Summary
ووصف الأسلوب مع مرافقة البصرية لإجراء قابلة لل، التحديدات إنتاجية عالية من اندماجي المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج ضد المئات من مولدات المضادات في وقت واحد. باستخدام هذا النهج الموازي، ونحن قد عزل شظايا الأجسام المضادة التي تظهر تقارب عالية وخصوصية لمستضدات المتنوعة التي وظيفية في المناعية القياسية.
Abstract
الطلب على الأجسام المضادة التي تلبي احتياجات كل من تطبيقات البحوث الأساسية والسريرية عالية، وسوف تزيد بشكل كبير في المستقبل. ومع ذلك، فمن الواضح أن التقنيات التقليدية ليست وحيدة النسيلة وحدها تصل إلى هذه المهمة. وقد أدى ذلك إلى تطوير أساليب بديلة لتلبية الطلب على جودة عالية والكواشف تقارب المتجددة لجميع العناصر يمكن الوصول إليها من بروتيوم. ولتحقيق هذه الغاية، وقد وضعت أساليب إنتاجية عالية لإجراء مختارات من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج للتطبيقات التي تنطوي على مستضدات متنوعة والأمثل لإنتاجية السريع والنجاح. هنا، يتم وصف بروتوكول في التفاصيل التي توضح مع مظاهرة الفيديو اختيار موازية من الحيوانات المستنسخة فاب-فج من المكتبات التنوع عالية ضد مئات الأهداف باستخدام معالج السائل اليدوي 96 قناة أو النظام الآلي الروبوتات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن لمستخدم واحد تولد المئات من مولدات المضادات،تحديد الأجسام المضادة لهم بالتوازي والتحقق من صحة الأجسام المضادة ملزمة في غضون 6-8 أسابيع. يسلط عليها الضوء هي: ط) شكل مستضد قابلة للحياة، والثاني) توصيف مستضد الاختيار، الثالث) الخطوات الحاسمة التي تؤثر في اختيار من الحيوانات المستنسخة محددة وعالية تقارب، والرابع) سبل فعالية اختيار رصد ومرحلة مبكرة الأجسام المضادة استنساخ التوصيف. مع هذا النهج، لقد حصلنا على شظايا الأجسام المضادة الاصطناعية (فابز) إلى العديد من الفئات المستهدفة بما في ذلك مستقبلات غشاء مسار واحد، الهرمونات تفرز بروتين، والبروتينات داخل الخلايا متعددة المجالات. يتم تحويل هذه الشظايا بسهولة إلى الأجسام المضادة كامل طول وتم التحقق من صحة لعرض تقارب عالية وخصوصية. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت لتكون وظيفية في مجموعة متنوعة من المناعية القياسية بما في ذلك غرب النشاف، ELISA، المناعي الخلوي، مناعي وفحوصات ذات الصلة. وهذه المنهجية تسريع اكتشاف الأجسام المضادة، وفي نهاية المطاف يقربنا من تحقيق هدف سو توليد الطاقة المتجددة، والأجسام المضادة ذات جودة عالية للبروتيوم.
Introduction
مع بداية عصر ما بعد الجينوم، وتوافر الكواشف ملزمة عالية الجودة لتوصيف وتعدل البروتينات ضروري لفتح البحوث الجديدة والسبل العلاجية. تستمر الأجسام المضادة لتكون حاسمة لكلا الباحثين الأكاديميين والصناعية، والبحوث الأساسية وأدوات التشخيص والعلاجات المحتملة. ليس من المستغرب، فقد كان هناك نمو هائل من شركات تطوير الأجسام المضادة العقد، ومعظمها تعتمد على التقنيات التقليدية هجين لتوليد الأجسام المضادة مخصصة. ومع ذلك، في المختبر التحديد باستخدام مكتبات الضد-عرض فج أصبحت تكنولوجيا بديلة قوية يمكن أن توفر مزايا فريدة والنجاح حيث التقنيات التقليدية يمكن أن تواجه القيود 1 و 2.
في ضوء طلب كبير على الأجسام المضادة ذات جودة عالية كما أدوات البحث، وهما التحديات الرئيسية لتوليد الأجسام المضادة المتجددة هي 1) الإنتاجية الاختيار و2) مركبات مستضدailability. ووصف عدد من الجماعات الآن في خطوط الأنابيب اختيار المختبر تهدف إلى زيادة الإنتاجية ومعدل تحديد الأجسام المضادة. هذه الأوصاف بالتفصيل مجموعة متنوعة من النهج قابلة للحياة أن تشمل اختيار إما على كامل طول تستهدف 3،4، أو هيكليا المجالات 5،6،7 ذات الصلة، سواء باستخدام 6،8 أو 3،4 مخططات مستضد تجميد لوحة المستندة على أساس حبة. وبالإضافة إلى ذلك، حققت تزايد اعتماد تقنيات التوليف الجيني 9 جيل مستضد المنهجي، ولا سيما من المجالات معزولة، معقول فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن يحتمل التخفيف من صعوبة في الحصول على كميات كافية من النقى كامل طول مستضد. باستخدام تقنيات اثنين جنبا إلى جنب، ولقد ابتكر خط أنابيب مكتفية ذاتيا وتوليد المستضدات تحجيم واختيار الأجسام المضادة التي من شأنها تمكين العزلة موازية من الأجسام المضادة لمجموعات كبيرة من المجالات المستضد أعرب وتسهيل تطوير الكاشف لتشاracterizing فئات كاملة من البروتينات المرتبطة هيكليا أو وظيفيا.
من أجل تحقيق هذا الهدف، وهو خط أنابيب المتكاملة التي تم تطويرها من الأزواج في تحديد سيليكون والمجالات مستضد التعبير عنه، والتوليف الجيني والتعبير البكتيرية عالية الإنتاجية من المستضدات وعرض فج التحديدات الأجسام المضادة قابلة للتطوير. هذا الخط يتطلب البنية التحتية الأساسية الوحيدة المتاحة لمعظم مختبرات علوم الحياة (بما في ذلك المكتبات الأجسام المضادة التي تكون متاحة على نحو متزايد من خلال ترخيص أو اتفاق نقل المواد)، ولكن هو أيضا قابلة للالتشغيل الآلي للاستخدام على نطاق صناعي. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لتوليد مئات من المجالات مستضد الموسومة تقارب، وعزل روتيني شظايا الأجسام المضادة محددة للغاية لكثير من هذه المستضدات.
وقد أظهرت تكنولوجيا العرض فج التوافق تظاهر مع مجموعة واسعة من صيغ المؤتلف تقارب كاشف بما في ذلك القوات المسلحة البوروندية، scFv، والمجالات اناث مستقلة ومجموعة متزايدة من "الأطر البديلة" صغيرة (المصممة ankyrin تكرار البروتينات (DARPINS)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وأكثر المجالات lipocalin 10). وتقتصر المناقشة في هذا المثال إلى عزل فاب شظايا الأجسام المضادة، على الرغم من أنه يفترض هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع أنواع أخرى من المكتبات. باستخدام هذه التكنولوجيا، فابز مع انخفاض nanomolar تقارب للمشاريع الصغيرة، الموسومة المجالات بما في ذلك المجالات بروتين عامل النسخ، المجالات SH2، وقد تم اختيار البروتينات وغيرها ملزم RNA بنجاح، وكثير منها ربط بروتين كامل طول ووظيفية في المناعية مثل المناعي ، مناعي والمناعية. الأهم من ذلك، استنساخ ملزمة المؤتلف قابلة للتجديد بالكامل ويمكن إعادة لدت-من التعبير يبني عبر البكتيرية طرح زيادة إنتاج الاتساق، استنساخ والفعالية من حيث التكلفة، وبالتالي تبرير حساب دقيق التحقق من صحة استنساخ.
في هذا البروتوكول الاضافيocol والفيديو المصاحب، وأثبتت الأساليب الأساسية لاختيار الأجسام المضادة من المكتبات عرض فج باستخدام المجالات مستضد يجمد. هذه طريقة معينة توظف المجالات البروتين الموسومة GST ثبتوا عن طريق الامتزاز السلبي في لوحات microwell، على الرغم من علامات أخرى 11،12،13 وصيغ اختيار 13،14،2 كما تم استخدامها بنجاح. الاعتبارات الهامة لإعداد وإجراء التحديدات مع مراقبة مواز من المعلمات اختيار تهدف إلى تحديد وعزل أجسام مضادة نسيلي المخصب خصيصا من أجل التحقق مفصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. مستضد الجيل
ملاحظة: المجالات مستضد يمكن توليفها واستنساخ من قبل مجموعة متنوعة من الباعة التجارية إلى-IPTG محرض التعبير بناء المناسب.
- تحويل بنيات التعبير إلى المختص كيميائيا، T1-فج مقاومة، BL21 E. خلايا القولونية عن طريق خلط 10 نانوغرام من ترميز الحمض النووي في 20 ميكرولتر من 1X KCM على الجليد في 96 لوحة PCR جيدا تليها إضافة 20 L الخلايا المختصة كيميائيا.
- احتضان الخليط خلية / الحمض النووي على الجليد لمدة 20 دقيقة، في RT لمدة 10 دقيقة ثم على الجليد مرة أخرى لمدة 2 دقيقة قبل إنقاذ مع 100 ميكرولتر من قبل تحسنت مرق السوبر الأمثل مع الجلوكوز (SOC) وسائل الاعلام، وتغطي مع لوحة ختم تنفس وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
- لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا تحولت إلى لوريا، BERTANI (LB) / لوحات أجار تستكمل مع كربنيسيلين (100 غرام / مل)، وتنمو O / N للحصول على المستعمرات واحدة تستخدم لتوليد الأسهم الجلسرين.
- تطعيم 1 مل من 2YT وسائل الإعلام / الكربوهيدرات مع 5 ميكرولتر الأسهم الجلسرين وتنمو لمدة 12 ساعة على 37 درجة مئوية في كتلة 96 بئر عميق جيدا مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
- تطعيم NZY media15 (تستكمل مع الجلوكوز 0.05٪، 2٪ اللاكتوز، و 100 غرام / مل كربنيسيلين) مع 1:40 التخفيف من هذه الثقافة، ثم يهز لمدة 6-8 ساعة عند 30 ° C و 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم المدار شاكر.
- البكتيريا بيليه وتنقية البروتينات المستضدية في الإنتاجية العالية في لوحة مرشح 96-جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من الراتنج ني NTA حسب protocols16،17 المنشورة سابقا.
- تحديد تركيز البروتينات تنقيته بواسطة برادفورد ملزم صبغ assay18 وتوصيف لحجم ونقاء من قبل الانفصال والتصور من 10-50 ميكروغرام مع Coomassie وصمة عار على جل SDS-الصفحة (انظر الشكل 2).
ملاحظة: في هذه المرحلة البروتينات يمكن وصفها بمزيد من الأساليب التي تقيم البروتين تجميع 19 20 تبعا لطبيعة مستضد ومتطلبات خط أنابيب الاختيار.
2. إعداد والمعايرة للمكتبة فاجي
- اختيار مستعمرة واحدة من مقاومة للفج T1 E. القولونية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين.
- وبمجرد إنشاء نمو الخلايا بصريا، وتمييع الثقافة في حجم أكبر من 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين لضمان وجود كمية كافية من الخلايا للعدوى (عادة 45 ميكرولتر في مكتبة التخفيف، انظر أدناه).
- إعداد مكتبة للاستخدام من قبل عجل فج من عازلة تخزين مع 1/5 من حجم تعقيمها 20٪ PEG-8000، و 2.5 M كلوريد الصوديوم (PEG-كلوريد الصوديوم) تفرخ على الجليد لمدة 30 دقيقة والتكوير عجل فج بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 ز س.
- تجاهل طاف و resuspend عجل فج في حجم مناسب من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، 0.2٪ BSA و 0.05٪ توين (PBT)، وتعديل رس تركيز فج المناسب لتحديدات (إذا لزم الأمر) لضمان تغطية مكتبة كافية. راجع الخطوة 2.9 ومناقشة.
- تمييع لفج قسامة 5 ميكرولتر في 45 ميكرولتر من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في العقيمة لوحة متعددة جيدا، مزيج، وإنشاء سلسلة من التخفيفات 10 أضعاف في المخزن نفسه.
- إضافة 5 ميكرولتر من كل فج التخفيف إلى 45 ميكرولتر من T1 مقاومة للفج E. القولونية الخلايا في النمو المرحلة السجل (OD 600 = 0.4-0.8) في لوحة multiwell آخر، وتغطي مع ختم تنفس واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
- لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة من كل من الآبار إلى لوحة آغار قبل تحسنت تستكمل مع 100 غرام / مل كربنيسيلين وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية حتى المستعمرات مرئية.
- حساب مجموع فج / مل على النحو التالي:
فج / مل = عدد المستعمرات على لوحة كربنيسيلين في معظم تمييع عينة × 200 × 10 ط (حيث ط = الحد الأقصى الأسطواناتنوفمبر من التخفيفات في المستعمرات التي هي واضحة). - لتحديد عدد الآبار مستضد المغلفة لضمان تغطية التنوع مكتبة، وحساب على النحو التالي:
عدد الآبار مستضد المغلفة المطلوب =
تغطية أضعاف المطلوب * التنوع مكتبة
# من فج لكل 100 ميكرولتر
3. اختيار الأجسام المضادة من المكتبات-عرض فاجي
3.1) مستضد الشلل
- لتجنب تجميد أذاب دورات التي يمكن أن تؤثر على نوعية المستضد وتسهيل التخفيفات، وإعداد البروتين لوحة الأسهم مستضد تطبيع إلى 100X تركيزات العمل (على سبيل المثال، 500 غ مل /) وقسامة في لغير ملزم لوحات 96-جيدا.
- إعداد لوحات المغلفة مستضد من حلول البروتين الاسهم يوم واحد قبل كل جولة من الاختيارات عن طريق تمييع لوحات من الأسهم مع برنامج تلفزيوني.
- معطف 96-جيدا عالية لوحات البوليسترين ملزم بروتين مع 100 ميكرولتر من بروتين المستضد GST الموسومة أو سلبي السيطرة عrotein (GST، BSA، neutravidin، الخ) في 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. يهز في 250 دورة في الدقيقة 4 ° CO / N على شاكر صفيحة ميكروسكوبية.
- إزالة حل البروتين من microplates المغلفة، منع لوحات المغلفة مستضد واختيار السلبية مع 200 ميكرولتر العازلة حظر (0.2٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X درجة الحموضة 7.4) ويهز في 250 دورة في الدقيقة في RT لمدة 1-2 ساعة.
- بعد حظر، تغسل الصحون المغلفة البروتين منع اربع مرات مع 200 ميكرولتر من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 0.05٪ توين (PT) العازلة إما يدويا أو باستخدام غسالة صفيحة ميكروسكوبية الآلي.
3.2) مكتبة ما قبل التخليص ومستضد فج الحضانة
- المستنفدة لمكتبة عدم (أو طلال أبوغزاله)، عرض فج الضد جزء استنساخ ملزمة محددة عن طريق نقل 100 ميكرولتر (10 12 فج) من مكتبة فج مستعدة في المخزن PBT لعدد من الآبار المغلفة مع البروتين السيطرة سلبي أو خالية العلامة تقارب البروتين (على سبيل المثال، GST) أي ما يعادل عدد الأهداف واحتضان فجفي الآبار لمدة 1-2 ساعة على RT مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: باسم بديل أو وسائل إضافية لاختيار السلبية، الحضانة ويمكن أيضا أن يؤديها في وجود فائض (5-25 ميكرومتر) البروتين القابلة للذوبان العلامة تقارب (على سبيل المثال، GST) لمواصلة إزالة ملزم العلامة الحيوانات المستنسخة وتعزيز الانتعاش من هدف محدد استنساخ ملزمة. - نقل فج طاف من اختيار السلبية لوحات المغلفة مستضد واحتضان لمدة 1-2 ساعة على RT مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لالتقاط من الحيوانات المستنسخة ملزمة محددة.
- إزالة فج غير منضم وغسل الآبار للصفيحة ميكروسكوبية 8-15 مرات مع العازلة PT إما يدويا أو باستخدام غسالة صفيحة ميكروسكوبية. إزالة الزائد غسل العازلة فقط قبل شطف.
3.3) شطف، العدوى وفاجي التضخيم
- في وقت مبكر يوم التحديدات، واختيار مستعمرة واحدة من مقاومة للفج T1 E. القولونية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين وينمو بمعدل 37 ° C وايعشر اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في شاكر المداري 2.5 سم أو ما يعادلها.
- وبمجرد إنشاء نمو الخلايا ويمكن أن ينظر إليه من قبل العين، وزيادة حجم وسائل الاعلام مع 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين لضمان وجود كمية كافية من الخلايا للعدوى (عادة 100 ميكرولتر في اختيار جيد).
- تنمو الخلايا حتى لOD يتم التوصل إلى 600 من 0.4-0.8 (حوالي 5-7 ساعة)، ثم إلى أزل فج المربوطة إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا إلى لوحة مستضد غسلها ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة M13K07 المساعد فج إلى تركيز النهائي من 1 × 10 10 وت م / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
- نقل الخلايا إلى 1.2 مل من 2YT تستكمل مع 150 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و 75 ميكروغرام / مل الكاناميسين في 96-جيدا كتلة بئر عميق مع V-القاع وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
3.4) إعداد فج وجولات متكررة من SELECنشوئها
- البكتيريا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- خلط كميات متساوية من supernatants فج من لوحات تكرار في أنبوب صغير 96-جيدا العقيمة صفيحة ميكروسكوبية الصندوق الأزرق، تحييد مع حجم عشر 1/10 من 10X PBT والمزيج. جولات كرر اختيار (بدءا من الخطوة 3.1.1) لمدة 3-4 جولات أو حتى لوحظ تخصيب (انظر الأقسام 4. و7.) مقارنة مع البروتين السيطرة سلبي.
ملاحظة: في الجولات الأولى من الاختيار عندما لا يتوقع الكبير / تخصيب اكتشاف (أي الجولات 1 و 2)، وتحديد حجم المدخلات والمخرجات فج عيارات (الموصوفة في القسم 7 و نتائج ممثل هو موضح في الشكل 3) قد تكون مفيدة في ضمان تركيزات الدنيا فج لتحديدات ناجحة (الموصوفة في مناقشة) وأكثر ملاءمة من ELISAs المجمعة.
4. توصيف من قبل مجمع ELISA
- معطف 96-كذلك نسبة عالية من البروتين مأزقلوحات البوليسترين جي مع 100 ميكرولتر من GST الموسومة بروتين المستضد أو البروتين السيطرة السلبية (GST، BSA، neutravidin الخ) في 2 ميكروغرام / مل حسب القسم 3.1 ويهز في 4 درجات CO / N.
- إزالة المستضد الزائد، ومنع لوحة مع 200 ميكرولتر من عرقلة العازلة مع اهتزاز لمدة 1-2 ساعة على RT في 250 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية وغسل أربع مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT إما باليد أو بواسطة الآلية لوحة غسالة.
- تطبيق 100 ميكرولتر من طاف فج (المخفف 1: 10-1: 20 في المخزن PBT)، ويهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في RT، وغسل لوحة ثماني مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT.
- إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة M13-HRP (1: 5،000 في المخزن PBT). يهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT، ثم يغسل لوحة ست مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT ومرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- تطبيق 100 ميكرولتر من 1: 1 TMB الركيزة وتطوير ل5-15 دقائق (أو حتى وضعت اللون كبير)، ثم وقف رد فعل من جانب إضافة 100 ميكرولتر من 1 MH 3 4 وقراءة لوحة في 450 نانومتر.
- بشكل عام، والإثراء في برك فج يمكن ملاحظة في جولات 3-4 كنسبة من محددة ملزمة مقابل غير محددة وملزمة لل> 2 (انظر الشكل 4)
ملاحظة: من المفيد الإشارة إلى إشارة ملزمة المطلقة التي عالية على البروتين العلامة تقارب يشير إلى إثراء المجلدات العلامة محددة (بدلا من المجلدات الهدف)، وهذا إشارة ملزمة المطلقة عالية على البروتين السيطرة سلبي يشير إثراء غير محددة أو " "اللاصقة لزجة.
5. استنساخ التحديد، التسلسل وتوصيف
5.1) عزل واحدة النسخ فاب-فج
- لعزل الحيوانات المستنسخة الفردية لتسلسل وتوصيف، تصيب حجم عشر 1/10 تجمع فج تضخيمها في لT1 مقاومة للفج E. القولونية الخلايا في مرحلة النمو سجل (OD 600 = 0.4-0.8) في الدور السفلي لوحة microtiter، وتغطي مع breathaبلي ختم لوحة واحتضان مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- إعداد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل في وسائل الإعلام و2YT لوحة بها على لوحات أجار منفصلة تستكمل مع 100 غرام / مل كربنيسيلين.
- اختيار المستعمرات واحد في 450 ميكرولتر من وسائل الإعلام 2YT / الكربوهيدرات تستكمل مع 1 × 10 9 M13K07 فج / مل وتنمو O / N في مصغرة أنبوب 96 معقمة جيدا صفيحة ميكروسكوبية المربع الأزرق احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
- البكتيريا بيليه من خلال الدوران في 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نسيلي فج طاف يمكن استخدامها لالتسلسل من الحيوانات المستنسخة فاب-فج (كما هو موضح في القسم 5.4) أو نسيلي ELISAs لتحديد خصوصية ضد المستضدات يجمد (كما هو موضح في القسمين 5.3 و 21) التي تظهر نتائج ممثلة في الشكل ملزمة المباشر 5.
5.2) التعبير من الحيوانات المستنسخة فاب لتوصيف
- بعد استنساخ في لبريد المناسبناقلات xpression (انظر مناقشة)، واختيار واحد E. القولونية المستعمرات تحولت مع التعبير يبني في ل1 مل من 2YT وسائل الإعلام / الكربوهيدرات في لوحة 96 بئر عميق جيدا باستخدام معقم مسواك أو ماصة طرف وتنمو لمدة 12-16 ساعة عند 37 ° C مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. ويمكن القيام بذلك إما يدويا أو مع منقار مستعمرة الآلي.
- 15 نقل 40 ميكرولتر من تنامي ثقافة إلى 1.5 مل من وسائل الإعلام NZY تستكمل مع الجلوكوز / اللاكتوز / الجلسرين في 96 كتلة deepwell كذلك في منهجية الدارس وآخرون.
ملاحظة: بالتناوب، والخلايا يمكن زراعتها لمدة 3-4 ساعة (OD 0،8-1،0) في غير تستكمل وتعبير البروتين الناجم عن إضافة 1 ملم IPTG. - تغطية كتلة الثقافة (s) مع ختم تنفس والتعبير عن استنساخ فاب لمدة 6-8 ساعة عند 30 ° C مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. لوحات تدور في 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير الخلايا البكتيرية، وإزالة طاف، بطانات مع ختم احباط وتجميد الكريات في -20 درجة مئوية حتى تحلل.
- تحرير فابز أعرب من الكريات جمعها مع 100 ميكرولتر من تحلل العازلة (تريس حمض الهيدروكلوريك 50 مم، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1.25٪ تريتون X-100 درجة الحموضة 8.0 مع 1mg / مل الليزوزيم و 10 U benzonase / مل الثقافة ومثبطات الأنزيم البروتيني) وتهتز لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف المحللة الخام لاستخدامها في توصيف الأولي للخصوصية التي كتبها لوحات ELISA (انظر القسم 5.3).
5.3) توصيف استنساخ كتبها المباشر ملزم نسيلي فاب ELISA
- شل مستضدات كما هو موضح في القسم 3.1 بدلا aliquotting 30 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل مستضد في برنامج تلفزيوني إلى الآبار من 384 لوحة جيدا. يمكن تخطيطات مستضد القائم على رباعية في لوحة تسهيل نقل الكاشف عند استخدام 96 القائم على قناة رؤساء الاستغناء. غسل وكتلة لوحات ELISA حسب القسم 3.1.
- لست] مسح تم جمعها من القسم 5.2 يمكن تطبيقها مباشرة على مستضد يجمد لإيفاluation ملزمة. احتضان 30 ميكرولتر من المحللة لكل بئر لمدة 15 دقيقة في RT مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يمكن بالتناوب تنقية فاب البروتين استنساخ يتم استخدامها من قبل تمييع إلى 10 ميكروغرام / مل في المخزن PBT وتطبيق 30 ميكرولتر من كل نسخة إلى الآبار سدت تحتوي على المستضد أو سلبي البروتين السيطرة (GST، BSA الخ) وتطوير بنفس الطريقة وصفه أدناه. بالتناوب، ويمكن أيضا فاب-فج يتم استخدامها من قبل تمييع 10 ميكرولتر من فج طاف (الموصوفة في القسم 5.1) في 20 ميكرولتر عازلة PBT (1: 3)، والكشف عن الأجسام المضادة مع مكافحة M13-HRP (الموصوفة في خطوات 4،4-4،5) - إزالة المحللة الزائد وغسل الآبار إما يدويا أو باستخدام لوحة الآلي غسلها 8X مع 100 ميكرولتر من العازلة PT وإزالة عازلة الزائد.
- احتضان 30 ميكرولتر من 1: 5،000 التخفيف من الثانوي الأجسام المضادة لمكافحة FLAG في المخزن PBT لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
- غسل وتطوير وقياس وفقا أقسام 4،3-4،5.
ملاحظة: ممثل النتائجوتظهر توضح استنساخ ملزمة على حد سواء محددة وغير محددة في الشكل (5).
5.4) تسلسل استنساخ
- إعداد مزيج الرئيسي PCR كما هو مبين في الجدول 2.
- إضافة 2 ميكرولتر من القالب PCR المناسب (إما فج طاف أو إعادة علقت واحدة المستعمرة التي تحتوي على phagemid البكتيرية) إلى 20 ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي أعد مع الاشعال المناسبة في الآبار لوحة PCR.
ملاحظة: هناك حاجة يمزج سيد منفصلة للتسلسل كل من سلسلة الجينات الثقيلة والخفيفة. - تشغيل رد فعل PCR باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 2 - إعدادات PCR.
- تحقق من نجاح للتفاعل PCR عن طريق خلط 5 ميكرولتر من رد فعل مع الانتهاء من صبغ تحميل على هلام الاغاروز 1٪ تستكمل مع وصمة عار التصور الحمض النووي والتصوير على نقل transilluminator 300 نانومتر.
- إضافة 2 ميكرولتر من الناتج PCR إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم تحتوي على 0.2. ميكرولتر كل من نوكلياز خارجية والقلوية الروبيان الفوسفاتيز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تليها تثبيط انزيم في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الاشعال الزائدة استعدادا لالتسلسل.
6. تحجيم لالآلي مختارات
6.1) القائم على ماصة المناولة السائلة
- إعداد 1٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول في الماء وإزالة جزيئات غير قابلة للذوبان باستخدام 0.45 مل التصفية.
- لتحديد نطاق الخطي للالامتصاصية على قارئ لوحة، وإعداد 1: 1،000 التخفيف من 1٪ برموفينول حل الأزرق في الماء، والاستمرار مع اثنين أضعاف التخفيفات المتسلسلة (مجموع 16 التخفيفات).
- نقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى أسفل 96 لوحة جيدا مسطحة وقراءة الامتصاصية في 590 نانومتر. مؤامرة الامتصاصية المطلق مقابل عامل التخفيف واختيار التخفيف في منتصف إلى نهاية عالية من مجموعة خطية للاختبارات لاحقة.
- إضافة برموفينول الأزرق للماء أو إلى حل الفعليالتي سيتم pipetted بناء على التخفيف المختارة في الخطوة السابقة بكميات كافية لpipetting للثلاثة 96 لوحات جيدة، بالإضافة إلى حجم القتلى في الخزان.
- معايرة pipettor على قناة واحدة لتقديم حجم اختبار من قبل pipetting الماء على التوازن التحليلي (100 ميكرولتر من المياه تزن 100 ملغ في RT).
- باستخدام pipettor معايرة، ونقل حجم اختبار من الحل مصبوغ للا يقل عن ثلاثة آبار لأسفل 96 لوحة جيدا مسطحة وقراءة الامتصاصية الخاصة بهم في 590 نانومتر، في ثلاث نسخ.
- تزن ثلاثة مسطحة القاع 96 لوحات جيدا فارغة على الميزان التحليلي وتسجيل كتلها.
- ماصة حجم اختبار من الخزان إلى كل من الثلاثة 96 لوحات جيدة وقياس الامتصاصية الخاصة بهم في 590 نانومتر، في ثلاث نسخ.
- تزن كل لوحة وحساب الفرق في الكتلة.
- أولا، تقييم ما إذا كانت الامتصاصية في كل بئر موحدة ضمن مجموعة من التسامح (على سبيل المثال، +/- 5٪) ومدى توافقهم مع الالامتصاصية الإلكترونية التي حصلت عليها اليد pipetting لمع pipetman معايرة. إذا قنوات معينة هي الإفراط باستمرار أو في إطار تقديم (على سبيل المثال انظر الشكل 6)، اتبع إجراءات إصلاح وكرر الإجراء تقييم حتى جميع القنوات تسليم كميات موحدة.
- ثانيا، حالما يتم تأكيد كل قنوات لإيصال كميات موحدة، والتحقق من دقة هذا الحجم عن طريق حساب متوسط الفارق الشامل، لكل بئر. على سبيل المثال، فإن مجموعة معالج السائل معايرة تماما لمدة 100 ميكرولتر تقديم 9.60 غرام من الماء لكل لوحة، أو 0.10 غرام من الماء لكل بئر. وإذا كان حجم الحقيقي هو تسليم باستمرار فوق أو تحت حجم المقصود، ومن ثم يمكن تطبيق معامل التصحيح، أي برمجة 110 ميكرولتر من أجل تقديم فعلا 100 ميكرولتر.
ملاحظة: للحصول على كميات صغيرة، على سبيل المثال، 10 ميكرولتر، استخدم عشرة أضعاف أكثر الأزرق برموفينول في حل مصبوغ، وقبل قسامة 90 ميكرولتر من الماء إلى لوحات جيدة 96 من جهة، للتأكد من أن ABsorbances هي للقياس وسقوط في مجموعة خطية.
6.2) الآلي غسل لوحة
- شل هدف إيجابي والبروتينات السيطرة السلبية في آبار منفصلة من 96 microplates جيدا (اثنين من لوحات لكل حالة لفحصها) كما هو موضح في القسم 3.1.
- حجب المواقع غير الملزمة محددة من الحضانة مع عرقلة الحل لساعة واحدة على RT.
- إضافة متطابقة مأخوذة 100 ميكرولتر من 10 13 وت م / مل حل فاب-فج في PBT لجميع الآبار في جميع لوحات ملزمة استهداف واحتضان مع الإثارة لطيف في RT لمدة 2 ساعة.
- غسل اثنين من لوحات وفقا لكل حالة، لوحة واحدة للعدوى والمعايرة وصفيحة واحدة للELISA.
- تقييم فعالية غسل عن طريق العدوى المباشرة إلى البكتيريا والمعايرة (كما هو موضح في القسم 3.3 (دون إضافة M13K07) و7.2.1) أو التطوير مع مكافحة M13 HRP الضد والركيزة اللونية (كما هو موضح في القسم 4).
- عيارات فج الابام سوف يستنسخ محددة غالبا ما تسفر في حدود 10 5 -10 7 فج / مل من البروتين الذي يجمد ضد استنساخ يربط على وجه التحديد. بعض المتبقية ملزم لبروتين سيطرة سلبية (على سبيل المثال، BSA) أمر متوقع وعموما 10 2 -10 5 فج / لوحظ مل، ولكن عيارات منخفضة جدا (أي.، <10 1) يمكن أن يشير غسل صرامة بشكل مفرط، والتي يمكن التنازل مجموعة مختارة.
- لفج ملزمة يحددها ELISA، مقارنة الإشارات ملزمة المطلقة للبروتينات الإيجابية والسلبية التحكم لتحديد ما إذا كان غسل الروبوتية ما يعادل أنشئت النتائج غسل اليدين (الشكل 7).
6.3) إزالة التلوث لوحة غسالة
- لبدء تشغيل بروتوكول إزالة التلوث لفحصها.
ملاحظة: نوصي باستخدام ما لا يقل عن ضعف حجم الخط الكلي، ورئيس ونقع رئيس غسالة لمدة 5 دقائق في 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم، الاب المخفف الطازجالتبييض التجاري OM (عادة 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم). - رئيس ونقع رئيس غسالة لمدة 5 دقائق في معقم (تعقيمها) المياه وأخيرا، رئيس النظام حتى خطوط مليئة الهواء.
- رئيس الخطوط مع الماء المعقم أو غسل العازلة.
- غسل العقيمة صفيحة ميكروسكوبية 96 جيدا مرة واحدة، وترفع من غسالة وختم مع معقم لوحة الختم. هذا هو لوحة التحكم قبل التلوث.
- قسامة 100 ميكرولتر من O / N تضخيم ثقافة فج طاف لجميع الآبار من 96 لوحة جيدا.
- غسل لوحة تحتوي على فج مرة واحدة، ثم إزالة من غسالة وختم بختم طبق من البلاستيك أو احباط. هذا هو لوحة تحكم التلوث.
- تنفيذ بروتوكول إزالة التلوث التي يجري اختبارها. في هذا المثال، كرر الخطوات من 6.3.1 و6.3.2.
- غسل صفيحة ميكروسكوبية العقيمة مرة واحدة، ثم إزالة من غسالة والختم. هذا هو لوحة اختبار إزالة التلوث.
- لوحة 50 ميكرولتر من مرحلة سجل E. القولونية إلى لوحات المعايرة. هذا هو ما قبل infecلوحة تحكم نشوئها.
- فضها قبل التلوث، التلوث وإزالة التلوث لوحات 96-جيدا وإضافة 100 ميكرولتر من E. القولونية في مرحلة النمو، مرحلة السجل لجميع الآبار، وذلك باستخدام نصائح جديدة للكل بئر.
- ختم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 200 دورة في الدقيقة.
- لوحة 50 ميكرولتر من الخلايا المصابة من ثلاثة آبار عشوائية من كل لوحة 96-جيدا إلى 10 سم لوحات 2YT / الكربوهيدرات واحتضان عند 37 درجة CO / N.
- نقل 50 ميكرولتر من الخلايا المصابة من جميع الآبار من كل لوحة لوحات بئر عميقة تحتوي على 1 مل 2YT بالإضافة إلى 100 غ / مل كربنيسيلين لكل بئر وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
- كرر بروتوكول إزالة التلوث وترك غسالة خطوط تجف.
ملاحظة: لا O / N النمو على لوحات أو في الوسط السائل ينبغي مراعاتها على السيطرة ما قبل الإصابة، ومراقبة ما قبل التلوث أو اختبار إزالة التلوث لوحات. ينبغي مراعاتها العديد من المستعمرات والنمو على لوحة تحكم تلوث؛ إذا لم يكن كذلك، أي استنتاجات حول فعاليةويمكن إجراء بروتوكول إزالة التلوث. من الناحية المثالية، فإن لوحات إزالة التلوث تسفر عن أي مستعمرات ولا O / N النمو في أي من الآبار في O / لوحات N. ويمكن زيادة التشدد في بروتوكول إزالة التلوث مع تركيزات التبييض أعلى وأطول نقع مرة ودورات إضافية.
7. الإدخال / الإخراج المعايرة
7.1) معايرات فج الإدخال
- تمييع قسامة 5 ميكرولتر من فج إلى 50 ميكرولتر مع PBS العقيمة التي تمت تصفيتها وتخلط.
- إعداد التسلسلي 10 أضعاف التخفيف في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها إلى 10 10 استخدام متعدد القنوات ماصة أو pipettor 96 قناة.
- تطعيم 5 ميكرولتر من فج مخففة في 45 ميكرولتر من مقاومة للفج T1 E. خلايا القولونية في مرحلة سجل النمو (OD 0،6-0،8)، واحتضان مغطاة ختم تنفس لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة الدخول إلى LB / لوحة أجار تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين واحتضان O / N لر 37 ° C.
- ويمكن تقدير تركيز فج من العينة الأكثر المخففة التي تظهر المستعمرات وفقا لحسابات بالتفصيل في القسم 2.8.
7.2) الناتج فج Pitrations
- وبعد شطف من متجهة لوحة فج من خلال إضافة E. القولونية الخلايا، تمييع قسامة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة فج إلى 50 ميكرولتر مع وسائل الإعلام 2YT تعقيمها
- إعداد التسلسلي التخفيف 10 أضعاف في وسائل الإعلام 2YT تعقيمها إلى 10 6 باستخدام ماصة متعدد القنوات أو 96 قناة pipettor.
- لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة إلى لوحة أجار تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- ويمكن تقدير تركيز فج من العينة الأكثر المخففة التي تظهر المستعمرات وفقا لحسابات بالتفصيل في القسم 2.8.
ملاحظة: في كلتا الحالتين (أي المدخلات والمخرجات فج عيارات، مقارنة مع أرقام مستعمرة على كل من التتراسيكلين (إجمالي سلل رقم) والكانامايسين (المساعد فج عيار) يمكن أيضا أن تكون غنية بالمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لعزل شظايا الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من كلا structurally- والمتعلقة ظيفيا المجالات مستضد من اندماجي-عرض فج المكتبات فاب بشكل متواز. القضايا المتعلقة توافر مستضد يمكن التحايل، في كثير من الحالات، من خلال تحديد سيليكون في المجالات مستضد التعبير عنه التي هي مناسبة لاختيار الأجسام المضادة 23. وذلك بربط المستضد التعبير لاختيار الأجسام المضادة داخل نفس المختبر (الشكل 1) يصبح ممكنا لبناء خط أنابيب المتكاملة، التي المعلمات مستضد حاسمة لاختيار يمكن السيطرة عليها بسهولة أكبر. في معظم الحالات، وتحديد دقيق للحدود النطاق تمكن التعبير وعزل كميات كافية من المستضد النقي بما فيه الكفاية من الإنتاجية العالية التعبير في 96 أو 24 لوحات deepwell جيدا (الشكل 2) للاستخدام الناجح في التحديدات الأجسام المضادة. خلال المتعاقبةجولات من عملية الاختيار، يمكن رصد تركيزات فج مزال وإثراء فج التي تربط تحديدا المستضد إما عن طريق المعايرة فج (الشكل 3) أو مع حمامات فج في فحص ELISA (الشكل 4). وهناك نسبة ملزم (> 2) يشير عموما وجود الحيوانات المستنسخة ملزمة محددة. على العكس من ذلك، يمكن للنسبة منخفضة (<2) تساعد في تحديد سبب فشل الاختيار. على سبيل المثال، يمكن لنسبة <2 مع ارتفاع OD غير محددة تشير إلى إزالة كافية من الحيوانات المستنسخة غير محددة (أو المجلدات لزجة) وربما تستدعي مزيدا من تعظيم الاستفادة من بروتوكول الاختيار. ومع ذلك، مرة واحدة تم الكشف عن تخصيب اليورانيوم، الفردية استنساخ تقارب عالية ويمكن بعد ذلك أن تكون معزولة عن تسلسل والتوصيف. ملزمة يمكن وصف استنساخ في المناعية اللونية وتمكن المقارنة بين الملزم للفاب-فج أو فاب للمستضد يجمد مقابل البروتين السيطرة سلبي، مما أسفر عن قدر من تخصيب (نسبة ملزم لتاr يمكنك الحصول مقابل البروتين السيطرة سلبي أو تقارب العلامة البروتين) (الشكل 5).
خلال التوسع وأتمتة هذه الطريقة، يمكن تقييم المهام الرئيسية لوحدة مناولة السائل أن تكون مفيدة لضمان التشغيل السليم ودقيقة مع حلول مماثلة لتلك المستخدمة خلال التحديدات الفعلية. استخدام حاملات امتصاص في حلول يمكن أن تساعد على كشف عندما قنوات محددة في FLUIDICS (الطموح أو صرفها) وإما انسداد أو فقدوا ختم مما أدى إلى تسليم حجم جزئي كما هو موضح في الشكل (6). يمكن للوحدات الغسيل الآلي أيضا أن يكون مصدرا للتقلب ويمكن أن تتطلب الاهتمام. استخدام الحيوانات المستنسخة ملزمة المعروف تمكن المقارنة بين ملزمة بين البروتين السيطرة المستهدفة لضمان أن الهدف هو الحفاظ بينما الخلفية ملزمة إزالة ملزمة (الشكل 7) عندما يجري الأمثل المعلمات غسل مثل الاستغناء سرعة وحجم غسل وعدد من يغسل. التالياستخدام لوحة غسالة الآلي مع حلول فج والبروتوكولات إزالة التلوث الفعالة ضرورية لضمان عدم وجود انتقال التلوث من جولات متتالية من التحديدات أو إجراءات الاختيار مختلفة ويتم توفير دليل / تفسير استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 3.
الشكل 1. نظرة عامة - إنتاج مستضد عالية الإنتاجية وخط أنابيب اختيار الأجسام المضادة تظهر هذه نظرة عامة على التصور خطوة بخطوة من جيل مستضد الضد واختيار خط أنابيب تمثيلي. تحديد سيليكون في حدود نطاق مستضد يمكن تركيب الجينات والتعبير والاختيار على المجالات لالبروتينات التي يمكن وصفها بشكل سيئ. ويجمد المجالات مستضد أعرب وتستخدم لعزل حمامات من الحيوانات المستنسخة محددة عالية تقارب الأجسام المضادة من التعاونمكتبة الأجسام المضادة mbinatorial المعروضة على سطح فج الخيطية. ويمكن بعد ذلك برك من الأجسام المضادة فج مزال وتضخيمها من مستضدات الفردية أن تستخدم لمراقبة تخصيب مستديرة لجولة من الحيوانات المستنسخة محددة ملزمة في المقايسات مقرها ELISA-المقارنة بين الهدف يجمد مقابل البروتين السيطرة سلبي قبل عزل الحيوانات المستنسخة ملزمة الفردية لتوصيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. SDS-PAGE التصور المستضدات الموسومة التقارب. ممثل SDS-PAGE من 6X-HIS-GST الموسومة المجالات مستضد أعرب وتنقيته (5-10 كيلو دالتون نطاق + 26 كيلو دالتون GST) التي تم تحديدها في الأصل من قبل في تحليل سيليكون والمستضد حدود المجال. أعربت المجالات البروتين ومعزولة من قبل افىوتتميز تنقية نبين بواسطة SDS-PAGE قبل التحديدات لضمان الهوية على أساس حجم، والمحاصيل المناسبة والنقاء لتمكين استخدام في اختيارات-فج الأجسام المضادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التصور من عيارات الناتج فج. ويتم تحديد عيارات الناتج فج من قبل الطلاء خارج الخلايا المصابة مع فج خلال سلسلة التخفيف 10 أضعاف على وسائل الإعلام أجار تستكمل مع مختلف المضادات الحيوية (تتراسيكلين، كربنيسيلين والكاناميسين) لتحديد أدنى التخفيف التي المستعمرات ويمكن ملاحظة وتقدير عدد فج ملزمة لاستهداف مستضد ومزال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة كبيرةنسخة R من هذا الرقم.
الشكل 4. نسبة تجليد الهدف إلى البروتين السيطرة السلبية التي كتبها المجمعة ELISA. يمكن تقييم التقدم في تخصيب جولات التالية من الاختيار عن طريق فحص eluents تضخيم الفردي ضد كل من أهداف محددة والبروتينات السيطرة السلبية و / أو معزولة العلامة التقارب. هو مبين في المؤامرة هي نسب تخصيب للربط من 96 الفردية حمامات-فج الأجسام المضادة ضد المستضدات كل منها 96 مقابل البروتين السيطرة سلبي في نفس الوقت. ويستمد كل قيمة نسبة من اثنين من القياسات الامتصاصية أن تحديد ملزمة للتجمع فج إما الهدف أو البروتين السيطرة السلبي باستخدام الأجسام المضادة HRP تنصهر محددة لM13 البروتين معطف فج. ويستخدم عتبة نسبة 2 أو أكثر (وغالبا ما تتراوح 2-10 أو أكثر كما هو مبين باللون الأحمر) كمؤشر على تخصيبووجود المرجح من الحيوانات المستنسخة ملزمة محددة. يمكن نسب أقل يعني فشل أو قضايا محددة مع التحديد الذي قد تستدعي مزيدا من التحسين من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. المباشر ملزم نسيلي فاب-فج أو فاب ELISA. الربط من الحيوانات المستنسخة واحدة (سواء في فاب-فج أو شكل فاب) يمكن تقييمها من قبل فحص ELISA مقرها في مقابل البروتين ثبتوا في 384 لوحات جيدة. ملزمة تم الكشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية HRP تنصهر ضد بروتين معطف M13 على فاب-فج أو علامة تقارب على فاب. وصفت القيم الامتصاصية الخام لربط نسيلي القوات المسلحة البوروندية-فج لاستهداف مستضد، والبروتين السيطرة سلبي وعلامة مستضد تقارب (GST) توضح ثنائية محددةnders (A01، A04، A06)، والمواد اللاصقة لزجة (A05).
الشكل 6. تقييم حجم الاستغناء عن طريق الآلي وحدة مناولة السائل. تسليم متسقة ودقيقة من وحدات التخزين المقصود من قبل أنظمة pipetting ل96-جيدا الروبوتية أو اليدوي يمكن تقييمها باستخدام حلول مصبوغ وقارئ لوحة. في هذا المثال، 10 ميكرولتر من محلول يحتوي على برموفينول اللون الأزرق هو بالتتابع pipetted لجميع الآبار اثنين من 96 لوحات جيدا باستخدام مربع طرف واحد. كل يحتوي من 90 ميكرولتر / جيد درهم 2 O، مماثلة لإضافة المساعد فج لE. المصابين القولونية. الامتصاصية كل لوحة لفي 590 نانومتر تتم قراءة في ثلاث نسخ، ومحرف كميات من منحنى القياسية أعدت باستخدام قناة pipetman واحد معايرة. وتظهر كميات تسليمها إلى صف واحد على لوحة الأولى والثانية. لاحظ أنه على التنوبر لوحة، وكذلك E04 تتلقى أي حل مصبوغ، وعلى لوحة ثانية، يتلقى حجم مزدوج. وهذا يدل على أن لمسة طرف ليس كافيا للتسليم ثابت، ويتطلب مزيد من التحسين. وتظهر فواصل الثقة 95٪ للقياسات ثلاث نسخ الامتصاصية.
الرقم 7. تقييم الآلي لوحة الغسيل. الإزالة الفعالة من فج غير منضم يمكن تقييم باستخدام ELISA لقياس فاب-فج ملزمة لإيجابية يجمد (مكافحة FLAG الأجسام المضادة) والسلبية البروتينات (BSA) السيطرة في حين متفاوتة الظروف غسل. في هذا المثال، ومدخلات فج مماثلة لمكتبة ساذجة (10 13 وت م / مل في PBT) وإزالتها باستخدام ثمانية أو ستة عشر يغسل، باليد أو باستخدام الروبوت. فج المتبقية ملزمة لBSA هو نفسه في جميع الظروف، كما هو محدد ملزم ليجمد الأجسام المضادة لمكافحة FLAG، الهنديةأثناء التشغيل أنه في هذا معدل التدفق المنخفض، على حد سواء أساليب تعادل وصارمة بما فيه الكفاية. وتظهر فواصل الثقة 95٪ من الآبار مكررة.
| SOLUTIONS | |||
| 2YT وسائل الإعلام - إضافة الماء إلى 1 L، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0، والأوتوكلاف. | خلاصة الخميرة | 10 ز | |
| تريبتون | 16 ز | ||
| كلوريد الصوديوم | 5 ز | ||
| NZY وسائل الإعلام (1 L) | NZ أمين | 10 ز | |
| خلاصة الخميرة | 5 ز | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 مل | ||
| الأسهم 20 الملح | 50 مل | ||
| 50X ZYM-5052 الأسهم السكر (1 L) | جلوكوز | 25 ز | |
| اللاكتوز | 100 غرام | ||
| الغليسيرول | 250 مل | ||
| 20x والأسهم الملح (1 L) | نا 2 هبو 4 | 500 ملي | |
| KH 2 PO 4 | 500 ملي | ||
| NH 4 الكلورين | 1 M | ||
| نا 2 SO 4 | 100 ملي | ||
| كربنيسيلين (كارب): | 100 ملغ / مل في الماء. تصفية تعقيم. | ||
| الكانامايسين (كانساس): | 25 ملغ / مل في الماء. تصفية تعقيم. | ||
| التتراسيكلين (تيت): | 10 ملغ / مل في الماء. فلتر تعقيم. | ||
| PEG-كلوريد الصوديوم | PEG | ||
| كلوريد الصوديوم | 2.5 M | ||
| برنامج تلفزيوني 1X (pH7.2) | كلوريد الصوديوم | 137 ملي | |
| بوكل | 3 مم | ||
| نا 2 هبو 4 | 8 ملي | ||
| KH 2 PO 4 | 1.5 ملم | ||
| 1X KCM | بوكل | 500 ملي | |
| CaCl 2 | 150 ملي | ||
| MgCl 2 | 250 ملي | ||
| SOC وسائل الإعلام | خلاصة الخميرة | 5 ز / L | |
| تريبتون | 20 ز / L | ||
| كلوريد الصوديوم | 10 ملي | ||
| بوكل | 2.5 ملم | ||
| MgSO 4 | 20 ملي | ||
| جلوكوز | 20 ملي | ||
| حظر العازلة | PBS | 1X | |
| BSA | 0.20٪ | ||
| عازلة PBT | PBS | 1X | |
| BSA | 0.20٪ | ||
| توين | 0.05٪ | ||
| عازلة PT | PBS | 1X | |
| توين | 0.05٪ | ||
| حمض الفوسفوريك | H 3 P0 4 | 1 M | |
الجدول 1. وسائل الإعلام وحلول.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ قوي> | |||
| عنصر | ميكرولتر في رد الفعل | ||
| ماء | 19.45 | ||
| عازلة 10X طق | 2.5 | ||
| dNTPs (10 ملي الأسهم) | 0،675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| طق انزيم | 0.125 | ||
| إلى الأمام التمهيدي (100 أوقية الأسهم) | 0.25 | ||
| التمهيدي العكسي (100 أوقية الأسهم) | 0.25 | ||
| سلسلة الثقيلة الاشعال التسلسل | |||
| M13 إلى الأمام التمهيدي | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 عكس التمهيدي | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| سلسلة الخفيفة الاشعال التسلسل | |||
| M13 إلى الأمام التمهيدي | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 عكس التمهيدي | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| SETTINGS PCR | |||
| الخطوة 1. | 94 درجة مئوية لمدة 03:00 دقيقة | ||
| الخطوة 2. | 94 درجة مئوية لمدة 00:30 دقيقة | ||
| الخطوة 3. | 55 درجة مئوية لمدة 00:30 دقيقة | ||
| الخطوة 4. | 72 درجة مئوية لمدة 01:00 دقيقة | ||
| العودة إلى الخطوة 2 وتكرار 24X | القفز إلى الخطوة 2 | ||
| الخطوة 5. | 72 ° C ل07:00 دقيقة | ||
| الخطوة 6. | |||
الجدول 2. PCR ميكس ماجستير وإعدادات.
| تفسير النتائج إزالة التلوث | |||
| لوحة | يتوقع عيار كربنيسيلين | إن لم يكن؟ | |
| السيطرة ما قبل الإصابة | 0 | والخلايا المصابة قبل. لا شيء يمكن أن نستخلص من هذه التجربة. | |
| مراقبة التلوث | العشب | التلوث غير كافية لتكون قادرة على تقييم فعالية إزالة التلوث لاحق؛ النظر غمر متعددة في حل فج بدلا من الشفط ذلك. | |
| اختبار إزالة التلوث | 0 | إزالة التلوث لم يكتمل. زيادة نقع الوقت، التبييض concentraنشوئها أو محاولة SDS ويغسل ETOH بدلا من ذلك. | |
الجدول 3. تقييم غسالة إزالة التلوث. لتحديد فعالية إزالة التلوث، فمن الضروري أن تظهر ملوثة أن غسالة مع فج، وأن البروتوكول تطهير القضاء بنجاح أن التلوث. باستخدام فج التي تمنح كربنيسيلين المقاومة، يتم سرد النتائج المتوقعة من مثل هذا الاختبار، جنبا إلى جنب مع الاقتراحات ينبغي أن النتيجة الحقيقية تختلف عن النتيجة المتوقعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند إجراء التحديدات في الأجسام المضادة في المختبر، وهما المحددات الأساسية لنجاح الاختيار هي 1) عزل أهداف المستضدات مطوية جيدا لاختيار عليه و2) توفر وظيفية مكتبة تنوع الأجسام المضادة عالية. في كثير من الحالات، وتوافر كميات كافية من مطوية جيدا، بروتين كامل طول يمكن الحد. نهج واحد للتغلب على هذا القيد هو استخدام المجالات التي تم تحديدها من تحليل بيوينفورمتيك 22 و مركبة للالإدراج في ناقلات التعبير البكتيرية مع علامة تقارب المناسبة.
وهناك مجموعة متنوعة من العلامات التي تستخدم في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لزيادة القابلية للذوبان، وتسهيل تنقية وتحقيق الاستقرار في المجالات غير مستقرة. 11 القدرة على تجميع تقريبا أي تسلسل إدراج المطلوب تمكن تنوعا للغاية منصة الجيل مستضد. على الرغم من أن شكل الموسومة GST هو شائع، فقد كانت النتائج ناجحة سابقاتم الحصول عليها باستخدام hexahistidine، FC، هالو، المالتوز بروتين ملزمة والعلامات biotinylation في مواقع محددة ويعتقد أن عدد لا يحصى من علامات تقارب أخرى قد يكون الأمثل للاستخدام في منصة مماثلة. ومع ذلك، يمكن علامات تقارب على حد سواء عواقب سلبية المفيدة وغير المقصودة في تطبيقات المصب 11 وينبغي التحقيق بدقة قبل إنشاء خط أنابيب استنادا إلى شكل معين.
في كثير من الأحيان سوف المستخدمين الجدد تشكل مسألة كيفية تقييم جودة مكتبة الأجسام المضادة وعلى الرغم من عدم وجود إجابة واضحة، ينبغي للمرء محاولة لتقييم العديد من السمات الرئيسية (سواء كانت طبيعية أو اصطناعية) بما في ذلك التنوع الشامل، ومستويات عرض النسبية، وطبيعة ومدى التوزيع العشوائي (أي تصميم مكتبة مقابل المحتوى مكتبة تحددها تسلسل) والخصائص الفيزيائية للأجسام المضادة في مقابل تطبيق المقصود. على الرغم من خارج نطاق هذا البروتوكول، ومحطات الصرف الصحي أكثر تفصيلاالإقليم الشمالي من هذه الميزات وكيف يمكن أن تؤثر على اختيار الأجسام المضادة يمكن العثور عليها هنا 2،23. معرفة التنوع المكتبة، على وجه الخصوص، أهمية لضمان التغطية الكافية للتنوع خلال التحديدات. عادة، تركيز الفيروس التي توفر 100-1،000 نسخ من كل فج استنساخ في المكتبة أمر مرغوب فيه ويجب أن تضمن أن أي المجلدات الإيجابية الحقيقية موجودة في مكتبة يمكن استردادها. ومع ذلك، غير محددة وملزمة من فج لصفيحة ميكروسكوبية الأسطح يزيد بشكل كبير فوق 10 13 فج / مل، وللمكتبات متنوعة جدا، أكثر من بئر واحد لكل مستضد قد تكون هناك حاجة لضمان التغطية الكافية. من ناحية أخرى، إذا كانت مكتبة المدخلات وتمييع للغاية، والتركيز المطلق من المجلدات الإيجابية الحقيقية ستكون أقل بكثير بحيث دينار كويتي (عادة نانومتر) أنها لن استردادها. ونظرا لهذه القيود، يجب أن تكون قابلة للمعلق المكتبات فج إلى 12-13 أكتوبر فج / مل للجولة الأولى من التحديدات.0؛ في هذا التركيز، قسامة 100 L من فج تمثل تغطية 1،000-100 حظيرة مكتبة التنوع 10 9 -10 10 ويمكن أن تسفر بشكل روتيني استنساخ ملزمة لمستضدات متنوعة. بتركيزات أقل، أو زيادة التنوع، قد يكون من الضروري زيادة عدد الآبار من المستضد اختيار ضدهم في الجولة الأولى (انظر القسم 2.9). وبعد أن الجولة 1، ومع ذلك، تمت إزالة معظم التنوع غير ملزم للمكتبة. تغطية الزائدة من تنوع الانتاج الجولة 1 هي في معظم الأحيان يمكن تحقيقها بسهولة باستخدام بئر واحد. في حالات التحديدات موازية في 96 لوحات جيدة، وهذا يمكن أن تقلل من عدد من لوحات مختارة المستضد اللازمة لواحد فقط، لاحقة إلى الدور الأول.
خلال التحديدات الفعلية، يمكن فج المعايرة تقدم مقاييس موضوعية لتوصيف ورصد التقدم المحرز، بينما يساعد على تحديد مجالات الاهتمام وخاصة في الجولات الأولى من حيث اختيار تخصيب لا يكفي ليتم الكشف عن. هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص خلال توسيع نطاق من الاختيارات لتحديد أداء البروتوكول. بشكل عام، عيارات المدخلات فج (أي مكتبة ساذجة أو ما بعد التضخيم من فج مزال) ينبغي أن تظل ثابتة نسبيا (10 12 -10 13 فج / مل) بين الجولات، مع نمو الخلايا الفقراء / منخفضة عيارات فج تشير التلوث المحتمل و / أو سوء الإخراج من الجولة السابقة. على الرغم من أن من المتوقع أن تزداد خلال تخصيب اليورانيوم في جولات لاحقة من اختيار عيارات الناتج فج، ومن المتوقع مجموعة من 10 3 -10 5 وت م / مل في أول جولتين. الانحراف عن هذا النطاق يمكن أن تشير إلى المشاكل المحتملة مع اختيار مثل التلوث أو الزائدة غسل صرامة. في جولات لاحقة من التحديد (أي تقريب 3 و 4)، وإثراء الحيوانات المستنسخة التي تربط خصيصا للمستضد الهدف يمكن تقييم عبر ELISAs المجمعة التي تقيس ملزمة تجمع فج ضد كل من المستضد الهدف والسلبيةالبروتين التحكم (انظر القسم 4).
بعد 3-4 جولات من الاختيار (أو مرة واحدة وصلت التخصيب على البروتين الهدف مستضد الهدف: السيطرة السلبية نسبة الإشارة البروتين من 2: 1 أو أعلى بالمقارنة مع البروتين الخلفية)، ومطلي الخلايا البكتيرية المصابة لعزل المستعمرات phagemid واحدة لتسلسل وتوصيف الأولي والاستنساخ إذا لزم الأمر. في هذا الوقت، فمن المستحسن جدا لتحويل فاب-فج لتحرير فاب قبل توصيف إضافية. وعلى الرغم من فاب-فج يمكن استخدامها لتوصيف الأولي عن طريق تمييع 10 ميكرولتر من فج طاف (الموصوفة في القسم 5.1) في 20 ميكرولتر عازلة PBT والكشف عن الأجسام المضادة مع مكافحة M13-HRP (الموصوفة في خطوات 4،4-4،5)، في تجربتنا، يمكن خصائص ملزم تغيير جوهري في أي مكان 5-20٪ من الحيوانات المستنسخة على التحرر من الجسيمات فج وتحويل مبكر يمكن أن تغني القضايا مع ايجابيات كاذبة. سوف منهجية محددة تستخدم لتحويل تعتمد على UNIQUلن يتم التعامل العمارة (ه) من phagemid وبالتالي مع صراحة هنا. ومع ذلك، في الأكثر شيوعا ناقلات، وهذا عموما يمكن أن يتحقق عن طريق 1) التحول من phagemid تنقيته (أو تجمع phagemid) في لغير القامع-E. المختصة سلالة القولونية مثل HB2151 أو 55244 إذا توقف العنبر (TAG) كودون تتدخل القوات المسلحة البوروندية وPIII البروتين، 2) الإدراج من رامزة توقف العنبر بين القوات المسلحة البوروندية وPIII البروتينات للسماح للتعبير عن شظايا الأجسام المضادة للذوبان في سلالة غير القامع أو 3) عن طريق استنساخ الجينات المناعي (من phagemid فرد أو تجمع phagemid) في لمتجه التعبير مناسب. لزيادة تبسيط اختيار وتوصيف وأساليب الاستنساخ المجمعة قد توفر وسيلة فعالة لتحويل استنساخ ملزمة بشكل جماعي في لبنيات التعبير، سواء القضاء على إمكانية ملزمة كاذبة إيجابية من الجسيمات فاب-فج وحيث يتم استخدام لست] التعبير عن توصيف المبكر، حتى تكلفة وجهد تنقيةيمكن تجنبها في البداية.
لاستنساخ معزولة مباشرة من مكتبة F (وصفها في 24)، المجالات المتغيرة الأجسام المضادة يمكن أن تكون متسلسلة باستخدام 1-2 ميكرولتر من فج طاف كقالب لPCR تضخيم التكامل تحديد المناطق (تقارير الإنجاز الموحدة) (انظر الجدول 2 من مواد الاشعال مكتبة F الموجه ). باستخدام هذه الاشعال، فإن المناطق المتغيرة الثقيلة والخفيفة سلسلة تسفر المنتجات من ~ 700 و ~ 500 شركة بريتيش بتروليوم، التي تغطي جميع تقارير الإنجاز الموحدة الثلاث على التوالي. وتشمل الاشعال مواقع الصلب لالاشعال M13 مثل أن المنتجات يمكن أن تكون متسلسلة بعد تنظيف (كما هو موضح في القسم 5.4.5) باستخدام بادئات القياسية المتوفرة في معظم مرافق التسلسل الأساسية. بالتناوب، لحمامات السباحة فاب-فج التي تم المستنسخة في لناقلات التعبير وتحويلها مباشرة في لE. القولونية للتعبير، المستعمرات واحدة يمكن أن تكون معزولة ومعلق في 15 ميكرولتر من 2YT و1-2 ميكرولتر من تعليق خلية استخدامها مباشرة كقالب لج احدةolony PCR باستخدام بادئات المناسبة.
سوف التحديدات أتمتة تتطلب التحسين والتحقق من عدة وظائف الروبوتية الرئيسية. بشكل عام، يجب أن يكون التعامل مع السائل القائم على ماصة دقيقة ومتناسقة عبر جميع القنوات 96، يجب غسل لوحة إزالة فج غير منضم بكفاءة دون تجريد مستضد كثف أو ملزمة فاب-فج من لوحة الاختيار. إزالة التلوث الفعال لوحة غسالة ضروري أيضا بين جولات للسماح للتخصيب وفعالة مضادة الاختيار، وبين التحديدات اللاحقة لمنع انتقال التلوث. للمساعدة في تحسين إجراءات الاختيار الإنتاجية العالية، وقد استخدمت النهج بسيطة لتقييم هذه الوظائف من قبل ويتم وصفها أدناه ومفصلة ضمن البروتوكول.
لتقييم اتساق كميات تسليمها من قبل جميع قنوات السائل رئيس الاستغناء / الطموح، وpipetted حل الملون إلى 96 لوحة جيدا مسطحة القاع وabsorbanم في كل قياسها بشكل جيد على قارئ لوحة. وحامل اللون مثل برموفينول الأزرق مفيد لحلول الصباغة مماثلة لتلك المستخدمة لتحديدات حقيقية لتقييم تأثيرات مختلفة التوتر السطحي والتماسك خصائص على وحدات تخزين تسليمها. بعد التأكد من أن جميع القنوات يستغني أحجام متناسقة، دقة من إجمالي حجم تسليمها يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس كتلة من السائل نقل إلى كل لوحة.
أتمتة وحة الغسيل لإزالة الحيوانات المستنسخة غير منضم يتطلب في المقام الأول تعظيم الاستفادة من المعدل الذي يغسل المخزن المؤقت إلى الاستغناء وعدد من يغسل إلى أن تستخدم. وهناك طريقة معقولة لتقييم هذه المعلمة يعمل الضوابط الإيجابية (محدد فاب-فج استنساخ ملزمة) لتقييم آثار متفاوتة معدل الاستغناء و / أو عدد يغسل لتحديد ما إذا كان 1) كثف مستضد أو فج المربوطة يتم إزالتها عن طريق الغسيل صرامة مفرطة أو 2) ملزمة للبروتينات غير المشابهة غير محددة هو د المفرطرق لغسل الظروف التي ليست صارمة بما فيه الكفاية. يمكن الكشف عن بقايا فج / مقيدة وكميا إما عن طريق العدوى إلى البكتيريا والطلاء عن التهم مستعمرة واحدة، أو عن طريق ELISA باستخدام الأجسام المضادة الثانوية محددة للعلامات الأجسام المضادة تقارب أو البروتينات معطف فج. وتستخدم ضوابط السلبية لتقييم المستويات المتبقية من غير ملزم فاب-فج لاستهداف البروتينات أو محدد ملزم فاب-فج لغير المشابهة / البروتينات الخلفية، والتي قد تكون عالية إذا غسل ليس صارما بما فيه الكفاية. في هذه الحالة، كنا يجمد BSA كعنصر تحكم لغير محددة وملزمة والأجسام المضادة لمكافحة FLAG الذي يعترف علامة FLAG حاتمة على فاب-فج كعنصر تحكم إيجابية. قارنا ثمانية وستة عشر دورات الغسيل باستخدام الروبوت مقابل غسل باليد، بمعدل تدفق المتوسط، لإظهار أن هذه التقنيات كانت مكافئة. بالتناوب، وقياس المدخلات والمخرجات عيارات فج (انظر القسم 7) خلال التحديدات الجارية ويمكن أيضا أن تساعد على جعل تعديلات دقيقة في معلمات غسل. وأخيرا، يجب أن تكون إزالة التلوث من غسالات الأطباق المستخدمة لتحديدات فعالة من أجل القضاء على ترحيل فج من التحديدات السابقة. في تجربتنا، المخفف الطازج 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم هو سريع وفعال ورخيص. المنظفات مثل SDS هي أيضا فعالة ولكنها تحتاج إلى الغسيل أكثر اتساعا بكثير لإزالة من النظام. تحقق من توافق كاشف للنظام قبل أي اختبارات. لتقييم إزالة التلوث، ونحن اختبار لوجود فج المتبقية في حلول التعامل معها من قبل النظام FLUIDICS وتفسير النتائج وفقا للجدول رقم 3.
باختصار، هذا البروتوكول يوفر طريقة قابلة للعزل فابز من المكتبات اندماجي التي كتبها بالتوازي في التحديدات المختبر ضد المجالات البروتين ويقدم تقنيات للتحقق من صحة نظام اختيار فج الآلي. والتخفيف من التكاليف والبنية التحتية الحواجز التي مرافق الحيوان واسعة يمكن أن تشكل لأن هذا الأسلوب لا إعادةلاي على تحصين الحيوانات. وعلاوة على ذلك، من خلال دمج الجيل مستضد مع اختيار الأجسام المضادة فج، والعوامل التي تؤثر على جودة نجاح الاختيار تتم مراقبتها بشكل أكثر سهولة وتعدل. عندما الإطار الزمني من مستضد التعبير لاختيار وتوصيف الأولي هو بناء على أمر من 6-8 أسابيع، وهو نظام أكثر استجابة للإنتاج قد تتحقق. الأجسام المضادة معزولة عن التحديدات في المختبر هي أيضا كلا تعديلها بسهولة (بسبب التركيب الوراثي-النمط الظاهري الربط) والمتجددة، والتي تتطلب DNA المخزنة فقط من بناء التعبير مرارا وتكرارا وبتكاثر إعادة توليد الأجسام المضادة. وأخيرا من خلال إظهار أن هذا البروتوكول يمكن أن تتم باستخدام إما نهج شبه يدوي أو أوتوماتيكي بالكامل يستخدم لذلك، نظام اختيار الروبوتية مصمم خصيصا، الإنتاجية يمكن أن تكون قابلة للتطوير والوصول إلى مختبرات الأكاديمية والصناعية الصغيرة على حد سواء.
باستخدام الأساليب الإنتاجية العالية المذكورة أعلاه ومكتبة F مكتبة الأجسام المضادة الاصطناعية 24 في المختبر - والبروتينات في الموقع -expressed. على الرغم من أن معدلات نجاح أي اختيار معين سوف يعتمد على كل من جودة (النقاء، foldedness، أحادية التبعثر الخ) من الأهداف مستضد فضلا عن جودة وتنوع مكتبة الأجسام المضادة، فقد لوحظ أن أي مكان 25-80 و٪ من المستضدات تسفر لدنة لمجموعة مختارة إنتاجية عالية. الأهم من ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الحيوانات المستنسخة مع القدرة على تعديل وظيفة الهدف يمكن أيضا في كثير من الأحيان يكون محددا. يتم إنشاء هذه المكتبة باستخدام إطار البشري بشكل كامل، الأمر الذي يجعل هذه الأجسام المضادة قابلة للتطبيق العلاجية المحتملة 25، مما يؤكد أهمية هذا الخط كنهج بديل لتوليد الكواشف تقارب مع قاعدة عريضةالقيمة.
وباختصار، فإن متانة وبراعة النهج الواردة في هذا البروتوكول يستمر للمساعدة في تحسين والتصنيع والاستخدام واسع النطاق النهائي لهذه التكنولوجيا باعتبارها وسيلة ناجعة لتحقيق هدف طويل الأجل لتوليد الكواشف تقارب فعليا لجميع أعضاء وبروتيوم البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونود أن نعترف الصندوق المشترك NIH - البروتين القبض على الكواشف برنامج لتمويل التنمية في اختيار الأجسام المضادة وتوصيف خط أنابيب المؤتلف الضد الشبكة والمؤسسة الكندية للإبداع للشراء التمويل من منصة اختيار الروبوتية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
