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Immunology and Infection

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

Published: January 17, 2015 doi: 10.3791/51492

Summary

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。

Abstract

両方の基礎および臨床研究用途のニーズを満たす抗体に対する要求が高く、劇的に、将来的に増加する。しかし、伝統的なモノクローナル技術は、このタスクまでだけではないことは明らかである。これは、プロテオームのアクセス可能なすべての要素を、高品質で再生可能な親和性試薬の需要を満たすために別の方法が開発された。そのために、ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーからの選択を行うためのハイスループット法は、多様な抗原を伴う用途のために考案されており、迅速なスループットと成功のために最適化された。ここで、プロトコルは、ビデオデモを手動96チャンネル液体ハンドラーまたは自動ロボットシステムのいずれかを使用してターゲットの数百に対して高い多様性ライブラリからのFabファージクローンの並列選択を示して詳細に説明する。このプロトコルを使用して、1人のユーザーが抗原の数百を生成することができ、並行して、それらに対する抗体を選択して、6〜8週間以内に結合する抗体を検証する。強調表示は、i)生存抗原フォーマット、ii)の事前選択抗原の特徴付け、iii)の特異的かつ高親和性クローンの選択に影響を与える重要なステップが、監視の選択の有効性および早期の抗体クローンの特徴付けのiv)の方法。このアプローチでは、我々は、シングルパス膜受容体を含む多くのターゲットクラスに分泌されるタンパク質ホルモン、及びマルチドメイン細胞内タンパク質を合成抗体断片(Fabを)取得している。これらの断片は、容易に完全長抗体に変換され、高い親和性および特異性を示すことが確認されている。さらに、それらは、ウエスタンブロッティング、ELISA、細胞の免疫蛍光、免疫沈降、および関連アッセイを含む標準的な免疫アッセイの様々な機能的であることが実証されている。この方法は、抗体の発見を加速し、最終的に目標Oの実現に近づく私たちをもたらすでしょうfのプロテオームの再生、高品質な抗体を生成する。

Introduction

ポストゲノム時代の開始と、特徴づけるおよびタンパク質を調節する高品質の結合試薬の利用可能性は、新たな研究および治療の道を開くことが不可欠である。抗体は、基礎研究および診断ツールおよび潜在的な治療薬として、学術および産業研究者の両方に重要であり続ける。当然のことながら、カスタム抗体を生成するために、従来のハイブリドーマ技術に依存してそのほとんどが契約抗体開発企業の印象的な成長があった。それにもかかわらず、ファージディスプレイ抗体ライブラリー用いたin vitroの選択は、従来の技術では限界が1、2に直面することできますユニークな利点と成功を提供することができる強力な代替技術になりつつある。

研究ツールとして、高品質の抗体についてのかなりの需要に照らして、再生可能な抗体を生成するための2つの主要な課題は、1)選択スループットおよび2)抗原avはあるailability。グループの数は、現在のスループットおよび抗体認識の速度を増加させることを目的とインビトロ選択パイプに記載されている。これらの説明は、詳細完全長ビーズベース6,8-またはプレートベース3,4抗原固定化スキームのいずれかを使用して、3,4、または構造的に関連するドメイン5,6,7を標的とするいずれかの際に選択することを含む実行可能な種々のアプローチを。さらに、遺伝子合成技術9の成長採用が合理的に費用効果と潜在的に精製された、完全長の抗原の十分な量を得ることが困難を緩和することができ、特に、単離されたドメインから、体系的抗原の生成を行った。タンデムに二つの技術を用いて、自己完結型のスケーラブルな抗原生成および抗体選択パイプラインは、発現される抗原ドメインの大きなセットのための抗体の並列単離を可能にし、茶のための試薬の開発を容易にするよう考案された構造的または機能的に関連するタンパク質の全体のクラスをracterizing。

この目的、表現可能な抗原ドメイン、遺伝子合成のインシリコ同定カップル統合されたパイプラインに向けて、抗原と拡張性のファージディスプレイされた抗体の選択のハイスループット細菌発現が開発されている。このパイプラインは、(ライセンスまたは材料移転契約を通じて、ますます利用できる抗体ライブラリを含む)は、ほとんどの生命科学研究室が利用できる唯一の​​基本的なインフラを必要としますが、工業規模での使用のためにも、自動化に適している。このプロトコルを使用して、親和性タグ化抗原ドメインの数百を生成することが可能であり、日常的には、これらの抗原の多くに非常に特異的な抗体断片を単離する。

ファージディスプレイ技術は、Fab、scFvは、自律のFvドメインであり、aを含む組換えアフィニティ試薬のさまざまな形式で実証互換性を示している小さ ​​な「代替フレームワーク」(設計されたアンキリンリピートタンパク質(ダルピン)、フィブロネクチン(FN)、リポカリンドメインと10以上)の成長配列。それは、これらの方法は、ライブラリーの他のタイプに適合させることができると推測されるが、議論は、Fab抗体フラグメントの単離この実施例では制限されている。この技術を用い、小さな低ナノモル親和性を有するFabを、全長タンパク質に結合し、そのような免疫蛍光法などのイムノアッセイにおいて機能的である多くはRNA結合タンパク質などが正常に選択された転写因子ドメイン、SH2ドメイン、を含むタンパク質ドメインをタグ付け、免疫沈降および免疫組織化学。重要なのは細菌の生産の提供を通じて、組換え結合クローンは、完全に再生可能であると表現構築から再生成することができ、したがって、厳密なクローンの検証の費用を正当化、一貫性、再現性と費用対効果を増加させた。

このPROTでocol及び添付ビデオは、固定化抗原ドメインを使用してファージディスプレイライブラリーからの抗体選択のための基本的な方法が実証されている。この特定の方法はまた、首尾よく使用されてきた13,14,2他のタグ11,12,13および選択フォーマットが、マイクロウェルプレートに受動的吸着により固定化されたGSTタグ付きタンパク質ドメインを使用する。特定と検証のために特別に濃縮されたクローン性抗体を単離することを目的とした選択パラメータの並列モニタリングと選択の設定や行動のための重要な考慮事項が詳述されている。

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Protocol

1.抗原ジェネレーション

注:抗原ドメインを合成し、適切なIPTG誘導発現構築、商用、さまざまなベンダーによってクローニングすることができる。

  1. 化学的にコンピ、T1-ファージに発現構築物をトランスフォーム耐性、BL21 E.化学的コンピテント細胞の20 Lを加えた96ウェルPCRプレート中で、氷上で1×KCM20μlの中でDNAをコードする10ngの混合による大腸菌細胞
  2. 室温で10分間、20分間、氷上で細胞/ DNA混合物をインキュベートし、次いで氷上で再び2分間通気性のプレートシールで、グルコース(SOC)培地で予め加温し超最適ブロス100μlのレスキュー覆う前と2.5センチメートルオービタルシェーカーで200rpmで1時間37℃で振とう。
  3. ルリア - ベルターニ(LB)カルベニシリンを補充/寒天プレート(100μg/ mlの)とのために使用される単一のコロニーを得るためにO / Nを成長する上で形質転換細胞のプレートを5μlグリセロールストックを生成する。
  4. 5μlのグリセロールストックとの2YT /炭水化物のメディアの1ミリリットルを接種し、2.5センチメートルオービタルシェーカーで200rpmで振とうしながら96ウェルディープウェルブロック中で37℃で12時間成長する。
  5. NZYのmedia15に接種し、この培養物の1:40希釈物と(0.05%グルコース、2%のラクトース、および100μg/ mlのカルベニシリンを補充した)、その後2.5センチメートル軌道で30℃、200rpmで6-8時間振盪シェーカー。
  6. ペレット細菌および以前に公開protocols16,17に従ってNi-NTA樹脂を100μlを含む96ウェルフィルタープレートでハイスループットで抗原タンパク質を精製する。
  7. ブラッドフォード色素結合assay18によって精製したタンパク質の濃度を測定し、SDS-PAGEゲル上で分離し、クマシー染色で10〜50μgのの可視化によって大きさや純度を特徴づける( 図2を参照)。
    注:この段階で、タンパク質はさらに、タンパク質凝集19を評価する方法を特徴とすることができる20を折り畳む。

ファージライブラリーの調製と滴定

  1. T1ファージ耐性E.の単一コロニーを選択してください大腸菌を50μg/ mlのテトラサイクリンを補った2YT培地の1ミリリットルへの細胞。
  2. 細胞増殖が視覚的に確立されると、2YTの大きなボリュームでの培養を希釈(ライブラリー希釈につき、一般45μL、下記参照。)感染症のための細胞の十分な容量を確保するために、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足した。
  3. 30分間ペレット化、氷上でインキュベートし、オートクレーブ処理の20%PEG-8000の1/5体積、2.5 MのNaCl(PEG-NaCl)で保存緩衝液からのファージを沈殿させることによって使用するためのライブラリーを作製するには、12000×gで遠心分離することによってファージを沈殿させた。
  4. 上清及び再懸濁をtを調整すること、1×PBS pH7.4中、0.2%BSAおよび0.05%のTween(PBT)の適切な容量のファージを沈殿させ捨てるOの選択のための適切なファージの濃度は、必要に応じて、適切なライブラリのカバレッジを確保する。ステップ2.9と議論を参照してください。
  5. 、無菌のマルチウェルプレートに1×PBS pHが7.4の45μLに5μlのファージのアリコートを希釈混合し、同じ緩衝液中で10倍希釈系列を作成します。
  6. T1ファージ耐性Eの45μlに各ファージ希釈の5μlを添加する。大腸菌別のマルチウェルプレート中で対数増殖期(OD 600 = 0.4〜0.8)の細胞は、通気性のシールでカバーし、2.5センチメートルオービタルシェーカーで30分間、200rpmで振とうしながら37℃でインキュベートする。
  7. 100グラム/ mlのカルベニシリンとコロニーが見えるまで37℃でO / Nを成長さを補った予め温め寒天プレートに上のウェルのそれぞれから感染した細胞のプレート5μL。
  8. 次のように全体のファージ/ mlのを計算します。
    最も希薄サンプル×200×10 のi(ただし、i =最大NUMでカルベニシリンプレート上のコロニーのファージ/ mlの=数希釈液のファイバれるコロニー)が明らかである。
  9. 次のようにライブラリの多様性のカバレッジを確保するために、コーティングされた抗原井戸の数を決定するには、計算します。
    コー​​ティングされた抗原井戸の数が必要=
    理想の倍のカバレッジ*ライブラリの多様性
    100μlのあたりファージの#

ファージディスプレイライブラリーから3抗体選択

3.1)抗原の固定化

  1. 抗原の品質に影響を与えることができるし、希釈を容易にするために、凍結融解サイクルを回避するために、非結合96ウェルプレートの中の100×作業濃度( 例えば、500グラム/ ml)のアリコートに正規化ストック抗原タンパク質プレートを準備。
  2. PBSでストックプレートから希釈することにより、1日以前の選択の各ラウンドに株式タンパク質溶液からの抗原でコーティングされたプレートを準備します。
  3. GSTタグ化抗原タンパク質または陰性対照pの100μlのコート96ウェル高タンパク質結合性ポリスチレンプレートrotein PBS中5μg/ mlの(GST、BSA、ニュートラアビジン等)。マイクロプレートシェーカー上で250 rpmで4℃CO / Nで振る。
  4. コー​​ティングされたからのタンパク質溶液を除去するマイクロプレート、緩衝液(1×PBS pH7.4中の0.2%BSA)でブロックし、200μlの抗原コーティングされた、負の選択プレートをブロックし、1〜2時間、室温で250rpmで振とうする。
  5. ブロッキング後、0.05%のTween(PT)手動または自動化されたマイクロプレート洗浄機を使用してバッファーで1×PBS pH7.4の200μlのブロックされたタンパク質でコーティングされたプレートを4回洗う。

3.2)ライブラリプリクリアランスおよび抗原ファージインキュベーション

  1. ネガティブコントロールタンパク質または無料の親和性タグでコーティングしたウェルの数にPBT緩衝液中で調製ファージライブラリを100μl(10 12ファージ)の移動を介して非(またはTAG-)特異的結合ファージディスプレイ抗体フラグメントクローンのライブラリーを破壊するタンパク質( 例えば、GST)ターゲットの数に相当し、ファージをインキュベート250rpmで振とうしながら室温で1〜2時間のためにウェル中。
    注:代替またはネガティブ選択の追加の手段として、インキュベーションはまた、過剰の存在下で実施することができる(5-25μM)可溶性タンパク質の親和性タグ( 例えば、GST)をさらにタグ結合クローンを除去し、特定のターゲットの回復を促進する結合クローン。
  2. 抗原コーティングしたプレートにネガティブ選択からのファージ上清を移し、特異的結合クローンの捕獲のために、250rpmで振とうしながら室温で1〜2時間インキュベートする。
  3. 未結合のファージを除去し、マイクロプレートのウェルを洗浄8-15回PT緩衝液で手動またはマイクロプレートウォッシャーを使用して。溶出直前に過剰洗浄バッファーを削除します。

3.3)溶出、感染およびファージ増幅

  1. 初期の選択の日には、T1ファージ耐性E.の単一コロニーを選択大腸菌 2YT培地の1ミリリットルへの細胞を、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足し、37℃ののWiで成長2.5センチメートルオービタルシェーカーまたは同等で200rpmで振盪番目。
  2. 細胞増殖が確立され、目で見ることができたら2YTは(一般的に選択当たり100μlウェル)感染細胞の十分な容量を確保するために、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足して、メディアの音量を上げる。
  3. 0.4〜0.8のOD 600が結合したファージを洗浄した抗原プレートに細胞100μlを追加し、30分間37℃で振る溶出するために、次に、(約5-7時間)に達するまで細胞を増殖させる。
  4. 1×10 10 cfu / mlでの最終濃度になるようにM13K07ヘルパーファージを加え、200rpmで振盪しながら45分間37℃でインキュベートする。
  5. 2YTの1.2ミリリットルに転送細胞はV底96ウェルディープウェルブロックに150 / mlのカルベニシリンおよび75 / mlのカナマイシンを添加し、2.5 cm単位で200 rpmで振とうしながら37℃でO / Nを育てるオービタルシェーカー。

3.4)は、ファージの調製とセレクの繰り返しラウンドン

  1. 4℃で15分間、4000×gでの遠心分離によってペレット細菌。
  2. 10X PBTの1/10容量で中和し、ミックス、ミニチューブ、96ウェルの滅菌マイクロプレート青いボックス内で複製プレートからのファージ上清を等量混ぜる。選択の繰り返しラウンドは3-4ラウンドの( ステップ3.1.1から開始)または濃縮が観察されるまで負の制御タンパク質と比較して(セクション4と7を参照)。
    注:選択の初期段階で重要な/検出可能な濃縮は予想されないとき( すなわち、1丸めおよび2)、( 図3に示す第7の代表的結果参照)入力および出力ファージ力価の定量を確保するのに役立つかもしれない(ディスカッションに記載されている)成功した​​選択のための最小のファージ濃度と、プールのELISAよりも適切である。

プールされたELISAによる4キャラクタリゼーション

  1. コー​​ト96ウェル高タンパク·バインド3.1項に従ってを2μg/ mlの抗原タンパク質または陰性対照タンパク質(GST、BSA、ニュートラなど)のGSTタグ付き100μlのポリスチレンプレートをると4℃CO / Nで振る。
  2. 、過剰抗原を外しマイクロプレートシェーカー上で250rpmで、室温で1〜2時間振盪しながらブロッキング緩衝液200μlのプレートをブロックし、どちらの手によってまたは自動プレート洗浄機により200μlのPT緩衝液で4回洗浄する。
  3. 、RTで15分間、250rpmで振とうし、200μlのPT緩衝液でプレートを8回洗浄するファージ上清(PBT緩衝液中の20:10-1 1に希釈)を100μlを適用する。
  4. 抗M13-HRPを100μl(:PBTバッファ内の5000 1)を追加します。その後、200μlのPBSで二回200μlのPT緩衝液でプレートを6回洗浄し、RTで30分間、200rpmで振とうする。
  5. 1100μlの適用:1 TMB基質を5〜15分間の開発(又は実質的な色が開発されるまで)、その後1 MH 3100μlを添加することによって反応を停止4および450nmでプレートを読んだ。
  6. 一般的には、ファージプールにおける濃縮は> 2の非特異的結合に対する特異的結合の割合としてラウンド3-4で観察することができる( 図4参照)。
    注:これは、(むしろ、標的結合剤よりも)、タグ固有の結合剤の濃縮を示し、負の対照タンパク質に対するその高い絶対結合シグナルは非特異的富化を示し、または「アフィニティータグタンパク質上の高い絶対結合シグナルに留意することが有益であるスティッキー "のバインダー。

5.クローンの選択、配列決定および特性評価

シングルのFabファージクローンの5.1)の単離

  1. シークエンシングおよび特性のための個々のクローンを単離するために、T1ファージ耐性E.に中で増幅ファージプールの10分 1の体積に感染大腸菌丸底マイクロタイタープレート中で対数増殖期(OD 600 = 0.4〜0.8)の細胞は、breathaでカバーBLEプレートシール及び37℃で30分間、200 rpmで振盪しながらインキュベートする。
  2. 2YT培地で10倍連続希釈液を調製し、100グラム/ mlのカルベニシリンを補充した独立した寒天プレート上にプレートアウト。
  3. 1×10 9 M13K07ファージ/ mlの補充した2YT /炭水化物のメディアの450μlに、単一のコロニーをピックアップし、200 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートミニチューブ96ウェル無菌のマイクロプレート青いボックスにO / Nを育てる。
  4. 4℃で10分間4000×gでスピンによってペレット細菌。
  5. クローンのファージ上清を代表的な結果をに示す。いるのFabファージクローン(5.4節で説明したように)、または固定化された抗原に対して特異性を決定するためのクローンの直接結合ELISAのために(セクション5.3および21に記載)の配列決定のために使用することができる5。

特徴付けのためのFabクローン5.2)式

  1. 以下の適切な電子へのクローニングXPRESSIONベクトル(説明を参照)、シングルEを選ぶ大腸菌表情で形質転換されたコロニーを滅菌した爪楊枝またはピペットチップを用いて96ウェルディープウェルプレートで2YT /炭水化物のメディアの1ミリリットルの中に構築し、200rpmで振とうしながら、37℃で12〜16時間、成長する。これは、手動または自動化コロニーピッカーを用いて行うことができる。
  2. Studier の方法論に従って96ウェルディープウェルブロックにグルコース/乳糖/グリセロールを補ったNZY培地の1.5ミリリットルに成長している文化の40μlの移転。15
    注:あるいは、細胞は、非補充1mMのIPTGの添加によって誘導されたタンパク質の発現に3-4時間(OD 0.8~1.0)のために増殖させることができる。
  3. 通気性のシールとの文化ブロック(複数可)をカバーし、200 rpmで振とうしながら30℃で6〜8時間、Fabクローンを発現する。 15分間4000×gでスピンプレートは、細菌細胞をペレット化して上清を除去、カバープレートホイルシールで、溶解するまで-20℃でペレットを凍結する。
  4. 100μlの溶解バッファー(トリスHCl 50mMの、200mMのNaCl、1.25%トリトンX-100のpHを1mg / mlのリゾチーム及び10 Uベンゾナーゼ/ mlで培養し、プロテアーゼ阻害剤と8.0)で収集したペレットから発現されたFabを解放し、2振盪4℃でhr。
  5. (5.3節を参照)を4℃で15分間4000×gでの遠心分離により細胞破片を除去し、ELISAプレートによる特異性の初期特性評価で使用するための粗溶解物の上清を収集します。

クローンのFab ELISAを直接結合することによって5.3)クローンキャラ

  1. 代わりに384ウェルプレートのウェルにPBS中2μg/ mlの抗原を30μlを等分3.1節で説明したように抗原を固定化。 96チャネル·ベースの分注ヘッドを使用するときにプレートのクワッドベースの抗原のレイアウトは、試薬移動を容易にすることができる。 3.1節に従って洗い、ブロックELISAプレート。
  2. から収集クリア溶解物 5.2節には、EVAの固定化抗原に直接適用することができるバインディングのluation。 200 rpmで振とうしながら室温で15分間、ウェルあたりの溶解物の30μlのをインキュベートする。
    注:精製のFabクローンのタンパク質が交互に説明したのと同じ方法で、PBT緩衝液中10μg/ mlに希釈し、抗原または陰性対照タンパク質(GST、BSA等)を含有するブロックされたウェルに各クローンの30μLを印加し、現像することにより使用することができ以下に。あるいは、Fabをファージは、ファージ10μlの上清を希釈して使用することができる20μlのPBT緩衝液(セクション5.1を参照)(1:3)と(ステップ4.4に記載さ - 4.5)、抗M13-HRP抗体を用いて検出する
  3. 過剰溶解液を取り出し、ウェルを洗浄し、手動または自動化されたプレートを用いたPTバッファー100μlで8倍速を洗浄し、余分なバッファを削除します。
  4. 200 rpmで振とうしながら室温で30分間、PBTバッファ内の二次抗FLAG抗体の5000希釈:1の30μlのをインキュベートする。
  5. 洗って、開発し、セクション4.3に従って定量化する - 4.5。
    注:代表的な結果特異的および非特異的結合クローンの両方を示すが、図5に示されている。

5.4)クローンの配列決定

  1. 表2に示したようにPCRマスターミックスを調製する。
  2. PCRプレートのウェルに適切なプライマーを用いて調製したPCRマスターミックスの20μlに適切なPCRテンプレート(ファージ上清または再懸濁シングルファージミド含有細菌コロニーのいずれか)の2を添加する。
    注:個別のマスターミックスは、両方の重鎖および軽鎖遺伝子の配列決定のために必要とされる。
  3. PCR設定- 表2に示すパラメータを用いてPCR反応を実行します。
  4. 300 nmのネーター上DNA可視化染色および画像化を補充し、1%アガロースゲル上にローディング色素との反応終了液5μlを混合してPCR反応の成功を確認する。
  5. 0.2を含む滅菌水10μlにPCR産物2μlのを追加します。;およびエキソヌクレアーゼおよびエビアルカリホスファターゼの各μlの配列決定のための準備として、過剰のプライマーを除去するために10分間80℃で酵素を不活性化し、20分間37℃でインキュベートする。

自動選択6.スケーリング

6.1)ピペットベースのリキッドハンドリング

  1. 水中1%(w / v)のブロモフェノールブルーを用意し、0.45ミリリットルのフィルタを使用して不溶性粒子を除去する。
  2. (16希釈液合計)水中1%ブロモフェノールブルー溶液の千希釈し、2倍連続希釈を続行:プレートリーダーで吸光度の直線範囲を決定するには、1を準備します。
  3. 平底96ウェルプレートに各希釈液100μlを移し、590nmで吸光度を読み取る。希釈係数に対してプロット絶対吸光度とその後の試験のための線形範囲のハイエンド半ばでの希釈を選択します。
  4. 水にまたは実際の溶液にブロモフェノールブルーを追加します。それは、3 96ウェルプレートにピペット操作のための十分なボリュームに加え、リザーバ内のデッドボリュームで、前の手順で選択した希釈に基づいてピペットでされます。
  5. 化学天秤に水をピペッティングしてテストボリュームを実現するシングルチャネルピペッターのキャリブレーション(水100μlをRTで100mgの重量を量る。)
  6. 較正されたピペッターを使用して、平底96ウェルプレートのうちの少なくとも3つのウェルを染色溶液の試験体積を転送し、トリプリケートで、590nmでその吸光度を読み取る。
  7. 化学天秤で3つの空の平底96ウェルプレートを秤量し、その質量を記録します。
  8. 3枚の96ウェルプレートのそれぞれのリザーバからピペットテスト容積と連で、590nmでその吸光度を測定する。
  9. 各プレートを計量し、質量の差を計算する。
  10. まず、( 例えば 、±5%)を各ウェルの吸光度が許容範囲内で均一であるかどうかを評価し、それらが目と一致するかどうかE吸光度を校正ピペットマンで手ペッティングにより得られた。特定のチャンネルが(例については、 図6を参照)一貫して過大または過小配信している場合は、修理手順に従い、すべてのチャネルが均一のボリュームをお届けするまで、評価手順を繰り返します。
  11. 第二に、一度すべてのチャネルが、ウェルあたりの平均質量差を算出することにより、そのボリュームの正確さを確認する、均一なボリュームを提供することが確認されている。例えば、100μlのために設定完全に校正液体ハンドラーはプレートあたりの水の9.60グラム、またはウェルあたりの水の0.10グラムをお届けします。配信実ボリュームは、意図ボリューム上にまたは下に一貫している場合には、補正係数は、実際に100μLを送達するために、110μlのプログラミング、すなわち 、適用することができる。
    注:ABことを保証するために、手で96ウェルプレートに小さなボリュームの場合、 例えば、10μlの、染色溶液中で10倍以上のブロモフェノールブルーを使用し、水のプレアリコート90μlのsorbancesは測定可能であり、線形の範囲に入る。

6.2)自動プレート洗浄

  1. セクション3.1で説明したように(各条件のための2つのプレートが試験される)を、96ウェルマイクロプレートの別々のウェルに陽性標的およびネガティブコントロールタンパク質を固定化する。
  2. 室温で1時間、ブロッキング溶液とのインキュベーションにより非特異的結合部位をブロックする。
  3. 10 13 CFUの同一の100μlアリコートを追加/すべてのプレート内のすべてのウェルにPBT中のFab-ファージ溶液を結合標的および室温で2時間穏やかに攪拌しながらインキュベートミリリットル。
  4. 、それぞれの条件に応じて感染し、滴定およびELISA用1プレート用1プレートを二つのプレートを洗ってください。
  5. (第4節で説明したように)抗M13 HRP抗体および比色基質または開発((M13K07追加)と7.2.1ずに3.3節で説明したように)、細菌や滴定への直接感染による洗浄の有効性を評価する。
  6. ファージ力価のFRオム特異的クローンは、多くの場合、クローンは特異的に結合し、それに対して固定されたタンパク質からの10 5〜10 7ファージ/ mlの範囲で得られる。陰性対照タンパク質( 例えば、BSA)への結合が予想され、一般的に10 2〜10 5ファージ/ mlのが観察され、しかし、非常に低い力価いくらかの残留( すなわち 、<10 1)が損なわれる可能性が過度にストリンジェントな洗浄を知らせることができる選択。
  7. ELISAによって決定され、結合したファージは、ロボットの洗浄が確立手洗い結果( 図7)と同等であるかどうかを決定するために正と負の対照タンパク質の絶対結合シグナルと比較する。

6.3)プレート洗浄除染

  1. 開始するには、試験対象の除染プロトコルを実行。
    注:我々は、少なくとも二重の総ライン容量を使用することをお勧めし、プライムと、0.5%の次亜塩素酸ナトリウム中で5分間新たに希釈したFRをワッシャーヘッドをソークオム市販の漂白剤(典型的には6%の次亜塩素酸ナトリウム)。
  2. ラインまで、首相及び滅菌(オートクレーブ処理)を水に5分間ワッシャーヘッドを浸して、最終的に、プライムシステムは、空気に満ちている。
  3. 首相滅菌水または洗浄緩衝液でライン。
  4. 一度無菌の96ウェルマイクロプレートを洗浄し、滅菌したプレートシールで洗濯機とシールから削除する。これは、事前汚染制御板である。
  5. アリコートO / Nの100μlを96ウェルプレートの全てのウェルにファージ培養上清を増幅した。
  6. 一度ファージ含有プレートを洗浄し、その後洗浄機から取り外し、プラスチックまたはホイルプレートシールで密封する。これは、汚染制御板である。
  7. テストされている除染プロトコルを実施する。この例では、繰り返しは6.3.1と6.3.2を繰り返します。
  8. 一度無菌のマイクロプレートを洗浄し、その後洗濯機とシールから削除する。これは、汚染除去試験プレートである。
  9. 対数期のE.のプレート50μL滴定プレートに大腸菌 ;これは、事前infecあるション制御板。
  10. 事前汚染、汚染や除染96ウェルプレートを開封し、Eの100μlを添加する各ウェルについて新しいチップを使用して全てのウェルに、対数期の成長段階において、大腸菌 、。
  11. 密封し、200rpmで30分間37℃でインキュベートする。
  12. 10cmの2YT /炭水化物のプレートに各96ウェルプレートの3ランダムウェルからプレート感染細胞50μlを、37℃CO / Nでインキュベートする。
  13. 1ミリリットルの2YTプラスウェルあたり100グラム/ mlのカルベニシリンを含むディープウェルプレートに各プレートの全てのウェルからの転送、感染細胞50μlを、37℃でO / Nを育てる。
  14. 除染プロトコルを繰り返し、ドライワッシャーラインを残す。
    注記:プレートまたは液体培地中でなしO / Nの成長は、感染前制御、プリ汚染制御または汚染除去試験プレート上で観察されるべきである。多くのコロニー、成長、汚染制御プレート上で観察されるべきである。の有効性についてではない場合、何の結論ない汚染除去プロトコルを行うことができる。理想的には、除染のプレートはコロニーとO / NプレートのウェルのいずれにもO / Nの成長をもたらすません。除染プロトコルのストリンジェンシーは、より長い時間と追加のサイクルを浸す、高い漂白剤濃度を増加させることができる。

7.入力/出力滴定

7.1)入力ファージ滴定

  1. 滅菌濾過したPBSで50μlにファージの5μlアリコートを希釈し、混合する。
  2. マルチチャンネルピ ​​ペットまたは96チャンネルピ ​​ペッターを用いて10〜10に滅菌濾過PBSで連続10倍の希釈を準備します。
  3. T1ファージ耐性E.の45μlに中に希釈したファージ5μlの接種大腸菌の対数増殖期の細胞(OD 0.6~0.8)、37℃で30分間通気性シール付きカバーさインキュベートする。
  4. プレートを100μg/ mlのカルベニシリンを補充したLB /寒天プレートに上に感染した細胞の5μLとO / N AをインキュベートT 37℃。
  5. ファージ濃度はコロニーは2.8節で詳述の計算によると表示されているほとんどの希薄サンプルから推定することができる。

7.2)出力ファージPitrations

  1. E.を添加することによって、プレートに結合したファージの溶出を以下の大腸菌の細胞は、オートクレーブ処理2YT培地で50μlにファージ感染細胞の5μlアリコートを希釈
  2. マルチチャンネルピ ​​ペットまたは96チャンネルピ ​​ペッターを用いて10〜6オートクレーブし2YT培地で連続10倍希釈を準備します。
  3. プレート5100μg/ mlのカルベニシリンを補充した寒天プレートに上の感染細胞のμL、37℃でO / Nインキュベートする。
  4. ファージ濃度はコロニーは2.8節で詳述の計算によると表示されているほとんどの希薄サンプルから推定することができる。
    注:いずれの場合も( すなわち、入力および出力ファージ力価、両方のテトラサイクリン上のコロニー数との比較(合計CELリットル数)およびカナマイシン(ヘルパーファージ力価)も有益であり得る。

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Representative Results

本明細書中に記載されるプロトコルは、並行して、コンビナトリアルファージディスプレイされたFabライブラリーからstructurally-と機能的に関連する抗原ドメインの両方の様々な抗体断片を単離するために使用されている。抗原の可用性に関連する問題は、抗体の選択23に適している発現可能な抗原ドメインのインシリコ同定によって、多くの場合、回避することができる。 ( 図1)は、同じ実験室内抗体選択に抗原発現を結合することにより、選択に重要な抗原パラメータをより容易に制御することができる統合されたパイプラインを構築することが可能となる。ほとんどの場合、ドメインの境界を注意深く決定は、抗体選択における使用の成功のために96または24ウェルディープウェルプレート( 図2)において、ハイスループット表現から十分に純粋な抗原の十分量の発現および単離を可能にする。相次ぐ中、選択プロセスのラウンドは、抗原に特異的に結合溶出したファージの濃度およびファージの濃縮は、ELISAアッセイのいずれかにおいて、ファージ滴定( 図3)またはファージプールを有する( 図4)によってモニターすることができる。結合比(> 2)は、一般に、特異的結合クローンの存在を示す。逆に、低い比率は、(<2)選択の失敗の原因を判断するのに役立ちます。例えば、高い非特異ODとの比<2は、非特異的クローン(または粘着性の結合剤)の不十分な除去を示すことができ、選択プロトコルのさらなる最適化を保証することができる。濃縮が検出されると、それにもかかわらず、個々の高親和性クローンを配列決定および特徴付けのために単離することができる。結合クローンは、比色イムノアッセイを特徴と陰性対照タンパク質に対して固定化抗原へのFabファージまたはFabの結合の比較を可能にし、濃縮の測定値が得られることができる(taのへの結合との比陰性対照タンパク質またはアフィニティータグタンパク質)( 図5)に対する目標。

スケーリングと、この方法の自動化の際に、液体処理ユニットの主要な機能の評価は、実際の選択の際に使用されるものと同様の溶液を用いて、適切かつ正確な動作を保証するために役立つことができる。溶液中の吸収発色団の使用は、流体工学(吸引又は分配)における特定のチャンネルがどちら目詰まりまたは図6に示すように、部分的な量の送出をもたらすシールを失ったときを検出するのを助けることができる。自動洗浄ユニットはまた、変動の原因であることができると注意を必要とすることができます。既知の結合クローンの使用は、分配速度、洗浄量及び洗浄回数として洗浄パラメータが最適化されているときに、背景を除去バインディングながら維持される結合標的( 図7)を確保する目標制御タンパク質との結合の比較を可能にする。以下ファージ溶液による自動プレート洗浄機を使用することは、効果的な汚染除去プロトコルは選択の連続ラウンドまたは異なる選択手順からの交差汚染が存在しないことを確保するために必要であり、トラブルシューティング/通訳ガイドを表3に提供される。

図1
図1.概要-ハイスループット抗原の産生および抗体選択パイプラインはこの概要では、代表的な抗原生成および抗体選択パイプラインのステップバイステップの視覚化を示している。抗原ドメイン境界のインシリコ同定が不十分特徴とすることができるタンパク質のためのドメインの際に遺伝子合成、発現、および選択を可能にする。発現された抗原ドメインが固定化し、共同で、特定の高親和性抗体クローンのプールを単離するために使用されている繊維状ファージの表面に提示mbinatorial抗体ライブラリー。個々の抗原から溶出し、増幅された抗体-ファージのプールは、次に前の特徴付けのために個々の結合クローンの単離に陰性対照タンパク質に対して固定された標的を比較するELISAベースのアッセイにおいて、特異的結合クローンのラウンドからラウンドの富化をモニターするために用いることができる。 くださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
親和性タグ化抗原の図2. SDS-PAGEの可視化。もともと抗原のインシリコ分析により同定し発現させ、精製6X-HIS-GSTタグ付き抗原ドメイン(5-10 kDaのドメイン+ 26kDaのGST)の代表的なSDS-PAGEドメイン境界。タンパク質ドメインを発現させ、アフィにより単離無限大の精製は、ファージ-抗体の選択で使用することを可能にするためにサイズベースのID、十分な収率および純度を確保するために以前の選択にSDS-PAGEによって特徴付けられる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3のファージ出力力価の可視化ファージ出力力価を最低希釈を決定するために種々の抗生物質(テトラサイクリン、カルベニシリンおよびカナマイシン)を補充した寒天培地上で10倍希釈系列を介したファージを感染させた細胞をプレーティングすることによって決定されるコロニー観察し、ファージ抗原を標的に結合し、溶出したの数を見積もることができます。 大型を見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のRバージョン。

図4
プールされたELISAによる陰性対照タンパク質に対する標的の比の結合を図4。濃縮の進行は、特定の標的およびネガティブコントロールタンパク質および/ ​​または単離された親和性タグの両方に対する個々の増幅溶出液をスクリーニングすることにより、選択の次のラウンドを評価することができる。プロットに示した並列で陰性対照タンパク質に対するそれらの96のそれぞれの抗原に対して96個のファージ - 抗体プールの結合の濃縮比である。各比の値は、M13ファージコートタンパク質に特異的なHRP融合抗体を用いて、標的または陰性対照タンパク質のいずれかにファージプールの結合を定量化する2吸光度測定値から導出される。 (赤色で示されているように、多くの場合、2-10又はそれ以上の範囲)が2以上の比率閾値は、濃縮の指標として使用されると特異的結合クローンの存在の可能性。レッサー比率は、プロトコルのさらなる最適化を保証することが選択での障害や特定の問題を意味することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5に直接結合クローンのFabファージまたはFab ELISA(FabをファージまたはFab形式でも)単一クローンの結合は、384ウェルプレート中の固定化タンパク質に対するELISAに基づくアッセイによって評価することができる。結合は、FabをファージまたはFabに対する親和性タグにM13コートタンパク質に対する二次HRP融合抗体を用いて検出される。標的抗原へのクローンのFabファージの結合を、陰性対照タンパク質と抗原親和性タグ(GST)の生の吸光度値は、特定の双方向を示す図示されているnders(A01、A04、A06)、及び粘着性の結合剤(A05)。

図6
自動液体処理装置により分配されたボリュームの図6の評価。、ロボットまたは手動の96ウェルピペッティングシステムによる意図した容量の一貫したかつ正確な送達は、染色溶液およびプレートリーダーを用いて評価することができる。この例では、ブロモフェノールブルーを含有する溶液10μlを、単一のチップボックスを使用して、2つの96ウェルプレートの全てのウェルにピペットで逐次ある。各ウェルは、感染したEにヘルパーファージを添加する90μL/ウェルのdH 2 O、類似含まれていますコリ。590nmにおける各プレートの吸光度を三連で読み取られ、ボリュームは、標準曲線から内挿し較正され、単一のチャンネルピ ​​ペットマンを用いて調製される。第一及び第二のプレート上の単一の行に配信ボリュームが表示されます。モミ上のことに注意してくださいトンプレートは、ウェルE04は、染色溶液を受信しないと、第二のプレートには、二重の体積を受け取る。これは、チップタッチ一貫した送達するために十分ではないことを示し、更なる最適化を必要とする。三重の吸光度測定のための95%信頼区間を示す。

図7
自動プレート洗浄の図7の評価。結合していないファージの効果的な除去は、洗浄条件を変化させて固定化した陽性(抗FLAG抗体)と負(BSA)コントロールタンパク質に結合するFabをファージを測定するためにELISAを用いて評価することができる。この例では、ナイーブライブラリー(PBT 10 13 cfu / mlで)に類似した入力ファージは、手で、8個または16回の洗浄を使用して、ロボットを使用して除去される。固定化した抗FLAG抗体との特異的結合であるとしてBSAへの結合残留ファージは、すべての条件で同じである、インド語この低い流速で、両方の方法が同等と十分にストリンジェントであることating。二連のウェルからの95%信頼区間を示す。

ソリューション
2YT培地 - 、1 Lに水を加え、pHを7.0に調整し、オートクレーブ。 酵母エキス 10グラム
トリプトン 16グラム
NaClを 5グラム
NZY培地(1 L) NZアミン 10グラム
酵母エキス 5グラム
50X ZYM-5052 20ミリリットル
20塩の株式 50ミリリットル
50倍ZYM-5052の砂糖の株式(1 L) グルコース 25グラム
乳糖 100グラム
グリセロール 250ミリリットル
20倍塩ストック(1 L) のNa 2 HPO 4 500 mMの
KH 2 PO 4 500 mMの
NH 4 Clを 1 M
をNa 2 SO 4 100 mMの
カルベニシリン(炭水化物): 水中の100 mg / mlの。フィルター滅菌する。
カナマイシン(菅): 水中で25 mg / mlの。フィルター滅菌する。
テトラサイクリン(テト): 水中の10mg / mlの。滅菌フィルター。
PEG-NaClを PEG
NaClを 2.5 M
1×PBS(pH7.2で) NaClを 137 mMの
塩化カリウム 3 mMの
のNa 2 HPO 4 8 mMの
KH 2 PO 4 1.5 mMの
1X KCM 塩化カリウム 500 mMの
のCaCl 2 150 mMの
のMgCl 2 250 mMの
SOCメディア酵母エキスを5g / L
トリプトンは20g / L
NaClを 10 mMの
塩化カリウム 2.5 mMの
MgSO 4 20 mMの
グルコース 20 mMの
ブロッキング緩衝液 PBS 1X
BSA 0.20%
PBTバッファ PBS 1X
BSA 0.20%
トゥイーン 0.05%
PTバッファ PBS 1X
トゥイーン 0.05%
リン酸 H 3 PO 4 1 M

表1.メディアおよびソリューション。

PCRマスターミックスSET-UP </ strong>の
コンポーネント 反応あたりμL
19.45
10倍のTaqバッファー 2.5
のdNTP(10mMストック) 0.675
DMSO 0.75
Taq酵素 0.125
フォワードプライマー(100μMのストック) 0.25
リバースプライマー(100μMのストック) 0.25
重鎖配列決定プライマー
M13フォワードプライマー GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC
M13リバースプライマー CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA
軽鎖の配列決定プライマー
M13フォワードプライマー TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG
M13リバースプライマー CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG
PCR SETTINGS
ステップ1。 3時00分、94℃
ステップ2。 午後12時30分94℃で
ステップ3。 午後12時30分55℃で
ステップ4。 1時00分、72℃
ステップ2と24Xを繰り返すように戻るステップ2にジャンプ
ステップ5。 72 7時00分°C
ステップ6。

表2. PCRマスターミックスと設定。

除染結果の解釈
プレート 期待されるカルベニシリン力価 しない場合はどうなりますか?
プリ感染制御 0 細胞は、事前感染であった。何も実験から結論することはできません。
汚染防止芝生不十分な汚染がその後の汚染除去の有効性を評価できるようにする。ファージ溶液中でマニホールド沈めるのではなく、それを吸引することを検討してください。
除染試験 0 除染完了していない。ソーク時間増加、漂白剤CONCENTRA代わりに、SDSおよびEtOHの洗浄をるか、試してみてください。

ワッシャ除染の表3の評価。除染の有効性を決定するために、そのワッシャがファージで汚染され、汚染除去プロトコルは正常にその汚れを除去することを示したことが必要である。カルベニシリン耐性を付与するファージを用いて、そのような試験から期待される成果を提案とともに、リストされている実際の結果が期待される成果と異なる必要があります。

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Discussion

体外抗体の選択行う場合、選択成功の二つの主要な決定の際、選択するための、よく折り畳まれた抗原標的の1)分離と高機能の多様化抗体ライブラリの2)利用可能である。多くの場合、十分に折り畳まれた、全長タンパク質の十分な量の利用可能性を制限することができる。この制限を克服する1つのアプローチは、適切な親和性タグを細菌発現ベクターへの挿入のための生物情報分析部22から識別され、合成されたドメインを使用することである。

、溶解度を増加させる精製を容易にし、不安定なドメインを安定化させるためのバイオテクノロジー用途に用いられているタグには様々なものがある。11、任意の所望の挿入配列は、汎用性の高い抗原生成プラットフォームを可能に仮想的に合成する能力が。 GSTタグ付き形式が一般的ですが、成功した結果が、以前にされているヘキサヒスチジンは、Fc、ハロ、マルトース結合タンパク質との部位特異的ビオチン化タグを使用して得られ、それは無数の他のアフィニティータグは、同様のプラットフォームで使用するために最適化することができると考えられる。しかし、親和性タグは、下流のアプリケーション11に有益な、意図しない負の結果の両方を持つことができますし、完全に特定のフォーマットに基づいてパイプラインを確立する前に調査する必要があります。

多くの場合、新規ユーザーは、抗体ライブラリーの品質を評価する方法の問題を提起し、全く簡単な答えはありませんが、1は、全体的な多様性、相対的な表示レベルの性質を含む、いくつかの重要な機能(天然または合成かどうか)を評価するようにしてくださいとランダム化の程度(すなわち、配列決定により決定ライブラリコンテンツに対してライブラリ設計)と意図されたアプリケーションに対する抗体の物理化学的特性。このプロトコルの範囲を超えているが、より詳細な下水処理これらの機能の塩基と、それらがどのように抗体の選択に影響を与えることができるが、ここ2,23見つけることができる。ライブラリーの多様性の知識は、特に、選択中の多様性の十分なカバレッジを確保することが重要である。一般的に、ライブラリ内の各ファージクローンの100〜1,000コピーを提供し、ファージ濃度が望ましいとライブラリに存在する任意の真陽性バインダーが回復できることを確認する必要があります。しかし、ファージの非特異的結合が劇的に上記10 13ファージ/ mlであり、非常に多様なライブラリーのための表面が大きくなるマイクロプレートため、抗原当たりの単一のウェルよりも、十分なカバレッジを確保するために必要とされる。入力ライブラリがあまりにも希薄される一方、真陽性の結合剤の絶対濃度は、これまでのところ、彼らは回復されないことをKD(通常はnM)を下回ることになる。これらの制約を考えると、ファージライブラリーは、一般的に選択の第一ラウンドのために10 12〜13ファージ/ mlに再懸濁されるべきである。0;この濃度では、ファージを100μLのアリコートを10 9 -10 10ダイバーシティライブラリの1,000-100倍の範囲を表し、日常的に多様な抗原に結合するクローンを得ることができる。低い濃度、または増加多様で、それは(セクション2.9を参照)最初のラウンドで選択された抗原に対してのウェルの数を増加する必要があるかもしれない。 1ラウンドに続いて、しかし、ライブラリの非結合多様性の大部分が除去されている。ラウンド1の出力の多様性の過剰報道は、単一のウェルを使用して、ほとんどの場合、簡単に達成可能である。 96ウェルプレートで並列選択の場合、これは最初のラウンドの後にひとつに必要な抗原の選択プレートの数を減らすことができる。

濃縮はに十分でない場合に、特に選択の初期のラウンドで気になる部分を識別するために支援しながら、実際の選択時には、ファージ滴定は、特徴づけると進捗状況を監視するための客観的測定を提供することができます検出される。これは、プロトコルのパフォーマンスを決定するために、選択のスケーリング時に特に有用であり得る。一般的には、入力されたファージの力価( すなわち、ナイーブライブラリーまたは溶出したファージの増幅後)は乏しい細胞増殖/汚染の可能性を示す低ファージ力価を、ラウンド間比較的一定(10 12 -10 13ファージ/ ml)にとどまるべきである、および/ ​​または前のラウンドからの貧しい出力。出力ファージ力価は、選択の後のラウンドでの濃縮の間に増加すると予想されるが、最初の2ラウンドでは10 3〜10 5 cfu / mlでの範囲が期待されている。この範囲からの逸脱は、このような汚染や過剰な洗浄ストリンなどの選択との潜在的な問題を示すことができます。選択の後のラウンド( すなわち、3及び4を丸め)で、標的抗原に特異的に結合するクローンの富化は、標的抗原と負の両方に対するファージプールの結合を測定するELISAを介してプールして評価することができる制御タンパク質(セクション4を参照してください)​​。

選択の3~4ラウンド後(:2の負の制御タンパク質シグナル比または標的タンパク質上の濃縮は、標的抗原に到達した後、バックグラウンドタンパク質と比較して1以上)を、感染した細菌細胞を、配列決定のための単一のファージミドのコロニーを単離するためにめっきされる、初期特性およびクローニング必要に応じて。この時点で、それは追加の特性評価の前のFabを解放するためのFabファージを変換することを強くお勧めします。 Fabをファージは、20μlのPBT緩衝液(5.1節で説明)ファージ上清を10μlを希釈し、(ステップ4.4に記載されて - 4.5)抗M13-HRP抗体で検出することにより、初期の特徴付けのために使用することができますが私たちの経験では、結合特性は、偽陽性の問題を未然に防ぐことができファージ粒子と早期の転換からの解放の際にクローンの百分の5から20のどこかで、実質的に変更することができます。変換に使用される特定の方法論はuniquに依存しますしたがって、Eファージミドのアーキテクチャとは、ここで明示的に扱われることはありません。しかし、最も一般的に使用されるベクターは、これは一般的に有能な非サプレッサーE.への精製されたファージミド(またはファージミドプール)の1)形質転換することによって達成することができるそのようなHB2151や55244などの大腸菌株をアンバー停止(TAG)コドンは、Fabと質pIIIタンパク質を介入した場合、2)のFabとのpIIIタンパク質との間のアンバー終止コドンの挿入は非サプレッサー株において可溶性抗体フラグメントの発現を可能にするか、 3)適切な発現ベクターに、個々のファージミドまたはファージミドプール)からの免疫グロブリン遺伝子を(クローニングすることができる。さらに、選択および特徴付けを合理化の方法は両方とも偶数のFabファージ粒子どこ発現溶解物を早期に特徴付けのために使用され、偽陽性の結合の可能性を排除し、発現構築物の中にまとめて結合するクローンを変換するための効果的な手段を提供することができるクローニングをプールするために精製のコストと労力最初に回避することができる。

(24に記載されている)ライブラリFから直接単離されたクローンは、抗体可変ドメイン(ライブラリF特異的プライマーのためのマテリアルの表2を参照相補性決定領域(CDR)をPCR増幅の鋳型としてファージ上清1-2μLを用いて配列決定することができる)。これらのプライマーを用いて、重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれ3つのCDRすべてをカバーする、〜700〜500塩基対の生成物が得られる。プライマーは、ほとんどのシーケンシング中核施設で利用可能な標準のプライマーを用いて(セクション5.4.5で説明したように)の製品は、クリーンアップ後に配列することができるようにM13プライマーのアニーリング部位を含む。あるいは、発現ベクター中にクローニングし、Eに直接形質転換されたFabをファージプールの大腸菌は、発現のために、単一のコロニーを単離することができ、単一のcについてのテンプレートとして直接使用2YT15μlの細胞懸濁液を1-2中に再懸濁適切なプライマーを用いてolony PCR。

選択を自動化するいくつかの重要なロボットの機能の最適化と検証が必要になります。一般的には、ピペットベースの液体ハンドリングは全96チャネルにわたって正確で一貫している必要があり、プレート洗浄は、選択プレートから吸着抗原または結合したFabファージを剥離することなく、効率的に結合していないファージを削除する必要があります。プレートウォッシャーの効果的な除染を濃縮し、効果的な対抗選択を可能にするラウンド間、及び交差汚染を防止するために、後続の選択の間にも必要である。ハイスループット選択手順を最適化するために、これらの機能を評価するための単純なアプローチは、以前に使用されており、以下に記載したプロトコル内で詳述されている。

液体分配/吸引ヘッドの全てのチャンネルで配信ボリュームの一貫性を評価するために、色の溶液を平底96ウェルプレートとabsorbanにピペットで各CEはウェルプレートリーダーで測定。そのようなブロモフェノールブルーなどの発色団は、供給量の別の表面張力および凝集特性の効果を評価するために実際の選択に使用されるものと同様の染色溶液のために有用である。すべてのチャネルが一貫したボリュームを分配していることを確認した後、総送達体積の精度は、各プレートに移した液体の質量を測定することによって決定することができる。

結合していないクローンを除去し、プレート洗浄の自動化は、主にバッファが分配されると、洗浄回数が使用される洗浄速度の最適化を必要とする。このパラメータを評価する合理的な方法は、1)吸着された抗原または結合したファージは、過度にストリンジェントな洗浄によって除去されているかどうかを決定するために、分注速度および/または洗浄の回数を変えることの効果を評価するための陽性対照(特異的Fabファージ結合クローン)を用いまたは2)非特異的非同族のタンパク質への結合は、過剰なdとUEは、十分に厳しくない条件を洗浄する。残留/結合したファージは、細菌に感染することにより、単一コロニー計数のためにプレーティング、またはELISAは、抗体親和性タグまたはファージコートタンパク質に特異的な二次抗体のいずれかを使用して検出し、定量することができる。陰性対照は、洗浄が十分にストリンジェントでない場合、高くてもよい非同族/背景タンパク質、タンパク質又は特異的結合のFabファージを標的とするために、非結合Fabをファージの残留レベルを評価するために使用される。このケースでは、非特異的結合についてのコントロールおよび陽性コントロールとしてのFabファージ上のFLAGエピトープタグを認識する抗FLAG抗体としてBSAを固定化した使用。我々は、これらの技術は同等であったことを示すために、媒体の流量で、手で洗浄対ロボットにより8、16回の洗浄サイクルを比較した。代わりに、継続的なセレクション時に入力と出力のファージ力価(第7節を参照)を測定することも洗浄パラメータの微調整をするのを助けることができる。 最後に、選択に用いられるプレート洗浄機の除染は、以前の選択からのファージのキャリーオーバーを排除するために有効でなければならない。我々の経験では、新たに希釈した0.5%の次亜塩素酸ナトリウムは、高速で効果的かつ安価である。 SDSなどの界面活性剤も有効であるが、システムから削除するには多くの大規模な洗浄を必要とする。すべてのテストの前にシステムのための試薬との互換性を確認してください。除染を評価するために、我々は、流体工学システムによって処理溶液中の残留ファージの存在をテストし、表3に従って結果を解釈する。

要約すると、このプロトコルは、タンパク質ドメインに対する体外の選択平行なコンビナトリアルライブラリーからFabを単離するための、スケーラブルな方法を提供し、自動化されたファージ選択システムを検証するための技術を提供しています。このメソッドは、再しないため大規模な動物施設がもたらす可能性がコストとインフラの障壁が緩和される動物の免疫の際にLY。さらに、抗体 - ファージの選択と抗原の生成を統合することにより、選択の成功に影響を与える品質係数は、より容易に監視および調整される。選択初期の特性に抗原発現の時間枠は、6-8週間のオーダーである場合には、生産の応答性システムを実現することができる。 in vitroでの選択から単離された抗体はまた、両方を容易に繰り返し再現性抗体を再生成するために発現構築物のみ格納されたDNAを必要とする(これは遺伝子型-表現型連関に)変更された再生可能である。最後に、このプロトコルは、カスタム設計され、ロボットの選択系を用いる準手動または完全に自動化されたアプローチのいずれかを用いて行うことができることを示すことによって、スループットを問わず、小さな学術及び産業研究室にスケーラブルでアクセス可能である。

上述のハイスループット法及びライブラリF合成抗体ライブラリ24を使用してインビトロの両方の免疫を含む免疫種々の用途において機能的であることができる- その場 -expressedタンパク質 。任意の選択の成功率は、抗原標的の品質(純度、foldedness、単分散など)、ならびに、抗体ライブラリーの質と多様性の両方に依存するであろうが、それは25から80の任意の場所が観察されている抗原の%は、ハイスループット選別のための結合剤が得られる。重要なことは、目的とする機能を調節する能力を有するクローンもまた、多くの場合、選択できることは注目に値する。このライブラリは、このように幅広いとの親和性試薬を生成するための別のアプローチとして、このパイプラインの重要性を強調し、潜在的な治療への応用〜25これらの抗体は従順になり、完全にヒトのフレームワークを使用して構築されている値。

要約すると、このプロトコルで提示アプローチのロバスト性および汎用性は、最適化、産業化との実質的にすべてのメンバーに発生する親和性試薬の長期的な目標を達成するための実行可能な手段として、この技術の最終的な広範な使用を支援するために引き続き人間プロテオーム。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgments

組換え抗体ネットワーク抗体選択および特性パイプラインとロボットの選択プラットフォームの資金調達購入のためのイノベーションのためのカナダの財団の開発に資金を提供するためのタンパク質捕獲試薬のプログラム-私たちは、NIHの共通基金を承認したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker Eppendorf M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system Anachem Ltd LIQ-96-200
Microplate shaker VWR 12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge Thermo Product 75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer Biotek ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml VWR 21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml VWR 89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes Corning MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate Sigma M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block Corning 3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box Corning AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film VWR 60941-084
REAGENTS
Name Company Catalog Number
polyethylene glycol Bioshop PEG800.1
yeast extract Bioshop YEX401.1
bio-tryptone Bioshop TRP402.1
N-Z amine Sigma C7290
glucose Sigma G8270-1KG
lactose Bioshop LAC234
glycerol Bioshop GLY001.500
carbenicillin  Bioshop CAR544.10
kanamycin Bioshop KAN201.25
tetracycline  Bioshop TET701.25
Tween 20 Bioshop TWN510.500
monobasic potassium phophate Bioshop PPM302.1
dibasic sodium phosphate Anachemia 84486-440
sodium chloride Bioshop SOD001.10
potassium chloride Bioshop POC308.1
calcium chloride Bioshop CCL302.500
magnesium sulphate EMD MX0070-1
magnesium chloride Bioshop MAG510.500
NH4Cl Amresco 0621-1KG
Na2SO4 Bioshop SOS513.500
agar Bioshop AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain Invitrogen S33102
phosphoric acid Acros Organics 201140010
lysozyme Bioshop LYS702.25
benzonase Novagen 71205
Triton X-100 Bioshop TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets Roche 11 836 170 001
Ni-NTA resin  Qiagen 1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) NEB N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). GE Healthcare 27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate  KPL 50-76-00
dNTPs Biobasic DD0056
Taq polymerase Genscript E00007
Exonuclease GE Healthcare  EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase GE Healthcare E70092Z-EZ

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References

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免疫学号95、細菌、ウイルス、アミノ酸、ペプチド、お​​よびタンパク質、核酸、ヌクレオチド、およびヌクレオシド、ライフサイエンス(一般)、ファージディスプレイ、合成抗体、ハイスループット、抗体の選択、スケーラブルな方法論
ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択
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Miersch, S., Li, Z., Hanna, R., McLaughlin, M. E., Hornsby, M., Matsuguchi, T., Paduch, M., Sääf, A., Wells, J., Koide, S., Kossiakoff, A., Sidhu, S. S. Scalable High Throughput Selection From Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries. J. Vis. Exp. (95), e51492, doi:10.3791/51492 (2015).

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