Hot Biological Katalyse: Isotermisk Titrering Calorimetry å karakter enzymatiske reaksjoner

Summary

Isoterm titrering kalorimetri tiltak varmestrøm løslatt eller absorberes i kjemiske reaksjoner. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere enzymkatalyse. I denne utredningen, protokollen for instrumental oppsett, eksperiment, og dataanalyse er generelt beskrevet, og brukes på karakterisering av enzymatisk urea hydrolyse av jack bønne urease.

Abstract

Isoterm titrering kalorimetri (ITC) er en godt beskrevet teknikk som måler varmen frigitt eller absorbert i løpet av en kjemisk reaksjon, ved hjelp av den som en indre sonde å karakterisere praktisk talt alle kjemisk prosess. I dag er denne teknikken mye brukt til å bestemme termodynamiske parametre for biomolekylære bindende likevekter. I tillegg har ITC blitt vist å være i stand til direkte å måle kinetiske og termodynamiske parametere _{(k, katt,} K _m, AH) av enzymatiske reaksjoner, selv om denne søknaden er fremdeles underutnyttet. Som varme endringer spontant forekomme under enzymatisk katalyse, betyr ITC krever noen modifikasjon eller merking av systemet under analysen og kan utføres i løsning. Videre krever fremgangsmåten lille mengde materiale. Disse egenskapene gjør ITC en uvurderlig, kraftig og unike verktøy for å studere enzymkinetikk i flere applikasjoner, slik som, for eksempel, drug discovery.

k _katt og K _M av den enzymatiske hydrolyse av urea ved Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Beregning av iboende molar entalpi (AH _int) av reaksjonen utføres. De verdier som således ble oppnådd er i overensstemmelse med tidligere data som er rapportert i litteraturen, noe som viser påliteligheten av metodikk.

Introduction

Kvantitativ måling av biokjemiske reaksjoner gir innsikt i de biologiske prosessene på grunnlag av livet. Kalorimetri tilbyr en etikett-fri metode for å kvantitativt karakterisere nesten enhver kjemisk reaksjon i løsningen. Denne teknikk måler varmen frigitt eller absorbert over tid, og er derfor en universell deteksjonssystem og en meget fordelaktig metode for å kvantifisere mengden av reagerende molekyler (det vil si bindingstermodynamikk), så vel som å måle reaksjonshastigheten (dvs. kinetikk). Spesielt har isoterm titrering kalorimetri (ITC) er vedtatt som metode for valg å karaktertermodynamikken for biomolekylære likevekter, som involverer protein-ligand, protein-protein, protein-metallioner og protein-DNA vekselvirkninger ^1-6. I tillegg gjør evnen til ITC å gi kinetisk informasjon den en meget kraftig system for å måle enzymkatalyse, men potensialet i denne søknaden er fremdelesvurderes ^7-9.

Den Michaelis-Menten ligningen ¹⁰ er en kvantitativ beskrivelse av enzymatiske reaksjoner, da det gir et forhold mellom reaksjonshastighet og substratet konsentrasjon, avhengig av to kinetiske parametre: Michaelis konstant (K _M), og den katalytiske hastighetskonstant (k _katt) . Den k _cat / K _M-forhold er omtalt som den katalytiske effektiviteten av et enzym. I praksis bestemmelse av K _M og k _katt for en bestemt reaksjon gir en fullstendig beskrivelse av katalyse.

I en typisk enzymreaksjon (figur 1), et substrat (S) kommuniserer med enzym (E) som danner det enzym-substrat (ES)-kompleks, som deretter aktiveres i overgangstilstand (ES *). Den sistnevnte omdannes til den enzymprodukt (EP)-kompleks som til slutt spaltes. Disse trinns er beskrevet ved den følgende reaksjon.

(1)

hvor k er _en hastighetskonstanten for dannelsen av ES-komplekset, k _-1 er hastighetskonstanten for dissosiering av ES-komplekset, mens k _katt er det katalytiske hastighetskonstant eller omsetning nummer.

I henhold til Michaelis-Menten ligningen ^10, kan reaksjonshastigheten beregnes som:

(2)

hvori K _M = (k _-1 + k _cat) / k ₁ og k _cat = v _max / [E], med v _max er den maksimale hastighet er nådd når alle enzymet er bundet til underlaget.

Den isotermiske titrering kalorimeteret er instrumentet brukt i denne studie for å karakterisere den enzymatiske hydrolyse av urea. Dette instrumentet består av en adiabatisk skjold som inneholder to innførte formede celler (figur 1). Disse er koblet til utsiden med smale tilgangs rør. Prøvecellens (ca. 1,4 ml) blir lastet med enzym-oppløsningen, mens referansecelle er vanligvis fylt med vann eller med oppløsningsmidlet som brukes for analysen. En roterende sprøyte med en lang nål og en røre paddle festet, vanligvis inneholdende ca. 0,3 ml av substrat-løsning, er montert på prøvecellen. En termoelektrisk enhet måler forskjellen i temperatur mellom prøven og referansecellen og, ved hjelp av en "celle tilbakekoblingsnettverk", opprettholder det denne forskjellen til null ved å legge til eller trekke varme. Under eksperimentet er substratet sprøytet inn i enzymløsning på en konstant valgt temperatur. Når det nozymatic reaksjon finner sted, hvor mye varme som frigis eller absorberes, er proporsjonal med antallet av substrat-molekyler som er omdannet til produkt-molekyler. I tillegg er hastigheten av varmestrømmen er direkte relatert til graden av reaksjonen. De målte data, som vises som et avvik av varme spor fra basislinje (figur 1), representerer den termiske effekt (μcal / sek) som leveres av apparatet til prøvecellen, som er proporsjonalt med varmestrømmen som forekommer i prøven cellen over tid.

Figur 1. Skjematisk fremstilling av isotermisk titrering kalorimeteret for å studere enzymatiske reaksjoner. An enzymatiske reaksjon oppstår ved titrering av substratet (i injeksjonssprøyten) inn i enzym-løsning (i prøvecellen) resulterer i en endring av den thermal kraft frigjøres av kalorimeteret, nødvendig for å holde forskjellen i temperatur mellom prøvecellen og referansecellen konstant. for å vise større bilde.

Totalt sett er den varmeendring (Q) proporsjonal med den molare entalpi av reaksjon (AH) og antall mol produkt ble generert (n), som i sin tur er gitt av det totale volumet ganger konsentrasjonen:

(3)

Produktet dannelse over tid (dP / dt), som svarer til reaksjonshastigheten, kan således være relatert til mengden av varme som genereres i samme tid (dQ / dt) ved forholdet:

(4)

I henhold til denne ligningen, for å oppnå en Michaelis-Menten plotte det er nødvendig å måle i) det totale molare entalpi AH, og ii) den varmestrøm dQ / dt på forskjellige substrat-konsentrasjoner. Vanligvis blir dette utført i to forskjellige eksperimenter: I det første eksperiment (metode 1, M1), blir substratet sprøytet inn i enzym-oppløsningen og varmen for fullstendig substrat omdanning blir målt; i det andre forsøk (metode 2, M2), er flere injeksjoner av substratet utføres, og graden av varmeproduksjonen blir målt ved forskjellige substrat-konsentrasjoner. Disse to sett med data er tilstrekkelig til å avlede de kinetiske parameterne K _M og k _katt.

I denne artikkelen, er en generell protokoll for å bestemme kinetiske parametere for enzymatiske reaksjoner som utføres ved hjelp av ITC beskrevet. Vi brukt metoden til urea hydrolyse av Canavalia ensiformis urease, som et referansesystem. Den god overensstemmelse mellom resultatene oppnådd ved hjelp av denne fremgangsmåte og de data som er rapportert i litteraturen viser påliteligheten til denne fremgangsmåten.

Protocol

En. Forbereder Samples

1. Forbered 2 ml enzymløsning og 0,5 ml av substrat-løsning for hver forsøkskjøring. Fortynn konsentrerte stamløsninger av enzym og substrat i bufferoppløsninger som har lik sammensetning for å redusere varmen av fortynning og blanding under substratet tilsetningen.
   1. Velg bufferbetingelser som er tilstrekkelig til å forhindre pH-endring i løpet av eksperimentet. For eksempel, i 20 mM HEPES pH 7 tilstrekkelig for målinger ved nøytral pH.
      MERK: Ved proton utveksling er involvert, må protonering enthalpies av de brukte buffere vurderes, fordi de påvirker den målte AH av reaksjonen. Mulige spesifikke virkninger av buffer eller tilsetningsstoffer molekyler på systemet under analysen må tas i betraktning. Dersom organiske løsningsmidler (f.eks DMSO) er inkludert i den enzym-løsning, legge dem på nøyaktig samme konsentrasjon i underlaget løsning.
   2. For M1 eksperimentet, begynnermed enzymkonsentrasjonen i nM området (for eksempel 1 nM) og med en substrat-konsentrasjon på minst tre størrelsesordener høyere enn den enzym-konsentrasjon og over K _M.
   3. For M2 eksperimentet, starter med enzymet konsentrasjon i PM-nM område (f.eks 15 PM). Substrat-konsentrasjon i sprøyte er i mM område (f.eks 400 mM).
      Merk: I enkelt injeksjon M1 eksperiment bør konsentrasjonen være tilstrekkelig til å oppnå den totale substrat omdanning til produktet via den eksperimentelle tiden. Derfor er konsentrasjonen av enzymet er avhengig av enzymhastighet: hvis enzymer med lav _k-katten er under undersøkelse, høyere enzymkonsentrasjoner (opptil 10 pm) må benyttes. På den annen side må enzymkonsentrasjonen benyttet i eksperimentet M2 sikre at den injiserte substratet er bare marginalt (mindre enn 5%) som forbrukes og at enzymet Reaksjonen forløper i den stabile tilstanden. Av denne grunn, jo høyereenzymeffektivitet, desto lavere den nødvendige enzymkonsentrasjon. Ved slutten av forsøket, bør substrat-konsentrasjon i prøvecellen være høyere enn K _M.
2. Kontroller nøye enzym og substrat-konsentrasjonene med en passende analytisk prosedyre (f.eks absorbans ved 280 nm, kolorimetriske, BCA-assay ^11. Dette er nødvendig for å oppnå nøyaktig og pålitelig beregning av de termodynamiske og kinetiske parametre.
3. Mål pH i oppløsningene, og verifisere at pH mismatch av både enzymet og substratblandingene løsninger er minimal under forsøksbetingelser (± 0,05 pH-enheter).

2. Utføre Experiment

NB: Den samme prosedyren må anvendes både for M1 og M2 eksperimentet, som utføres etter hverandre.

1. Kontroller at prøvecellen og injeksjonssprøyten er renset i henhold til produsentensinstruksjoner. Fyll laste sprøyten som følger med instrumentet med destillert vann, forsiktig stikk nålen i prøvecellen, fylle cellen og fjerne væsken bruker samme sprøyte. Ved hjelp av denne fremgangsmåte, vaske prøven cellen to ganger med destillert vann og to ganger med buffer.
2. Laste prøven celle med to ml enzym løsning ved hjelp av laste sprøyte, nøye unngå dannelse av luftbobler. Sakte injisere oppløsningen i cellen inntil den strømmer ut av toppen av cellestammen. Produsere en sprute på ca. 0,25 ml av oppløsningen inn i cellen. Gjenta to ganger. Dette trinnet fjerner luftbobler fanges i prøvecellen.
3. Plasser nålen av laste sprøyten på avsatsen mellom cellestammen og cellen port og fjerne eventuell overskytende oppløsning.
4. Start VP-Viewer programmet og, fra maskin-grensesnitt, likevekt ITC instrument til en temperatur 3 ° C under ønsket eksperimentell temperatur. Dette er nødvendig for å unngå lange ekvilibreringperioder før forsøket, på grunn av den passive instrumental kjøleenhet.
5. Fyll referansecelle med destillert vann med den samme prosedyren ovenfor. Når buffere med høy ionestyrke eller høy osmolalitet er i prøveløsningen, bør den samme buffer bli brukt som en referanseløsning.
6. Linje en plastsprøyte til påfyllingsporten av injeksjonssprøyten, med en tynn silikonrøret. Fyll injeksjonssprøyten plassere nålespissen inn i vann og trekke opp, til vannet som kommer ut av den øverste fylleporten, som indikerer at injeksjonssprøyten er full. Deretter flytte sprøytespissen fra vannet og trekke opp luften, for å tømme injeksjonssprøyten. Med denne fremgangsmåten, vaskes injeksjonssprøyte med buffer, og trekke luft gjennom systemet. Deretter plasserer injeksjonsnålen i et smalt rør inneholdende 0,5 ml av substrat-løsning forsiktig trekke opp og helt fyller injeksjonssprøyten, slik at små mengder av oppløsning på bunnen av røret.
7. Framaskin-grensesnitt, trykk "Close påfyllingsporten". Ta av silisium lasteslangen. Trykk "Purge og fyll"-knappen for å la injeksjonssprøyte for å fjerne eventuelle luftbobler og for å utvise dem tilbake i bulk løsningen. Gjenta to ganger.
8. Beveg injeksjonssprøyte, tørker på sidene for å fjerne eventuelle dråper og plassere nålen på injeksjonssprøyte inn i prøvecellen.
9. På datamaskinen, sette de aktuelle driftsparametere. Den eksperimentelle enzym og substrat konsentrasjoner kan være indisert.
   1. I M1 eksperimentet, sett i det minste to tilsetninger (5-30 ul) av substratet for å kontrollere reproduserbarheten. Sett avstanden mellom hver injeksjon (for eksempel 1000 sek) stort nok til å sikre at varme signalet kommer tilbake til grunnlinjen før neste tilsetningen.
   2. I M2 eksperiment, satt flere (f.eks 15 x 5-10 mL) injeksjoner. Sett intervallet mellom injeksjonene (f.eks 180 sek) slik at systemet stabilize den termiske kraften til den nye baseline etter hver injeksjon.
      MERK: Avstands Tiden mellom injeksjon i M2 eksperiment bør være kort nok til å unngå omdanning av en betydelig mengde av underlaget, slik at de målinger som skal utføres under stabile forhold.
   3. I M2 eksperimentet bruke små volumer (f.eks 2-ul) for den første injeksjon, som har tilsvarende verdi blir forkastet i løpet av den etterfølgende dataanalyse. Faktisk viser det ofte artefakter som følge av den første substrat diffusjon gjennom sprøytespissen, og for tilstedeværelse av luftbobler fanget i sprøytespissen.
   4. Sett referansen makt, omtrentlig nivå der baseline vil bli plassert før reaksjonen starter, til en verdi av 20 år. Deretter definerer den eksperimentelle enzym og substrat konsentrasjoner og valgte et navn på eksperimentet.
   5. Definer eksperimentelle temperatur, typisk ved 25 ° C. ITC gjør at arbeidstemperaturer mellom to ° C og 80 ° C. Eksperimentet er klar for drift. Trykk på "Start"-knappen for å starte eksperimentet.
10. Når eksperimentet er ferdig, rengjøre prøvecellen og sprøyten i henhold til produsentens instruksjoner.
11. Gjenta eksperimentet i det minste en eller to ganger til for å kontrollere reproduserbarheten av dataene.

Tre. Data Analysis

1. Fra analyseprogrammet, klikk på "Les data"-knappen, og naviger til mappen der. ITC fil av utført M2 eksperimentet ligger. Klikk på rullegardinpilen på "Files of type" og velg "enzymanalysen (det?)". Deretter klikker du på og åpne. ITC-fil av M2 eksperimentet.
2. Skaff AH av reaksjonen fra integrere kurven av M1 eksperiment i henhold til ligning 5.
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Klikk på "Les data"-knappen, og velg filen. ITC av utført M1 eksperiment. Ved hjelp av Origin, dele spor i forskjellige deler som inneholder en topp hver og lagre hver topp som en. OPJ fil. Åpne filen som tilsvarer den første topp, som resulterer fra utgangsavvik i det termogram av den enkelt injeksjon M1 eksperiment, integrere det og dividere den oppnådde område verdi, uttrykt i μcal, ved den endelige substratkonsentrasjon i prøvecellen, uttrykt i uM, og ved cellevolum uttrykt i liter, og å bestemme, i henhold til ligning 5, vil AH av reaksjonen.
   2. Gjenta fremgangsmåten for den andre topp av M1 eksperiment og oppnå en middelverdi for de to AH målinger.
3. Bestem dQ / dt fra M2 eksperiment som måler differansen mellom den opprinnelige grunnlinjen og den nye utgangs etter hver injeksjon. Konverter experimental data til reaksjonshastigheten i henhold til ligning 4, ved hjelp av entalpi verdien oppnådd i M1 eksperiment og passer dataene til Michaelis-Menten ligningen.
   1. Fra analyseprogrammet, klikk på "Les data"-knappen, og velg filen. ITC av utført M2 eksperiment. Klikk på rullegardinpilen på "Files of type" og velg "enzymanalysen (det?)".
   2. Den enzymanalysen dialogboksen åpnes, slik at du velger en av de fire modellene. Velg "metode 2 - bare Substrate" fra vinduet.
   3. I AH-vinduet, indikerer verdien av AH oppnådd i trinn 4.2.
   4. Klikk på "Konsentrering" for å kontrollere konsentrasjonsverdier som skal brukes i tilpasningsprosedyren. Klikk på "Gjennomsnittlig tid (P)"-knappen. Dialogboksen åpnes gir mulighet til å endre eller godta standardverdien. Denne verdien representerer tiden før hver injection i hvilken instrument gjennomsnitt på-signal til å bestemme effektnivået ved hver substratkonsentrasjon. Klikk OK for å bekrefte standardverdien.
   5. Klikk på "Zero Y-akse"-knappen. Markøren blir til et trådkors som tillater å dobbeltklikke et poeng, for å plassere på y = 0. Dobbeltklikk like før første injeksjonspunktet.
   6. Klikk på Beregn pris knappen. Rate er plottet mot underlaget konsentrasjon, utledet ved å dele underlaget lagt under titreringen for prøvecellevolum (hensyntatt utvanningseffekter). Denne operasjonen gir en typisk Michaelis-Menten tomt som kan monteres for å få K _M og k _katt.
   7. Hvis noen punkter bør slettes, velg "Avkort data"-knappen. Flytt dataindikatorer for å utelate de dårlige datapunkter og dobbeltklikk på en av markører eller trykk enter.
   8. Bruk "Fit for å modellere"-funksjonen til å passe kurven og tilskaffe de kinetiske konstanter.

Representative Results

Urease (EC 3.5.1.5; urea amidohydrolase) er en multisubunit nikkelholdig enzym som finnes i Archea, bakterier, encellede eukaryote og planter. Dette protein fungerer i det siste trinnet av organisk nitrogen minera, katalysering av hydrolyse av urea til ammoniakk og karbamat, som spontant spaltes til å gi et andre molekyl av ammoniakk og bikarbonat (Ligning 6) ^12.

(6)

Denne reaksjon fører til en økning av pH-verdien i miljøet, som er ansvarlig for negative effekter for mennesker og ^jord-13. I planter, er den primære rolle urease å resirkulere næringsstoffer nitrogen fra arginase-avledet urea ^14. Plant ureases er generelt homo-heksamer et ₆ med hver subenhet som inneholder et aktivt sete med to Ni ^{2 +-ioner 15.} Blant dem,Canavalia ensiformis (jack bønne) urease (JBU) har vært den første protein til å bli krystallisert i 1926 ^16. Siden da har flere studier omfattende karakterisert den strukturelle og enzymatisk aktivitet av ureases fra flere kilder ^{13, 17.} Derfor ble ureolytic aktivitet av JBU valgt som en representant for reaksjonen for å demonstrere anvendeligheten av ITC i kvantitativt å bestemme enzymatisk katalyse. En verdi på AH = -10.5 kcal / mol ble målt i et M1 eksperiment (figur 2A) ved å integrere den varmekraft som resulterer ved å injisere urea substratet inn i urease-løsning, og tillate reaksjonen å fortsette til fullførelse. Den termiske effekt som er registrert i en M2 eksperiment (figur 2B) ble omdannet til reaksjonshastigheten ved hjelp av ligning 4 (figur 2C). Snitt av de oppnådde data til Michaelis-Menten ligningen gitt de kinetiske parameterne for JBU in20 mMHEPES pH 7 som k _cat = 30200 sek ^-1 og K _M = 3,45 mM, i samråd med tidligere rapporterte data ^{18, 19.}

Figur 2. Urea hydrolyse av urease bestemt av ITC. JBU (type C3) ble kjøpt som lyofilisert enzym (nominell aktivitet 1538 U / mg) og fortynnet med 20 mM HEPES pH 7 til den endelige konsentrasjon. Konsentrasjonen av enzymet i reaksjonsblandingen ble beregnet ved å sammenligne den beregnede aktivitet av det kjøpte produkt til aktiviteten av det rene enzym, rapporteres å være 6200 U / mg av rent enzym ^20, og en molar masse på 545 kDa, som tilsvarer den homo-heksa protein. (B) Termisk effekt observert i M1 eksperiment, utført ved 25 ° C med 2 x 5 ul injeksjonsjoner av 20 mM urea (i injeksjonssprøyten) i 1 nM JBU (i prøvecellen). En avstand på 750 sec mellom injeksjonene ble anvendt for å tillate referanse vende tilbake til den opprinnelige verdi. Entalpien for reaksjonen er beregnet fra integrering av hver topp-og gjennomsnittet av de to verdiene, i henhold til ligning 5. Denne verdien er rapportert i teksten. (B) Termisk effekt observert i M2 eksperiment, erholdt ved titrering av 400 mM urea (20 x 5 mL injeksjoner) i 15 pM JBU. En avstand på 180 sek ble påført mellom injeksjoner, for å tillate systemet å nå og opprettholde en stabil tilstand nivå. DQ / dt på forskjellige substrat-konsentrasjoner oppnås som forskyvning av grunnlinjen etter hver tilsetning. Varmen fra fortynning er vist som en blindprøve (grå), utføres ved å titrere substrat inn i buffer alene. (C) Referanse forskyvning i figur 2B ble omdannet til reaksjonshastigheten ved hjelpLigning 4. Snitt av de oppnådde data (fylte firkanter) ble utført ved å bruke ligning 2, og er representert som en heltrukket linje. Verdien av K _M og k _katt innhentet fra fit rapporteres i teksten.

Den totale varmeendringer målt i eksperimentet M1 representerer summen av alle hendelser som inntreffer under reaksjonen i henhold til analyse, og er avhengig av det molare entalpi for alle fremgangsmåter som er involvert, herunder eventuelt proton frigjøring eller opptaket fra bufferen. I en generell fremgangsmåte hvor den reagerende system erverver protoner i en bufret løsning, frigjør buffer protoner, produsere tilleggsvarme i reaksjonscellen. Derfor er den målte tilsynelatende AH (AH _app), og omfatter den indre AH av reaksjon (AH _int), samt ionisering entalpi av buffer (AH _ion), og ii) antallet utveksling protoner (n), ifølge ligning 7:

(7)

Ved hjelp av denne ligning, in M1 eksperimenter, kan vi fastslå n og AH _int ved å utføre den samme eksperiment i buffere med forskjellige ionisering enthalpies, og plotte den målte AH _{applikasjonen} som en funksjon av AH _ion spesifikk for bufferen. Fra den resulterende lineære regresjon, n er avledet fra skråningen: en negativ helning reflekterer protoner ervervet av bufferen, mens en positiv helning representerer protoner frigjøres fra buffer; AH _int er avledet fra skjæringspunktet på y-aksen.

Som observert i ligning 6, den samlede urea hydrolyse reaksjonen fører til anskaffelse av et proton H ⁺ fra bufferen. Følgelig, som debeskrevet ovenfor, idet reaksjonsvarmen inkluderer bidrag av buffer deprotonering. For å beregne den iboende AH fra hydrolysereaksjonen, ble tre M1 eksperimenter utført i forskjellige buffere (HEPES, Tris-HCl, fosfat), karakterisert ved tre forskjellige AH _ion. AH _int og antallet proton frigjøres fra buffer, regnet fra skjæringspunkt, og hellingen til den lineære tilpasningen av de eksperimentelle data (figur 3) i henhold til ligning 7, var -14,7 kcal / mol og 0,98 henholdsvis i fullt samsvar med tidligere rapportert for samme reaksjon katalysert av Helicobacter pylori urease ^7. data. Så vidt vi vet, har ingen termodynamiske data rapportert for JBU, så langt.

AH _int av urease reaksjon. Verdier av AH _app i forskjellige buffere (fylte firkanter) ble bestemt ved å utføre M1 eksperimenter i 20 mMHEPES (AH _ion = 4,88 kcal / mol), 20 mM Tris-HCl (AH _ion = 11,34 kcal / mol), og 20 mM fosfat (AH _ion = 0,86 kcal / mol) ^21. Lineær regresjonsanalyse (heltrukket linje) av de data tillatt å bestemme AH _int av reaksjonen, så vel som antallet protoner som utveksles i løpet av urea omsetning.

Discussion

Betydningen av ITC å studere enzymatisk aktivitet med hensyn til eksisterende metoder

I tillegg til sin klassiske programmer for å studere bindende likevekter, gir isoterm titrering kalorimetri en pålitelig og rask metode for å karakterisere enzymatiske reaksjoner i løsning ved hjelp av reaksjonsvarmen som en sonde, uten å kreve system modifikasjon eller merking. Den kinetiske parameterne k _katt og K _M blir vanligvis oppnådd gjennom et sett av tidsforløpet eksperimenter, hvor produktdannelse (eller substrat forbruk) blir overvåket i kontinuerlige eller diskontinuerlige assays. Vanligvis er substratet eller produktkonsentrasjon målt ved lys absorbans eller fluorescens ved karakteristiske bølgelengder. Men de fleste underlag og / eller produkter er ikke spektroskopisk aktive, og derfor en kromofor eller fluorofor må være inkludert for å følge reaksjonen. Alternativt, kombinert analyser, medproduktet av den katalyse å være et substrat for en reaksjon med målbart produkt, kan anvendes. Disse metodene er imidlertid innføre ytterligere variabler som reduserer nøyaktigheten av de fastsatte verdier av K og _M k _katt. I tillegg kan karakterisering av enzym-hemming av små ligander ved hjelp av tradisjonelle metoder bli komplisert ved absorbans eller fluorescens av den lille ligand i seg selv, noe som kan påvirke påliteligheten av spektroskopiske analysen. Alternative metoder involverer sluttet strømningsteknikker, karakterisert ved at mengden av produktet blir kvantifisert ved hjelp av massespektrometri eller kromatografi. Disse teknikkene er meget nøyaktige og pålitelige, men de er tidkrevende og kostbart for rutineanalyse. Sonden følges i ITC-eksperimenter, det vil si den varme som frigjøres eller absorberes, er en iboende egenskap ved nesten alle kjemiske reaksjoner. Derfor ITC ikke krever noen modifikasjon eller merking av systemet under analysen. Dessuten, tsin teknikk er enkel og rask, krever liten mengde materiale, og kan utføres i løsning ^{22, 23.}

Kritiske trinnene i protokollen og mulige endringer

Reaksjons Analysen utføres generelt i to forskjellige forsøk, som gir det totale molare entalpi av reaksjonen og varmeendring over tid ved forskjellige substrat-konsentrasjoner. For å oppnå data av god kvalitet, må forsøket utformes i detalj ved begynnelsen av undersøkelsen. Den protein-og substrat-konsentrasjonene må være nøye bestemt, som deres korrekte verdi er viktig for å beregne pålitelige parametere i dataanalysen. Bufferen sammensetning og pH av både enzymet og substratblandingene løsninger må være identiske, for å minimalisere varmen i å blande under substratet tilsetningen. Dette er vanligvis sikret ved å utføre en dialyse eller en størrelse uteluksjons kromatografitrinn på enzym-oppløsningen før kjøring av forsøket, og ved hjelp av buffer eluert fra kolonnen for å oppløse substratet. Et kontrolleksperiment må utføres med identiske løsninger av underlaget sprøytes inn i reaksjonsbuffer i fravær av enzymet, for å trekke varme fra fortynning eller for å verifisere at det er ubetydelig.

Dataanalyse er generelt utført med Origin-programmet for ITC gitt av produsenten. En alternativ program av valget for dataanalyse kan anvendes, hvis nødvendig.

Feilsøking og begrensninger av teknikken

En god signal-til-støy-forhold oppnås hvis reaksjonen forløper ved en hastighet som gjør det mulig for systemet å produsere nok varme i ITC-celle for å overvinne den instrumentelle deteksjonsgrensen. Dette oppnås vanligvis for systemer med k _katt høyere enn 1 min ^-1. I dette tilfelletOrigin programvare for ITC beregner automatisk Michaelis-Menten plottet fra rådata, og ved hjelp av ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse, den beregner k _katt og K _M verdier. Analysen forutsetter ingen signifikant produkt hemming. Sistnevnte er generelt synlige når påfølgende injeksjoner i M1 eksperimentet produsere topper med forskjellige former og, spesielt, med på-spor av den andre topp tar lengre tid for å gå tilbake til basislinje. Hvis produktet hemming oppstår, en annen programvare av valget, gjennomført med spesialspesifikke ligninger, må brukes.

Gitt den iboende forskjell i hver enzymatisk system, og den annen varme som produseres av forskjellige reaksjoner, som ikke kan kvantifiseres a priori å fastsette de optimale driftsforhold (dvs. enzym-og substrat-konsentrasjoner, antall og volum av injeksjoner, mellomrom tid, etc.) for et bestemt system noen ganger r equire noen utforsk titreringer.

I løpet av analysen, må forsiktighet anvendes til å velge de eksperimentelle forhold i henhold til systemet under analysen. For eksempel hemmer fosfat ureahydrolyse av urease, og derfor utfører eksperimentet i fosfatbuffer reduserer den totale frekvensen av den enzymatiske reaksjon ^{24, 25..}

Søknader

Når kinetikken av enzymatisk reaksjon har blitt bestemt, kan reaksjonen bli gjentatt i nærvær av forskjellige typer og konsentrasjoner av hemmere i prøvecellen, for å måle, ved å bruke den generelle hemning Ligning 8 ^26, kompetitiv (K _ic) og udyktig (K _UIC) inhiberingskonstantene, dermed tillater oss å skille, mellom ulike typer hemming.

iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "width =" 284 "/> (8)

Som konklusjon kan denne metoden anvendes som en rask og økonomisk måte å teste et stort antall enzyminhibitorer for farmasøytiske og industrielle anvendelser, for eksempel i medikament-screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument