Hot Biologisk katalyse: Isothermal Titrering kalorimetri at karakterisere enzymatiske reaktioner

Summary

Isotermisk titrering kalorimetri foranstaltninger varmestrøm frigivet eller absorberet i kemiske reaktioner. Denne metode kan anvendes til at kvantificere enzym-katalyse. I dette papir, protokol for instrumental opsætning, eksperiment kører, og dataanalyse beskrives generelt, og anvendes til karakterisering af enzymatisk urea hydrolyse ved sværdbønne urease.

Abstract

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) er et velbeskrevet teknik, der måler varmeafgivelse eller absorberes i løbet af en kemisk reaktion, bruge det som en iboende sonde til at karakterisere næsten enhver kemisk proces. I dag er denne teknik vid udstrækning anvendes til at bestemme termodynamiske parametre for biomolekylær bindende ligevægte. Desuden har ITC vist sig at være i stand til direkte at måle kinetik og termodynamiske parametre (k _kat, K _M, AH) af enzymatiske reaktioner, selv om denne ansøgning er stadig underudnyttet. Som spontant opstår varme ændringer i løbet af enzymatisk katalyse, er ITC ikke kræver nogen ændring eller mærkning af systemet under analyse og kan udføres i opløsning. Desuden fremgangsmåden brug lille mængde materiale. Disse egenskaber gør ITC et uvurderligt, kraftfuld og unikt værktøj til at studere enzymkinetik i flere programmer, såsom, for eksempel lægemiddelforskning.

kcat og K _M af den enzymatiske hydrolyse af urinstof ved Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Beregning af indre molære enthalpi (AH _int) i reaktionen udføres. De således opnåede værdier er i overensstemmelse med tidligere data rapporteret i litteraturen, viser pålideligheden af ​​metoden.

Introduction

Kvantitativ bestemmelse af biokemiske reaktioner giver indsigt i de biologiske processer på basis af livet. Kalorimetri tilbyder en etiket-fri metode til kvantitativt karakterisere næsten enhver kemisk reaktion i opløsning. Denne teknik måler den varme, der frigøres eller absorberes over tid, og derfor er et universelt system til påvisning og en meget praktisk metode til at kvantificere mængden af reagerende molekyler (dvs. bindende termodynamik), samt til at måle reaktionshastigheden (dvs. kinetik). Især har isoterm titrering kalorimetri (ITC) er blevet vedtaget som den foretrukne metode til at karakterisere termodynamik biomolekylære ligevægte, der involverer protein-ligand protein-protein, protein-metalioner og protein-DNA interaktioner ^1-6. Desuden evne ITC at tilvejebringe kinetisk information gør det til en meget kraftfuld system til at måle enzymkatalyse, selv om potentialet i denne ansøgning er stadigundervurderet ^7-9.

Michaelis-Menten-ligningen ¹⁰ er en kvantitativ beskrivelse af enzymatiske reaktioner, da det giver en sammenhæng mellem reaktionshastighed og substratkoncentrationen, afhængigt af to kinetiske parametre: Michaelis konstant (K _M), og den katalytiske hastighedskonstant _(kcat) . The _kcat / _KM-forholdet er nævnt som den katalytiske effektivitet af et enzym. I praksis, bestemmelse af K _M og K _kat for en specifik reaktion giver en komplet beskrivelse af katalyse.

I en typisk enzymatisk reaktion (figur 1) et substrat (S) interagerer med enzymet (E), der danner enzym-substrat (ES)-komplekset, der efterfølgende aktiveres i transition state (ES *). Sidstnævnte omdannes til enzym-produkt (EP) kompleks, der i sidste ende dissocierer. Disse skridts er beskrevet ved den følgende reaktion.

(1)

hvor k ₁ er hastighedskonstanten for dannelsen af ES-kompleks, k _-1 er hastighedskonstanten for dissociation af ES-kompleks, mens _kcat er den katalytiske hastighedskonstant eller omsætning nummer.

Ifølge Michaelis-Menten ligningen ^10, kan hastigheden af reaktionen beregnes som:

(2)

hvor K _M = (k _-1 + k _cat) / k ₁ og k _cat = v _max / [E], og v _max er den maksimale hastighed nås, når alt enzym er bundet til substratet.

Den isotermiske titrering kalorimeter er det instrument, der anvendes i denne undersøgelse for at karakterisere den enzymatiske hydrolyse af urinstof. Dette instrument består af en adiabatisk skjold indeholder to opfundet-formede celler (fig. 1). Disse er forbundet til ydersiden med smalle adgang rør. Prøvecellen (ca. 1,4 ml) er fyldt med enzymopløsningen, mens Cellereferencen generelt er fyldt med vand eller med opløsningsmidlet, der anvendes til analysen. En roterende sprøjte med en lang nål og en mixeren tilknyttet, der sædvanligvis indeholder ca. 0,3 ml substratopløsning er monteret på prøvecellen. En termoelektrisk anordning måler forskellen i temperatur mellem prøven og referencen celle og ved hjælp af en "celle-feedback netværk", det fastholder denne forskel på nul ved at tilføje eller fratrække varme. Under eksperimentet substratet sprøjtes ind enzymopløsningen ved en konstant valgte temperatur. Når enzymatic reaktion finder sted, den mængde varme, der frigøres eller absorberes er proportional med antallet af substratmolekyler, der omdannes til produkt-molekyler. Desuden er hastigheden af ​​varmestrømmen direkte relateret til hastigheden af ​​reaktionen. De målte data, der optræder som en afvigelse af varme spor fra den indledende baseline (figur 1), repræsenterer den termiske effekt (μcal / sek) leveres af instrumentet til prøven celle, der er proportional med varmestrøm forekommer i prøven celle over tid.

Figur 1. Skematisk repræsentation af isotermisk titrering-kalorimeter at undersøge enzymatiske reaktioner. En enzymatisk reaktion under titrering af substratet (i injektionssprøjten) i enzymopløsning (i prøvecellen) resulterer i en ændring af den thermal effekt frigivet af kalorimeteret, nødvendig for at holde forskellen i temperatur mellem prøven celle og cellereferencen konstant. Klik her for at se større billede.

Samlet set varmeændring (Q) er proportional med den molære enthalpi af reaktionen (AH) og antallet af mol-produkt genereret (n), som igen er givet ved den samlede volumen gange koncentrationen:

(3)

Produktet formation over tid (dP / dt), der svarer til den reaktionshastighed, kan således være relateret til mængden af ​​varme, der genereres i løbet af samme tid (dQ / dt) gennem relationen:

(4)

Ifølge denne ligning med henblik på at opnå en Michaelis-Menten plot det er nødvendigt at måle i) den samlede molære enthalpi AH, og ii) varmestrøm dQ / dt ved forskellige substratkoncentrationer. Normalt er denne udført i to forskellige eksperimenter: i det første eksperiment (metode 1 M1) substratet injiceres i enzymopløsningen og varmen for komplet substrat omdannelse måles; i det andet eksperiment (Metode 2, M2), er flere injektioner af substrat udføres, og hastigheden af varmeproduktion måles ved forskellige substratkoncentrationer. Disse to sæt af data er tilstrækkelige til at udlede de kinetiske parametre K _M og k _kat.

I denne artikel er en generel protokol til at bestemme de kinetiske parametre for enzymatiske reaktioner udført ved hjælp af ITC beskrevet. Vi har anvendt den metode til at urea hydrolyse af Canavalia ensiformis ureaselv som et referencesystem. Den gode aftale mellem de opnåede ved hjælp af denne metode resultater og de rapporterede data i litteraturen viser pålideligheden af ​​denne fremgangsmåde.

Protocol

1.. Forberedelse Prøver

1. Forbered 2 ml enzymopløsning og 0,5 ml substratopløsning for hver forsøgskørsel. Fortyndes koncentrerede stamopløsninger af enzym og substrat i pufferopløsninger med identisk sammensætning for at minimere den varme fortynding og blanding under substrattilsætning.
   1. Vælg pufferbetingelserne forhold, der er tilstrækkelig til at forhindre pH-ændring i løbet af eksperimentet. For eksempel, 20 mM HEPES pH 7 er tilstrækkelig til målinger ved neutral pH.
      BEMÆRK: Hvis protonudveksling er involveret, skal protonering enthalpien af de anvendte buffere i betragtning, fordi de påvirker den målte AH af reaktionen. Der skal tages hensyn til eventuelle særlige virkninger af buffer eller tilsætningsstoffer molekyler på systemet under analysen. Hvis organiske opløsningsmidler (f.eks DMSO) er inkluderet i enzymopløsningen tilføje dem på præcis den samme koncentration i substratopløsningen.
   2. For M1 eksperimentet startermed enzym koncentration i nM-området (fx 1 nM) og med en substratkoncentration mindst tre størrelsesordener højere end enzymkoncentrationen og over K _M.
   3. For M2 eksperimentet starter med enzym koncentration i PM-nM (fx 15 PM). Substratkoncentration i sprøjten er i mM rækkevidden (f.eks 400 mM).
      BEMÆRK: I enkelt injektion M1 eksperiment, skal koncentrationen være tilstrækkelig til at opnå den totale substratomdannelse i produktet i løbet af den eksperimentelle tid. Derfor er koncentrationen af enzym afhænger af hastighedsbegrænsende enzym: Hvis enzymer med lav _kcat er under undersøgelse, højere enzymkoncentrationer (op til 10 uM) skal anvendes. På den anden side skal enzymkoncentrationer anvendes i M2 eksperimentet sikre, at den injicerede substratet er kun marginalt (mindre end 5%), der forbruges, og at enzymet reaktionen forløber ved steady state. Derfor, jo højereenzym effektivitet, jo lavere den ønskede enzymkoncentration. Ved afslutningen af forsøget, bør substratkoncentration i prøvecellen være højere end K _M.
2. Kontroller omhyggeligt enzym og substratkoncentrationer med en passende analysemetode (f.eks absorbansen ved 280 nm, kolorimetriske, BCA analyser ^11. Dette er nødvendigt for at opnå præcis og pålidelig beregning af termodynamiske og kinetiske parametre.
3. Mål pH-værdien af ​​løsninger, og kontrollere, at pH misforhold både enzymet og substratet løsninger er minimal under de eksperimentelle betingelser (± 0,05 pH-enheder).

2. Udførelse af eksperiment

BEMÆRK: Den samme fremgangsmåde skal anvendes for både M1 og M2 forsøget, som udføres efter hinanden.

1. Kontroller, at prøvecellen og injektionssprøjten rengøres ifølge producentensinstruktioner. Fyld lastning sprøjte forsynet med instrumentet med destilleret vand, indsættes nålen forsigtigt i prøven celle, fylde cellen og fjern væsken ved hjælp af den samme sprøjte. Ved hjælp af denne metode vaskes prøvecellen to gange med destilleret vand og to gange med puffer.
2. Load prøven celle med 2 ml enzym løsning vha. lastning sprøjten omhyggeligt undgår dannelse af luftbobler. Langsomt injicere opløsningen ind i cellen, indtil det spild ud i toppen af ​​cellen stilken. Fremstil en slutspurt på ca. 0,25 ml opløsning i cellen. Gentag to gange. Dette trin fjerner luftbobler fanget i prøvecellen.
3. Anbring kanylen af ​​læsning sprøjte på afsatsen mellem cellen stilken og celle-port og fjerne overskydende opløsning.
4. Start VP-Viewer-programmet og fra computer interface, ligevægt ITC instrumentet til en temperatur 3 ° C under den ønskede eksperimentel temperatur. Dette er nødvendigt for at undgå lange ligevægtsindstillingperioder før forsøget, på grund af den passive instrumental køleindretning.
5. Fyld cellereferencen med destilleret vand med samme procedure ovenfor. Når puffere med høj ionstyrke eller høj osmolalitet er i prøveopløsningen, skal den samme puffer anvendes som en referenceopløsning.
6. Link en plastsprøjte til fyldeporten af ​​injektionssprøjten ved hjælp af en tynd silicium rør. Fyld injektionssprøjten placere nålespidsen i vand og udarbejdelse, indtil vandet kommer ud af den øverste fyldning port, hvilket indikerer, at injektionssprøjten er fuld. Derefter flytte sprøjten fra vand og udarbejde luft, at tømme injektionssprøjten. Med denne fremgangsmåde vaskes injektionssprøjten med puffer og trække luft gennem systemet. Efterfølgende placere injektionsnålen i et smalt rør indeholdende 0,5 ml substratopløsning omhyggeligt udarbejde og fuldstændigt at fylde injektionssprøjten, efterlader lille mængde opløsning ved bunden af ​​røret.
7. Fracomputer interface, skal du trykke på "Close fyld port". Fjern silicium loading røret. Tryk på "Purge og refill" knappen for at tillade injektionssprøjten at løsne eventuelle luftbobler og udvise dem tilbage i bulk løsning. Gentag to gange.
8. Flyt injektionssprøjten, tørre på siderne for at fjerne eventuelle dråber og placere kanylen af ​​injektionssprøjten i prøven celle.
9. På computeren, angive de relevante drifts-parametre. Kan angives den eksperimentelle enzym og substratkoncentrationer.
   1. I M1 eksperiment sat mindst to tilføjelser (5-30 ul) af substrat at verificere reproducerbarhed. Indstil afstanden mellem hver injektion (fx 1.000 sek) stor nok til at sikre, at de varme signalet vender tilbage til basislinien inden næste tilsætning.
   2. I M2 eksperiment sat flere (fx 15 x 5-10 ul) injektioner. Indstil intervallet mellem injektionerne (fx 180 sek) gør det muligt for systemet at stabilize termiske effekt til den nye baseline efter hver injektion.
      BEMÆRK: Afstanden tid mellem injektionerne i M2 eksperimentet skal være kort nok til at undgå konvertering af en betydelig mængde af substrat, så målingerne skal udføres under stabile forhold.
   3. I M2 eksperiment bruge små mængder (f.eks 2 ul) for den første injektion, hvis tilsvarende værdi kasseres under den efterfølgende dataanalyse. Faktisk er det ofte viser artefakter på grund af den oprindelige substrat diffusion gennem sprøjtens spids og for tilstedeværelsen af ​​luftbobler fanget i kanylen.
   4. Indstil reference magt, den omtrentlige niveau, hvor baseline vil blive placeret før reaktionen starter, til en værdi af 20. Derefter definere den eksperimentelle enzym og substratkoncentrationer og valgte et navn til eksperimentet.
   5. Definer den eksperimentelle temperatur, typisk ved 25 ° C. Tillader ITC arbejder temperaturer mellem 2 ° C og 80 ° C. Eksperimentet er klar til at køre. Tryk på "Start" knappen for at starte eksperimentet.
10. Når eksperimentet er afsluttet, rense prøvecellen og sprøjten i henhold til producentens anvisninger.
11. Gentag forsøget mindst én eller to gange mere for at kontrollere reproducerbarheden af ​​dataene.

3. Dataanalyse

1. Ud fra analysen program, klik på "Læs data" knappen, og navigere til den mappe, hvor. ITC fil af det udførte M2 eksperimentet er placeret. Klik på pilen rulle ned af "Filtype" og vælg "Enzyme Assay (det?)". Derefter, klik og åbn. ITC fil af M2 eksperimentet.
2. Anskaf AH af reaktionen fra integrere kurven for M1 forsøget i henhold til ligning 5..
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Klik på "Læs data" knappen, og vælg filen. ITC af det udførte M1 eksperimentet. Brug Oprindelse, opdele spor i forskellige dele, der indeholder et højdepunkt hver og gemme hver top som en. OPJ fil. Åbn den fil, der svarer til den første top, hvilket resulterer fra baseline afvigelse i termogrammet af enkelt injektion M1 eksperiment integrere det og dividere den opnåede område værdi, udtrykt i μcal ved det endelige substrat i prøven celle, udtrykt i uM, og cellevolumenet udtrykt i liter, bestemme, i henhold til ligning 5, er AH af reaktionen.
   2. Gentag den samme procedure for den anden top af M1 eksperimentet og opnå en gennemsnitlig værdi for de to DH målinger.
3. Bestem dQ / dt M2 eksperimentet måle forskellen mellem den oprindelige baseline og den nye baseline efter hver injektion. Konverter experimental data til reaktionshastigheder ifølge ligning 4, ved hjælp af enthalpi værdi opnået i M1 eksperimentet og passer data til Michaelis-Menten ligningen.
   1. Ud fra analysen program, klik på "Læs data" knappen, og vælg filen. ITC af det udførte M2 eksperimentet. Klik på pilen rulle ned af "Filtype" og vælg "Enzyme Assay (det?)".
   2. Enzymassayet dialogboks, så at vælge en af ​​de fire modeller. Vælg "Metode 2 - kun Substrat" ​​fra vinduet.
   3. I AH vinduet angiver værdien af AH opnået i trin 4.2.
   4. Klikke på "Concentration" knappen for at kontrollere de koncentrationsværdier, der skal anvendes i tilpasningsproceduren. Klik på "Gennemsnitlig tid (P)"-knappen. Dialogboksen åbnes giver mulighed for at ændre eller acceptere standardværdien. Denne værdi repræsenterer den tid, før hver injicereion, som instrumentet gennemsnit magt signal til at bestemme effekt ved hver substratkoncentration. Klik på OK for at bekræfte standardværdien.
   5. Klik på "Zero Y-akse"-knappen. Markøren bliver til et trådkors gør det muligt at dobbeltklikke på et punkt, at placere på y = 0. Dobbeltklik lige før den første injektion punkt.
   6. Klik på knappen Beregn Rate. Rate afsættes mod koncentrationen substrat, fremkommer ved at dividere substrat tilsættes under titreringen for celle volumen af ​​prøven (under hensyntagen til udvanding effekter). Denne operation giver et typisk Michaelis-Menten plot, som kan monteres for at opnå K _M og k _kat.
   7. Hvis nogle punkter bør udgå, skal du vælge "Afkort data"-knappen. Flyt datamærker at udelukke de dårlige datapunkter og dobbeltklik på en af ​​de markører eller tryk enter.
   8. Brug funktionen "Tilpas til Model" til at passe kurven og tilopnå de kinetiske konstanter.

Representative Results

Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) er en multisubunit nikkel-holdige enzym i Archea, bakterier, encellede eukaryoter og planter. Dette protein virker i det sidste trin af organisk kvælstof mineralisering, katalyserer hydrolyse af urea til ammoniak og carbamat, som spontant nedbrydes til at give et andet molekyle af ammoniak og bikarbonat (ligning 6) ^12.

(6)

Denne reaktion medfører en samlet stigning af pH i miljøet, som er ansvarlig for negative virkninger for menneskers sundhed og landbrug ^13.. I planter, den primære rolle urease er at genanvende næringsstoffer kvælstof fra arginase-afledt urea ^14. Plant ureaser er generelt homo-hexamerer ₆ med hver underenhed indeholdende et aktivt sted med to Ni ^{2 +} ioner ^15. Blandt dem,Canavalia ensiformis (jack bønne) urease (JBU) har været den første protein, der skal krystalliseres i 1926 ^16. Siden da har flere undersøgelser grundigt karakteriseret den strukturelle og enzymatiske aktivitet af ureaser fra flere kilder ^{13, 17.} Derfor blev den ureolytic aktivitet JBU udvalgt som et repræsentativt reaktion at demonstrere anvendeligheden af ​​ITC i kvantitativ bestemmelse enzymatisk katalyse. En værdi på AH = -10,5 kcal / mol blev målt i et M1 eksperiment (figur 2A) ved at integrere den termiske effekt resulterer ved at injicere urinstof substrat i ureaseopløsning og lade reaktionen forløbe til færdiggørelse. Den termiske effekt er registreret i en M2 eksperiment (figur 2B) blev omdannet til reaktionshastigheden anvendelse af ligning 4 (figur 2C). Fit af de opnåede data til Michaelis-Menten ligningen forudsat de kinetiske parametre for JBU i20 mM HEPES pH 7 som k _cat = 30.200 sek ^-1 og K _M = 3,45 mM efter aftale med tidligere rapporterede data ^{18, 19.}

Figur 2. Urea hydrolyse med urease bestemt ved ITC. JBU (type C3) blev købt som lyofiliseret enzym (nominel aktivitet 1.538 U / mg) og fortyndet med 20 mM HEPES pH 7 til den endelige koncentration. Koncentrationen af enzymet i reaktionsblandingen blev beregnet ved at sammenligne den bestemte aktivitet af det købte produkt til aktiviteten af det rene enzym, rapporteret at være 6.200 U / mg rent enzym ^20, og en molær masse på 545 kDa, svarende til homo-hexamer protein. (A) termisk effekt observeret i M1 forsøg udføres ved 25 ° C med 2 x 5 ul injektiontioner af 20 mM urea (i injektionssprøjten) i 1 nM JBU (i prøvecellen). En afstand på 750 sek mellem injektionerne blev anvendt til at tillade basislinien at vende tilbage til den oprindelige værdi. Enthalpien af reaktionen beregnes ud fra integration af hver spids og gennemsnittet af de to værdier, i henhold til ligning 5. Værdien er rapporteret i teksten. (B) Termisk effekt observeret i M2 eksperimentet, fremstillet ved titrering 400 mM urea (20 x 5 mikroliter injektioner) i 15 pM JBU. En afstand på 180 sek blev anvendt mellem injektioner, med henblik på at gøre det muligt for systemet at nå og opretholde steady state niveau. DQ / dt ved forskellige substratkoncentrationer fås som forskydning af baseline efter hver tilsætning. Varmen fra fortynding er vist som en tom eksperiment (grå), udføres ved at titrere substrat i puffer alene. (C) at baseline forskydning i figur 2B blev omdannet til reaktionshastigheden ved hjælpLigning 4. Fit af de opnåede data (udfyldte firkanter) blev udført under anvendelse af ligning 2, og er repræsenteret som en optrukken linje. Værdien af K _{M kcat} opnået fra pasformen er rapporteret i teksten.

Den samlede varmeproduktion ændring målt i M1 eksperiment repræsenterer summen af ​​alle hændelser under reaktionen under analysen, og afhænger af den molære enthalpi alle de involverede processer, herunder, hvis relevant, proton frigivelse eller optagelse fra bufferen. I en generisk proces, hvor reaktionssystemets erhverver protoner i en bufferopløsning, bufferen frigiver protoner producerer yderligere varme i reaktionen celle. Derfor måles AH fremgår (AH _app) og omfatter den iboende AH af reaktionen (AH _int) samt ionisering entalpi bufferen _(AH-ion), og ii) antallet af exchangning protoner (n), ifølge ligning 7:

(7)

Ved hjælp af denne ligning, i M1 eksperimenter, kan vi bestemme n og AH _int ved at udføre det samme eksperiment i buffere med forskellige ionisering entalpier og afbilde den målte AH _app som en funktion af AH _ion specifikt for bufferen. Fra den resulterende lineær regression, n er afledt fra hældningen: negativ hældning afspejler protoner erhvervet af puffer, mens en positiv hældning repræsenterer protoner frigives fra bufferen, AH _int stammer fra skæringen på y-aksen.

Som anført i ligning 6, de samlede urea hydrolyse reaktion resulterer i erhvervelse af en proton H ⁺ fra bufferen. Således som debeskrevet ovenfor, reaktionsvarmen omfatter bidrag puffer deprotonering. For at beregne de iboende AH af hydrolysereaktionen, blev tre M1 eksperimenter udført i forskellige buffere (HEPES, Tris-HCI, phosphat), kendetegnet ved tre forskellige _AH-ion. AH _int og antallet af proton frigivet fra buffer, beregnet ud fra skæringspunkt og hældningen af den lineære fit af de eksperimentelle data (Figur 3) i henhold til ligning 7, var -14,7 kcal / mol og 0,98 henholdsvis i fuld overensstemmelse med data, der tidligere er rapporteret for den samme reaktion katalyseret af Helicobacter pylori urease ^7. Til vores viden, er der ikke termodynamiske data blevet rapporteret for JBU, indtil videre.

AH _int urease reaktionen. Værdier af AH _app i forskellige buffere (fyldte firkanter) blev bestemt ved at udføre M1 eksperimenter i 20 mM HEPES (AH _ion = 4,88 kcal / mol), 20 mM TrisHCI (AH _ion = 11,34 kcal / mol), og 20 mM phosphat (AH _ion = 0,86 kcal / mol) ^21. Lineær regressionsanalyse (fuldt optrukket linie) af data tilladt bestemmelse AH _int af reaktionen, samt antallet af protoner, der udveksles under urinstof omsætning.

Discussion

Betydningen af ITC at studere enzymatisk aktivitet med hensyn til de eksisterende metoder

Ud over sin klassiske applikationer for at studere bindende ligevægte, isotermiske titrering kalorimetri giver en pålidelig og hurtig metode til at karakterisere enzymatiske reaktioner i opløsning ved hjælp af varmen fra reaktionen som en sonde, uden at det kræver systemet ændring eller mærkning. De kinetiske parametre _kcat og K _M opnås sædvanligvis gennem et sæt af tidsforløbet eksperimenter, hvor dannelsen produkt (eller substrat forbrug) overvåges i kontinuerlige eller diskontinuerlige assays. Typisk er substratet eller produktet koncentration målt ved lysabsorbans eller fluorescens ved karakteristiske bølgelængder. Men de fleste substrater og / eller produkter ikke er spektroskopisk aktive, og derfor en kromofor eller fluorofor skal medtages for at følge reaktionen. Alternativt koblede assays medproduktet af katalyse være et substrat for en anden reaktion med målbare produkt, kan anvendes. Disse metoder er imidlertid indføre yderligere variabler, der reducerer nøjagtigheden af de bestemte værdier for K _M og K _kat. Desuden kan karakterisering af enzyminhibering små ligander ved hjælp af traditionelle metoder, kompliceres af absorbansen eller fluorescensen af ​​den lille ligand selv, hvilket kan ændre pålideligheden af ​​spektroskopisk analyse. Alternative metoder indebærer stoppet flow teknikker, hvor mængden af ​​produktet kvantificeres ved hjælp af massespektrometri eller kromatografi. Disse teknikker er meget præcis og pålidelig, men er tidskrævende og dyrt til rutineanalyse. Sonden blev fulgt i ITC eksperimenter, der er den varme, frigivet eller absorberet, er en iboende egenskab af næsten alle kemiske reaktioner. Derfor finder ITC kræver ikke nogen ændring eller mærkning af systemet under analysen. Endvidere thans teknik er enkel og hurtig, kræver lille mængde materiale og kan udføres i opløsning ^{22, 23.}

Kritiske trin i protokollen og eventuelle ændringer

Reaktionen analyse udføres generelt i to forskellige forsøg, som giver den totale molære enthalpi af reaktionen og varmen ændring over tid ved forskellige substratkoncentrationer. For at opnå data af god kvalitet, skal forsøget planlægges i detaljer i starten af ​​undersøgelsen. Proteinet og substratkoncentrationer skal omhyggeligt bestemmes, da deres korrekte værdi er afgørende for beregning af pålidelige parametre i dataanalyse. Sammensætningen puffer og pH af både enzymet og substratet løsninger skal være ens, for at minimere varme blanding under substrattilsætning. Dette opnås normalt ved at udføre en dialyse eller en størrelse udelukkendesionen kromatografitrin på enzymopløsningen før kører eksperiment, og under anvendelse af bufferen eluering fra søjlen til at opløse substratet. Et kontrolforsøg skal udføres med identiske opløsninger af substrat sprøjtet ind i reaktionsbuffer i fravær af enzymet, for at trække varme fortynding eller at kontrollere, at den er ubetydelig.

Dataanalyse er generelt udført med Origin program for ITC fra producenten. Et alternativt program valg for dataanalyse kan anvendes, hvis nødvendigt.

Problemløsning og begrænsninger af teknikken

Et godt signal-støj-forhold opnås, hvis reaktionen forløber med en hastighed, der tillader systemet at producere nok varme i ITC celle til at overvinde den instrumentale detektionsgrænse. Dette opnås sædvanligvis til systemer med k _kat højere end 1 min ^-1. I dette tilfældeOrigin software til ITC beregner automatisk Michaelis-Menten plot fra rå data, og ved hjælp lineær mindste kvadraters regressionsanalyse beregner k _kat og K _M værdier. Denne analyse forudsætter ingen signifikant produkt hæmning. Sidstnævnte er generelt synlige, når efterfølgende injektioner i M1 eksperimentet producerer toppe med forskellige former og i særdeleshed, med magt spor af den anden top tager længere tid at vende tilbage til den oprindelige baseline. Hvis produktet hæmning opstår, en anden software valg, implementeret med formålet-specifikke ligninger, skal anvendes.

I betragtning af den iboende forskel på hver enzymsystem, og de ​​forskellige varme, der produceres af forskellige reaktioner, som ikke kan kvantificeres på forhånd bestemme de optimale driftsforhold (dvs. enzym og substrat koncentrationer, antallet og omfanget af injektioner, afstand tid osv.) for et særligt system til tider r equire få sonderende titreringer.

Under analysen, skal anvendes sørge for at vælge de eksperimentelle betingelser i henhold til systemet under analysen. For eksempel, phosphat inhiberer urinstof hydrolyse med urease, og derfor udfører eksperimentet i phosphatbuffer nedsætter den samlede hastighed af den enzymatiske reaktion ^{24, 25.}

Ansøgninger

Når kinetikken for enzymatisk reaktion er blevet bestemt, kan reaktionen gentages i nærværelse af forskellige typer og koncentrationer af hæmmere i prøvecellen, for at måle, ved hjælp af den generelle hæmning Ligning 8 ^26, konkurrencedygtig (K _ic), og konkurrencedygtige (K _UIC) inhiberingskonstanter, hvilket giver os mulighed for at skelne mellem forskellige typer af hæmning.

iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "width =" 284 "/> (8)

Sammenfattende kan denne fremgangsmåde anvendes som en hurtig og økonomisk måde at teste et stort antal enzyminhibitorer til farmaceutiske og industrielle anvendelser, såsom i lægemiddel-screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument