Summary
등온 적정 열량 측정 열 흐름이 방출 또는 화학 반응에 흡수. 이 방법은 효소 - 촉매 반응을 정량화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 악기 설정을위한 프로토콜, 실험 실행 및 데이터 분석은 일반적으로 기술되고, 잭 콩 요소 분해 효소에 의해 가수 분해 효소 요소의 특성에 적용.
Abstract
등온 적정 열량 측정 (ITC)는 열이 거의 모든 화학적 프로세스를 특성화하기 위해 극한 프로브로서 사용하여, 화학 반응 동안 방출 또는 흡수 측정 잘 설명 된 기술이다. 현재에는,이 기술은 광범위 생체 분자 결합 평형의 열역학적 파라미터를 결정하기 위해 적용된다. 또한, ITC가 직접 응용 프로그램이 여전히 underexploited에도 불구하고, 효소 반응의 역학 및 열역학 매개 변수 (K 고양이, K M, ΔH)을 측정 할 수 있도록 입증되었습니다. 열 변화가 자발적 효소 촉매 반응 중에 발생하는 바와 같이, ITC는 분석중인 시스템의 변경이나 표시를 필요로하지 않고, 용액에서 수행 될 수있다. 또한,이 방법은 재료의 작은 금액을 필요로한다. 이러한 속성은 ITC로 다음과 같은 다양한 응용 프로그램, 예를 들어, 약물 발견에 효소 반응 속도를 연구하는, 귀중한 강력하고 독특한 도구합니다.
K 고양이를 결정하기 위해 적용되는 Canavalia의 ensiformis (잭 콩) 요소 분해 효소에 의한 요소의 효소 가수 분해의 K M. 반응의 고유 몰 엔탈피 (ΔH의 INT)의 계산이 수행된다. 얻어진 값은 방법론의 신뢰성을 보여주는, 문헌에보고 이전의 데이터와 일치한다.
Introduction
생화학 반응의 정량은 삶의 기초에서 생물학적 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 열량은 양적 솔루션의 거의 모든 화학 반응의 특성에 레이블이없는 방법을 제공합니다. 이러한 기술은 열을 방출 또는 시간에 걸쳐 흡수 계측하고, 따라서 보편적 검출 시스템과 반응 분자 (즉, 결합 열역학)뿐만 아니라, 반응 속도 (즉, 반응 속도)을 측정하기위한 양을 정량화하는 매우 편리한 방법이다. 특히, 등온 적정 열량계 (ITC)는 단백질 - 리간드, 단백질 - 단백질, 단백질 - 금속 이온과 단백질-DNA 상호 작용 1-6을 포함, 생명 평형의 열역학 특성에 선택의 방법으로 채택하고있다. 본 출원의 전위가있을지라도 또, 운동 정보를 제공하기 위해 ITC의 능력은 그것의 효소 촉매 작용을 측정하는 매우 강력한 시스템 만든다7-9을 과소 평가.
미카엘리스 상수 (K M) 및 촉매 속도 상수 (k 고양이)는이 운동 매개 변수에 따라, 반응 속도와 기질의 농도 간의 관계를 제공하는 등 미카엘 - 멘텐 방정식 (10)은 효소 반응의 정량적 인 설명이다 . K 고양이는 / K M 비율은 효소의 촉매 효율로 언급된다. 실제로, 특정 반응에 대한 K M의 의지와 K 고양이는 촉매에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
전형적인 효소 반응 (도 1)에서, 기판 (S)을 연속적으로 전이 상태로 활성화되는 효소 - 기질 (ES) 복합체를 형성하는 효소 (E), (ES *)와 상호 작용한다. 후자는 결국 해리 효소 제품 (EP) 단지로 변환됩니다. 이 단계(S)는 다음과 같은 반응에 의해 설명된다.
(1)
K 1은 ES 단지, K -1의 형성 속도 상수입니다 K 고양이 촉매 속도 상수 또는 회전율 수있는 동안, ES 복합체의 해리에 대한 속도 상수이다.
: 미카엘리스 - 멘텐 방정식 10에 따르면, 반응의 속도는 다음과 같이 계산 될 수있다
(2)
하는 K M = (K -1 + K 고양이) / K 1과 K 고양이 = V 최대 / [E], V 최대 모든 효소가 기판에 바인딩 될 때 도달 최대 속도 인과.
등온 적정 열량계는 우레아의 가수 분해 효소의 특성을 본 연구에서 사용 된 수단이다. 이 기기는 두 개의 만들어 낸 모양의 세포 (그림 1)를 포함하는 단열 차폐 만든다. 이러한 좁은 프리 튜브와 외부에 접속된다. 기준 셀은 일반적으로 물 또는 분석을 위해 사용 된 용매로 충진되는 동안 샘플 셀 (약 1.4 ml)을, 효소 용액과 함께로드된다. 일반적으로 기질 용액 캘리포니아. 0.3 ML를 포함하는 긴 바늘과 연결된 교반 패들과 회전 주사기, 시료 셀에 장착된다. 열전 장치가 "셀 피드백 네트워크"를 사용하여, 시료 및 참조 셀 사이의 온도차를 측정하고, 그 열을 추가하거나 감산함으로써 제로의 차이를 유지한다. 실험하는 동안, 기판은 일정한 온도에서 선택된 효소 용액에 주입된다. 때 엔zymatic 반응물 방출 또는 흡수되는 열량이 상품 분자로 변환된다 기질 분자의 수에 비례하여, 일어난다. 또, 열 흐름의 속도를 직접 반응의 속도에 관한 것이다. 측정 된 데이터는, 초기 기준선에서 열 트레이스의 편차 (도 1)으로 나타나는 (μcal / 초) 샘플 셀에서 발생하는 열 유량에 비례하는 샘플 셀에 기기에 의해 공급 화력을 나타낸다 시간이 지남에.
그림 1. 효소 반응을 연구 등온 적정 열량계의 개략도. (샘플 셀에서) 거기의 변화의 결과로 효소 용액 (주입 주사기) 기판의 적정시 발생하는 효소 반응시료 셀과 기준 셀 상수 사이의 온도 차이를 유지하는 데 필요한 칼로리, 발표 한 말의 힘. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
전반적으로, 열 변화 (Q)을 반응 (ΔH)와 교대로 합계 양 배 농도 주어진다 (N), 생성 된 생성물의 몰수의 몰 엔탈피에 비례한다 :
(3)
생성물 형성은 시간이 지남에 따라 반응 속도에 대응한다 (DP / DT)는, 이와 관련하여 통해 동시에 (dQ를 / DT) 위에 발열량 관련 될 수있다 :
(4)
이 식에 따르면, 미카엘리스 - 멘텐를 얻기 위해는) 전체 몰 엔탈피 ΔH를 I를 측정하는 것이 필요하다 플롯 상이한 기질 농도에서 ⅱ) 열 흐름 dQ를 / DT. 일반적으로이 두 개의 상이한 실험에서 수행된다 : 첫 번째 실험 (방법 1, M1)에서, 기판이 효소 용액에 주입하고 완전한 기판 변환 용 히트가 측정된다; 두 번째 실험 (방법 2, M2)에서, 기판의 체류 주사가 수행되고, 열 생성 속도가 상이한 기질 농도에서 측정된다. 2 개의 데이터 세트는 운동 매개 변수 K M과 K 고양이를 유도하기에 충분하다.
본 기사에서는 ITC를 사용하여 수행 효소 반응에 대한 운동 매개 변수를 결정하는 일반적인 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 Canavalia ensiformis 요소에 의해 요소의 가수 분해 방법을 적용SE, 참조 시스템과 같은. 이 방법을 사용하여 얻은 결과와 문헌에보고 된 데이터와 잘 일치하는이 방법의 신뢰성을 보여줍니다.
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Protocol
1. 준비 샘플
- 효소 용액 2 ㎖ 및 각 실험 실행에 대한 기질 용액 0.5 ㎖를 준비합니다. 기판 첨가하는 동안 희석 및 혼합의 열을 최소화하기 위해 동일한 조성물을 갖는 완충 용액에 효소와 기질의 농축 원액을 희석.
- 실험 기간 동안 pH 변화를 방지하기 위해 적절 버퍼 조건을 선택합니다. 예를 들어, 20 mM의 HEPES 산도 7은 중성 pH의 측정에 적합합니다.
NOTE : 양성자 교환이 관여되는 경우 그들이 반응 ΔH 측정에 영향을 줄 수 있기 때문에, 사용 된 버퍼의 양성자 화 엔탈피가 고려되어야한다. 분석중인 시스템의 버퍼 또는 첨가제 분자의 가능한 특정 효과가 고려되어야한다. 유기 용매 (예 : DMSO)가 효소 용액에 포함되는 경우, 기질 용액에 정확히 동일한 농도에 추가. - M1의 실험 시작nm의 범위에서 효소 농도 (예를 들면 1 NM)와 함께 효소 농도보다와 K M 이상 크기의 적어도 세 순서 높은 기질 농도.
- M2 실험의 경우, PM-nm의 범위에서 효소 농도 (예 : 15시)로 시작합니다. 주사기에서 기질 농도는 mM의 범위 (예를 들면 400 ㎜)이다.
참고 : 단일 주입 M1의 실험에서, 농도는 실험 시간이 지남에 따라 제품에 전체 기판 변환을 달성하기에 적절해야한다. 따라서, 효소의 농도는 효소의 속도에 따라 달라 낮은 K 고양이와 효소 연구 중에있는 경우, 높은 효소 농도 (최대 10 μM)를 사용합니다. 한편, M2의 실험에서 사용 된 효소 농도는 주입 된 기판만을 소폭 (5 % 미만) 소비와 효소 반응이 정상 상태로 진행한다 있다는 것을 확신한다. 이 때문에, 높은효소의 효율성, 필요한 효소의 농도가 낮은. 실험의 끝에, 샘플 셀에서 기질 농도는 K M보다 높아야한다.
- 실험 기간 동안 pH 변화를 방지하기 위해 적절 버퍼 조건을 선택합니다. 예를 들어, 20 mM의 HEPES 산도 7은 중성 pH의 측정에 적합합니다.
- 조심스럽게 280 nm의, 색채, BCA 분석 실험 11에서 적절한 분석 절차 (예를 들면 흡수와 효소와 기질 농도를 확인합니다. 이것은 열역학 및 운동 매개 변수의 정확하고 신뢰할 수있는 계산을 얻기 위해 필요합니다.
- 용액의 pH를 측정하고, 효소와 기질 용액 모두의 pH 불일치 (0.05의 pH 단위 ±) 실험 조건 하에서 최소인지 확인.
2. 실험 수행
참고 : 같은 절차가 모두 다른 후 하나를 수행하는 M1과 M2의 실험에 적용해야합니다.
- 시료 셀 및 주입 주사기 제조업체에 따라 청소되어 있는지 확인지침. 증류수로 기기와 함께 제공되는로드 주사기를 채우기, 부드럽게, 샘플 셀에 바늘을 삽입 할 셀을 채우고 같은 주사기를 사용하여 액체를 제거합니다. 이 방법을 사용하면, 완충액으로 두번 증류수로 두 번 샘플 셀 씻어.
- 정중 기포의 형성을 피하는, 로딩 주사기를 사용하여 효소 용액 2 ㎖와 함께 샘플 셀을로드. 그것이 셀 스템의 상부 밖으로 유출까지 천천히 셀로 용액을 주입. 캘리포니아의 스퍼트를 생성합니다. 용액 0.25 ml의 세포로. 두 번 반복합니다. 이 단계는 샘플 셀에 갇힌 공기 방울을 제거한다.
- 셀 스템 셀 포트 사이의 선반에로드 주사기의 바늘을 놓고 초과 솔루션을 제거합니다.
- VP-뷰어 프로그램을 시작하고, 컴퓨터 인터페이스, 원하는 실험 온도 이하의 온도 3 ° C의 ITC 악기를 평형. 이것은 긴 평형을 방지하기 위해 필요합니다수동적 수단이 냉각 장치에 의한 실험 전 기간.
- 상기 동일한 방법으로 증류수로 레퍼런스 셀을 채운다. 높은 이온 강도 또는 높은 삼투압을 가진 버퍼를 시료 용액에있을 때, 동일한 완충액은 참조 용액으로 사용한다.
- 얇은 실리콘 튜브를 사용하여 주입 주사기 충진 포트에 플라스틱 주사기를 연결한다. 물이 주입 주사기가 가득 차 있음을 나타내는, 최고 충전 포트 나올 때까지 물에 바늘 끝을 배치하고 최대 그리기 주입 주사기를 채우십시오. 그런 다음 물에서 주사기의 끝을 이동하고 공기를 빨아, 주입 주사기를 비 웁니다. 이 절차를 버퍼로 주입 주사기를 씻어 시스템을 통해 공기를 그립니다. 이어서, 튜브의 저부에 용액의 소량 남게 정중 빨아 완전히 주입 주사기를 채우기 기질 용액 0.5 ㎖를 함유 좁은 튜브에 주사 바늘을 배치.
- 에서컴퓨터 인터페이스를 누르십시오 "닫기 채우기 포트". 실리콘로드 튜브를 제거합니다. 을 눌러 "퍼지 및 리필"주입 주사기가 공기 방울을 제거하고 대량 솔루션에 다시 추방 할 수 있도록 버튼을 클릭합니다. 두 번 반복합니다.
- 모든 방울을 제거하고 시료 셀에 주입 주사기의 바늘을 배치 측면에 닦아 주입 주사기를 이동합니다.
- 컴퓨터에서 적절한 실행 매개 변수를 설정합니다. 실험 효소와 기질 농도가 표시 될 수있다.
- M1 실험에서, 재현성을 확인하기 위해 기판의 적어도 두 개의 추가 (5-30 μL)을 설정. 각 주입 사이의 간격 시간을 보장하기에 충분한 크기 (예 : 1000 초)를 설정 그 다음 또한 이전의 기준에 열 신호로 돌아갑니다.
- M2의 실험에서, (예를 들어 15 X 5-10 μL) 주사를 복수로 설정합니다. 시스템의 허용 주사제 (예를 들면 180 초) 간의 간격을 설정각 주입 후 새로운 기준에 화력을 tabilize.
NOTE : M2 실험에서 주사 사이 간격 시간 측정은 정상 상태 조건 하에서 수행 될 수 있도록, 기판의 상당한 양의 전환을 방지하기 위해 충분히 짧아야한다. - M2의 실험에서, 그 대응하는 값 이후의 데이터 분석에서 삭제되는 첫 번째 주입을위한 작은 볼륨 (예를 들어, 2 μL)를 사용합니다. 실제로, 대개 주사기 팁을 통해 초기 기판 확산으로 인한 아티팩트를 제시하고 주사기 바늘에 갇힌 기포의 존재.
- 기준 전력을 설정, 기준이 반응하기 전에 배치 될 수있는 대략 레벨 20의 값으로 시작합니다. 그런 실험 효소 및 기질 농도를 정의하고 실험의 이름을 선택했다.
- 일반적으로 25 ° C에서, 실험 온도를 정의 ITC는 할 수 있습니다 (2)의 작동 온도 ° C와 80 ° C. 실험을 실행하기위한 준비가되어 있습니다. 실험을 시작하여 "시작"버튼을 누릅니다.
- 실험이 끝난 후에, 제조자의 지시에 따라 시료 셀 및 주사기를 청소한다.
- 적어도 하나 또는 두 번 이상 데이터의 재현성을 확인하는 실험을 반복합니다.
3. 데이터 분석
- 분석 프로그램에서 "데이터 읽기"버튼을 클릭하고 수행 M2 실험. ITC 파일이있는 폴더로 이동합니다. "파일 형식"의 아래로 스크롤 화살표를 클릭하고 "효소 분석 (그것을?)"를 선택합니다. 그 후, 클릭하고 M2 실험. ITC 파일을 엽니 다.
- 수학 식 5에 따라 M1 실험 곡선을 적분에서 반응 ΔH를 얻었다.
"폭 ="126 "/> (5)- "데이터 읽기"버튼을 클릭하고 수행 M1 실험의 파일. ITC를 선택합니다. 원산지를 사용하여, 하나의 피크를 각각 포함하는 다른 부분에서 추적을 나누고. OPJ 파일로 각각의 피크를 저장합니다. 단일 사출 M1 실험 해 통합하고, 얻어진 면적 값을 분할의 열상의 기준선 어긋남으로 인해, 첫번째 피크에 대응하는 파일을 열고 μcal 표현, 샘플 셀의 최종 기질 농도에 의해, μM 표현 및 셀의 용량에 식 5, 반응 ΔH에 따라 결정 리터 표현.
- M1 실험의 두 번째 피크에 대한 동일한 절차를 반복하고이 ΔH 측정 평균값을 얻었다.
- 각 주입 다음 원래 기준과 새로운 기준의 차이를 측정 M2 실험에서 dQ를 / DT를 결정합니다. 전자 변환수학 식 4에 따른 반응 속도로 xperimental 데이터 M1 실험에서 얻어진 엔탈피 값을 이용하여 미카엘리스 - 멘텐 방정식에 데이터 피트.
- 분석 프로그램에서 "데이터 읽기"버튼을 클릭하고 수행 M2 실험의 파일. ITC를 선택합니다. "파일 형식"의 아래로 스크롤 화살표를 클릭하고 "효소 분석 (그것을?)"를 선택합니다.
- 효소 분석 대화 상자가 4 가지 모델 중 하나를 선택 수 있도록 열립니다. 창에서 - "만 기질 방법 2"를 선택합니다.
- ΔH 창에서 4.2 단계에서 얻은 ΔH의 값을 나타냅니다.
- 피팅 절차에 사용되는 농도 값을 확인 "집중"버튼을 클릭. "평균 시간 (P)"버튼을 클릭합니다. 대화 상자의 기본값을 변경하거나 받아 들일 수있는 기회를 제공 열립니다. 이 값은 각각의 분사 전에 시간을 나타낸다이온있는 악기의 평균 각 기질 농도에서 전력 레벨을 결정하는 전력 신호. 기본 값을 확인하기 위해 확인을 클릭합니다.
- "제로 Y 축"버튼을 클릭합니다. 커서는 Y = 0에 배치 할 점을 두 번 클릭 할 수 있도록 크로스 헤어로 변합니다. 단지 첫 번째 주입 지점 전에 두 번 클릭합니다.
- 계산 속도 버튼을 클릭합니다. 환율 (계정 희석 효과를 고려하여) 샘플 셀 볼륨에 대한 적정 중에 추가 기판을 분할함으로써 유도 기질 농도, 대 플롯. 이 작업은 K M과 K 고양이를 얻기 위해 장착 할 수있는 일반적인 미카엘 - 멘텐 플롯을 제공합니다.
- 몇 가지 포인트가 삭제해야하는 경우, "자르기 데이터"버튼을 선택합니다. 잘못된 데이터 점을 입력 마커를 누르거나 중 하나를 두 번 클릭을 제외 할 데이터 마커를 이동합니다.
- 곡선에 맞게하고하는 "모델에 맞춤"기능을 사용하여운동 상수를 구하십시오.
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Representative Results
요소 분해 효소 (EC 3.5.1.5, 요소 amidohydrolase는) archea, 박테리아, 단세포 진핵 생물과 식물에서 발견 multisubunit 니켈 함유 효소이다. 자발적으로 암모니아 및 수소 나트륨 (식 6) (12)의 두 번째 분자를 제공하기 위해 분해 암모니아, 카르 바 메이트에 요소의 가수 분해를 촉매 유기 질소 광물의 마지막 단계에있는이 단백질의 역할,,.
(6)
이 반응은 인간의 건강과 농업 13 부정적인 영향의 책임이있는 환경의 pH의 전반적인 증가의 원인이됩니다. 식물, 요소 분해 효소의 주요 역할은 아르 기나 파생 요소 (14)로부터 영양소 질소를 재활용하는 것입니다. 식물 우레아제는 일반적으로 2 + 15을 이온 니켈 두 가지로 활성 부위를 포함하는 각 서브 유닛과 6 호모 헥사 있습니다. 그 중에서도,Canavalia의 ensiformis (잭 콩) 요소 분해 효소 (JBU가) 1926 (16)에 결정화 된 최초의 단백질이다. 그 이후, 여러 연구는 광범위하게 여러 소스 13, 17 우레아제의 구조와 효소 활성을 특징으로했다. 따라서 JBU의 ureolytic 활동 정량적 효소 촉매를 결정 ITC의 적용 가능성을 입증하는 대표적인 반응으로 선택되었다. ΔH = -10.5 만 kcal / 몰의 값은 우레아제 우레아 용액에 기판을 주입하고, 반응이 완료 될 때까지 계속함으로써 얻어진 화력을 통합하여 M1 실험 (도 2A)로 측정 하였다. M2 실험 (도 2B)에 등록 화력은 수학 식 4 (도 2C)를 사용하여 반응 속도로 전환시켰다. 미카엘리스 - 멘텐 식으로 얻어진 데이터의 적합에 JBU의 운동 매개 변수를 제공20 mM의 HEPES pH가 7은 K 고양이 = 30,200 초 -1 K M = 3.45 MM은, 동의 이전에 데이터를 18, 19을보고.
그림 2. ITC. JBU (타입 C3)에 의해 결정된 순서 우레아제 유레아 가수 분해 효소는 동결 건조 (공칭 활성 1,538 U / ㎎)을 구매하고 최종 농도 20 mM의 HEPES pH를 7로 희석 하였다. 반응 혼합물에서의 효소의 농도를 순수 효소의 활성에 구입 상품의 결정된 활성을 비교하여 계산하고,에 대응하는, 6200 U / 순수 효소 20 ㎎, 545 kDa의의 몰 질량으로보고 호모 hexameric 단백질. 2 × 5 μL의 주입에와 25 ° C에서 수행 M1 실험에서 관찰 (A) 화력,(샘플 셀) 1 nM의 JBU에 (주입 주사기) 20 MM의 요소의 tions. 주사 사이 750 초의 간격을 초기 값으로 복귀 기준선을 허용하기 위해 적용 하였다. 반응 엔탈피는 수학 식 5에있어서, 각 피크와 두 값의 평균의 적분으로부터 계산된다. 값은 텍스트에보고된다. (B) 15 μM의 JBU에 400 밀리미터의 요소 (20 × 5 μL 주사를) 적정에 의해 얻어진 M2 실험에서 관찰 된 화력. 180 초의 간격은 시스템이 정상 상태 레벨에 도달하고 유지하도록하기 위해, 주사 사이에인가 하였다. 상이한 기질 농도에서 dQ를 / DT 각 첨가 후 기준선의 변위로서 수득된다. 희석의 열은 혼자 버퍼에 기판을 적정 수행 빈 실험 (회색)으로 표시됩니다. (C)도 2b의 기준 변위하여 반응 속도로 전환시켰다식 4. 얻어진 데이터 (채워진 사각형)의 적당한 수학 식 2를 사용하여 수행하고, 실선으로 표현된다. 착용감에서 얻은 K M 값과 K 고양이는 텍스트에보고됩니다.
M1 실험에서 측정 된 전체 열 변화 분석 하에서 반응 동안 일어나는 모든 이벤트의 합을 나타내고, 버퍼로부터 양성자 방출 또는 흡수, 적용 가능한 경우, 포함한 모든 관련 프로세스의 몰 엔탈피에 의존한다. 반응 시스템은 완충 용액에서 양성자를 취득하는 일반적인 방법에서, 버퍼는 반응 셀 내에 추가적인 열을 생산 양성자 출시. 따라서 측정 ΔH는 (ΔH 응용) 겉보기이고, 반응 (ΔH의 INT)의 극한 ΔH뿐만 아니라 버퍼의 이온화 엔탈피 (ΔH 이온), 및 EXCHANG의 II)을 포함양성자 (N)를 보내고 식 7에 따라 :
(7)
이 방정식을 사용하여, M1 실험에서, 우리는 다른 이온화 엔탈피와 버퍼에서 같은 실험을 수행하고, 버퍼에 대한 특정 ΔH 이온의 함수로 측정 ΔH 응용 프로그램을 플로팅하여 n 및 ΔH의 INT를 확인할 수 있습니다. 얻어진 선형 회귀에서, N은 기울기로부터 유도된다 : 양의 기울기는 버퍼로부터 방출 양자를 나타내는 동안 음의 기울기는, 상기 버퍼에 의해 취득 양성자를 반영; ΔH의 INT는 Y 축상의 절편으로부터 유도된다.
수학 식 6에서 관찰 된 바와 같이, 버퍼에서 양성자 H의 +의 인수의 전반적인 요소의 가수 분해 반응의 결과. 따라서,로 드위의 스 크라이 빙, 반응의 열 버퍼 탈 양성자의 기여를 포함한다. 가수 분해 반응의 극한 ΔH를 계산하기 위해, 세 M1 실험은 INT ΔH. 세 가지 ΔH 이온이 특징의 다른 버퍼 (HEPES, TrisHCl, 포스페이트)에서 수행하고, 상기 버퍼로부터 방출 양성자의 수는 계산 차단 수학 식 7에 따라 실험 데이터의 선형 피팅의 기울기 (그림 3), 이전에 헬리코박터 파이로리의 우레아제 (7)에 의해 촉매 같은 반응에 대해보고 된 데이터와 전체 계약에 각각 -14.7 만 kcal / 몰과 0.98이었다. 우리의 상식으로, 더 열역학적 데이터는 지금까지 JBU에보고되었습니다.
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Discussion
기존의 방법과 관련하여 효소 활성을 연구하는 ITC의 의의
결합 평형을 연구의 고전 어플리케이션 이외에, 등온 적정 열량 측정 시스템 수정 또는 라벨링을 요구하지 않고, 프로브로서, 반응의 열을 사용하여 용액의 효소 반응의 특성을 안정적이고 빠른 방법을 제공한다. 운동 파라미터는 고양이 K와 K M은 보통 제품의 형성 (또는 기판 소비) 연속 또는 불연속 분석법에서 모니터링되는 시간 경과 실험의 집합을 통해 얻어진다. 통상적으로, 기판 또는 제품 농도 특성 파장에서 흡광도 또는 형광에 의해 측정된다. 그러나, 대부분의 기판들 및 / 또는 제품은 광학적으로 활성이 아니므로 발색단 또는 형광 반응을 수행하기 위해 포함되어야한다. 다른 방법으로, 분석을 결합측정 된 제품 또 다른 반응을위한 기질 인 촉매의 상품은, 사용될 수있다. 이러한 방법은, 그러나, K M과 K 고양이의 결정 값의 정확도를 감소 추가 변수를 소개합니다. 또, 기존의 방법을 사용하여 작은 리간드에 의한 효소 저해의 특성화는 분광 분석의 신뢰도를 변경할 수 작은 리간드 자체의 흡광도 또는 형광에 의해 복잡하게 될 수있다. 다른 방법은 상품의 양은 질량 분석법 또는 크로마토 그래피를 이용하여 정량되는 정지 흐름 기법을 포함한다. 이 기술은 매우 정확하고 신뢰할 수 있지만, 시간과 일상적인 분석을 위해 비싸다. 프로브는 그 해제되거나 흡수 된 열입니다, ITC의 실험에 따라, 거의 모든 화학 반응의 본질적인 속성입니다. 따라서 ITC는 분석중인 시스템의 변경이나 라벨을 필요로하지 않습니다. 또한, T그 방법은, 간단하고 빠르다 물질 소량을 필요로하고 용액 (22), (23)에서 수행 될 수있다.
프로토콜 및 가능한 수정 내에서 중요한 단계
반응 분석은 일반적으로 상이한 기질 농도에서의 시간에 따른 반응 및 열 변화의 전체 몰 엔탈피를 제공하는 두 가지 실험을 행한다. 좋은 품질 데이터를 얻기 위해서, 실험은 조사의 시작 부분에서 상세히 계획되어야한다. 올바른 값은 데이터 분석에서 신뢰할 수있는 매개 변수를 계산하기위한 필수적인으로 단백질과 기질 농도는 신중하게 결정해야합니다. 버퍼 조성물과 효소 및 기질 용액 모두의 pH는 기판 첨가하는 동안 혼합 열을 최소화하기 위해서 동일해야한다. 이것은 일반적으로 투석이나 사이즈 EXCLU를 수행함으로써 보장된다실험을 실행하고, 상기 기판을 용해하는 컬럼으로부터 용출 완충액을 사용하기 전에 효소 용액에 시온 크로마토 그래피 단계. 대조 실험은 희석의 열을 뺄하거나 무시할 수 있는지 확인하기 위해, 효소의 부재하에 반응 완충액에 주입 기판의 동일한 솔루션으로 수행되어야한다.
데이터 분석은 일반적으로 제조업체에서 제공 ITC위한 원래 프로그램으로 수행된다. 필요한 경우 데이터 분석을위한 선택의 대안 프로그램은 사용할 수있다.
기술의 문제 해결 및 제한
양호한 신호 대 잡음 비율은 반응 시스템이 쓸모 검출 한계를 극복하기 위해 ITC 셀에 충분한 열을 생성 할 수있는 속도로 진행하는 경우에만 수득된다. 이것은 일반적으로 1 분 -1보다 K 고양이 이상과 시스템에 달성된다. 이 경우,ITC위한 원점 소프트웨어는 원시 데이터로부터 미카엘리스 - 멘텐 플롯을 산출하고, 비선형 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여, K는 고양이와 K M 값을 계산한다. 이 분석은 의미있는 제품 저해을지지 않습니다. M1 실험의 후속 주사는 초기 기준에 반환되는 데 오래 걸리는 두 번째 피크 전력 추적과 다른 모양을 가진 봉우리와, 특히를 생성 할 때, 후자는 일반적으로 볼 수 있습니다. 제품 저해가 발생하는 경우, 목적 별 방정식으로 구현 선택한 다른 소프트웨어는 사용되어야한다.
각 효소 시스템의 본질적인 차이 등에 대한 최적의 주행 조건 (즉, 효소와 기질 농도, 개수 및 주입 부피, 간격 시간 등)를 결정하고, 선험적으로 정량화 될 수없는 다른 반응에 의해 생성 된 서로 다른 열 관련 구체적인 시스템은 때때로 r에 몇 답사의 적정을 equire.
분석하는 동안주의를 분석중인 시스템에 따라 실험 조건을 선택 적용해야합니다. 예를 들어, 포스페이트 효소 반응 (24, 25)의 전체 속도를 저하 포스페이트 완충액에서 실험을 수행, 따라서 분해 효소에 의해 가수 분해 요소를 억제하고.
응용 프로그램
효소 반응의 반응 속도가 결정되면, 반응은 경쟁적 일반적인 저해 수학 식 (8) 26 (K 용 IC)를 사용하여 측정하기 위해, 다양한 종류와 샘플 셀에 효소 저해제의 농도의 존재하에 반복 될 수있다 따라서 우리는 억제의 다른 유형 사이에서 구별 할 수 있도록 경쟁력 (K UIC) 억제 상수.
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결론적으로, 본 방법은 약물 스크리닝 같이 제약 및 산업용 애플리케이션에 대한 효소 저해제의 다수를 테스트하기위한 신속하고 경제적 인 방법으로 사용될 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
특수 비료 제품 회사 (SFP)는이 연구에 필요한 자금을 제공하기 위해 인정 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
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