Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas

Summary

Medidas de calorimetría de titulación isotérmica flujo de calor liberado o absorbido en las reacciones químicas. Este método se puede utilizar para cuantificar la enzima-catálisis. En este trabajo, el protocolo para la configuración instrumental, experimento en marcha, y el análisis de datos se describe generalmente, y se aplica a la caracterización de la hidrólisis enzimática de la urea por la ureasa jack bean.

Abstract

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien descrito que mide el calor liberado o absorbido durante una reacción química, utilizando como una sonda intrínseca para caracterizar prácticamente todos los procesos químicos. Hoy en día, esta técnica se aplica ampliamente para determinar los parámetros termodinámicos de los equilibrios de unión biomoleculares. Además, el CCI se ha demostrado ser capaz de medir directamente la cinética y los parámetros termodinámicos (k _gato, K _M,? H) de las reacciones enzimáticas, a pesar de que esta aplicación es aún sin explotar. Como los cambios de calor se producen de forma espontánea durante la catálisis enzimática, el CCI no requiere ninguna modificación o etiquetado del sistema bajo análisis y se puede realizar en solución. Por otra parte, el método necesita poca cantidad de material. Estas propiedades hacen que el CCI una herramienta inestimable, poderosa y única para estudiar la cinética de enzimas en varias aplicaciones, tales como, por ejemplo, el descubrimiento de fármacos.

k _gato y K _M de la hidrólisis enzimática de la urea por Canavalia ensiformis (canavalia) ureasa. Se realiza Cálculo de la entalpía molar intrínseca (H _int) de la reacción. Los valores así obtenidos son consistentes con los datos anteriores reportados en la literatura, lo que demuestra la fiabilidad de la metodología.

Introduction

La determinación cuantitativa de las reacciones bioquímicas proporciona información detallada sobre los procesos biológicos en la base de la vida. Calorimetría ofrece una metodología libre de marca para caracterizar cuantitativamente virtualmente cada reacción química en la solución. Esta técnica mide el calor liberado o absorbido con el tiempo, y por lo tanto es un sistema de detección universal y una metodología muy conveniente para cuantificar la cantidad de moléculas que reaccionan (es decir, la termodinámica de unión), así como para medir la velocidad de reacción (es decir, la cinética). En particular, Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) ha sido adoptado como método de elección para caracterizar la termodinámica de los equilibrios biomoleculares, que implica la proteína-ligando, proteína-proteína, proteína de iones metálicos y la proteína-DNA ^1.6. Además, la capacidad de CCI para proporcionar información cinética hace que sea un sistema muy potente para medir la catálisis enzimática, aunque el potencial de esta aplicación es todavíasubestimado ^7-9.

La ecuación de Michaelis-Menten ¹⁰ es una descripción cuantitativa de las reacciones enzimáticas, ya que proporciona una relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato, dependiendo de dos parámetros cinéticos: la constante de Michaelis (K _M) y la constante de velocidad catalítica _(kcat) . El k _cat / K proporción _M se conoce como la eficiencia catalítica de una enzima. En la práctica, la determinación de K _M y k _gato para una reacción específica proporciona una descripción completa de la catálisis.

En una reacción enzimática típica (Figura 1), un sustrato (S) interactúa con la enzima (E) que forma el complejo enzima-sustrato (ES), que se activa posteriormente en el estado de transición (ES *). Este último se convierte en el complejo enzima-producto (EP) que, finalmente, se disocia. Estos pasoss se describen mediante la siguiente reacción.

(1)

donde k ₁ es la constante de velocidad para la formación del complejo ES, k _-1 es la constante de velocidad para la disociación del complejo ES, mientras que k _gato es la constante de velocidad catalítica o número de recambio.

De acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten ^10, la velocidad de la reacción se puede calcular como:

(2)

en la que _M = K (k _-1 + k _gato) / k ₁ y k _cat = V _max / [E], con v _max siendo la velocidad máxima se alcanza cuando toda la enzima se une al sustrato.

El calorímetro de titulación isotérmica es el instrumento utilizado en este estudio para caracterizar la hidrólisis enzimática de la urea. Este instrumento es de un escudo adiabático que contiene dos células en forma de cuño (Figura 1). Estos están conectados al exterior con tubos de acceso estrechos. La celda de muestra (aproximadamente 1,4 ml) se carga con la solución de enzima, mientras que la celda de referencia es generalmente llena con agua o con el disolvente utilizado para el análisis. Una jeringa que gira con una aguja larga y una paleta de agitación adjunta, que normalmente contiene ca. 0,3 ml de solución de sustrato, está montado en la celda de muestra. Un dispositivo termoeléctrico mide la diferencia de temperatura entre la muestra y la celda de referencia y, utilizando una "red de realimentación de células", mantiene esta diferencia a cero por la adición o sustracción de calor. Durante el experimento, el sustrato se inyecta en la solución de enzima a una temperatura elegida constante. Cuando la lineaenzimáticos reacción tiene lugar, la cantidad de calor liberada o absorbida es proporcional al número de moléculas de sustrato que se convierten en moléculas de producto. Además, la tasa de flujo de calor está directamente relacionada con la velocidad de la reacción. Los datos medidos, que aparece como una desviación de la traza de calor de línea de base inicial (Figura 1), representan la potencia térmica (μcal / seg) suministrado por el instrumento para la celda de muestra, que es proporcional al flujo de calor se produce en la celda de muestra con el tiempo.

Figura 1. Representación esquemática de calorímetro de titulación isotérmica para estudiar las reacciones enzimáticas. Una reacción enzimática que ocurre durante la titulación del sustrato (en la jeringa de inyección) en la solución de enzima (en la celda de muestra) resulta en un cambio de la Therpoder mal lanzado por el calorímetro, necesaria para mantener la diferencia de temperatura entre la celda de muestra y la constante de celda de referencia. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

En general, el cambio de calor (Q) es proporcional a la entalpía molar de la reacción (H) y el número de moles de producto generado (N), que a su vez viene dada por los tiempos totales de volumen de la concentración:

(3)

La formación de producto a través del tiempo (dP / dt), que corresponde a la velocidad de reacción, puede por lo tanto estar relacionado con la cantidad de calor generado durante el mismo tiempo (dQ / dt) a través de la relación:

(4)

De acuerdo con esta ecuación, a fin de obtener una de Michaelis-Menten trazar es necesario medir i) el total delta H entalpía molar, y ii) el flujo de calor dQ / dt en diferentes concentraciones de sustrato. Por lo general, esto se realiza en dos experimentos diferentes: en el primer experimento (Método 1, M1), el sustrato se inyecta en la solución de enzima y se mide el calor para la conversión completa del sustrato; en el segundo experimento (Método 2, M2), múltiples inyecciones de sustrato se llevan a cabo y la tasa de producción de calor se mide a diferentes concentraciones de sustrato. Estos dos conjuntos de datos son suficientes para derivar los parámetros cinéticos K _M y K _gato.

En el presente artículo, un protocolo general para determinar los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas realizadas utilizando ITC se describe. Se aplicó el método de hidrólisis de la urea con urea Canavalia ensiformisse, como un sistema de referencia. La buena concordancia entre los resultados obtenidos con este método y los datos reportados en la literatura demuestra la fiabilidad de este enfoque.

Protocol

1. Muestras Preparación

1. Preparar 2 ml de solución de enzima y 0,5 ml de solución de sustrato para cada prueba experimental. Diluir las soluciones madre concentradas de enzima y sustrato en soluciones tampón que tiene composición idéntica a minimizar el calor de dilución y mezcla durante la adición de sustrato.
   1. Elija las condiciones de tampón que sean adecuados para evitar el cambio de pH durante el experimento. Por ejemplo, 20 mM de HEPES pH 7 es adecuado para mediciones a pH neutro.
      NOTA: Si el intercambio de protones está involucrado, entalpías de protonación de los tampones utilizados deben ser considerados, ya que afectan el delta H medido de la reacción. Posibles efectos específicos de la memoria intermedia o aditivos moléculas en el sistema bajo análisis deben tenerse en cuenta. Si disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) se incluyen en la solución de enzima, añadirlos a exactamente la misma concentración en la solución de sustrato.
   2. Para el experimento de M1, comiencecon concentración de la enzima en el rango de nM (por ejemplo, 1 nM) y con una concentración de sustrato al menos tres órdenes de magnitud más alta que la concentración de la enzima y por encima de la K _M.
   3. Para el experimento M2, comience con la concentración de la enzima en la producción de PM-nM (por ejemplo, 15 horas). La concentración de sustrato en la jeringa está en el intervalo mM (por ejemplo 400 mM).
      NOTA: En la inyección única M1 experimento, las concentraciones deben ser adecuados para lograr la conversión total del sustrato en el producto durante el tiempo de experimentación. Por lo tanto, la concentración de la enzima depende de la velocidad de la enzima: si enzimas con baja _kcat están bajo estudio, las concentraciones de enzimas elevadas (hasta 10 m) deben ser utilizados. Por otro lado, las concentraciones de enzima usada en el experimento M2 debe asegurar que el sustrato inyectado es sólo marginalmente (menos de 5%) consumido y que la reacción de la enzima procede en el estado estacionario. Por esta razón, cuanto mayor sea ella eficiencia de la enzima, menor será la concentración de la enzima requerida. Al final del experimento, la concentración de sustrato en la celda de muestra debe ser mayor que K _M.
2. Compruebe cuidadosamente enzima y concentraciones de sustrato con un procedimiento analítico adecuado (por ejemplo, la absorbancia a 280 nm, colorimétricos, ensayos de BCA ^11. Esto es necesario para obtener un cálculo preciso y fiable de los parámetros termodinámicos y cinéticos.
3. Medir el pH de las soluciones y verificar que el desajuste pH tanto de la enzima y las soluciones de sustrato es mínima en las condiciones experimentales (± 0,05 unidades de pH).

2. Realización del experimento

NOTA: El mismo procedimiento debe ser aplicado tanto para el M1 y el experimento M2, que se realizan una después de la otra.

1. Verificar que la celda de muestra y la jeringa de inyección se limpian según el fabricante deinstrucciones. Llene la jeringa de carga proporcionado con el instrumento con agua destilada, insertar suavemente la aguja en la celda de muestra, llenar la célula y eliminar el líquido usando la misma jeringa. Usando este método, se lava la celda de la muestra dos veces con agua destilada y dos veces con el tampón.
2. Cargue la cubeta de muestras con 2 ml de solución enzimática utilizando la jeringa de carga, evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Inyecte lentamente la solución en la célula hasta que se derrama fuera de la parte superior del tallo celular. Producir un chorro de CA. 0,25 ml de solución en la célula. Repita dos veces. Este paso elimina las burbujas de aire atrapadas en la celda de muestra.
3. Coloque la aguja de la jeringa de carga en la repisa entre el vástago de la celda y el puerto celular y retirar cualquier exceso de solución.
4. Inicie el programa VP-Viewer y, desde la interfaz de la computadora, equilibrar el instrumento ITC a una temperatura de 3 ° C por debajo de la temperatura deseada experimental. Esto es necesario para evitar el tiempo de equilibrioperíodos antes del experimento, debido a que el dispositivo de refrigeración pasiva instrumentales.
5. Llenar la celda de referencia con agua destilada con el mismo procedimiento anterior. Cuando tampones con fuerza iónica alta o alta osmolalidad son en la solución de muestra, el mismo tampón se debe utilizar como una solución de referencia.
6. Link a la jeringa de plástico para el puerto de llenado de la jeringa de inyección, usando un tubo de silicio delgada. Llene la jeringa de inyección de colocar la punta de la aguja en agua y elaboración, hasta que el agua salga del puerto de llenado superior, lo que indica que la jeringa se llene. A continuación, mueva la punta de la jeringa de agua y elaborar aire, para vaciar la jeringa de inyección. Con este procedimiento, se lava la jeringa de inyección con tampón, y extraer el aire a través del sistema. Posteriormente, colocar la aguja de inyección en un tubo estrecho que contiene 0,5 ml de solución de sustrato, extraer cuidadosamente y llenar completamente la jeringa de inyección, dejando una pequeña cantidad de solución en la parte inferior del tubo.
7. Desdeinterfaz de la computadora, pulse "Cerrar el orificio de llenado". Retire el tubo de carga de silicio. Pulse el botón "Purgar y volver a llenar" para permitir que la jeringa de inyección para desalojar las burbujas de aire y para expulsarlos de nuevo en la solución a granel. Repita dos veces.
8. Mover la jeringa de inyección, limpie en los lados para eliminar cualquier gota y colocar la aguja de la jeringa de inyección en la celda de muestra.
9. En el equipo, establezca los parámetros de funcionamiento adecuados. La enzima experimental y concentraciones de sustrato se pueden indicar.
   1. En el experimento M1, establecer al menos dos adiciones (5-30 mu l) de sustrato para verificar la reproducibilidad. Ajuste el tiempo de separación entre cada inyección (por ejemplo, 1,000 segundos) lo suficientemente grande para asegurar que la señal vuelve de calor a la línea de base antes de la siguiente adición.
   2. En el experimento M2, ajuste múltiple (por ejemplo, 15 x 10.5 mu l) inyecciones. Establezca el intervalo entre las inyecciones (por ejemplo, 180 segundos) que permiten que el sistema se stabilize la potencia térmica a la nueva línea de base después de cada inyección.
      NOTA: El tiempo de separación entre las inyecciones en el experimento M2 debe ser lo suficientemente corto para evitar la conversión de una cantidad significativa de sustrato, permitiendo que las mediciones que se llevan a cabo bajo condiciones de estado estacionario.
   3. En el experimento M2, utilizar pequeños volúmenes (por ejemplo, 2 l) para la primera inyección, cuyo valor correspondiente se desecha durante el posterior análisis de datos. De hecho, con frecuencia se presenta artefactos debido a la difusión inicial del sustrato a través de la punta de la jeringa, y para la presencia de burbujas de aire atrapadas en la aguja de la jeringa.
   4. Establecer la potencia de referencia, el nivel aproximado en el que se coloca la línea de base antes de la reacción se inicia, en un valor de 20. A continuación, defina la enzima experimental y concentraciones de sustrato y eligió un nombre para el experimento.
   5. Definir la temperatura experimental, por lo general a los 25 ° C. ITC permite temperaturas de trabajo entre 2 ° C y 80 ° C. El experimento está listo para el funcionamiento. Pulse el botón "Inicio" para iniciar el experimento.
10. Una vez que el experimento ha terminado, limpiar la celda de muestra y la jeringa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
11. Repetir el experimento al menos una o dos veces más para comprobar la reproducibilidad de los datos.

3. Análisis de Datos

1. Desde el programa de análisis, haga clic en el botón "Leer datos", y vaya a la carpeta donde se encuentra el archivo de itc. Del experimento realizado M2. Haga clic en la flecha de desplazamiento hacia abajo de los "Archivos de tipo" y seleccione "Ensayo de enzimas (que?)". Posteriormente, haga clic en y abra el archivo itc. Del experimento M2.
2. Obtener el delta H de la reacción de la integración de la curva del experimento M1 de acuerdo con la Ecuación 5.
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   1. Haga clic en el botón "Leer datos", y seleccione el archivo. Itc del experimento M1 realizado. El uso de Origin, dividir la traza en diferentes partes contienen un pico y guardar cada pico como un archivo opj.. Abrir el archivo correspondiente al primer pico, resultante de la desviación de línea de base en el termograma de la inyección única M1 experimento, integrarlo y dividir el valor del área obtenida, expresada en μcal, por la concentración de sustrato final en la celda de muestra, expresado en M, y por el volumen de la celda expresada en litros, determinar, de acuerdo con la Ecuación 5, el delta H de la reacción.
   2. Repita el mismo procedimiento para el segundo pico del experimento M1 y obtener un valor promedio de las dos mediciones? H.
3. Determinar dQ / dt en el experimento M2 medir la diferencia entre la línea de base original y la nueva línea de base después de cada inyección. Convertir el correodatos Xperimental a velocidades de reacción de acuerdo con la ecuación 4, utilizando el valor de entalpía obtenidos en el experimento M1 y ajustar los datos a la ecuación de Michaelis-Menten.
   1. Desde el programa de análisis, haga clic en el botón "Leer datos", y seleccione el archivo. Itc del experimento realizado M2. Haga clic en la flecha de desplazamiento hacia abajo de los "Archivos de tipo" y seleccione "Ensayo de enzimas (que?)".
   2. Se abre el cuadro de diálogo Ensayo de enzimas, lo que permite la selección de uno de los cuatro modelos. Seleccione "Método 2 - único sustrato" de la ventana.
   3. En la ventana? H, indicar el valor de? H obtenido en el paso 4.2.
   4. Haga clic en el botón "Concentración" para comprobar los valores de concentración para ser utilizado en el procedimiento de ajuste. Haga clic en el botón "Tiempo Promedio (P)". El cuadro de diálogo se abre dando la oportunidad de cambiar o aceptar el valor predeterminado. Este valor representa el tiempo antes de cada inyecciónde iones en el que los promedios de instrumentos la señal de potencia para determinar el nivel de potencia en cada concentración de sustrato. Haga clic en Aceptar para confirmar el valor predeterminado.
   5. Haga clic en el botón "Zero Eje". El cursor se convierte en una cruz lo que permite hacer doble clic en un punto, para colocar en y = 0. Haga doble clic justo antes del primer punto de inyección.
   6. Haga clic en el botón Calcular Cambio. Cambio se representó frente a la concentración de sustrato, derivada dividiendo el sustrato añadido durante la titulación para el volumen de celda de muestra (teniendo en cuenta los efectos de dilución). Esta operación da un típico diagrama de Michaelis-Menten que puede ser instalado para obtener K _M y k _gato.
   7. Si se deben eliminar algunos puntos, seleccione el botón "Truncar datos". Mueva los marcadores de datos para excluir a los puntos de datos malos y hacer doble clic sobre uno de los marcadores o pulse Intro.
   8. Utilice la función "Ajustar a modelar" para adaptarse a la curva y paraobtener las constantes cinéticas.

Representative Results

La ureasa (CE 3.5.1.5; amidohidrolasa de urea) es una enzima que contiene níquel de múltiples subunidades que se encuentra en Archea, bacterias, eucariotas y plantas unicelulares. Actos esta proteína en el último paso de la mineralización de nitrógeno orgánico, que catalizan la hidrólisis de urea a amoniaco y carbamato, que se descompone espontáneamente para dar una segunda molécula de amoniaco y bicarbonato (Ecuación 6) ^12.

(6)

Esta reacción provoca un aumento global del pH del entorno, que es responsable de los efectos negativos para la salud humana y la agricultura ^13. En las plantas, la función primordial de la ureasa es reciclar nutrientes de nitrógeno de la arginasa derivados de urea ^14. Ureasas de las plantas son generalmente homo-hexámeros un ₆ con cada subunidad que contiene un sitio activo con dos de Ni ^{2 +} iones ^15. Entre ellos,Canavalia ensiformis (canavalia) ureasa (JBU) ha sido la primera proteína que se cristalizó en 1926 ^16. Desde entonces, varios estudios han caracterizado ampliamente la actividad estructural y enzimática de ureasas de varias fuentes ^{13, 17.} Por lo tanto, la actividad ureolíticas de JBU fue elegida como una reacción representativa para demostrar la aplicabilidad de las TIC en determinar cuantitativamente la catálisis enzimática. Un valor de delta H = -10,5 kcal / mol se midió en un experimento de M1 (Figura 2A) mediante la integración de la potencia térmica resultante mediante la inyección de sustrato de la urea en la solución de ureasa y permitiendo que la reacción continúe hasta la terminación. La potencia térmica registrada en un experimento de M2 (Figura 2B) se convirtió en la velocidad de reacción utilizando la ecuación 4 (Figura 2C). Ajuste de los datos obtenidos a la ecuación de Michaelis-Menten proporcionan los parámetros cinéticos para JBU enHEPES 20 mM pH 7 como k _cat = 30200 ^s-1 y K _M = 3,45 mM, de acuerdo con datos de informes anteriores ^{18, 19.}

Figura 2. Hidrólisis de la urea por la ureasa determinado por el CCI. JBU (tipo C3) se adquirió como enzima liofilizada (actividad nominal de 1.538 U / mg) y se diluyó con 20 mM de HEPES de pH 7 a la concentración final. La concentración de la enzima en la mezcla de reacción se calculó mediante la comparación de la actividad determinada del producto comprado a la actividad de la enzima pura, informó de que 6.200 U / mg de enzima pura ^20, y una masa molar de 545 kDa, correspondiente a la proteína-homo hexameric. (A) de potencia térmica observada en el experimento M1, realizado a 25 ° C con 2 x 5 l de inyecciónciones de urea 20 mM (en la jeringa de inyección) en 1 nM JBU (en la celda de muestra). Una separación de 750 seg entre las inyecciones se aplicó para permitir que la línea de base de volver al valor inicial. La entalpía de la reacción se calcula a partir de la integración de cada pico y el promedio de los dos valores, de acuerdo con la Ecuación 5. El valor se informó en el texto. (B) Potencia térmica observada en el experimento M2, obtenido mediante titulación de urea 400 mM (20 x 5 inyecciones mu l) en 15 pM JBU. Una separación de 180 seg se aplicó entre las inyecciones, con el fin de permitir que el sistema para alcanzar y mantener el nivel de estado estacionario. DQ / dt en diferentes concentraciones de sustrato se obtiene como el desplazamiento de la línea de base después de cada adición. El calor de dilución se muestra como un ensayo en blanco (gris), realizado por valoración de sustrato en el tampón solo. (C) El desplazamiento de la línea de base en la Figura 2B se convirtió en la velocidad de reacción utilizandoEcuación 4. Ajuste de los datos obtenidos (cuadrados rellenos) se realizó utilizando la ecuación 2, y se representa como una línea sólida. El valor de K _M y K _gato obtenido a partir del ajuste se indican en el texto.

El cambio de calor total medido en el experimento M1 representa la suma de todos los eventos que se producen durante la reacción bajo análisis, y depende de la entalpía molar de todos los procesos implicados, incluyendo, en su caso, la liberación de protones o la captación de la memoria intermedia. En un proceso genérico en el que el sistema de reacción adquiere protones en una solución tamponada, la memoria intermedia libera protones, la producción de calor adicional dentro de la célula de reacción. Por lo tanto, la delta H medido es aparente _(APP? H), e incluye el delta H intrínseca de la reacción (H _int), así como la entalpía de ionización de la memoria intermedia _(iones? H), y ii) el número de exchanging protones (n), según la ecuación 7:

(7)

Usando esta ecuación, en experimentos M1, podemos determinar N y delta H _int realizando el mismo experimento en tampones con diferentes entalpías de ionización, y el trazado de la _aplicación delta H medida como una función de? H _{de iones} específico para el tampón. A partir de la regresión lineal resultante, n se deriva de la pendiente: pendiente negativa refleja protones adquiridos por la memoria intermedia, mientras que una pendiente positiva representa protones liberados de la memoria intermedia; delta H _int se deriva de la intersección en el eje y.

Como se observa en la Ecuación 6, los resultados globales de reacción de hidrólisis de la urea en la adquisición de un protón H ⁺ de la memoria intermedia. Por consiguiente, como dedescrito más arriba, el calor de reacción incluye la contribución de desprotonación tampón. Con el fin de calcular el delta H intrínseca de la reacción de hidrólisis, tres experimentos M1 se realizaron en diferentes tampones (HEPES, Tris HCl, fosfato), caracterizado por tres _iones delta H diferente. Delta H _Int y el número de protones liberados de la memoria intermedia, calculan a partir de la origen y la pendiente del ajuste lineal de los datos experimentales (Figura 3) de acuerdo con la Ecuación 7, eran -14,7 kcal / mol y 0,98, respectivamente, en completo acuerdo con los datos presentados anteriormente para la misma reacción catalizada por la ureasa de Helicobacter pylori ^7. Hasta donde sabemos, no hay datos termodinámicos se han reportado para JBU, hasta ahora.

delta H _int de reacción de la ureasa. Los valores de delta H _aplicación en diferentes tampones (cuadrados rellenos) se determinaron mediante la realización de los experimentos M1 en HEPES 20 mM (H _ión = 4,88 kcal / mol), mM de Tris HCl 20 (H _ión = 11,34 kcal / mol), y fosfato 20 mM (H _ión = 0,86 kcal / mol) ^21. Análisis de regresión lineal (línea continua) de los datos permitió determinar delta H _int de la reacción, así como el número de protones intercambiados durante el recambio de urea.

Discussion

Importancia de las TIC para estudiar la actividad enzimática con respecto a los métodos existentes

Además de sus aplicaciones clásicas para estudiar los equilibrios de unión, calorimetría de titulación isotérmica proporciona un método fiable y rápido para caracterizar reacciones enzimáticas en solución utilizando el calor de reacción como una sonda, sin requerir la modificación del sistema o etiquetado. Los parámetros cinéticos k _gato y K _M se obtienen generalmente a través de un conjunto de experimentos de tiempo, en el que la formación de producto (o consumo de sustrato) se supervisa en ensayos continuos o discontinuos. Típicamente, la concentración de sustrato o producto se mide por absorbancia de luz o fluorescencia a longitudes de onda características. Sin embargo, la mayoría de los sustratos y / o productos no son espectroscópicamente activo, y por lo tanto un cromóforo o fluoróforo deben ser incluidos para seguir la reacción. Alternativamente, los ensayos acoplada, conel producto de la catálisis ser un sustrato para la otra reacción con el producto medible, se podría emplear. Estos métodos, sin embargo, introducen variables adicionales que reducen la exactitud de los valores determinados de K _M y K _gato. Además, la caracterización de la inhibición de la enzima por pequeños ligandos utilizando métodos tradicionales podría ser complicado por la absorbancia o fluorescencia de la pequeña sí mismo ligando, que puede alterar la fiabilidad del ensayo espectroscópico. Los métodos alternativos incluyen técnicas de flujo detenido, en el que se cuantifica la cantidad de producto que utiliza la espectrometría de masas o cromatografía. Estas técnicas son muy precisos y fiables, pero son mucho tiempo y dinero para los análisis de rutina. La sonda siguió en los experimentos de ITC, que es el calor liberado o absorbido, es una propiedad intrínseca de casi todas las reacciones químicas. Por lo tanto, el CCI no requiere ninguna modificación o etiquetado del sistema bajo análisis. Por otra parte, Tsu técnica es sencillo y rápido, requiere pequeña cantidad de material y se puede realizar en solución ^{22, 23.}

Los pasos críticos dentro de las modificaciones al protocolo y las posibles

El análisis de la reacción se realiza generalmente en dos experimentos diferentes, que proporcionan la entalpía molar total de la reacción y el cambio de calor con el tiempo a diferentes concentraciones de sustrato. Con el fin de obtener datos de buena calidad, el experimento debe planificarse en detalle en el comienzo de la investigación. La proteína y concentraciones de sustrato se deben determinar con cuidado, ya que su valor correcto es esencial para el cálculo de parámetros confiables en el análisis de datos. La composición del tampón y el pH de tanto la enzima y las soluciones de sustrato deben ser idénticos, con el fin de minimizar el calor de mezcla durante la adición de sustrato. Este fin, generalmente mediante la realización de una diálisis o una exclusión de tamañoSion etapa de cromatografía en la solución de enzima antes de ejecutar el experimento, y utilizando el tampón de elución de la columna para disolver el sustrato. Un experimento de control se debe realizar con soluciones idénticas de sustrato inyectados en el tampón de reacción en ausencia de la enzima, con el fin de restar el calor de dilución o para verificar que es insignificante.

El análisis de datos se realiza generalmente con el programa de origen para el CCI proporcionado por el fabricante. Un programa alternativo de elección para el análisis de datos se puede emplear, si es necesario.

Solución de problemas y limitaciones de la técnica

Se obtiene una buena relación señal-ruido sólo si la reacción procede a una velocidad que permite que el sistema produce suficiente calor en la celda de ITC para superar el límite de detección instrumental. Esto se logra por lo general para los sistemas con _kcat superior a 1 min ^-1. En este caso,el software de Origen para ITC calcula automáticamente la trama de Michaelis-Menten de datos en bruto, y el uso de análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal, calcula los valores k K _{M gato} y. Este análisis asume ninguna inhibición significativa del producto. Este último es generalmente visible cuando las inyecciones posteriores en el experimento M1 producen picos con diferentes formas y, en particular, con la traza de potencia del segundo pico tomando más tiempo para volver a la línea de base inicial. Si se produce la inhibición del producto, otro software de su elección, implementado con ecuaciones de propósito específico, debe ser utilizado.

Dada la diferencia intrínseca de cada sistema enzimático, y el diferente calor producido por diferentes reacciones, que no se pueden cuantificar a priori, la determinación de las condiciones de funcionamiento óptimas (es decir, la enzima y concentraciones de sustrato, número y volumen de las inyecciones, el espaciamiento de tiempo, etc) para los un sistema específico a veces r Requerir algunas titulaciones exploratorios.

Durante el análisis, la atención debe ser utilizada para elegir las condiciones experimentales de acuerdo con el sistema bajo análisis. Por ejemplo, fosfato inhibe la hidrólisis de la urea por la ureasa, y por lo tanto, realizar el experimento en tampón de fosfato disminuye la velocidad total de la reacción enzimática ^{24, 25.}

Aplicaciones

Una vez que la cinética de la reacción enzimática se ha determinado, la reacción se puede repetir en la presencia de diferentes tipos y concentraciones de inhibidores de la enzima en la célula de muestra, con el fin de medir, usando la ecuación general de inhibición 8 ^26, competitiva (K _IC) y no competitivas (K _UIC) constantes de inhibición, lo que nos permite distinguir entre diferentes tipos de inhibición.

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En conclusión, este método se puede utilizar como una forma rápida y económica para probar un gran número de inhibidores de la enzima para aplicaciones farmacéuticas e industriales, tales como en la detección de drogas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument