcal / mol och 0,98 respektive, i full överensstämmelse med data som tidigare rapporterats för samma reaktion som katalyseras av Helicobacter pylori ureas 7. Såvitt vi vet har inga termodynamiska data rapporterats för JBU hittills.

Figur 3
AH int av ureasreaktionen. Värden av AH app i olika buffertar (fyllda kvadrater) bestämdes genom att utföra M1 experiment i 20 mM HEPES (AH jon = 4,88 kcal / mol), 20 mM Tris-HCl (AH jon = 11,34 kcal / mol) och 20 mM fosfat (AH jon = 0,86 kcal / mol) 21. Linjär regressionsanalys (heldragen linje) av data som tillåts bestämma AH int av reaktionen, liksom antalet protoner utbyts under ureaomsättningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betydelsen av ITC att studera enzymatisk aktivitet med avseende på befintliga metoder

Utöver sin klassiska program för att studera bindande jämvikter, ger isotermisk titrering kalorimetri en tillförlitlig och snabb metod för att karakterisera enzymatiska reaktioner i lösning med hjälp av reaktionsvärmen som en sond, utan att kräva system för modifiering eller märkning. De kinetiska parametrarna kcat och K M erhålls vanligen genom en uppsättning av tidsförlopp experiment, i vilka produktbildning (eller substratkonsumtion) övervakas i kontinuerliga eller diskontinuerliga analyser. Typiskt är substratet eller produktkoncentration uppmätt genom Ijusabsorbans eller fluorescens vid karaktäristiska våglängder. Men de flesta underlag och / eller produkter är inte spektroskopiskt aktiva, och därmed en kromofor eller fluorofor måste inkluderas för att följa reaktionen. Alternativt kopplades analyser medprodukten av katalys är ett substrat för en annan reaktion med mätbar produkt, kan användas. Dessa metoder är dock införa ytterligare variabler som minskar noggrannheten i de bestämda värdena på K M och k katt. Vidare skulle karakterisering av enzymhämning av små ligander med användning av traditionella metoder att kompliceras av absorbansen eller fluorescensen hos den lilla liganden själv, vilket kan ändra tillförlitlighet spektroskopisk analys. Alternativa metoder innefattar stoppade flödestekniker, i vilka den mängd produkt kvantifieras genom masspektrometri eller kromatografi. Dessa tekniker är mycket exakt och tillförlitlig, men är tidskrävande och dyrt för rutinanalys. Sonden följde i ITC experiment, det är den värme som frigörs eller absorberas, är en inneboende egenskap hos nästan alla kemiska reaktioner. Därför ITC inte kräver någon ändring eller märkning av det system som analyseras. Dessutom thans teknik är enkel och snabb, kräver liten mängd material och kan utföras i lösning 22, 23.

Kritiska steg i protokoll och eventuella ändringar

Reaktions analys utföres i allmänhet i två olika experiment, som ger den totala molära entalpin av reaktionen och värmeförändringar över tiden vid olika substratkoncentrationer. För att få uppgifter av god kvalitet, måste experimentet planeras i detalj i början av undersökningen. Proteinet och substratkoncentrationer måste noggrant bestämmas, eftersom deras rätt värde är viktigt för att beräkna tillförlitliga parametrar i dataanalys. Bufferten komposition och pH för både enzymet och substratlösningarna måste vara identiska, för att minimera värme av blandning under substrattillsats. Detta kan i allmänhet säkerställas genom att utföra en dialys eller en storlek uteslusionen kromatografisteg på enzymlösningen före kör experimentet och med användning av den buffert som eluerar från kolonnen för att lösa upp substratet. Ett kontrollexperiment måste utföras med identiska lösningar av substrat sprutas in i reaktionsbuffert i frånvaro av enzymet, för att subtrahera hetta utspädning eller att kontrollera att den är försumbar.

Dataanalys utförs i allmänhet med Origin program för ITC som tillhandahålls av tillverkaren. Ett alternativt program för valet för dataanalys kan användas, om det behövs.

Felsökning och begränsningar av tekniken

En bra signal-till-brusförhållande erhålles endast om reaktionen fortskrider i en takt som gör att systemet för att producera tillräckligt med värme i ITC-cell för att övervinna den instrumentdetektionsgränsen. Detta uppnås vanligen för system med kcat högre än 1 min -1. I detta fallOrigin programvara för ITC beräknar automatiskt Michaelis-Menten plot från rådata, och med hjälp av icke-linjär minsta kvadratregressionsanalys, den beräknar k katt och K M-värden. Denna analys tar inget betydande produkt inhibition. Det senare är i allmänhet synlig när efterföljande injektioner i M1 experimentet producerar toppar med olika former och, framför allt, med makt spår av den andra toppen tar längre tid att återgå till den ursprungliga baslinjen. Om produkthämning inträffar, en annan programvara val, genomförs med syfte specifika ekvationer, måste användas.

Med tanke på den inneboende skillnaden för varje enzymsystem och olika värme som produceras av olika reaktioner, som inte kan kvantifieras på förhand bestämma de optimala driftsförhållanden (dvs. enzym-och substratkoncentrationer, antal och volym av injektioner, distans tid, etc.) för ett specifikt system ibland r Equire fåtal undersökande titreringar.

Under analysen måste försiktighet tillämpas för att välja de experimentella betingelserna i enlighet med systemet i enlighet med analysen. Exempelvis inhiberar fosfatureahydrolysen med ureas, och därför bättre att utföra experimentet i fosfatbuffert minskar den totala hastigheten för den enzymatiska reaktionen 24, 25.

Tillämpningar

När kinetiken för den enzymatiska reaktionen har bestämts, kan reaktionen upprepades i närvaro av olika typer och koncentrationer av enzyminhibitorer i provcellen, för att mäta, med hjälp av den allmänna hämning Ekvation 8 26, konkurrenskraftig (K ic) och konkurrenskraftiga (K UIC) inhibitionskonstanter, vilket gör det möjligt för oss att urskilja bland olika typer av inhibition.

iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "width =" 284 "/> (8)

Sammanfattningsvis kan denna metod användas som ett snabbt och ekonomiskt sätt att testa ett stort antal enzyminhibitorer för farmaceutiska och industriella tillämpningar, t.ex. i läkemedelsscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Den specialgödnings Produkter Företag (SFP) är känd för att tillhandahålla de medel som behövs för denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma H3375 dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base Sigma T1503 dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate Riedel-de-Haen 4270 dissolving in water
Sodium phosphate dibasic Riedel-de-Haen 30427 dissolving in water
Urea Sigma U4128 dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3) Sigma U0251 dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) SYS13901 instrument 
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) data acquisition software supplied with the instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
  2. Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
  3. Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
  4. Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
  5. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
  6. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  7. Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
  8. Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
  9. Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
  10. Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
  11. Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. , Cambridge University Press. 312-356 (2000).
  12. Ciurli, S. Nickel and its surprising impact in nature. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).
  13. Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
  14. Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
  15. Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
  16. Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
  17. Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
  18. Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
  19. Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
  20. Hausinger, R. P., Karplus, P. A. Handbook of Metalloproteins. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. , John Wiley & Sons. 867-879 (2001).
  21. Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
  22. Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
  23. Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
  24. Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
  25. Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
  26. Segel, I. H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , Wiley, NY. (1993).

Tags

Kemi Isotermisk titrering kalorimetri enzymatisk katalys kinetik termodynamik entalpi Michaelis konstant katalytiska hastighetskonstanten ureas
Hot biologisk katalys: Isotermiska Titrering Calorimetry för att karaktärisera enzymatiska reaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. More

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter