Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

Summary

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean.

Abstract

Calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique bien décrite qui mesure la chaleur dégagée ou absorbée au cours d'une réaction chimique, en l'utilisant comme une sonde intrinsèque de caractériser pratiquement tous les processus chimiques. De nos jours, cette technique est largement utilisée pour déterminer des paramètres thermodynamiques des équilibres de liaison biomoléculaires. En outre, le CCI a été démontré pour être en mesure de mesurer directement la cinétique et les paramètres thermodynamiques (k _chat, K _M, AH) de réactions enzymatiques, même si cette application est encore sous-exploité. Comme les changements thermiques se produisent spontanément au cours de la catalyse enzymatique, le CCI ne nécessite aucune modification ou l'étiquetage du système en cours d'analyse et peut être réalisée en solution. En outre, le procédé a besoin de peu de quantité de matière. Ces propriétés font de l'ITC un outil précieux, unique et puissant pour étudier la cinétique enzymatique dans plusieurs applications, telles que, par exemple, la découverte de médicaments.

k _{cat M} et K de l'hydrolyse enzymatique de l'urée par Canavalia ensiformis (jack bean) uréase. Calcul de l'enthalpie molaire intrinsèque (AH _int) de la réaction est effectuée. Les valeurs ainsi obtenues sont en accord avec les données précédentes rapportés dans la littérature, ce qui démontre la fiabilité de la méthode.

Introduction

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme méthode de choix pour caractériser la thermodynamique des équilibres biomoléculaires, impliquant la protéine-ligand, protéine-protéine, protéine-ions métalliques et des interactions protéine-ADN ^1-6. En outre, la capacité de l'ITC de fournir des informations cinétique en fait un système très puissant pour mesurer la catalyse enzymatique, bien que le potentiel de cette application est encoresous-estimé ^7-9.

L'équation de Michaelis-Menten ¹⁰ est une description quantitative des réactions enzymatiques, car il fournit une relation entre la vitesse de réaction et la concentration du substrat, en fonction de deux paramètres cinétiques: la constante de Michaelis (K _M) et la constante de vitesse catalytique (k _cat) . Le k _cat / rapport K _M est mentionné comme l'efficacité catalytique d'une enzyme. Dans la pratique, la détermination de K et _M k _cat pour une réaction spécifique fournit une description complète de la catalyse.

Dans une réaction enzymatique typique (figure 1), un substrat (S) interagit avec l'enzyme (E) la formation du complexe enzyme-substrat (ES), qui est ensuite activé dans l'état de transition (ES *). Celui-ci est converti en le complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie éventuellement. Ces étapes sont décrits par la réaction suivante.

(1)

où k ₁ est la constante de vitesse pour la formation du complexe ES, _k-1 est la constante de vitesse de la dissociation du complexe ES, tandis que k _cat est la constante de vitesse catalytique ou le numéro de chiffre d'affaires.

Selon l'équation de Michaelis-Menten ^10, la vitesse de la réaction peut être calculé comme suit:

(2)

dans laquelle K = _{M (k-1} + k _cat) / k ₁ et k _cat = v _max / [E], avec v _max étant la vitesse maximale atteinte lorsque tous enzyme est lié au substrat.

La titration calorimétrique isotherme est l'instrument utilisé dans cette étude pour caractériser l'hydrolyse enzymatique de l'urée. Cet instrument est constitué d'un écran adiabatique contenant deux cellules en forme frappées (figure 1). Ceux-ci sont connectés à l'extérieur par des tubes d'accès étroits. La cellule de l'échantillon (environ 1,4 ml) est chargé avec la solution d'enzyme, tandis que la cellule de référence est généralement remplie avec de l'eau ou avec le solvant utilisé pour l'analyse. Une seringue en rotation avec une longue aiguille et une palette d'agitation attaché, contenant habituellement ca. 0,3 ml de solution de substrat, est monté sur la cellule d'échantillon. Un dispositif thermoélectrique mesure la différence de température entre l'échantillon et la cellule de référence et, à l'aide d'un "réseau de contre-réaction de la cellule", il maintient cette différence à zéro par addition ou soustraction de chaleur. Pendant l'expérience, le substrat est injecté dans la solution d'enzyme à une température constante choisie. Lorsque la sallezymatic réaction a lieu, la quantité de chaleur libérée ou absorbée est proportionnelle au nombre de molécules de substrat qui sont converties en molécules de produit. En outre, le taux de flux de chaleur est directement liée à la vitesse de la réaction. Les données mesurées, apparaissant comme un écart de la trace de la chaleur à partir de la ligne de base initiale (figure 1), représentent la puissance thermique (μcal / sec) fournie par l'instrument de la cellule d'échantillon, qui est proportionnel au flux de chaleur se produisant dans la cellule d'échantillonnage au fil du temps.

Figure 1. Représentation schématique de titration calorimétrique isotherme d'étudier les réactions enzymatiques. Une réaction enzymatique se produisant lors de la titration de substrat (dans la seringue d'injection) dans la solution d'enzyme (dans la cellule d'échantillon) a pour résultat un changement de la therpuissance mal dégagée par le calorimètre, nécessaire pour maintenir la différence de température entre la cellule de l'échantillon et la constante de la cellule de référence. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Dans l'ensemble, le changement de chaleur (Q) est proportionnelle à l'enthalpie molaire de la réaction (AH) et le nombre de moles de produit généré (n), qui à son tour est donné par le temps de volume total de la concentration:

(3)

La formation de produit avec le temps (dP / dt), qui correspond à la vitesse de la réaction, peut ainsi être liée à la quantité de chaleur engendrée pendant la même période (dQ / dt) par la relation:

(4)

Selon cette équation, afin d'obtenir un Michaelis-Menten Parcelle il est nécessaire de mesurer i) l'enthalpie molaire totale AH, et ii) l'écoulement dQ / dt de la chaleur à différentes concentrations de substrat. Habituellement, ceci est effectué dans deux expériences différentes: dans la première expérience (méthode 1, M1), le substrat est injecté dans la solution d'enzyme et de la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée; dans la seconde expérience (méthode 2, M2), de multiples injections de substrat sont effectuées et le taux de production de chaleur est mesuré à différentes concentrations de substrat. Ces deux ensembles de données sont suffisantes pour calculer les paramètres cinétiques K _M et k _cat.

Dans le présent article, un protocole général pour déterminer les paramètres cinétiques pour les réactions enzymatiques réalisées à l'aide ITC est décrite. Nous avons appliqué la méthode à hydrolyse de l'urée par Canavalia de l'uréesoi, comme un système de référence. Le bon accord entre les résultats obtenus en utilisant cette méthode et les données rapportées dans la littérature démontre la fiabilité de cette approche.

Protocol

Une. Préparation des échantillons

1. Préparer 2 ml de solution d'enzyme et 0,5 ml d'une solution de substrat pour chaque série expérimentale. Diluer les solutions mères concentrées de l'enzyme et du substrat dans des solutions tampons ayant une composition identique à minimiser la chaleur de dilution et de mélange au cours de l'addition du substrat.
   1. Choisissez les conditions de tampon qui sont adéquates pour prévenir les changements de pH pendant l'expérience. Par exemple, 20 mM HEPES pH 7 est adéquate pour des mesures à pH neutre.
      REMARQUE: si l'échange de proton est impliquée, les enthalpies de protonation des tampons utilisés doivent être considérées, car elles affectent l'AH de mesure de la réaction. Effets spécifiques possibles du tampon ou des molécules des additifs sur le système en cours d'analyse doivent être pris en compte. Si des solvants organiques (par exemple le DMSO) sont inclus dans la solution d'enzyme, les ajouter à la même concentration dans la solution de substrat.
   2. Pour l'expérience M1, commenceravec la concentration d'enzyme dans la plage nM (par exemple de 1 nM) et avec une concentration de substrat d'au moins trois ordres de grandeur plus élevée que la concentration en enzyme et au-dessus de la K _M.
   3. Pour l'expérience M2, commencer avec la concentration de l'enzyme dans la gamme pM-nM (par exemple 15 heures). concentration du substrat dans la seringue est dans la gamme mM (par exemple, 400 mM).
      NOTE: Dans l'expérience unique d'injection M1, les concentrations devraient être suffisants pour obtenir la conversion de substrat totale dans le produit au cours de la durée de l'essai. Par conséquent, la concentration de l'enzyme dépend de la vitesse de l'enzyme: si les enzymes ayant un faible k _cat sont à l'étude, les concentrations d'enzymes élevés (jusqu'à 10 uM) doivent être utilisés. D'autre part, les concentrations enzymatiques utilisées dans l'expérience M2 doivent assurer que le substrat est injecté seulement marginalement (moins de 5%) consommée et que la réaction enzymatique se déroule à l'état d'équilibre. Pour cette raison, plus lal'efficacité de l'enzyme, plus faible est la concentration de l'enzyme nécessaire. A la fin de l'expérience, la concentration du substrat dans la cellule d'échantillonnage doit être supérieure à K _M.
2. Vérifiez soigneusement enzyme et des concentrations de substrat avec une méthode d'analyse appropriée (par exemple l'absorption à 280 nm, colorimétriques, les dosages de BCA ^11. Cela est nécessaire pour obtenir un calcul précis et fiable des paramètres thermodynamiques et cinétiques.
3. Mesurer le pH des solutions et vérifier que le décalage de pH à la fois l'enzyme et les solutions de substrat est minimale dans les conditions expérimentales (± 0,05 unité de pH).

2. Exécution de l'expérience

REMARQUE: La même procédure doit être appliquée à la fois pour le M1 et M2 de l'expérience, qui sont réalisées l'une après l'autre.

1. Vérifier que la cellule d'échantillonnage et de la seringue d'injection sont nettoyés après le fabricant deinstructions. Remplir la seringue de chargement fournie avec l'instrument à l'eau distillée, insérez délicatement l'aiguille dans la cellule de l'échantillon, remplir la cellule et enlever le liquide en utilisant la même seringue. En utilisant cette méthode, laver la cellule d'échantillonnage deux fois avec de l'eau distillée et deux fois avec le tampon.
2. Charger la cellule d'échantillonnage avec 2 ml de solution d'enzyme à l'aide de la seringue de chargement, en évitant soigneusement formation de bulles d'air. Injecter lentement la solution dans la cellule jusqu'à ce qu'il se déverse sur la partie supérieure de la tige de la cellule. Produire une poussée de ca. 0,25 ml de solution dans la cellule. Répéter deux fois. Cette étape élimine les bulles d'air piégées dans la cellule d'échantillon.
3. Placer l'aiguille de la seringue de chargement sur le rebord entre la tige de la cellule et l'orifice de la cellule et retirer tout excès de solution.
4. Démarrez le programme VP-Viewer et, à partir de l'interface de l'ordinateur, équilibrer l'instrument ITC à une température de 3 ° C en dessous de la température expérimentale souhaitée. Cela est nécessaire pour éviter les longues équilibrationles périodes antérieures à l'expérience, à cause de l'appareil de refroidissement passif instrumentale.
5. Remplir la cellule de référence avec de l'eau distillée avec le même mode opératoire ci-dessus. Lorsque les tampons ayant une force ionique élevée ou élevée sont osmolalité dans la solution d'échantillon, le même tampon doit être utilisé en tant que solution de référence.
6. Relier une seringue en plastique à l'orifice de remplissage de la seringue d'injection, à l'aide d'un tube mince de silicium. Remplir la seringue d'injection de placer la pointe de l'aiguille dans l'eau et en tirant vers le haut, jusqu'à ce que l'eau qui sort de l'orifice de remplissage par le haut, ce qui indique que la seringue d'injection est remplie. Déplacez ensuite le bout de la seringue de l'eau et dresser l'air, pour vider la seringue d'injection. Avec cette procédure, laver la seringue d'injection avec un tampon, et aspirer l'air à travers le système. Par la suite, placer l'aiguille d'injection dans un tube étroit contenant 0,5 ml de solution de substrat, soigneusement élaborer et de remplir complètement la seringue d'injection, ce qui laisse peu de solution au fond du tube.
7. De l'interface de l'ordinateur, appuyez sur "Fermer remplissage port". Retirer le tube de chargement de silicium. Appuyez sur "Purge et recharge" pour permettre à la seringue d'injection pour déloger les bulles d'air et de les expulser de nouveau dans la solution globale. Répéter deux fois.
8. Déplacer la seringue d'injection, essuyer sur les côtés pour enlever les gouttes et placer l'aiguille de la seringue d'injection dans la cellule d'échantillon.
9. Sur l'ordinateur, définissez les paramètres de fonctionnement appropriés. L'enzyme expérimental et des concentrations en substrat peuvent être indiquées.
   1. Dans l'expérience M1, mettre au moins deux ajouts (5-30 pi) de substrat pour vérifier la reproductibilité. Réglez l'heure de l'espacement entre chaque injection (par exemple 1000 sec) suffisamment large pour assurer que les retours de signaux de chaleur à la ligne de base avant la prochaine addition.
   2. Dans l'expérience M2, mis multiple (par exemple 15 x 5-10 pi) injections. Définissez l'intervalle entre les injections (par exemple 180 sec) permettant au système de stabilize la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection.
      NOTE: Le temps d'espacement entre les injections dans l'expérience M2 doit être suffisamment courte pour éviter la conversion d'une quantité importante de substrat, ce qui permet les mesures soient effectuées dans des conditions de régime permanent.
   3. Dans l'expérience M2, utiliser de petits volumes (par exemple 2 pi) pour la première injection, dont la valeur correspondante est éliminée au cours de l'analyse ultérieure des données. En effet, il présente souvent des artefacts dus à la diffusion initiale de substrat à travers l'embout de la seringue, et pour la présence de bulles d'air emprisonnées dans l'aiguille de la seringue.
   4. Réglez la puissance de référence, le niveau approximatif dans lequel la ligne de base sera placé avant la réaction commence, à une valeur de 20. Définissez ensuite l'enzyme expérimental et des concentrations de substrat et choisir un nom pour l'expérience.
   5. Définir la température expérimentale, typiquement à 25 ° C. ITC permet des températures de travail entre 2 ° C et 80 ° C. L'expérience est prêt pour l'exécution. Appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'expérience.
10. Une fois l'expérience terminée, nettoyer la cellule d'échantillonnage et la seringue selon les instructions du fabricant.
11. Répétez l'expérience au moins une ou deux fois de plus pour vérifier la reproductibilité des données.

3. Analyse des données

1. Dans le programme d'analyse, cliquez sur le bouton "Lecture des données", et naviguez vers le dossier où le fichier de l'expérience réalisée M2. Itc est situé. Cliquez sur la flèche déroulante de la "Type de fichiers" et sélectionnez "Enzyme Assay (il?)". Par la suite, cliquez sur et ouvrez le fichier de l'expérience M2. Itc.
2. Obtenir l'AH de la réaction à partir de l'intégration de la courbe de l'expérience M1 conformément à l'équation 5.
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Cliquez sur le bouton "Lecture des données", et sélectionnez le fichier. CCI de l'expérience M1 effectué. Utilisation origine, diviser la trace dans différentes parties contenant un pic pièce et économisez chaque pic en tant que fichier OPJ.. Ouvrir le fichier correspondant au premier pic, résultant de la déviation de référence dans le thermogramme de l'expérience unique M1 d'injection, intégrer et diviser la valeur de la surface obtenue, exprimée en μcal, par la concentration finale en substrat dans la cellule de l'échantillon, exprimée en uM, et par le volume de cellule exprimé en litres, la détermination, conformément à l'équation 5, l'AH de la réaction.
   2. Répétez la même procédure pour le deuxième pic de l'expérience M1 et obtenir une valeur moyenne pour les deux mesures de AH.
3. Déterminer dQ / dt à partir de l'expérience M2 mesurer la différence entre la valeur de référence initiale et la nouvelle ligne de base après chaque injection. Convertir le eXperimental données à des vitesses de réaction en fonction de l'équation 4, en utilisant la valeur de l'enthalpie obtenue dans l'expérience M1 et accrocher les données à l'équation de Michaelis-Menten.
   1. Dans le programme d'analyse, cliquez sur le bouton "Lecture des données", et sélectionnez le fichier. CCI de l'expérience réalisée M2. Cliquez sur la flèche déroulante de la "Type de fichiers" et sélectionnez "Enzyme Assay (il?)".
   2. La boîte de dialogue Enzyme Assay s'ouvre, permettant la sélection de l'un des quatre modèles. Sélectionnez "Méthode 2 - Substrat seulement" de la fenêtre.
   3. Dans la fenêtre AH, indiquer la valeur de AH obtenu à l'étape 4.2.
   4. Cliquez sur le bouton "Concentration" pour vérifier les valeurs de concentration pour être utilisé dans la procédure d'ajustement. Cliquez sur le bouton "Temps moyen (P)". La boîte de dialogue s'ouvre donnant la possibilité de changer ou accepter la valeur par défaut. Cette valeur représente le temps avant chaque injectionion, dans lequel les moyennes de l'appareil le signal de puissance pour déterminer le niveau de puissance à chaque concentration de substrat. Cliquez sur OK pour confirmer la valeur par défaut.
   5. Cliquez sur le bouton "zéro Axe Y". Le curseur se transforme en une croix permettant de double-cliquer sur un point, de mettre à y = 0. Double-cliquez juste avant le premier point d'injection.
   6. Cliquez sur le bouton Calculer Taux d'. Rate est tracée en fonction de la concentration du substrat, obtenu en divisant le substrat ajouté au cours du titrage pour le volume de la cellule de l'échantillon (en tenant compte des effets de dilution). Cette opération donne un terrain typique de Michaelis-Menten qui peut être monté pour obtenir K _M et k _cat.
   7. Si certains points doivent être supprimés, cliquez sur le bouton "Tronquer données". Déplacez les marqueurs de données pour exclure les points de données mauvaises et double-cliquez sur un des marqueurs ou appuyez sur Entrée.
   8. Utilisez la fonction "Ajuster à modéliser" pour s'adapter à la courbe et àobtenir les constantes cinétiques.

Representative Results

Uréase (CE 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant du nickel unités multiples trouvée dans archées, les bactéries, eucaryotes unicellulaires et les plantes. Ceci agit de protéines dans la dernière étape de minéralisation de l'azote organique, catalysant l'hydrolyse de l'urée en ammoniac et de carbamate, qui se décompose spontanément pour donner une deuxième molécule d'ammoniac et de bicarbonate (Equation 6) ^12.

(6)

Cette réaction provoque une augmentation globale du pH de l'environnement, qui est responsable d'effets négatifs pour la santé humaine et l'agriculture ^13. Chez les plantes, le rôle principal de l'uréase est de recycler l'azote nutritif de arginase dérivés de l'urée ^14. uréases végétales sont généralement homo-hexamères un ₆ avec chaque sous-unité contenant un site actif avec deux ions Ni ^{2 + 15.} Parmi ceux-ci,ensiformis Canavalia (jack bean) uréase (JBU) a été la première protéine à cristalliser en 1926 ^16. Depuis, plusieurs études ont largement caractérisé l'activité enzymatique de la structure et uréases de plusieurs sources ^{13, 17.} Par conséquent, l'activité uréolytique de JBU a été choisi comme une réaction représentant de démontrer l'applicabilité des TIC dans la détermination quantitative de la catalyse enzymatique. Une valeur de AH = -10,5 kcal / mol a été mesurée dans un essai M1 (figure 2A) par intégration de la puissance thermique obtenu en injectant substrat de l'urée dans la solution d'uréase et permettant à la réaction de se poursuivre jusqu'à son terme. La puissance thermique enregistré dans une expérience M2 (figure 2B) a été convertie en la vitesse de réaction en utilisant l'équation 4 (figure 2C). Ajustement des données obtenues à l'équation de Michaelis-Menten à condition que les paramètres cinétiques pour JBU dansHEPES 20 mM pH 7 comme k _cat = 30 200 s ^-1 et K _M = 3,45 mM, en accord avec les données précédemment déclarées ^{18, 19.}

Figure 2. Hydrolyse de l'urée par l'uréase déterminé par le CCI. JBU (type C3) a été acheté comme enzyme lyophilisée (activité nominale 1538 U / mg) et dilué avec de l'HEPES 20 mM pH 7 à la concentration finale. La concentration de l'enzyme dans le mélange de réaction a été calculée en comparant l'activité déterminée du produit acheté à l'activité de l'enzyme pure, signalé comme étant 6200 U / mg d'enzyme pur ^20, et une masse molaire de 545 kDa, correspondant à la protéine homo-hexamère. (A) la puissance thermique observée dans l'expérience M1, réalisée à 25 ° C avec 2 x 5 ul d'injectiontions de 20 mM d'urée (dans la seringue d'injection) en une JBU nM (dans la cellule d'échantillon). Un espacement de 750 s entre les injections a été appliquée à la ligne de base de permettre le retour à la valeur initiale. L'enthalpie de la réaction est calculée à partir de l'intégration de chaque pic et la moyenne des deux valeurs, selon l'Equation 5. La valeur est indiquée dans le texte. (B) La puissance thermique observée dans l'expérience M2, obtenue en titrant urée 400 mM (20 x 5 injections de pi) dans 15 pM JBU. Un espacement de 180 sec a été appliquée entre les injections, afin de permettre au système d'atteindre et de maintenir le niveau de régime permanent. DQ / dt à différentes concentrations de substrat est obtenu sous forme d'un déplacement de la ligne de base après chaque addition. La chaleur de dilution est indiquée par un essai à blanc (gris), réalisée par titrage de substrat dans le tampon seul. (C) Le déplacement de la ligne de base dans la Figure 2B a été converti à la vitesse de réaction en utilisantEquation 4. Ajustement des données obtenues (carrés pleins) a été effectuée en utilisant l'équation 2, et est représentée par un trait continu. La valeur de K _M et k _cat obtenu à partir de l'ajustement sont présentés dans le texte.

Le changement de chaleur totale mesurée dans l'expérience M1 représente la somme de tous les événements qui se produisent au cours de la réaction en cours d'analyse, et dépend de l'enthalpie molaire de tous les processus impliqués, y compris, le cas échéant, la libération de protons ou d'une absorption à partir de la mémoire tampon. Dans un procédé générique dans laquelle le système acquiert des protons réagir dans une solution tampon, le tampon libère des protons, en produisant de la chaleur supplémentaire à l'intérieur de la cellule de réaction. Par conséquent, l'AH est apparent mesuré _(app AH), et comprend l'AH intrinsèque de la réaction (AH _int), ainsi que l'enthalpie d'ionisation du tampon (AH _d'ions), et ii) le nombre d'échantion protons (n), selon l'équation 7:

(7)

En utilisant cette équation, dans des expériences M1, on peut déterminer n et AH _int en réalisant la même expérience dans des tampons ayant des enthalpies d'ionisation, et en traçant _{l'application} de AH mesurée en fonction de AH _ion spécifique pour le tampon. Partir de la régression linéaire résultant, n est dérivée de la pente: pente négative reflète protons acquises par le tampon, tandis qu'une pente positive représente protons libérés à partir de la mémoire tampon; AH _int est dérivé de l'ordonnée à l'origine sur l'axe des y.

Comme observé dans l'équation 6, les résultats globaux de la réaction d'hydrolyse de l'urée dans l'acquisition d'un proton H ⁺ à partir de la mémoire tampon. Par conséquent, en tant que dedécrit ci-dessus, la chaleur de réaction comprend la contribution de la déprotonation de la mémoire tampon. Afin de calculer le AH intrinsèque de la réaction d'hydrolyse, trois expériences M1 ont été réalisées dans différents tampons (HEPES, Tris-HCl, de phosphate), caractérisé par trois _ion AH différente. AH _int et le nombre de protons libérés à partir de la mémoire tampon, calculées à partir de la interception et la pente de la régression linéaire des données expérimentales (figure 3) selon l'équation 7, étaient -14,7 kcal / mol et 0,98 respectivement, en plein accord avec les données précédemment rapportées pour la même réaction catalysée par Helicobacter pylori uréase ^7. À notre connaissance, aucune donnée thermodynamiques ont été rapportés pour JBU, jusqu'ici.

AH _int de réaction de l'uréase. Valeurs de AH _application dans différents tampons (carrés pleins) ont été déterminées en effectuant des expériences M1 dans HEPES 20 mM (AH _ion = 4.88 kcal / mol), mM Tris-HCl 20 (AH _ion = 11,34 kcal / mole) et de phosphate 20 mM _(ion AH = 0,86 kcal / mol) ^21. Une analyse de régression linéaire (ligne continue) de déterminer les données autorisées AH _int de la réaction, ainsi que le nombre de protons échangés durant le retournement de l'urée.

Discussion

L'importance de l'ITC pour étudier l'activité enzymatique par rapport aux méthodes existantes

En plus de ses applications classiques pour étudier les équilibres de liaison, calorimétrie de titration isotherme offre une méthode fiable et rapide pour caractériser les réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur de réaction comme une sonde, sans nécessiter de modification ou l'étiquetage système. Les paramètres cinétiques _{kcat et} Km sont habituellement obtenus par le biais d'une série d'expériences de cours de temps, dans lequel la formation du produit (ou de la consommation de substrat) est surveillée dans des dosages continus ou discontinus. Typiquement, la concentration du substrat ou du produit est mesurée par absorbance de la lumière ou de la fluorescence à des longueurs d'ondes caractéristiques. Cependant, la plupart des substrats et / ou de produits ne sont pas spectroscopiquement actif, et donc un chromophore ou fluorophore doivent être inclus pour suivre la réaction. En variante, des dosages couplé, avecle produit de la catalyse étant un substrat pour une autre réaction avec le produit mesurable, pourrait être utilisé. Ces méthodes, cependant, introduire des variables supplémentaires qui réduisent la précision des valeurs déterminées de K _M et k _cat. De plus, la caractérisation de l'inhibition de l'enzyme par des petits ligands en utilisant des procédés classiques peut être compliquée par l'absorbance ou la fluorescence du ligand lui-même petit, ce qui peut altérer la fiabilité de l'analyse spectroscopique. Méthodes alternatives impliquent des techniques d'écoulement arrêté, dans lequel la quantité de produit est quantifiée par spectrométrie de masse ou la chromatographie. Ces techniques sont très précises et fiables, mais sont longues et coûteuses pour les analyses de routine. La sonde a suivi dans les expériences de l'ITC, c'est la chaleur dégagée ou absorbée, est une propriété intrinsèque de la quasi-totalité des réactions chimiques. Par conséquent ITC ne nécessite aucune modification ou l'étiquetage du système en cours d'analyse. En outre, tsa technique est simple et rapide, nécessite peu de matière et peut être effectuée en solution ^{22, 23.}

Les étapes critiques dans le protocole et les éventuelles modifications

L'analyse de la réaction est généralement effectuée dans deux expériences différentes, qui fournissent l'enthalpie molaire totale de la réaction et de la variation de la chaleur au cours du temps à différentes concentrations de substrat. Afin d'obtenir des données de bonne qualité, l'expérience doit être planifiée en détail au début de l'enquête. La protéine et des concentrations de substrat doivent être soigneusement déterminés, que leur valeur correcte est essentielle pour calculer des paramètres fiables dans l'analyse des données. La composition du tampon et le pH de l'enzyme et à la fois les solutions de substrat doivent être identiques, de manière à minimiser la chaleur du mélange pendant l'addition de substrat. Ceci est généralement assurée par l'exécution d'une dialyse ou d'une exclusion de taillesion étape de chromatographie de la solution d'enzyme avant l'exécution de l'expérience, et en utilisant le tampon d'élution de la colonne pour dissoudre le substrat. Une expérience de contrôle doit être effectué avec des solutions identiques de substrat injecté dans le tampon de réaction en l'absence de l'enzyme, afin de soustraire la chaleur de dilution ou de vérifier qu'elle est négligeable.

L'analyse des données est généralement réalisée avec le programme d'origine pour ITC fourni par le fabricant. Un programme alternatif de choix pour l'analyse des données peut être utilisé, si nécessaire.

Dépannage et les limites de la technique

Un bon rapport signal à bruit n'est obtenue que si la réaction se déroule à une vitesse qui permet au système de produire suffisamment de chaleur dans la cellule ITC pour surmonter la limite de détection instrumentale. Ceci est habituellement réalisé pour des systèmes avec k _cat supérieure à 1 min ^-1. Dans ce cas,le logiciel d'origine pour ITC calcule automatiquement le tracé de Michaelis-Menten de données brutes, et en utilisant l'analyse non linéaire des moindres carrés régression, il calcule k _chat et les valeurs K _M. Cette analyse suppose aucune inhibition significative de produit. Ce dernier est généralement visible lorsque les injections suivantes dans l'expérience M1 produisent des pics avec des formes différentes et, en particulier, avec la trace de la puissance du second pic de prendre plus de temps pour revenir à la ligne de base initiale. Si l'inhibition de produit se produit, un autre logiciel de choix, mis en œuvre avec des équations à des fins particulières, doit être utilisé.

Compte tenu de la différence intrinsèque de chaque système enzymatique, et l'autre la chaleur produite par des réactions différentes, qui ne peuvent être quantifiés a priori, de déterminer les conditions de fonctionnement optimales (c.-à-enzymatiques et les concentrations de substrat, le nombre et le volume des injections, temps espacement, etc) pour un système spécifique parfois r Equire quelques titrages exploratoires.

Au cours de l'analyse, il faut appliquer pour choisir les conditions expérimentales selon le système en cours d'analyse. Par exemple, le phosphate inhibe l'urée par l'uréase hydrolyse, et, par conséquent, d'effectuer l'essai dans du tampon phosphate diminue le débit total de la réaction enzymatique ^{24, 25.}

Applications

Une fois la cinétique de la réaction enzymatique a été déterminée, la réaction peut être répétée en présence de différents types et concentrations des inhibiteurs de l'enzyme dans la cellule à échantillon, afin de mesurer, en utilisant l'inhibition de l'équation générale 8 ^26, compétitif (K _ic) et compétitives (K _UIC) constantes d'inhibition, permettant ainsi de distinguer, parmi les différents types d'inhibition.

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En conclusion, cette méthode peut être utilisée en tant que moyen simple et économique pour tester un grand nombre d'inhibiteurs d'enzymes pour des applications pharmaceutiques et industriels, comme dans le criblage de médicaments.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument