Summary
Isothermische titratiecalorimetrie maatregelen warmtestroom vrijgelaten of geabsorbeerd in chemische reacties. Deze methode kan worden gebruikt voor enzym-katalyse kwantificeren. In deze paper, het protocol voor instrumentale setup, experiment loopt, en data-analyse wordt in het algemeen beschreven en toegepast op de karakterisering van enzymatische hydrolyse van ureum door jack bean urease.
Abstract
Isothermische titratie calorimetrie (ITC) is een goed beschreven techniek die meet de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd tijdens een chemische reactie, te gebruiken als een intrinsieke probe vrijwel karakteriseren elk chemisch proces. Tegenwoordig wordt deze techniek op grote schaal toegepast op thermodynamische parameters van biomoleculaire bindingsevenwichten bepalen. Bovendien is ITC aangetoond kunnen rechtstreeks meten kinetiek en thermodynamische parameters (kcat, KM, AH) enzymatische reacties, hoewel deze toepassing nog onderbenut. Omdat warmte verandert spontaan optreden tijdens de enzymatische katalyse, heeft ITC geen wijziging of de etikettering van het systeem onder analyse nodig en kan in oplossing worden uitgevoerd. Bovendien moet de methode kleine hoeveelheid materiaal. Deze eigenschappen maken ITC een waardevolle, krachtig en uniek instrument om enzymkinetiek te bestuderen in verschillende toepassingen, zoals bijvoorbeeld geneesmiddelenonderzoek.
kcat en Km bepalen van de enzymatische hydrolyse van ureum door Canavalia ensiformis (Jack Bean) urease. Berekening van intrinsieke molaire enthalpie (AH int) van de reactie wordt uitgevoerd. De aldus verkregen waarden zijn in overeenstemming met eerdere gegevens in de literatuur, waaruit de betrouwbaarheid van de methode.
Introduction
Kwantitatieve bepaling van biochemische reacties geeft inzicht in de biologische processen die aan de basis van het leven. Calorimetry biedt een label-free methode om kwantitatief karakteriseren vrijwel elke chemische reactie in oplossing. Deze techniek meet de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd in de tijd, en dus een universeel detectiesysteem en een zeer gunstige methode om de hoeveelheid reagerende moleculen (bijvoorbeeld binding thermodynamica), alsmede de reactiesnelheid (dwz kinetiek) meten kwantificeren. Met name isothermische titratie calorimetrie (ITC) goedgekeurd als mogelijk om deze de thermodynamica van biomoleculaire evenwichten karakteriseren, waarbij eiwit-ligand, eiwit-eiwit, eiwit-metaalionen en eiwit-DNA-interacties 1-6. Bovendien is het vermogen van ITC kinetische informatie maakt het een zeer krachtig systeem enzym katalyse meten, hoewel het potentieel van deze toepassing nogonderschat 7-9.
De Michaelis-Menten-vergelijking 10 is een kwantitatieve beschrijving van enzymatische reacties, omdat het een relatie tussen de reactiesnelheid en de substraatconcentratie, afhankelijk van twee kinetische parameters: de Michaelis-constante (KM) en de katalytische snelheidsconstante (kcat) . De kcat / M-verhouding wordt aangeduid als de katalytische efficiëntie van een enzym. In de praktijk bepalen van K M en k kat voor een specifieke reactie geeft een volledige beschrijving van de katalyse.
Bij een kenmerkende enzymatische reactie (figuur 1), een substraat (S) samenwerkt met het enzym (E) die het enzym-substraat (ES) complex, dat vervolgens in de overgangstoestand is geactiveerd (ES *). Deze wordt omgezet in het enzym-product (EP) complex dat uiteindelijk dissocieert. Deze staps worden beschreven door de volgende reactie.
(1)
waarin k 1 is de snelheidsconstante voor de vorming van het ES-complex, k -1 is de snelheidsconstante voor de dissociatie van het ES-complex, terwijl kcat de snelheidsconstante of katalytische omzettingsgetal.
Volgens de Michaelis-Menten-vergelijking 10, kan de snelheid van de reactie als volgt berekend:
(2)
waarbij K = M (k -1 + k cat) / k 1 en k cat = v max / [E] met v max wordt de maximale snelheid bereikt wanneer alle enzym gebonden aan het substraat.
De isothermische titratie calorimeter is het instrument in deze studie om de enzymatische hydrolyse van ureum karakteriseren. Dit instrument bestaat uit een adiabatische schild met twee gemunt-vormige cellen (Figuur 1). Deze zijn verbonden met de buitenzijde met smalle toegang buizen. De monstercel (ca. 1,4 ml) wordt geladen met de enzymoplossing, terwijl de referentiecel algemeen gevuld met water of met het oplosmiddel dat voor de analyse. Een roterende spuit met een lange naald en een roer paddle bevestigd, en doorgaans ca.. 0,3 ml substraatoplossing, is gemonteerd op de monstercel. Een thermo-elektrische apparaat meet het verschil in temperatuur tussen het monster en de referentie-cel en, met behulp van een "cel feedback netwerk", stelt zij dit verschil op nul door het optellen of aftrekken van warmte. Tijdens het experiment, wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing op een constante gewenste temperatuur. Wanneer de nlzymatic reactie plaats, de hoeveelheid vrijkomende warmte of geabsorbeerd is evenredig met het aantal substraat moleculen die worden omgezet in product moleculen. Daarnaast wordt de snelheid van warmtestroom direct gerelateerd aan de snelheid van de reactie. De meetgegevens, die als afwijking van de verwarmingskabel uit nulmeting (figuur 1), vertegenwoordigen de thermische (μcal / s) geleverd door het instrument op de monstercel, dat evenredig is met de warmtestroom zich in de monstercel na verloop van tijd.
Figuur 1. Schematische weergave van isothermische titratie calorimeter enzymatische reacties bestuderen. Een enzymatische reactie die optreedt bij titratie van het substraat (in de injectiespuit) in de enzymoplossing (in de monstercel) resulteert in een verandering van de thermal macht vrijgegeven door de calorimeter, die nodig zijn om het verschil in temperatuur tussen het monster cel en de celverwijzing constant te houden. Klik hier voor grotere afbeelding.
Kortom, de warmteverandering (Q) is evenredig met de molaire enthalpie van de reactie (AH) en het aantal molen product verkregen (n), die op zijn beurt wordt gegeven door het totale maal de concentratie:
(3)
De productvorming in tijd (dP / dt), die overeenkomt met de reactiesnelheid kunnen dus worden gerelateerd aan de hoeveelheid warmte die via gelijktijdig (dQ / dt) door de relatie:
(4)
Volgens deze vergelijking om een Michaelis-Menten vinden plot dient te meten i) de totale molaire enthalpie AH, en ii) de warmtestroom dQ / dt bij verschillende substraatconcentraties. Gewoonlijk wordt dit in twee verschillende experimenten: in het eerste experiment (methode 1, M1), wordt het substraat geïnjecteerd in de enzymoplossing en de warmte voor volledige omzetting van het substraat wordt gemeten; in de tweede proef (Methode 2, M2), zijn meerdere injecties substraat uitgevoerd en de snelheid van de warmteproductie gemeten bij verschillende substraatconcentraties. Deze twee sets gegevens zijn voldoende om de kinetische parameters K M en k kat ontlenen.
In dit artikel wordt een algemeen protocol om de kinetische parameters voor enzymatische reacties uitgevoerd met behulp van ICT te bepalen beschreven. We pasten de methode om ureum hydrolyse door Canavalia ensiformis ureumse, als referentiesysteem. De goede overeenkomst tussen de zo verkregen resultaten en de gegevens in de literatuur toont de betrouwbaarheid van deze benadering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van monsters
- Bereid 2 ml enzym-oplossing en 0,5 ml substraat oplossing voor elke experimentele run. Verdun geconcentreerde voorraadoplossingen van enzym en substraat in bufferoplossingen met identieke samenstelling om de hitte van verdunnen en vermengen tijdens het substraat toevoeging minimaliseren.
- Kies de buffer omstandigheden die voldoende zijn om pH-verandering tijdens experiment te voorkomen. Bijvoorbeeld, 20 mM HEPES pH 7 is voldoende voor metingen bij neutrale pH.
OPMERKING: Als proton exchange is betrokken, moet protonering enthalpie van de gebruikte buffers worden beschouwd, omdat ze invloed hebben op de gemeten AH van de reactie. Mogelijke specifieke effecten van de buffer of additieven moleculen op het systeem geanalyseerde moet rekening worden gehouden. Als organische oplosmiddelen (bijv. DMSO) zijn opgenomen in de enzymoplossing, voeg ze precies dezelfde concentratie in de substraatoplossing. - Voor de M1 experiment startenmet enzymconcentratie in het nM bereik (1 nM) en met een substraatconcentratie ten minste drie ordes van grootte hoger dan de enzymconcentratie en boven de KM.
- Voor de M2 experiment beginnen met enzym-concentratie in de PM-nM bereik (bijv. 15 uur). Substraatconcentratie in de spuit in het mM bereik (400 mM).
OPMERKING: In de enkele injectie M1 experiment moeten de concentraties voldoende zijn om de totale omzetting van het substraat in het product over de experimentele tijd te bereiken. Daarom is de concentratie van het enzym hangt af van het enzym rate: als enzymen met lage kcat worden bestudeerd, hogere concentraties enzym (tot 10 uM) worden gebruikt. Anderzijds moet enzymconcentraties in de M2 experiment verzekeren dat de geïnjecteerde substraat slechts marginaal (minder dan 5%) verbruikt en dat de enzym reactie verloopt bij steady state. Daarom, hoe hoger deenzymefficiëntie, hoe lager de vereiste enzymconcentratie. Na afloop van het experiment moeten substraatconcentratie in de monstercel boven KM zijn.
- Kies de buffer omstandigheden die voldoende zijn om pH-verandering tijdens experiment te voorkomen. Bijvoorbeeld, 20 mM HEPES pH 7 is voldoende voor metingen bij neutrale pH.
- Controleer enzym en substraat concentraties voorzichtig met een geschikte analysemethode (bijvoorbeeld absorptie bij 280 nm, colorimetrische assays BCA 11. Dit is nodig om nauwkeurige en betrouwbare berekening van de thermodynamische en kinetische parameters te verkrijgen.
- Meet de pH van de oplossingen en controleer of de pH mismatch van zowel het enzym en het substraat oplossingen is minimaal in de experimentele omstandigheden (± 0,05 pH-eenheden).
2. Het uitvoeren van het Experiment
OPMERKING: Dezelfde procedure moet worden toegepast zowel voor M1 en M2 proef, die worden uitgevoerd na elkaar.
- Controleer of de monstercel en de injectiespuit worden gereinigd volgens de fabrikantinstructies. Vul het laden bijgeleverd met het instrument met gedestilleerd water, voorzichtig steek de naald in de steekproef cel, vul de cel en verwijder de vloeistof met behulp van dezelfde spuit. Met deze methode was de monstercel tweemaal met gedestilleerd water en twee keer met buffer.
- Laad de monstercel met 2 ml enzymoplossing met het laden injectiespuit vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. Injecteer langzaam de oplossing in de cel totdat het lozingen uit de bovenkant van de cel stam. Maak een spurt van ca. 0,25 ml oplossing in de cel. Tweemaal herhalen. Deze stap verwijdert luchtbellen in het monster cel.
- Plaats de naald van de laad-spuit op de richel tussen de cel stam en de cel-poort en verwijder de overtollige oplossing.
- Start de VP-Viewer en vanaf de computer interface equilibreren de ITC instrument een temperatuur 3 ° C onder de gewenste experimentele temperatuur. Dit is nodig om te voorkomen lange equilibratieperioden voor het experiment vanwege de passieve instrumentele koelinrichting.
- Vul de celverwijzing met gedestilleerd water met dezelfde procedure hierboven. Wanneer buffers met hoge ionische sterkte of hoge osmolaliteit in de monsteroplossing, dezelfde buffer als referentieoplossing.
- Link een plastic spuit aan de vulopening van de injectiespuit, met een dunne siliconenslang. Vul de injectiespuit plaatsen van de naald in het water en het opstellen, totdat er water uit de bovenste vulling poort, wat aangeeft dat de injectiespuit vol is. Verplaats dan de spuit uit het water en stelt lucht, om de injectiespuit te legen. Met deze procedure was de injectiespuit met buffer en trekken lucht door het systeem. Plaats vervolgens de injectienaald in een smalle buis die 0,5 ml substraatoplossing, zorgvuldige wijze en volledig vullen van de injectiespuit, waardoor kleine hoeveelheid oplossing op de bodem van de buis.
- Vancomputer interface, drukt u op "Close fill port". Verwijder het silicium vulbuis. Druk op "Purge en vullen"-knop om de injectiespuit om eventuele luchtbellen te verjagen en om hen terug te verdrijven in de bulk oplossing. Tweemaal herhalen.
- Beweeg de injectiespuit, vegen aan de zijkanten om eventuele druppels halen en de naald van de injectiespuit in de monstercel.
- Op de computer, stel de juiste lopende parameters. De experimentele enzym en substraat concentraties worden vermeld.
- In de M1 experiment vastgesteld tenminste twee toevoegingen (5-30 pl) van substraat om de reproduceerbaarheid te controleren. Stel de afstand tussen elke injectie (bijv. 1000 sec) groot genoeg is opdat de warmte signaal terug naar de basislijn voor de volgende toevoeging.
- In het M2 experiment ingesteld meerdere (bv. 15 x 5-10 pi) injecties. Stel het interval tussen de injecties (bijvoorbeeld 180 seconde) waardoor het systeem stabilize het thermisch vermogen van de nieuwe baseline na elke injectie.
OPMERKING: De afstand tussen de injecties in de M2 experiment moeten kort genoeg zijn om de omzetting van een aanzienlijke hoeveelheid substraat te voorkomen, waardoor de metingen onder stabiele omstandigheden worden uitgevoerd. - In het M2 experiment gebruikt kleine volumes (bijv. 2 pl) voor de eerste injectie, waarvan de corresponderende waarde in de gegevensanalyse weggegooid. Immers vaak weer artefacten vanwege de oorspronkelijke substraat diffusie door de spuit, en de aanwezigheid van luchtbellen in de naald.
- Stel het referentievermogen, bij benadering niveau waarmee de basislijn voor de reactie worden geplaatst begint bij een waarde van 20. Definieer vervolgens de experimentele enzym en substraat concentraties en koos een naam voor het experiment.
- Definieer de experimentele temperatuur, typisch bij 25 ° C. ITC maakt het werken een temperatuur tussen 2 ° C en 80 ° C. Het experiment is klaar voor hardlopen. Druk op "Start"-knop om het experiment te starten.
- Nadat het experiment klaar Reinig de monstercel en de injectiespuit volgens de instructies van de fabrikant.
- Herhaal het experiment ten minste een of twee keer om de reproduceerbaarheid van de gegevens te controleren.
3. Data Analysis
- Uit de analyse programma, klik op de "Read data" knop en navigeer naar de map waar de itc dossier van de uitgevoerde M2 experiment. Ligt. Klik op het pijltje naar beneden scrollen van de "Files of type" en selecteer "Enzyme Assay (het?)". Vervolgens klikt u op en open de itc-bestand van de M2-experiment..
- Haal de AH van de reactie van de integratie van de curve van de M1 experiment volgens vergelijking 5.
"Width =" 126 "/> (5)- Klik op de "Read data" knop, en selecteer het bestand. Itc van de uitgevoerde M1 experiment. Met behulp van Origin, verdeel het spoor in verschillende delen die een piek en bespaar elke piek als een. Opj bestand. Open het bestand overeenkomt met de eerste piek als gevolg van basislijn afwijking in het thermogram van de injectie M1 experiment integreren en verdeel de verkregen gebied, uitgedrukt in μcal door het eindsubstraat concentratie in de monstercel, uitgedrukt in uM, en het celvolume uitgedrukt in liters, bepaling, volgens vergelijking 5, de AH van de reactie.
- Herhaal dezelfde procedure voor de tweede piek van de M1 experiment en het verkrijgen van een gemiddelde waarde voor de twee AH metingen.
- Bepaal dQ / dt van het M2 experiment meten van het verschil tussen de oorspronkelijke basislijn en de nieuwe basislijn na elke injectie. Zetten de eXperimental gegevens om reactiesnelheden volgens vergelijking 4, met behulp van de verkregen in de M1 experiment enthalpiewaarde en past de gegevens aan de Michaelis-Menten-vergelijking.
- Uit de analyse programma, klik op de "Read data" knop, en selecteer het bestand. Itc van de uitgevoerde M2 experiment. Klik op het pijltje naar beneden scrollen van de "Files of type" en selecteer "Enzyme Assay (het?)".
- Het dialoogvenster Enzyme Assay wordt geopend, waardoor het selecteren van een van de vier modellen. Selecteer "Methode 2 - alleen Substraat" uit het raam.
- In het venster AH, geven de waarde van AH verkregen in stap 4.2.
- Klik op de "Concentratie" om de concentratie waarden te controleren om te worden gebruikt in de fitting procedure. Klik op de "Gemiddelde tijd (P)" knop. Het dialoogvenster wordt geopend waardoor de kans om te veranderen of accepteer de standaardwaarde. Deze waarde geeft de tijd voordat elke injection waar het instrument het gemiddelde stroomsignaal om de kracht te bepalen bij elke substraatconcentratie. Klik op OK om de standaard waarde te bevestigen.
- Klik op de "Zero Y-as" knop. De cursor verandert in een kruis haar mogelijk maakt om dubbelklikken op een punt, te plaatsen op y = 0. Dubbelklik net voor de eerste injectie.
- Klik op de knop Berekenen Rate. Rate wordt uitgezet tegen de substraatconcentratie, bepaald door het substraat toegevoegd tijdens de titratie van het monster celvolume (rekening houdend verdunning) te delen. Deze operatie geeft een typische Michaelis-Menten plot dat kan worden gemonteerd op K M en k kat verkrijgen.
- Als sommige punten moeten worden geschrapt, selecteert u de knop "Truncate gegevens". Verplaats de gegevens markers om de slechte datapunten en dubbelklik op een van de markers of druk op Enter te sluiten.
- Gebruik de functie "Fit to model" om de curve te passen en teverkrijgen van de kinetische constanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Urease (EC 3.5.1.5; ureum amidohydrolase) is een multisubunit nikkel-bevattende enzym dat in Archea, bacteriën, eencellige eukaryoten en planten. Dit eiwit werkt in de laatste stap van organische stikstof mineralisatie, katalyseren de hydrolyse van ureum naar ammoniak en carbamaat, die spontaan afgebroken waarna een tweede molecuul van ammoniak en bicarbonaat (vergelijking 6) 12 geven.
(6)
Deze reactie veroorzaakt een algehele verhoging van de pH van de omgeving, die verantwoordelijk is voor negatieve gevolgen voor de menselijke gezondheid en de landbouw 13. In planten, de primaire rol van urease is om voedingsstoffen stikstof recyclen van-arginase afgeleid ureum 14. Plant ureasen algemeen homo-hexameren 6 waarbij elke subeenheid die een actieve plaats met twee Ni2 + ionen 15. Onder hen,Canavalia ensiformis (jack bean) urease (JBU) is de eerste eiwit te kristalliseren in 1926 16. Sindsdien hebben verschillende studies uitgebreid gekarakteriseerd de structurele en enzymatische activiteit van ureasen uit verschillende bronnen 13, 17. Daarom is de activiteit van ureolytische JBU werd gekozen als een representatieve reactie op de toepasbaarheid van het ICT kwantitatief bepalen van enzymatische katalyse tonen. De waarde AH = -10,5 kcal / mol werd gemeten in een M1 experiment (Figuur 2A) door integratie van de thermische verkregen door het injecteren van ureum substraat in de urease-suspensie en waardoor de reactie doorgaan voltooid. De thermische energie in een M2 experiment (figuur 2B) geregistreerd werd omgezet in het reactiesnelheid met vergelijking 4 (figuur 2C). Passing van de verkregen data naar de Michaelis-Menten-vergelijking mits de kinetische parameters voor JBU20 mM HEPES pH 7 als k cat = 30200 sec-1 en K M = 3.45 mM, in overeenstemming met eerder gerapporteerde gegevens 18, 19.
Figuur 2. Ureum hydrolyse door urease bepaald door ITC. JBU (type C3) werd gekocht als gevriesdroogde enzyme (nominale activiteit 1538 U / mg) en verdund met 20 mM HEPES pH 7 tot de uiteindelijke concentratie. De concentratie van het enzym in het reactiemengsel werd berekend door de bepaalde activiteit van het gekochte product om de activiteit van het zuivere enzym, gerapporteerd 6.200 U / mg zuiver enzym 20 en een molaire massa van 545 kDa, overeenkomend met de homo-hexamere eiwit. (A) Thermische waargenomen in de M1 experiment uitgevoerd bij 25 ° C met 2 x 5 pi injectieties van 20 mM ureum (in de injectiespuit) in 1 nM JBU (in de steekproef cel). Een tussenruimte van 750 seconden tussen de injecties werd op de basislijn terugkeren naar de initiële waarde toe. De enthalpie van de reactie wordt berekend uit de integratie van elke piek en het middelen van de twee waarden, volgens vergelijking 5. De waarde wordt in de tekst. (B) Thermisch vermogen waargenomen in de M2 experiment, verkregen door titratie van 400 mM ureum (20 x 5 ul injecties) in 15 pM JBU. Een tussenruimte van 180 seconden werd toegepast tussen de injecties, zodat het systeem de steady state niveau bereiken en behouden. DQ / dt bij verschillende substraatconcentraties verkregen verschuivingen van de basislijn na elke toevoeging. De warmte van verdunning wordt weergegeven als een blanco experiment (grijs), uitgevoerd door titratie van substraat in de buffer alleen. (C) De basislijn verplaatsing in figuur 2B werd omgezet in de reactiesnelheid metVergelijking 4. Passing van de verkregen gegevens (dichte vierkanten) werd uitgevoerd onder toepassing van vergelijking 2, en wordt weergegeven als een ononderbroken lijn. De waarde van KM en kcat verkregen uit de passing worden in de tekst.
De totale warmte verandering gemeten in de M1 experiment is de som van alle gebeurtenissen tijdens de reactie onder analyse, en afhankelijk van de molaire enthalpie van alle processen, waaronder eventueel proton afgifte of opname uit de buffer. In een algemene werkwijze waarbij het reactiesysteem verkrijgt protonen in een gebufferde oplossing, de buffer releases protonen, produceert extra warmte in de reactiekamer. Daarom is de gemeten AH blijkt (AH app), en omvat de intrinsieke AH van de reactie (AH int), alsmede de ionisatie enthalpie van de buffer (AH ion), en ii) het aantal uitwisseing protonen (n), volgens vergelijking 7:
(7)
Met deze vergelijking M1 experimenten, kunnen we bepalen n en AH int door het uitvoeren van hetzelfde experiment in buffers met verschillende ionisatie enthalpie en uitzetten van de gemeten AH app als functie van AH ion specifiek voor de buffer. Uit de resulterende lineaire regressie, n is afgeleid van de helling: een negatieve helling weerspiegelt protonen verkregen door de buffer, terwijl een positieve helling vertegenwoordigt protonen vrijkomen uit de buffer, AH int wordt afgeleid uit de intercept on y-as.
Zoals in vergelijking 6 de totale ureum hydrolysereactie resulteert in de verwerving van een proton H + van de buffer. Dienovereenkomstig, als dehierboven beschreven, de hitte van de reactie omvat de bijdrage van buffer deprotonatie. Om de intrinsieke AH van de hydrolysereactie te berekenen, werden drie M1 experimenten uitgevoerd in verschillende buffers (HEPES, Tris-HCl, fosfaat), gekenmerkt door drie verschillende AH ion. AH int en het aantal protonen vrijkomen uit de buffer, berekend uit de intercept en de helling van de lineaire fit van de experimentele data (Figuur 3) volgens vergelijking 7, waren -14,7 kcal / mol en 0,98 respectievelijk, in volledige overeenstemming met gegevens die eerder gerapporteerd voor dezelfde reactie gekatalyseerd door Helicobacter pylori urease 7. Voor zover wij weten zijn geen thermodynamische gegevens vermeld voor JBU nu toe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betekenis van ITC om enzymatische activiteit te bestuderen met betrekking tot bestaande methoden
Naast de klassieke toepassingen bindingsevenwichten bestuderen, isothermische titratie calorimetrie een betrouwbare en snelle methode om enzymatische reacties in oplossing karakteriseren met de reactiewarmte als een probe, zonder dat het systeem wijziging of labeling. De kinetische parameters kcat en Km worden gewoonlijk verkregen door een reeks tijdsverloop experimenten, waarbij de productvorming (of substraat consumptie) wordt bewaakt continu of discontinu assays. Gewoonlijk wordt het substraat of product concentratie gemeten door licht absorptie of fluorescentie bij karakteristieke golflengten. De meeste substraten en / of producten niet spectroscopisch actieve en dus een chromofoor of fluorofoor worden opgenomen om de reactie te volgen. Alternatief combinatie assays, methet product van katalyse als een substraat voor een reactie met meetbare product, kunnen worden gebruikt. Deze methoden zijn echter voorzien in extra variabelen die de nauwkeurigheid van de bepaalde waarden van K en M kcat verminderen. Bovendien zou de karakterisering van remming enzym kleine liganden op traditionele wijze worden bemoeilijkt door de absorptie of fluorescentie van het kleine ligand zelf, die de betrouwbaarheid van de spectroscopische test kan veranderen. Alternatieve werkwijzen omvatten gestopt stroom technieken, waarbij de hoeveelheid product wordt gekwantificeerd met massaspectrometrie of chromatografie. Deze technieken zijn zeer nauwkeurig en betrouwbaar, maar tijdrovend en duur voor routinematige analyse. De sonde gevolgd ITC experimenten dat de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd, is een intrinsieke eigenschap van bijna alle chemische reacties. Daarom ITC geen wijziging of de etikettering van het systeem onder analyse vereisen. Voorts tzijn techniek is eenvoudig en snel, vergt kleine hoeveelheid materiaal en kan in oplossing 22, 23 worden uitgevoerd.
Kritische stappen in het protocol en eventuele wijzigingen
De reactie analyse gebeurt meestal in twee verschillende experimenten, waarbij de totale molaire enthalpie van de reactie en de warmte verandering in de tijd bij verschillende substraatconcentraties verschaffen. Om betrouwbare gegevens te verkrijgen, moet de proef worden gepland in detail bij de aanvang van het onderzoek. Het eiwit en substraat concentraties moeten zorgvuldig worden bepaald, aangezien hun juiste waarde is essentieel voor het berekenen betrouwbare parameters gegevensanalyse. De buffersamenstelling en pH van zowel het enzym en het substraat oplossingen moeten identiek zijn, om warmte van het vermengen bij substraat toevoeging minimaliseren. Dit wordt over het algemeen gewaarborgd door het uitvoeren van een dialyse of een formaat uitsluitingsie chromatografiestap de enzymoplossing vóór het uitvoeren van de proef en met de buffer geëlueerd uit de kolom op het substraat lossen. Een controle-experiment moet worden uitgevoerd met identieke oplossingen substraat geïnjecteerd in de reactiebuffer bij afwezigheid van het enzym, teneinde de warmte van verdunning aftrekken of controleren of te verwaarlozen.
Data-analyse gebeurt meestal met de Oorsprong programma voor ITC door de fabrikant. Een alternatieve programma keuze voor gegevensanalyse kunnen worden toegepast, indien nodig.
Het oplossen van problemen en beperkingen van de techniek
Een goede signaal-ruisverhouding wordt verkregen indien de reactie verloopt met een snelheid waarmee het systeem voldoende warmte in de ITC cel om de instrumentele detectiegrens overwinnen. Dit wordt gewoonlijk bereikt voor systemen met kcat meer dan 1 min -1. In dit gevalde Oorsprong software voor ITC berekent automatisch de Michaelis-Menten plot van ruwe data, en het gebruik van niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse, berekent k kat en K M waarden. Deze analyse veronderstelt geen significante remming product. De laatste is gewoonlijk zichtbaar als volgende injecties in de M1 experiment produceren pieken met verschillende vormen en met name met de kracht spoor van de tweede piek die langer terugkeren naar de oorspronkelijke basislijn. Als produktinhibitie optreedt, een software keuze, uitgevoerd met een doel-specifieke vergelijkingen worden gebruikt.
Gezien de intrinsieke verschil van ieder enzymatisch systeem en de verschillende warmte geproduceerd door verschillende reacties, die niet kan worden gekwantificeerd a priori bepalen van de optimale bedrijfsomstandigheden (bijvoorbeeld enzym en substraat concentraties aantal en volume van injecties, spatiëring tijd, etc.) een specifiek systeem soms r noodzakelijk maken enkele verkennende titraties.
Gedurende de analyse, moet erop worden toegepast op de experimentele condities kiezen volgens het systeem onder analyse. Bijvoorbeeld, fosfaat remt hydrolyse van ureum door urease, en derhalve het uitvoeren van de proef in fosfaatbuffer vermindert de totale snelheid van de enzymatische reactie 24, 25.
Toepassingen
Zodra de kinetiek van enzymatische reactie is vastgesteld, kan de reactie worden herhaald in de aanwezigheid van verschillende soorten en concentraties van remmers de monstercel, om meten met de algemene remming Vergelijking 8 26, competitieve (K ic) en niet-concurrerende (K UIC) remmingsconstanten, waardoor ons te onderscheiden, de verschillende soorten inhibitie.
iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "width =" 284 "/> (8)
Concluderend kan deze werkwijze worden toegepast als een snelle en economische manier om een groot aantal remmers testen farmaceutische en industriële toepassingen, zoals bij het screenen van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De gespecialiseerde meststoffen Company (SFP) is erkend voor het verstrekken van de nodige fondsen voor deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
References
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
- Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
- Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
- Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
- Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
- Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
- Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. , Cambridge University Press. 312-356 (2000).
- Ciurli, S. Nickel and its surprising impact in nature. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).
- Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
- Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
- Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
- Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
- Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
- Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
- Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
- Hausinger, R. P., Karplus, P. A. Handbook of Metalloproteins. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. , John Wiley & Sons. 867-879 (2001).
- Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
- Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
- Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
- Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
- Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
- Segel, I. H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , Wiley, NY. (1993).
