Summary
Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.
Abstract
Izotermal titrasyon kalorimetre (ITC) ısı hemen hemen her kimyasal süreci karakterize etmek için içsel bir prob olarak kullanarak, kimyasal bir reaksiyon esnasında salınan veya emilen ölçen iyi tanımlanmış bir tekniktir. Günümüzde, bu teknik kapsamlı bağlama biyomoleküler termodinamik denge parametreleri belirlemek için uygulanır. Buna ek olarak, bu uygulama ITC doğrudan hala yeterince faydalanılmayan olduğu halde, enzimatik reaksiyonların kinetik ve termodinamik parametreleri (k cat, K E, AH) ölçüm yapabilmek için gösterilmiştir. Isı değişiklikler kendiliğinden enzim katalizi sırasında meydana geldiğinde, ITC analiz edilen sistemin herhangi bir değişiklik ya da etiketleme gerektirmez ve çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, yöntem malzemenin az miktarda ihtiyaç duyar. Bu özellikler ITC gibi çeşitli uygulamalar, örneğin, ilaç keşfi enzim kinetiğinin araştırılması için, paha biçilmez güçlü ve benzersiz bir araç yapmak.
k cat belirlemek için uygulanır ve Canavalia ensiformis (jack bean) üreaz tarafından enzimatik üre hidrolizinin K M. Reaksiyonun içsel molar entalpisi (AH int) hesaplanması gerçekleştirilir. Bu şekilde elde edilen değerler, metodolojisinin güvenilirliğini gösteren, literatürde bildirilen daha önceki veriler ile tutarlıdır.
Introduction
Biyokimyasal reaksiyonların kantitatif tayini hayatın temelinde biyolojik süreçlere bakış sağlar. Kalorimetre kantitatif çözelti içinde hemen hemen her kimyasal reaksiyon karakterize etmek için bir etiket içermeyen bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, ısı serbest ya da zaman içinde absorbe ölçer ve bu nedenle evrensel bir algılama sistemi ve reaksiyona moleküllerin (örneğin bağlanma termodinamik) yanı sıra, bu, reaksiyon oranını (yani kinetik) ölçmek için miktarını ölçmek için çok uygun bir yöntemdir. Özellikle, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) protein-ligand, protein-protein, protein-metal iyonları ve protein-DNA etkileşim 1-6 dahil, biyomoleküler dengenin termodinamik karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu uygulamanın potansiyel hala olmasına rağmen ek olarak, kinetik bilgi sağlamak için ITC yeteneği, bu enzim katalizi ölçmek için çok güçlü bir sistem yapar7-9 hafife.
Michaelis sabiti (K M) ve katalitik oranı sabiti (k cat): iki kinetik parametrelere bağlı olarak, reaksiyon hızı ve alt tabaka konsantrasyonu arasında bir ilişki sağlayan olarak Michaelis-Menten denklemi 10, enzimatik reaksiyonların kantitatif açıklaması . K cat / K oranı, M, bir enzimin katalitik verimlilik olarak adlandırılır. Uygulamada, belirli bir reaksiyon için K M belirlenmesi ve k kedi kataliz tam bir açıklamasını sağlar.
Tipik bir enzimatik reaksiyon (Şekil 1) olarak, bir alt-tabaka (S) daha sonra geçiş durumuna aktif enzim-alt-tabaka (ES) kompleks oluşturucu enzim (E), (ES *) ile etkileşime girer. Ikinci sonunda ayrışmaktadır enzim ürünü (EP) kompleksi haline dönüştürülür. Bu adımin aşağıdaki reaksiyon ile açıklanmıştır.
(1)
k, 1 ES kompleksi, k -1 oluşumu için oran sabit olduğu k cat katalitik oranı sabit ya da devir sayısı iken, ES kompleksinin ayrışma için oran sabitidir.
: Michaelis-Menten denklemine 10 göre, reaksiyonun oranı olarak hesaplanabilir
(2)
burada K M = (k + -1 k cat) / k 1 ve k cat = v max / [E], v max tüm enzim alt-tabakaya bağlı olduğunda, ulaşılan maksimum hızı olmak üzere.
Izotermal titrasyon kalorimetre üre enzimatik hidrolizi karakterize etmek için, bu çalışmada kullanılan bir araçtır. Bu cihaz iki icat şeklinde hücreleri (Şekil 1) ihtiva eden bir adiyabatik kalkanı yapılır. Bu dar giriş boruları ile dışarıdan bağlanır. Referans hücre, genellikle su ile ya da analiz için kullanılan çözücü ile dolu iken numune hücresi (yaklaşık 1.4 mi), enzim solüsyonu ile yüklenir. Genellikle alt-tabaka çözeltisi ca. 0.3 ml ihtiva eden bir uzun iğne ve bağlı bir karıştırma kürek ile dönen bir şırınga, numune hücresi üzerine monte edilir. Bir termoelektrik cihaz "hücre geribildirim ağı" kullanarak, örnek ve referans hücre arasındaki sıcaklık farkını ölçer, ısı eklenerek veya çıkarılarak sıfırdan bu farkı tutar. Deney esnasında, alt-tabaka sabit bir seçilen sıcaklıkta enzim çözeltisi içine enjekte edilir. Ne zaman trzymatic Reaksiyon serbest veya emilen ısı miktarı ürün moleküllerine dönüştürülür alt-tabaka moleküllerinin sayısı ile orantılıdır, gerçekleşir. Buna ek olarak, ısı akış oranının doğrudan reaksiyonun hızı ile ilgilidir. Ölçülen veriler, başlangıç bazal ısı iz bir sapma (Şekil 1) olarak görülen, (μcal / saniye) numune hücresinin meydana gelen ısı akışı ile orantılıdır numune hücresinin, için cihaz tarafından verilen ısı gücü temsil zaman içinde.
Şekil 1. Enzimatik reaksiyonları incelemek için izotermal titrasyon kalorimetre şematik temsili. (Örnek hücre olarak) Ther bir değişiklik ile sonuçlanır enzim çözeltisi içine (enjeksiyon şırınga içinde), substratın üzerine titre oluşan bir enzimatik reaksiyon,örnek hücre ve referans hücre sabiti arasındaki sıcaklık farkı tutmak için gerekli kalorimetre tarafından yayımlanan mal güç. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Genel olarak, ısı değişim (Q) reaksiyonu (AH) ve sırayla toplam hacim kat konsantrasyonu verilir (n), üretilen ürünün mol sayısının molar entalpisi ile orantılıdır:
(3)
Ürün oluşumu, zaman içinde, reaksiyon hızına karşılık gelen (dP / dt), böylece, ilişki ile aynı zamanda (dQ / dt) üzerinden oluşan ısı miktarı ile ilişkili olabilir:
(4)
Bu denkleme göre, Michaelis-Menten elde etmek amacıyla it) toplam moler entalpisi AH i ölçmek için gerekli olan arsa ve değişik alt tabaka konsantrasyonunda ii) ısı akışı dQ / dt. Genellikle, bu, iki farklı deney yapılır: ilk deneyde (Yöntem 1, M1) olarak, alt-tabaka enzim çözeltisi içine enjekte edilir ve tam dönüşüm için alt-tabaka ısı ölçülür; İkinci deneyde (Yöntem 2, M2), alt-tabakanın birden çok enjeksiyon yapılmaktadır ve ısı üretim oranı, çeşitli substrat konsantrasyonlarında ölçülmüştür. Bu iki veri setleri kinetik parametreleri K, M ve k cat elde etmek için yeterlidir.
Bu makalede, ITC kullanılarak gerçekleştirilmiştir enzimatik reaksiyonlar için kinetik parametrelerinin belirlenmesi için genel bir protokol tarif edilmektedir. Biz Canavalia ensiformis üre üre hidroliz yöntemi uygulananse, bir referans sistemi olarak. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçları ve literatürde bildirilen veriler arasında iyi bir uyum, bu yaklaşımın güvenilirliğini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Numune Hazırlanması
- Enzim çözeltisi 2 ml ve her bir deney işlemi için alt-tabaka çözeltisi, 0.5 ml hazırlayın. Alt-tabaka, ilave sırasında seyreltme ve karıştırma ısısının en aza indirmek için özdeş bileşime sahip olan, tampon çözeltiler içinde, enzim ve substrat konsantre stok çözeltileri seyreltin.
- Deney sırasında pH değişikliğini önlemek için yeterli tampon koşulları seçin. Örneğin, 20 mM HEPES pH 7 nötr pH değerinde yapılan ölçümler için yeterlidir.
Not: proton değişimi söz konusu ise bu reaksiyonun ölçülen AH etkiler nedeniyle, kullanılan tamponların protonasyon entalpileri, kabul edilmelidir. Analiz edilen sistem üzerinde tampon veya katkı moleküllerinin olası spesifik etkileri dikkate alınmalıdır. Organik çözücüler (örneğin DMSO) enzim çözeltisi içerdiği takdirde, alt-tabaka çözeltisi içine tam olarak aynı konsantrasyonda ekleyin. - M1 deney için, başlangıçnM aralığındaki enzim konsantrasyonunun (örneğin, 1 nM) ve enzim konsantrasyonundan ve K M yukarıda büyüklük en az üç tane yüksek olan bir alt-tabaka konsantrasyonu.
- M2 deneme için, pM-nM aralığında enzim konsantrasyonu (örneğin, 15 pM) ile başlar. Şırınga içinde substrat konsantrasyonu mM aralığında (örneğin 400 mM) bulunmaktadır.
NOT: Tek bir enjeksiyon M1 deneyde, konsantrasyonları deneysel zamanla ürünün içine toplam madde dönüşüm elde etmek için yeterli olmalıdır. Bu nedenle, enzimin konsantrasyonu, enzim hızına bağlıdır: düşük k cat sahip enzimler çalışma altında ise, daha yüksek enzim konsantrasyonları (en fazla 10 uM) kullanılmalıdır. Öte yandan, M2 deneyde kullanılan enzim konsantrasyonları enjekte edilen alt-tabaka, sadece marjinal (% 5'ten az) tüketilen ve enzim reaksiyonu kalıcı halde devam olmasıdır sağlamak gerekir. Bu nedenle, daha yüksekEnzim etkinliği, gerekli enzim konsantrasyonu, daha düşüktür. Deneyin sonunda, numune, hücre içinde alt-tabaka konsantrasyonu M K daha yüksek olmalıdır.
- Deney sırasında pH değişikliğini önlemek için yeterli tampon koşulları seçin. Örneğin, 20 mM HEPES pH 7 nötr pH değerinde yapılan ölçümler için yeterlidir.
- Dikkatle 280 nm, kolorimetrik, BCA deneyleri 11 de uygun bir analitik prosedüre (örneğin absorbans ile enzim ve alt tabaka konsantrasyonları kontrol edin. Bu termodinamik ve kinetik parametrelerinin doğru ve güvenilir bir hesabını elde etmek için gereklidir.
- Çözeltilerin pH değeri ölçülür ve enzim ve alt tabaka çözümlerin her ikisinin de pH uyumsuzluk (0.05 pH birimi ±) deney koşulları altında en az olduğundan emin olun.
2. Deney Sahne
Not: Aynı prosedür, her ikisi de birbiri ardına gerçekleştirilen M1 ve M2 deney için uygulanması gerekir.
- Numune hücresi ve enjeksiyon şırınga üreticinin talimatlarına göre temizlenir doğrulayıntalimatları. Damıtılmış su ile aleti ile temin edilen yükleme şırınga doldurun, yavaşça, örnek hücredeki iğneyi hücreyi doldurmak ve aynı şırınga kullanılarak sıvı boşaltılır. Bu yöntem kullanılarak, tampon maddesi ile iki kere damıtılmış su ile iki kez, numune hücresini yıkayın.
- Dikkatli bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek, yükleme şırınga kullanılarak enzim solüsyonu ile 2 ml numune hücresini yerleştirin. Bu hücre kök üst dökülürler kadar yavaşça hücre içine enjekte çözüm. Ca bir hamle üretir. Çözeltisi 0.25 ml hücreye. Iki kez tekrarlayın. Bu adım, örnek hücre içinde hava kabarcığı kaldırır.
- Kök hücre ve hücre noktası arasındaki bir çıkıntı üzerinde yükleme şırınganın iğne koyun ve herhangi bir fazla uzaklaştırın.
- VP-Görüntüleyici programını başlatın ve bilgisayar arayüzü, arzu edilen deney sıcaklığının altında bir sıcaklık 3 ° C'ye kadar dengeye ITC cihazı. Bu uzun dengeye önlemek için gereklidirpasif soğutma enstrümantal cihaz nedeniyle deneyden önce dönemleri.
- Yukarıdaki ile aynı prosedür ile damıtılmış su ile referans hücre doldurun. Yüksek iyonik kuvveti ve yüksek osmolalitesi ile tampon çözelti içinde, örnek olarak, aynı tampon çözelti referans olarak kullanılmalıdır.
- Ince bir silikon tüp kullanılarak, enjeksiyon şırınga doldurma portuna plastik bir şırınga bağlayın. Su şırınga dolu olduğunu gösteren, üst dolum noktasına çıkıncaya kadar, suya iğne ucu yerleştirme ve yukarı çizim enjeksiyon şırınga doldurun. Sonra su şırınga ucu taşımak ve havayı yukarı çekmek, enjeksiyon şırınga boşaltmak için. Bu işlem ile, tampon ile enjeksiyon şırınga yıkayın ve sistem üzerinden havayı çekmek. Daha sonra, tüpün altındaki çözeltinin küçük bir miktar bırakarak, dikkatli bir şekilde çekmek ve tamamen enjeksiyon enjektörü doldurmak, alt-tabaka çözeltisi, 0.5 ml ihtiva eden dar bir tüp içinde enjeksiyon iğne yerleştirin.
- Gönderenbilgisayar arayüzü, basın "Close dolgu liman". Silikon yükleme tüpü çıkarın. Basın "Temizle ve dolum" şırınga herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak ve toplu çözüm içine onları kovmak için izin düğmesi. Iki kez tekrarlayın.
- Her damla çıkarın ve örnek hücre içine enjeksiyon şırınganın iğne yerleştirmek için iki tarafta silin, enjeksiyon şırınga hareket ettirin.
- , Bilgisayarda uygun çalışma parametrelerini ayarlamak. Deney, enzim ve alt tabaka konsantrasyonu gösterilebilir.
- M1 deneyde, tekrarlanabilirliğini doğrulamak için alt tabakanın en az iki ekleme (5-30 ul) ayarlayın. Her enjeksiyon arasındaki boşluk süresi sağlamak için yeterince büyük (örneğin, 1000 sn) bir sonraki ilave edilmeden önce bazal ısı sinyali geri döner.
- M2 deneyde, (örneğin, 15 x 5-10 ul) enjeksiyonu birden ayarlayın. Sistem s izin enjeksiyonlar (örneğin 180 sn) arasındaki aralığı ayarlayınHer enjeksiyondan sonra yeni başlangıca termal güç civarında tutulması.
Not: M2 deneyde enjeksiyonlar arasındaki aralık süresi ölçümleri kararlı hal şartları altında gerçekleştirilebilir izin vererek, alt-tabaka bir önemli miktarda dönüşümünü önlemek için yeterince kısa olmalıdır. - M2 deneyde, karşılık gelen değer sonraki veri analizi sırasında atılır ilk enjeksiyon için, küçük hacimli (örneğin, 2 ul) kullanır. Gerçekten de, genellikle, şırınga ucu ile ilk alt-tabaka difüzyon nedeniyle eserler sunar ve şırınga iğnesi sıkışmış hava kabarcıklarının varlığı için.
- Referans güç ayarlama, taban reaksiyonundan önce yerleştirileceği olarak yaklaşık 20 düzeyinde bir değerde, başlar. Daha sonra deney enzim ve alt tabaka konsantrasyonları tanımlayan ve deney için bir isim seçtik.
- Tipik olarak 25 ° C'de, deney sıcaklığı tanımlar ITC sağlar 2 arasındaki çalışma sıcaklıkları ° C ile 80 ° C. Deney çalıştırmak için hazırdır. Denemeyi başlatmak için "Başla" düğmesine basın.
- Deney tamamlandıktan sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak örnek hücre ve şırınga temizleyin.
- En az bir veya iki kez daha verilerin tekrarlanabilirliği kontrol etmek için bir deney tekrarlayın.
3. Veri Analizi
- Analiz programı, "verileri oku" butonuna tıklayın, ve yapılan M2 deney. Itc dosyasının bulunduğu klasöre gidin. "Dosya türü" kaydırma aşağı oka tıklayın ve "Enzim Assay (it?)" Seçeneğini seçin. Daha sonra, tıklayın ve M2 deney. Itc dosyasını açın.
- Denklem 5'e göre deney M1 eğrisini entegre gelen reaksiyonun SH elde edilir.
"Width =" 126 "/> (5)- "Verisini oku" butonuna tıklayın ve yapılan M1 deney dosyası. ITC seçin. Origin kullanarak, bir tepe her içeren farklı yerlerinde iz bölmek ve bir. Opj dosyası olarak her tepe kaydedin. Tek bir enjeksiyon deney M1, entegre ve elde edilen alan değerine bölünür ve termogramında başlangıç sapmadan kaynaklanan, birinci pik değerine karşılık gelen bir dosya açma, μcal olarak ifade edilen numune hücresinin nihai substrat konsantrasyonu, uM olarak ifade edilmiştir ve hücre hacmi ile Denklem 5, reaksiyonun AH göre belirlenmesi, litre olarak ifade edilmiştir.
- M1 Deneyin ikinci zirve için aynı prosedürü tekrar ve iki SH ölçümleri için ortalama bir değer elde.
- Her bir enjeksiyonun ardından orijinal temel ve yeni taban arasındaki farkı ölçen M2 deneyden dQ / dt belirler. E dönüştürmekDenklem 4'e göre reaksiyon oranları Xperimental verileri, M1 deneyde elde edilen entalpi değeri kullanılarak ve Michaelis-Menten denklemine verileri uygun.
- Analiz programı, "verileri oku" butonuna tıklayın, ve yapılan M2 deney dosyası. ITC seçin. "Dosya türü" kaydırma aşağı oka tıklayın ve "Enzim Assay (it?)" Seçeneğini seçin.
- Enzim Testi iletişim kutusu dört modellerinden birini seçerek izin açılır. Penceresinden - "sadece Yüzey Yöntem 2" seçeneğini seçin.
- SH penceresinde, aşama 4.2 'de elde AH değerini göstermektedir.
- Uygun prosedürde kullanılmak üzere konsantrasyon değerlerini kontrol etmek için "Konsantrasyon" butonuna tıklayın. "Ortalama Süre (P)" düğmesine tıklayın. Iletişim kutusu varsayılan değeri değiştirmek veya kabul etmek için bir fırsat vererek açar. Bu değer, her enjektö önce zamanı temsiliyon hangi araç ortalamalar her bir alt-tabaka konsantrasyonunda güç seviyesini belirlemek için güç sinyalinin. Varsayılan değeri onaylamak için Tamam'a tıklayın.
- "Sıfır Y Eksen" düğmesine tıklayın. İmleç y = 0 da yerleştirmek için, bir noktayı tıklatın çift izin haç dönüşür. Sadece ilk enjeksiyon noktasından önce çift tıklayın.
- Hesapla Hızı düğmesine tıklayın. Oranı (hesap seyreltme etkiler dikkate alınarak) numune hücre hacmi için titrasyon sırasında eklenen alt-tabakanın bölünmesi ile elde edilen substrat konsantrasyonuna karşı çizilmiştir. Bu işlem, M K ve k cat elde etmek üzere takılabilir, tipik Michaelis-Menten grafiğini vermektedir.
- Bazı noktaları silinecek olursa, "Truncate Verileri" düğmesini seçin. Kötü veri noktalarını ve girmek belirteçlerin basın veya birine çift tıklayın dışlamak için veri işaretçileri hareket ettirin.
- Eğriye uyacak ve için "model Fit" işlevini kullanınkinetik sabitleri elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üreaz (EC 3.5.1.5, üre amidohidrolaz) archea, bakteri, tek hücreli, ökariyotlar ve bitkilerde bulunan bir multisubunit nikel ihtiva eden bir enzimdir. Kendiliğinden amonyak ve bikarbonat (denklem 6) 12, ikinci bir molekül vermek için parçalanır amonyak ve karbamata üre hidrolizini katalize organik nitrojen mineralizasyon son adımda bu protein etki eder,.
(6)
Bu reaksiyon, insan sağlığı ve tarım 13 için olumsuz etkilerinin sorumlu olan ortam, pH değeri genel bir artışa neden olmaktadır. Bitkilerde üreaz birincil rolü arginaz türetilen üre 14 besin azot geri etmektir. Plant üreazları genellikle 2 + iyonların 15 Ni iki ile etkin bir yeri ihtiva eden her bir alt-birimi ile bir 6 homo-heksamerleri bulunmaktadır. Bunlar arasında,Canavalia ensiformis (jack bean) üreaz (JBU) 1926 16 kristalize edilecek ilk protein olmuştur. O zamandan beri, çeşitli çalışmalarda yaygın olarak çeşitli kaynaklardan 13, 17 ile üreazları yapısal ve enzimatik aktivitesi tanımlanmıştır. Bu nedenle, JBU en ureolytic aktivitesi kantitatif enzimatik katalize belirlenmesinde ITC uygulanabilirliğini göstermek için temsili bir tepki olarak seçildi. AH = -10.5 kcal / mol arasında bir değeri, üreaz, üre çözeltisi içine alt-tabakanın enjekte edildi ve reaksiyon tamamlanmaya izin vererek elde edilen termal enerji entegre bir deney M1 (Şekil 2A) ölçülmüştür. M2 bir deneme için (Şekil 2B) kayıtlı termik Denklem 4 (Şekil 2C), tepkime hızı dönüştürüldü. Michaelis-Menten denklemine Elde edilen verilerin uyum içinde JBU için kinetik parametreleri sağlamıştır20 mM HEPES pH 7 k cat = 30.200 sn -1 ve K M = 3.45 mM ile anlaşma daha önce verileri 18, 19 olarak bildirdi.
Şekil 2. ITC. JBU (tip C3) ile tespit üreazla hidrolizi, üre liyofilize enzim (nominal aktivitesi 1538 U / mg) olarak satın alınabilir ve nihai bir konsantrasyona kadar 20 mM HEPES pH 7 ile seyreltildi. Reaksiyon karışımı içindeki enzim konsantrasyonu, saf enzim aktivitesi için satın alınan ürünün saptanmış faaliyetleri ile karşılaştırılması ile hesaplandı, karşılık gelen, 6,200 U / saf enzim 20 mg, ve 545 kDa'lık bir molar kütle olduğu bildirilmiştir homo-heksamerik protein. 2 x 5 ul enjeksiyon ile 25 ° C 'de gerçekleştirilen M1 deneyinde gözlemlenen (A) termik,(örnek hücre), 1 nM JBU içine (enjeksiyon şırınga içinde) 20 mM üre tions. Enjeksiyonlar arasında 750 saniye arasında bir aralama başlangıç değerine geri temel sağlamak için uygulanmıştır. Reaksiyonun entalpisi Denklem 5'e göre, her tepe ve iki değerin ortalaması entegrasyonu hesaplanır. Bu değer, metin içinde bildirilmektedir. (B) 15 pM JBU içine 400 mM üre elde edilmiştir (20 x 5 ul enjeksiyon) titre edilmesiyle elde edilen M2 deneyde görülen termik güç. 180 saniyelik bir aralama sistem kararlı durum seviyesine ulaşmak ve korumak için izin vermek amacıyla, enjeksiyonlar arasında uygulandı. Değişik alt tabaka konsantrasyonunda dQ / dt her eklemeden sonra taban çizgisi yer değiştirmesi olarak elde edilir. Seyreltme ısı tek başına alt-tabaka tampon maddesi içine titre tarafından yapılan boş deneyde (gri), olarak gösterilmiştir. (C) Şekil 2B'de temel yer değiştirme ile, reaksiyon hızı ile dönüştürüldüDenklem 4. Elde edilen veriler (içi dolu kareler) Fit Denklem 2 kullanılarak gerçekleştirilmiştir, ve düz bir çizgi olarak temsil edilir. Uyum elde edilen K M değeri ve k cat metinde rapor edilmiştir.
M1 deneyde ölçülen toplam ısı değişim analizi altında reaksiyon sırasında meydana gelen tüm olayların toplamını temsil eder, ve tampon proton serbest ya da alım uygulanabilirse de dahil olmak üzere ilgili tüm işlemler, molar entalpisi bağlıdır. Reaksiyona sistem tamponlu bir çözelti içinde proton elde edildiği bir işlem genel olarak, tampon, reaksiyon hücre içinde ilave ısı üreten, protonları salgılar. Bu yüzden, ölçülen AH (AH app) olması ve reaksiyonun (AH int) ve içsel SH, hem de tampon iyonizasyon entalpisini (SH iyon) ve değiştiricisinden ii) de içerir, protonlar (n) ing Denklem 7 göre:
(7)
Bu denklemi kullanarak, M1 deneylerde, farklı iyonlaşma entalpileri tampon ile aynı deney yapmak, ve tampon için özel AH iyonunun bir fonksiyonu olarak ölçülen AH uygulamasını çizilerek n ve AH int belirleyebilir. Elde edilen lineer regresyon kaynaktan, n eğiminden elde edilir: pozitif eğim tampon serbest proton temsil ederken, bir negatif eğim, tampon maddesi ile elde edilen proton yansıtır; SH int y-ekseni üzerinde kesişim türetilmiştir.
Denklem 6'da görüldüğü gibi, geçici bellekten bir proton H + edinimi genel üre hidroliz reaksiyonu neden olur. Buna uygun olarak, hem deYukarıda açıklandığı, reaksiyonun ısı tampon deprotone katkısını içerir. Hidroliz reaksiyonunun içsel SH hesaplamak için üç deney M1 int AH. Üç farklı SH iyonu ile karakterize edilen farklı tamponlar (HEPES, TrisHCl, fosfat), yapıldı ve tampon salınan proton sayısı hesaplandı kesmek ve Denklem 7'ye göre deneysel verileri doğrusal uyum eğimi (Şekil 3), daha önce Helicobacter pylori üreaz 7 ile katalize edilen aynı reaksiyon için rapor edilen verilerle tam bir uyum içinde, sırası ile -14.7 kcal / mol ve 0.98 idi. Bildiğimiz kadarıyla, hiçbir termodinamik veri şimdiye kadar, JBU rapor edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut yöntemlere göre enzimatik aktivitesini incelemek için ITC önemi
Bağlama dengeleri incelemek için klasik uygulamalara ek olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi sistem modifikasyon veya etiketleme gerektirmeden, bir prob olarak reaksiyon ısısının kullanılarak çözelti içinde enzimatik reaksiyonları karakterize için güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar. Kinetik parametreler kedi k ve K M genellikle ürün formasyonu (ya da alt-tabaka tüketimi), sürekli ya da süreksiz deneylerde kontrol edildiği zaman akışı deneylerinde, bir dizi ile elde edilir. Tipik haliyle, alt-tabaka ya da ürün konsantrasyonu, karakteristik dalga boyunda ışık emiliminin veya flüoresan ile ölçülür. Bununla birlikte, en çok alt-tabakalar ve / veya ürün spektroskopik olarak aktif değildir ve bu nedenle bir kromofor veya florofor reaksiyonu takip dahil edilmelidir. Seçenek olarak ise, birlikte, tahlilleri birleştiğindeölçülebilir ürün ile bir reaksiyon için bir alt-tabaka olan kataliz ürünü, kullanılabilecektir. Bu yöntemler arasında, ancak, K, M ve k cat belirlenen değerlerin doğruluğunu azaltmak başka değişkenler tanıtmak. Buna ek olarak, geleneksel yöntemler kullanılarak küçük bir ligand ile enzim inhibisyon karakterizasyonu spektroskopik tayinin güvenilirliğini değiştirebilir küçük ligandın kendisi, absorbans veya floresan ile karmaşık olabilir. Alternatif yöntemler ürün miktarı, kütle spektrometrisi veya kromatografisi kullanılarak ölçülür edildiği durdu akım teknikleri, içerir. Bu teknikler çok hassas ve güvenilir, ama zaman alıcı ve rutin analiz için pahalıdır. Sonda, bu serbest ya da emilen ısı, ITC deneylerde, ardından hemen hemen tüm kimyasal reaksiyonlar içsel bir özelliğidir. Bu nedenle ITC analiz altında sisteminin herhangi bir değişiklik veya etiketleme gerektirmez. Ayrıca, tonun teknik, basit ve hızlı olan bir malzeme küçük bir miktar gerektirir ve çözelti 22, 23 de gerçekleştirilebilir.
Protokol ve olası değişiklikler içinde kritik adım
Reaksiyon, genel olarak, farklı alt-tabaka analizi konsantrasyonlarda zaman reaksiyonun ve ısı değişim toplam moler toplu ısı sağlayabilir iki farklı deneylerde, gerçekleştirilir. Kaliteli veriler elde etmek amacıyla, deneme soruşturmanın başında ayrıntılı olarak planlanmalıdır. Kendi doğru değer veri analizi güvenilir parametrelerinin hesaplanması için gerekli olduğu gibi protein ve alt tabaka konsantrasyonu dikkatli bir şekilde belirlenmelidir. Tampon bileşimi ve enzim ve alt tabaka çözümlerin her ikisinin de pH alt-tabaka, ilave işlemi sırasında karışım ısısını en aza indirmek amacıyla, aynı olmalıdır. Bu, genellikle, bir ya da bir diyaliz boyutu büyük ölçüde erkekler gerçekleştirerek sağlanmaktadırdeney çalışan ve substratın çözünmesi için sütundan elüsyon tamponu kullanılarak önce enzim solüsyonu ile ilgili sion kromatografi aşaması. Bir kontrol deneyi seyreltme ısı çıkarma ya da ihmal edilebilir olduğunu doğrulamak amacıyla, enzim yokluğunda reaksiyon tampon enjekte alt-tabakanın aynı çözümleri ile gerçekleştirilmelidir.
Veri analizi, genellikle üreticinin sağladığı ITC için Origin programı ile gerçekleştirilir. Gerekirse, veri analizi için tercih edilen alternatif bir program kullanılabilir.
Teknik sorun giderme ve sınırlamaları
İyi bir sinyal-gürültü oranı, reaksiyon sistemin etkili algılama limiti aşmak için ITC hücre içinde yeterli ısı üretmesine olanak sağlayan bir oranda ilerler halinde elde edilir. Bu genellikle 1 dakika -1 daha k kedi yüksek olan sistemler için elde edilir. Bu durumda,ITC için Origin yazılım otomatik olarak ham veriden Michaelis-Menten arsa hesaplar, ve doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi kullanılarak, bu k kedi ve K M değerleri hesaplar. Bu analiz, önemli bir ürün önlemesine varsayar. M1 deneyde Sonraki enjeksiyonlar ilk taban çizgisine geri dönmek için uzun süren ikinci tepe güç izleme ile farklı şekiller ile tepe ve, özellikle de, üretim sırasında, genellikle ikinci görülebilir. Ürün inhibisyonu olursa, amaca özgü denklem ile uygulanan tercih edilen başka bir yazılım, kullanılmalıdır.
Her bir enzimatik sistemin kendi farkı ve çalışma için en uygun şartları (örneğin, enzim ve alt tabaka konsantrasyonu, sayı ve enjeksiyon hacmi aralığı süresi, vb) belirlenmesi, a priori olarak sayısal olamaz farklı tepkiler, tarafından üretilen farklı ısı göz önüne alındığında, Belirli bir sistem bazen r birkaç keşif titrasyonlarını equire.
Analiz sırasında bakım analiz altındaki sistemine göre deneysel koşullar seçmek için uygulanması gerekir. Örneğin, fosfat enzimatik reaksiyon 24, 25, toplam oranı azalır fosfat tamponu içinde deney yapmak, bu nedenle üreaz üre hidrolizini inhibe eder, ve.
Uygulamalar
Enzimatik reaksiyonun kinetiği belirlendikten sonra, reaksiyon genel rekabetçi inhibisyon Denklem 8 26, (K ic) kullanılarak, test etmek amacıyla, farklı türde ve örnek hücrede enzim inhibitör konsantrasyonlarının varlığında, tekrar edilebilir ve böylece bizi engellenmesi farklı türleri arasında, ayırt etmek için izin rekabetsiz (K UIC) inhibisyon sabitleri.
iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "width =" 284 "/> (8)
Sonuç olarak, bu yöntem, ilaç taraması gibi farmasötik ve endüstriyel uygulamalar için, enzim inhibitörleri, çok sayıda test etmek için hızlı ve ekonomik bir yol olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Özel Gübre Ürünleri Şirketi (SFP) Bu çalışma için gerekli fonları sağlamak için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
References
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
- Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
- Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
- Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
- Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
- Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
- Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. , Cambridge University Press. 312-356 (2000).
- Ciurli, S. Nickel and its surprising impact in nature. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).
- Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
- Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
- Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
- Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
- Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
- Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
- Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
- Hausinger, R. P., Karplus, P. A. Handbook of Metalloproteins. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. , John Wiley & Sons. 867-879 (2001).
- Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
- Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
- Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
- Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
- Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
- Segel, I. H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , Wiley, NY. (1993).
