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Immunology and Infection

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Published: January 17, 2015 doi: 10.3791/51492

Summary

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Abstract

La richiesta di anticorpi che soddisfano le esigenze di applicazioni sia di ricerca di base e clinica è alta e aumenterà notevolmente in futuro. Tuttavia, è evidente che le tecnologie tradizionali monoclonali non sono soli fino a questo compito. Questo ha portato allo sviluppo di metodi alternativi per soddisfare la domanda di alta qualità e reagenti di affinità rinnovabili a tutti gli elementi accessibili del proteoma. A questo fine, i metodi high throughput per condurre le selezioni da librerie di anticorpi sintetici fagi-visualizzati sono stati ideati per applicazioni con diversi antigeni e ottimizzato per la velocità rapida e di successo. Qui, un protocollo è descritto in dettaglio che illustra con video dimostrativo la selezione parallela di cloni Fab-fago da librerie alte diversità contro centinaia di obiettivi utilizzando sia un gestore di liquido 96 canali manuale o sistema robotico automatizzato. Usando questo protocollo, un singolo utente può generare centinaia di antigeni,selezionare anticorpi a loro in parallelo e validare vincolante entro 6-8 settimane di anticorpi. Evidenziate sono: i) un formato antigene praticabile, ii) caratterizzazione dell'antigene preselezione, iii) passaggi critici che influenzano la scelta di specifiche e di alta cloni affinità, e iv) modi di efficacia selezione monitoraggio e tempestivamente clone anticorpo caratterizzazione. Con questo approccio, abbiamo ottenuto i frammenti di anticorpi sintetici (FAB) a molte classi di destinazione, tra cui i recettori single-pass di membrana, ormoni proteici secreti, e multi-dominio proteine ​​intracellulari. Questi frammenti sono facilmente convertiti in anticorpi full-length e sono stati convalidati per esibire elevata affinità e specificità. Inoltre, essi hanno dimostrato di essere funzionale in una varietà di immunodosaggi standard, tra cui Western blotting, ELISA, immunofluorescenza cellulari, immunoprecipitazione e saggi relativi. Questa metodologia accelerare la scoperta di anticorpi e infine ci avvicinano a realizzare l'obiettivo of generazione rinnovabili, anticorpi di alta qualità al proteoma.

Introduction

Con l'inizio dell'età post-genomica, la disponibilità dei reagenti vincolanti alta qualità per caratterizzare e modulare proteine ​​è essenziale per aprire nuove ricerche e vie terapeutiche. Anticorpi continuano ad essere fondamentale per entrambi i ricercatori accademici e industriali come la ricerca di base e gli strumenti diagnostici e potenziali terapie. Non sorprende, c'è stata una crescita impressionante di imprese di sviluppo di anticorpi contratto, la maggior parte dei quali si basano su tecnologie ibridomi convenzionali per generare anticorpi personalizzati. Tuttavia, la selezione in vitro utilizzando le librerie di anticorpi fagi-visualizzato sta diventando una potente tecnologia alternativa in grado di offrire vantaggi unici e di successo in cui le tecnologie convenzionali possono affrontare limitazioni 1, 2.

Alla luce della forte domanda per gli anticorpi di alta qualità come strumenti di ricerca, due sfide principali per la generazione di anticorpi rinnovabili sono: 1) la velocità di selezione e 2) av antigenevata disponibilità. Un certo numero di gruppi hanno ora descritto in gasdotti di selezione in vitro volti ad aumentare la produttività e il tasso di individuazione di anticorpi. Queste descrizioni particolare una varietà di approcci vitali che includono la selezione su o full-length obiettivi 3,4, o strutturalmente domini 5,6,7 correlato, utilizzando 6,8 o piatto a base di 3,4 schemi antigene immobilizzazione basati bead-. Inoltre, la crescente adozione di tecnologie di sintesi del gene 9 ha generazione sistematica antigene, in particolare di domini isolati, ragionevolmente conveniente e può potenzialmente alleviare la difficoltà di ottenere quantità sufficienti di purificato, antigeni full-length. Utilizzando le due tecnologie in tandem, una pipeline autonomo e generazione antigene scalabile e selezione anticorpo è stato ideato che consente l'isolamento parallelo di anticorpi per grandi insiemi di domini antigeni espressi e facilitare lo sviluppo di reagenti per characterizing intere classi di proteine ​​strutturalmente o funzionalmente collegate.

Verso questo obiettivo, una pipeline integrata che è stato sviluppato coppie in silico individuazione di domini antigene esprimibili, sintesi genica, espressione batterico high-throughput di antigeni e anticorpi selezioni scalabili fagi-visualizzato. Questo gasdotto richiede solo infrastrutture di base a disposizione la maggior parte dei laboratori di scienze della vita (comprese le biblioteche di anticorpi che sono sempre disponibili tramite licenza o trasferimento di materiale accordo), ma è anche suscettibile di automazione per l'utilizzo su scala industriale. Utilizzando questo protocollo, è possibile generare centinaia di domini antigene-tag di affinità e di routine isolare altamente specifici frammenti anticorpali a molti di questi antigeni.

Tecnologia di visualizzazione dei fagi ha dimostrato la compatibilità dimostrata con una vasta gamma di formati di reagenti affinità ricombinanti tra cui Fab, scFv, e domini autonomi Fv ecrescente schiera di piccoli 'quadri alternativi "(progettati proteine ​​ankyrin ripetizione (DARPINS), fibronectina (FN), domini lipocalina e più 10). La discussione è limitata in questo esempio per l'isolamento di frammenti anticorpali Fab, anche se si presume questi metodi possono essere adattati ad altri tipi di librerie. Grazie a questa tecnologia, Fabs con bassa affinità nanomolare piccolo, tagged domini proteici compresi settori fattore di trascrizione, i domini SH2,-RNA binding proteine ​​e altri sono stati selezionati con successo, molti dei quali legano la proteina full-length e sono funzionali in test immunologici quali immunofluorescenza , immunoprecipitazione ed immunoistochimica. È importante sottolineare che, cloni vincolanti ricombinanti sono completamente rinnovabili e possono essere rigenerati dalla espressione costruisce attraverso un'offerta produzione batterica maggiore coerenza, riproducibilità ed economicità, giustificando così la spesa di convalida clone rigorosa.

In questo protOcol e video di accompagnamento, sono dimostrati metodi di base per la selezione di anticorpi da librerie fagiche-visualizzato utilizzando domini antigene immobilizzati. Questo particolare metodo utilizza i domini di proteine ​​GST-tagged immobilizzati per adsorbimento passivo in micropiastra, anche se altri tag 11,12,13 e formati di selezione 13,14,2 sono stati utilizzati con successo. Considerazioni critiche per l'impostazione e lo svolgimento delle selezioni con monitoraggio parallelo di parametri di selezione volti a identificare e isolare anticorpi monoclonali specificamente arricchiti per la convalida sono dettagliati.

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Protocol

1. Generation Antigen

NOTA: i domini Antigen può essere sintetizzato e clonato da una varietà di fornitori commerciali a un adeguato espressione costrutto IPTG-inducibile.

  1. Trasforma costrutti di espressione in chimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. coli di miscelazione 10 ng di DNA codificante in 20 ml di 1X KCM su ghiaccio in una piastra da 96 pozzetti PCR seguita dall'aggiunta di 20 L di cellule chimicamente competenti.
  2. Incubare la miscela di cellule / DNA in ghiaccio per 20 minuti, a temperatura ambiente per 10 minuti e poi in ghiaccio ancora per 2 minuti prima di salvataggio con 100 ml di brodo eccellente ottimale pre-riscaldato con glucosio (SOC) i media, coprendo con un sigillo piatto traspirante e agitazione a 37 ° C per 1 ora a 200 rpm in un agitatore orbitale 2,5 centimetri.
  3. Tavola 5 microlitri di cellule trasformate a Luria-Bertani (LB) piastre di agar addizionato con / carbenicillina (100 g / ml) e crescere O / N per ottenere colonie singole utilizzati pergenerando scorte glicerolo.
  4. Seminare 1 ml di 2YT media / carb con 5 ml di glicerolo magazzino e crescere per 12 ore a 37 ° C in un blocco di 96 ben profondo bene con agitazione a 200 rpm in un 2,5 centimetri agitatore orbitale.
  5. Seminare NZY media15 (integrato con 0,05% di glucosio, 2% di lattosio e 100 g / ml carbenicillina) con una diluizione 1:40 di questa cultura, poi agitare per 6-8 ore a 30 ° C e 200 rpm in un orbitale 2,5 centimetri shaker.
  6. Batteri pellet e purificano proteine ​​antigeniche in high-throughput in un piatto di filtro a 96 pozzetti contenente 100 ml di resina Ni-NTA secondo protocols16,17 pubblicato in precedenza.
  7. Determinare la concentrazione di proteine ​​purificate da Bradford-dye vincolante assay18 e si caratterizza per le dimensioni e la purezza, la separazione e la visualizzazione di 10-50 mg con macchia Coomassie su un gel SDS-page (vedi figura 2).
    NOTA: In questa fase le proteine ​​può essere ulteriormente caratterizzata da metodi che valutano la proteina aggregazione 19 20 a seconda della natura dell'antigene e requisiti della tubazione di selezione.

2. Preparazione e titolazione della Biblioteca dei fagi

  1. Scegli una singola colonia di T1 fago resistenti E. coli cellule in 1 ml di media 2YT integrato con 50 mg / ml tetraciclina.
  2. Una volta che la crescita cellulare è visivamente stabilito, diluire la cultura in un volume maggiore di 2YT integrata con 50 mg / ml di tetraciclina per garantire un volume sufficiente di cellule per l'infezione (in genere 45 ml per la diluizione biblioteca, vedi sotto.).
  3. Preparare la libreria per l'uso da precipitare il fago dal buffer di memorizzazione con 1/5 ° volume autoclavato 20% PEG-8000, 2.5 M NaCl (PEG-NaCl) incubazione in ghiaccio per 30 min e pellet precipitato fago per centrifugazione a 12.000 x g.
  4. Eliminare il surnatante e risospendere precipitato fago in un volume adeguato di 1x PBS pH 7.4, 0.2% BSA e 0,05% Tween (PBT), regolazione to una concentrazione fago appropriato per le selezioni (se necessario) per garantire una copertura adeguata biblioteca. Vedere il punto 2.9 e discussione.
  5. Diluire 5 ml fago aliquota in 45 microlitri di 1x PBS pH 7.4 in un piatto multi-bene sterili, mescolare e creare una serie di 10 diluizioni nello stesso tampone.
  6. Aggiungere 5 ml di ogni diluizione fago a 45 ml di T1 fago resistente E. coli cellule in fase di crescita di registro (OD 600 = 0,4-0,8) in un altro piatto pozzetti, coprire con un sigillo traspirante e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 30 minuti in un 2,5 centimetri agitatore orbitale.
  7. Tavola 5 ml di cellule infettate da ciascuno dei pozzetti di una piastra di agar preriscaldata integrato con 100 g / ml carbenicillina e crescere O / N a 37 ° C fino colonie sono visibili.
  8. Calcolare il totale fago / ml come segue:
    Phage / ml = numero di colonie su una piastra carbenicillina nel diluire il campione x 200 x 10 i (i = massimo num piùBER di diluizioni in cui le colonie sono evidenti).
  9. Per determinare il numero di pozzetti rivestiti di antigene per assicurare la copertura della diversità biblioteca, calcola come segue:
    Numero di pozzetti dell'antigene rivestiti richiesto =
    Copertura piega desiderata * diversità biblioteca
    # Di fago per 100 ml

3. Anticorpo Selezione da librerie fagiche-visualizzato

3.1) Antigen immobilizzazione

  1. Per evitare cicli di gelo-disgelo, che possono influenzare la qualità dell'antigene e per facilitare diluizioni, preparare un piatto di proteine ​​magazzino dell'antigene normalizzato a 100x concentrazioni di lavoro (ad esempio, 500 g / ml) e aliquote per non vincolanti piastre da 96 pozzetti.
  2. Preparare piatti antigene rivestite da soluzioni magazzino proteine ​​un giorno prima di ogni turno di selezioni diluendo dai piatti azionari con PBS.
  3. Coat 96 pozzetti lastre di polistirene di legame alle proteine ​​alti con 100 ml di proteina dell'antigene GST-tagged o controllo negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a 5 mg / ml in PBS. Agitare a 250 giri al minuto 4 ° CO / N, un vortex.
  4. Rimuovere la soluzione di proteine ​​dal rivestito micropiastre, bloccare le piastre antigene rivestite e di selezione negativa con 200 microlitri tampone di bloccaggio (0,2% BSA in 1x PBS pH 7.4) e agitare a 250 rpm a temperatura ambiente per 1-2 ore.
  5. Dopo il blocco, lavare le piastre rivestite con proteine ​​bloccate quattro volte con 200 microlitri di PBS 1x pH 7,4 con 0,05% Tween (PT) tampone manualmente oppure utilizzando un lavatore automatico di micropiastre.

3.2) Biblioteca pre-clearance e Antigen-fago incubazione

  1. Esaurire la biblioteca di non (o su tag) specifici fago-visualizzato cloni di frammenti di anticorpi leganti tramite trasferimento di 100 ml (10 12) fagi di biblioteca fagi preparato in tampone PBT ad un numero di pozzi rivestiti con proteine ​​controllo negativo o tag affinità gratuito proteine ​​(ad esempio, GST) pari al numero di obiettivi e incubare fagoin pozzi per 1-2 ore a temperatura ambiente con agitazione a 250 rpm.
    NOTA: Come alternativa o ulteriori mezzi di selezione negativa, incubazione può anche essere eseguita in presenza di un eccesso (5-25 mM) tag di affinità proteina solubile (ad esempio, GST) per rimuovere ulteriormente cloni-tag legame e migliorare il recupero di destinazione specifica cloni vincolante.
  2. Trasferimento fago surnatante dalla selezione negativa a piastre antigene-rivestito e incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente con agitazione a 250 rpm per la cattura di specifici cloni vincolanti.
  3. Rimuovere fago non legato e lavare i pozzetti della micropiastra 8-15 volte con tampone di PT manualmente o utilizzando una rondella micropiastre. Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso appena prima eluizione.

3.3) eluizione, infezione e fagi Amplificazione

  1. All'inizio della giornata di selezioni, scegliere una singola colonia di T1 fago resistenti E. coli cellule in 1 ml di supporti 2YT integrato con 50 ug / ml di tetraciclina e crescere a 37 ° C with agitazione a 200 rpm in un 2,5 centimetri agitatore orbitale o equivalente.
  2. Una volta stabilita la crescita cellulare e può essere visto da occhio, aumentare il volume del supporto con 2YT integrato con 50 ug / ml di tetraciclina per garantire un volume sufficiente di cellule per l'infezione (generalmente 100 microlitri per selezione ben).
  3. Crescere le cellule finché un OD 600 di 0,4-0,8 è raggiunto (circa 5-7 ore), poi per eluire fago bound aggiungere 100 microlitri di cellule alla piastra dell'antigene lavato e agitare a 37 ° C per 30 min.
  4. Aggiungere M13K07 helper phage ad una concentrazione finale di 1 x 10 10 CFU / ml e incubare a 37 ° C per 45 minuti con agitazione a 200 rpm.
  5. Trasferire le cellule in 1,2 ml di 2YT integrate con 150 mg / ml carbenicillina e 75 ug / ml kanamicina in un blocco ben 96 pozzetti profondi con V-bottom e crescere O / N a 37 ° C con agitazione a 200 rpm in 2,5 centimetri agitatore orbitale.

3.4) Phage Preparazione e Rounds ripetute di Seleczione

  1. Batteri pellet per centrifugazione a 4.000 xg per 15 min a 4 ° C.
  2. Miscelare uguali volumi di surnatanti fagi da lastre replicate in un mini-tube 96 pozzetti sterili micropiastre blu box, neutralizzare con 1/10 volume di 10X PBT e mescolare. Ripetere round di selezione (a partire dal punto 3.1.1) per 3-4 turni o fino a quando si osserva l'arricchimento (Vedere le sezioni 4. e 7.) rispetto alle proteine ​​di controllo negativo.
    NOTA: Nei primi turni di selezione quando non è previsto significativo arricchimento / rilevabile (cioè, arrotonda 1 e 2), la quantificazione di ingresso e di uscita dei fagi titoli (descritte nella sezione 7 e risultati rappresentativi mostrato in Figura 3) può essere utile per garantire Le concentrazioni minime fagi per le selezioni di successo (descritti in discussione) e siano più appropriate di ELISA pool.

4. Caratterizzazione by pool ELISA

  1. Coat 96 pozzetti ad alto contenuto proteico-binding lastre di polistirene con 100 ml di GST-tagged proteine ​​antigene o proteina di controllo negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 mg / ml di cui alla Sezione 3.1 e agitare a 4 ° CO / N.
  2. Rimuovere eccesso di antigene, bloccare la piastra con 200 ml di tampone di bloccaggio con agitazione per 1-2 ore a temperatura ambiente a 250 rpm su un agitatore per micropiastre e lavare quattro volte con tampone di PT 200 microlitri mano o con apparecchio di lavaggio piatto.
  3. Applicare 100 ml di surnatante fago (diluito 1: 10-1: 20 in tampone PBT), agitare a 250 rpm per 15 minuti a RT, e lavare la piastra otto volte con tampone di PT 200 microlitri.
  4. Aggiungere 100 ml di anti-M13-HRP (1: 5.000 in tampone PBT). Agitare a 200 rpm per 30 min a temperatura ambiente, poi lavare la piastra sei volte con tampone PT 200 microlitri e due volte con 200 ml di PBS.
  5. Applicare 100 ml di 1: 1 substrato TMB e sviluppare per 5-15 min (o fino a colore sostanziale ha sviluppato), quindi arrestare la reazione mediante aggiunta di 100 ml di 1 MH 3 4 e leggere a 450 nm.
  6. In generale, l'arricchimento in piscine fagiche può essere osservato in turni 3-4 come rapporto di legame specifico rispetto legame non specifico di> 2 (vedi figura 4)
    NOTA: E 'informativa notare che segnale alto vincolante assoluto sulla proteina tag affinità indica l'arricchimento di leganti specifici tag (anziché leganti target), e che segnale alto vincolante assoluto sulla proteina di controllo negativo indica l'arricchimento di non-specifico o " leganti appiccicoso ".

5. Clone Selection, Sequencing e caratterizzazione

5.1) Isolamento di singoli cloni Fab-fago

  1. Per isolare cloni individuali per il sequenziamento e la caratterizzazione, infettare 1/10 volume della piscina fago amplificato per T1 fago resistenti E. coli cellule in fase di log di crescita (OD 600 = 0,4-0,8) in micropiastra a fondo rotondo, coprire con un Breathaguarnizione della piastra bile e incubare con agitazione a 200 rpm per 30 min a 37 ° C.
  2. Preparare diluizioni seriali di 10 volte nei media 2YT e piastra su piastre di agar separati integrati con 100 g / ml carbenicillina.
  3. Scegli singole colonie in 450 ml di mezzi 2YT / carb integrati con 1 x 10 9 M13K07 fago / ml e crescere O / N in un mini-tubo 96 e sterile microplate blu box incubazione a 37 ° C con agitazione a 200 rpm.
  4. Batteri pellet di filatura a 4.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  5. Clonale fago supernatante può essere utilizzato per il sequenziamento dei cloni Fab-fagi (come descritto nella Sezione 5.4) o per clonale diretta vincolante ELISA per determinare la specificità contro antigeni immobilizzati (come descritto nelle sezioni 5.3 e 21) per i quali i risultati rappresentativi sono mostrati in figura 5.

5.2) Espressione di Fab cloni per la caratterizzazione

  1. Dopo la clonazione in un adeguato expression vettore (vedi la discussione), selezionare singola E. coli colonie trasformate con espressione crea per 1 ml di 2YT media / carb in un piatto ben 96 profondo bene con una punta stuzzicadenti o pipetta sterile e crescere per 12-16 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Questo può essere fatto manualmente o con un selettore colonia automatizzato.
  2. Trasferire 40 ml di cultura in crescita a 1,5 ml di mezzi nZY integrato con glucosio / lattosio / glicerolo in un blocco ben Deepwell 96 secondo la metodologia di Studier et al. 15
    NOTA: In alternativa, le cellule possono essere coltivate per 3-4 ore (OD 0.8-1.0) nell'espressione non integrato e proteine ​​indotta mediante l'aggiunta di 1 mM IPTG.
  3. Coprire il blocco coltura (s) con una guarnizione traspirante ed esprimere Fab cloni per 6-8 ore a 30 ° C con agitazione a 200 rpm. Piastre Spin a 4.000 xg per 15 min a pellet cellule batteriche, rimuovere il surnatante, piastre di copertura con un sigillo di alluminio e congelare pellet a -20 ° C fino lisi.
  4. Liberate Fabs espresse dal pellet raccolti con 100 ml di tampone di lisi (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mm, 1,25% Triton X-100 pH 8.0 con 1 mg / ml di lisozima e 10 U benzonasi / cultura ml e inibitori della proteasi) e agitazione per 2 ore a 4 ° C.
  5. Rimuovere i detriti delle cellule per centrifugazione a 4.000 xg per 15 minuti a 4 ° C e raccogliere greggio surnatante lisato per l'uso in prima caratterizzazione della specificità da piastre ELISA (vedere paragrafo 5.3).

5.3) Clone Caratterizzazione da Direct Binding clonale Fab ELISA

  1. Immobilizzare antigeni come descritto nella sezione 3.1, invece aliquotting 30 ml di 2 mg / ml di antigene in PBS a pozzetti di una piastra ben 384. Basata Quad-layout antigene nella piastra possono facilitare reattivo quando si utilizza 96 teste di dosaggio in funzione del canale. Lavare e blocco piastre ELISA ai sensi dell'articolo 3.1.
  2. Lisati sgomberati raccolti da Sezione 5.2 può essere applicato direttamente all'antigene immobilizzato per evatazione di associazione. Incubare 30 ml di lisato per bene per 15 minuti a RT con agitazione a 200 rpm.
    NOTA: proteina purificata clone Fab può alternativamente essere utilizzato diluendo a 10 ug / ml in tampone PBT e applicando 30 microlitri di ciascun clone di pozzetti bloccati contenente antigene o proteina controllo negativo (GST, ecc BSA) e sviluppando nello stesso modo descritto seguito. In alternativa, Fab-fago può anche essere utilizzato diluendo 10 ml di fago surnatante (descritta nel paragrafo 5.1) in 20 microlitri di buffer PBT (1: 3) e rilevando con anticorpi anti-M13-HRP (descritto nei passaggi 4,4-4,5)
  3. Rimuovere l'eccesso lisato e lavare pozzi manualmente o utilizzando una piastra automatico lavato 8x con 100 ml di buffer di PT e rimuovere il tampone in eccesso.
  4. Incubare 30 ml di una diluizione 1: 5000 di anticorpo anti-FLAG secondaria in tampone PBT per 30 minuti a RT con agitazione a 200 rpm.
  5. Lavare, sviluppare e quantificare come da sezioni 4,3-4,5.
    NOTA: I risultati rappresentativiillustrano cloni vincolanti sia specifici e non specifici sono mostrati in Figura 5.

5.4) Clone Sequencing

  1. Preparare una master mix PCR come indicato nella tabella 2.
  2. Aggiungere 2 ml di appropriata template PCR (o fago surnatante o singola colonia batterica ri-sospeso-fagemidi contenenti) a 20 ml di PCR master mix preparata con primer adeguati in pozzetti di una piastra PCR.
    NOTA: Master Mix separati sono necessari per il sequenziamento di entrambi i geni della catena pesanti e leggeri.
  3. Eseguire la reazione di PCR utilizzando i parametri indicati nella tabella 2 - Impostazioni PCR.
  4. Verificare successo della reazione PCR mescolando 5 ml di reazione completata con colorante di caricamento su un gel di agarosio 1% supplementato con macchia visualizzazione DNA e immagini su un transilluminatore a 300 nm.
  5. Aggiungere 2 ml di prodotto di PCR a 10 ml di acqua sterile contenente 0,2; Microlitri ciascuno di esonucleasi e alcalino fosfatasi gamberetti e incubare a 37 ° C per 20 minuti seguito da inattivazione enzimatica a 80 ° C per 10 minuti per rimuovere i primer in eccesso in preparazione per il sequenziamento.

6. Scaling per Automated Selezioni

6.1) basata Pipetta-Handling Liquid

  1. Preparare un 1% (w / v) blu di bromofenolo in acqua e rimuovere le particelle insolubili usando un filtro da 0,45 ml.
  2. Per determinare il campo lineare di assorbanza sul lettore piatto, preparare una diluizione 1: 1.000 del bromofenolo soluzione blu 1% in acqua, e continuare con due diluizioni seriali (16 diluizioni totale).
  3. Trasferire 100 ml di ogni diluizione ad un fondo 96 pozzetti piatta e leggere l'assorbanza a 590 nm. Plot assorbanza assoluto rispetto fattore di diluizione e scegliere una diluizione a metà di fascia alta del range lineare per le prove successive.
  4. Aggiungere blu di bromofenolo all'acqua o alla soluzione effettivache sarà pipettato basato sulla diluizione scelta nel passaggio precedente in volume sufficiente per pipettamento per tre 96 pozzetti, più il volume morto nel serbatoio.
  5. Calibrare una pipetta a singolo canale per fornire il volume di prova pipettando acqua su una bilancia analitica (100 ml di acqua pesa 100 mg a RT.)
  6. Usando il pipettatore calibrato, trasferire il volume di prova della soluzione tinto di almeno tre pozzi di fondo 96 pozzetti piatta e leggere i loro assorbanza a 590 nm, in triplice copia.
  7. Pesare tre a fondo piatto 96 pozzetti vuoti su una bilancia analitica e registrare le loro masse.
  8. Pipetta volume di prova dal serbatoio a ciascuno dei tre 96 pozzetti e misurare le loro assorbanza a 590 nm, in triplice copia.
  9. Pesare ciascuna piastra e calcolare la differenza di massa.
  10. In primo luogo, valutare se l'assorbanza di ciascun pozzetto sono uniformi all'interno della gamma di tolleranza (ad es., +/- 5%) e se sono coerenti con the assorbanza ottenuta a mano-pipettaggio con la Pipetman calibrata. Se i canali particolari sono costantemente sovra o sotto-fornitura (per esempio vedi figura 6), seguire le procedure di riparazione e ripetere la procedura di valutazione fino a quando tutti i canali offrono i volumi uniformi.
  11. In secondo luogo, una volta che tutti i canali sono confermati a fornire volumi uniformi, verificare l'esattezza di tale volume, calcolando la differenza media di massa, per pozzetto. Per esempio, un insieme gestore liquido perfettamente calibrata per 100 microlitri fornirà 9.60 g di acqua per piastra, o 0,10 g di acqua per pozzetto. Se il volume reale erogata è costantemente sopra o sotto il volume desiderato, poi un fattore di correzione può essere applicato, ad esempio, programmazione 110 microlitri per fornire effettivamente 100 microlitri.
    NOTA: Per piccoli volumi, ad esempio, 10 microlitri, utilizzare dieci volte più blu di bromofenolo nella soluzione tinto, e pre-aliquota 90 microlitri di acqua alle piastre a 96 pozzetti a mano, per garantire che il absorbances sono misurabili e la caduta nella gamma lineare.

6.2) lavaggio automatico Piatto

  1. Immobilizzare target positivo e di proteine ​​di controllo negativo in pozzetti separati di 96 pozzetti (due piastre per ogni condizione di essere testati), come descritto nella sezione 3.1.
  2. Bloccare non specifici siti di legame di incubazione con la soluzione di blocco per un ora a RT.
  3. Aggiungi identiche aliquote di 100 microlitri di una ufc 10 13 / ml obiettivo vincolante soluzione Fab-fago in PBT per tutti i pozzetti di tutte le piastre e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 2 ore.
  4. Lavare due piastre in base alla situazione, una piastra per l'infezione e di titolazione e una piastra per ELISA.
  5. Valutare l'efficacia del lavaggio per contagio diretto in batteri e di titolazione (come descritto nella sezione 3.3 (senza M13K07 aggiunta) e 7.2.1) o di sviluppo con M13 anti-anticorpo HRP e substrato colorimetrico (come descritto nella Sezione 4).
  6. Titres fago from cloni specifici spesso cedere nell'intervallo 10 5 -10 7 fago / ml da una proteina immobilizzata contro cui il clone lega specificamente. Alcuni residui di legame alle proteine ​​controllo negativo (ad esempio, BSA) è prevedibile e in generale 10 2 -10 5 fago / ml si osservano, tuttavia molto basso titolo (es., <10 1) può segnalare lavaggio eccessivamente stringenti, che possono compromettere una selezione.
  7. Per fago legame determinato dalla ELISA, confrontare i segnali vincolanti assoluto per le proteine ​​di controllo positivi e negativi per determinare se il lavaggio robotica equivale a risultati di lavaggio a mano stabiliti (Figura 7).

6.3) Piastra Rondella Decontaminazione

  1. Per iniziare, eseguire il protocollo di decontaminazione da testare.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare almeno il doppio del volume totale della linea, e il primo e immergere la testa di lavaggio per 5 min in 0,5% di ipoclorito di sodio, fr fresco diluitoom candeggina commerciale (in genere 6% di ipoclorito di sodio).
  2. Prime e immergere la testa di lavaggio per 5 minuti a sterile (autoclave) acqua e infine, il primo sistema fino a quando le linee sono pieni d'aria.
  3. Prime le linee con acqua sterile o tampone di lavaggio.
  4. Lavare sterile micropiastra 96 ​​bene una volta, togliere dal lavatrice e sigillare con guarnizione piastra sterile. Questa è la piastra di controllo pre-contaminazione.
  5. Aliquotare 100 ml di O / N amplificati cultura fago surnatante in tutti i pozzetti di una piastra ben 96.
  6. Lavare la piastra-fago contenente una volta, quindi rimuovere dalla lavatrice e sigillare con un sigillo piatto di plastica o carta stagnola. Questa è la piastra di controllo della contaminazione.
  7. Effettuare il protocollo di decontaminazione in fase di test. In questo esempio, ripetere i passaggi 6.3.1 e 6.3.2.
  8. Lavare micropiastra sterili una volta, quindi togliete dal lavatrice e di tenuta. Questa è la piastra di prova decontaminazione.
  9. Piatto 50 ml di fase log E. coli alle piastre di titolazione; questo è il pre-infepiastra di controllo zione.
  10. Dissigillare pre-contaminazione, contaminazione e decontaminazione piastre da 96 pozzetti e aggiungere 100 ml di E. coli in fase di fase di crescita logaritmica a tutti i pozzetti, utilizzando nuove punte per ogni bene.
  11. Sigillare e incubare a 37 ° C per 30 min a 200 rpm.
  12. Piatto 50 ml di cellule infette da tre pozzi casuali di ogni piastra a 96 pozzetti per 10 centimetri piatti 2YT / carb e incubare a 37 ° CO / N.
  13. Trasferire 50 ml di cellule infette da tutti i pozzetti di ogni piastra a pozzetti profondi contenenti 1 ml 2YT più 100 g / ml carbenicillina per bene e crescere O / N a 37 ° C.
  14. Ripetere il protocollo di decontaminazione e lasciare la rondella linee asciutte.
    NOTA: No O crescita / N su piastre o in mezzo liquido deve osservare sulle piastre di controllo pre-infezione, controllo pre-contaminazione o prova decontaminazione. Molte colonie e la crescita devono essere osservati sulla piastra di controllo della contaminazione; se non, alcuna conclusione circa l'efficacia delprotocollo di decontaminazione può essere fatto. Idealmente, le piastre di decontaminazione produrrà senza colonie e non O crescita / N in uno dei pozzi nel O / N piastre. La rigorosità del protocollo di decontaminazione può essere aumentato con concentrazioni più elevate di candeggina, orari e ulteriori cicli più ammollo.

7. Input / Output titolazioni

7.1) titolazioni fagi Input

  1. Diluire un'aliquota 5 ml di fago a 50 ml con sterile filtrata PBS e mescolare.
  2. Preparare serie di diluizione di 10 volte in sterile filtrata PBS per 10 10 con pipetta multicanale o una pipetta a 96 canali.
  3. Seminare 5 ml di fago diluito in 45 ml di T1 fago resistenti E. coli in log-fase di crescita (OD 0,6-0,8) e incubare coperto con una guarnizione traspirante per 30 minuti a 37 ° C.
  4. Tavola 5 ml di cellule infette su di un / piastra di agar LB addizionato con 100 mg / ml e incubare carbenicillina O / N at 37 ° C.
  5. La concentrazione fago può essere stimato dal campione più diluito in cui le colonie appaiono secondo i calcoli descritti nel paragrafo 2.8.

7.2) Uscita Phage Pitrations

  1. Dopo eluizione della piastra-bound fago mediante aggiunta di E. coli cellule, diluire un'aliquota 5 microlitri di cellule fago infettate a 50 ml con i media 2YT autoclave
  2. Preparare serie di diluizione di 10 volte nei media 2YT autoclave a 10 6 utilizzando una pipetta multicanale o 96 canali pipetta.
  3. Tavola 5 ml di cellule infette su di una piastra di agar integrato con 100 mg / ml carbenicillina e incubare O / N a 37 ° C.
  4. La concentrazione fago può essere stimato dal campione più diluito in cui le colonie appaiono secondo i calcoli descritti nel paragrafo 2.8.
    NOTA: In entrambi i casi (ad esempio, di ingresso e di uscita dei fagi titoli, il confronto con i numeri di colonie sia tetraciclina (cel totalenumero l) e kanamicina (helper phage titolo) possono anche essere informativo.

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Representative Results

Il protocollo qui descritto è stato usato per isolare frammenti anticorpali ad una varietà di entrambi i domini antigene strutturalmente e funzionalmente correlati da combinatori fago visualizzato librerie Fab in parallelo. Questioni relative alla disponibilità di antigene possono essere aggirate, in molti casi, per l'identificazione in silico di domini antigene esprimibili che sono adatti per la selezione di anticorpi 23. Accoppiando espressione dell'antigene alla selezione anticorpo nello stesso laboratorio (Figura 1) diventa possibile costruire una pipeline integrata, in cui i parametri di antigene critici per la selezione possano essere più facilmente controllabili. Nella maggior parte dei casi, accurata determinazione dei confini dominio consente l'espressione e l'isolamento di quantitativi adeguati di antigene sufficientemente puro da espressione ad alta produttività in 96 o 24 pozzetti deepwell (Figura 2) per l'uso con successo nelle selezioni anticorpi. Durante successivegiri del processo di selezione, le concentrazioni dei fagi eluiti e arricchimento di fago che specificamente si legano all'antigene possono essere controllati da una titolazione fago (figura 3) o con piscine fagiche in un saggio ELISA (Figura 4). Un rapporto di binding (> 2) indica generalmente la presenza di specifici cloni vincolanti. Viceversa, un basso rapporto (<2) può aiutare a determinare la causa di un errore di selezione. Per esempio, un rapporto <2 con alta OD non specifico può indicare la rimozione insufficiente di cloni non specifici (o leganti appiccicose) e che può richiedere ulteriore ottimizzazione del protocollo di selezione. Tuttavia, una volta che viene rilevato un arricchimento, i singoli cloni ad alta affinità possono essere isolati per il sequenziamento e la caratterizzazione. Clone legame può essere caratterizzata in un immunodosaggio colorimetrico e permette il confronto del legame del fago o Fab-Fab all'antigene immobilizzato contro proteine ​​controllo negativo, ottenendo una misura di arricchimento (rapporto di legame target contro proteine ​​di controllo negativo o affinità tag proteine) (Figura 5).

Durante scaling e automazione di questo metodo, la valutazione delle funzioni principali dell'apparecchio di trattamento liquido può essere utile per assicurare un funzionamento corretto e preciso con soluzioni simili a quelli utilizzati per le selezioni attuali. L'uso di cromofori assorbenti in soluzioni può contribuire a rilevare quando canali specifici nelle fluidica (aspirazione o di erogazione) sono o intasati o hanno perso guarnizione con conseguente consegna di volume parziale come illustrato in figura 6. Lavaggi automatici possono anche essere una fonte di variabilità e può richiedere attenzione. L'uso di noti cloni vincolanti consente di confrontare vincolante tra proteine ​​controllo di destinazione per garantire che venga mantenuta vincolante mentre sfondo rilegatura rimosso bersaglio (Figura 7) quando vengono ottimizzati parametri di lavaggio quali la velocità di erogazione, volumi di lavaggio e il numero di lavaggi. Seguitol'uso di un lavatore automatico piastra con soluzioni fagi, protocolli di decontaminazione efficaci sono necessarie per garantire l'assenza di contaminazione incrociata da cicli successivi di selezioni o diverse procedure di selezione e di una guida / interpretazione risoluzione dei problemi è previsto nella tabella 3.

Figura 1
Figura 1. Panoramica -. High-throughput produzione di antigeni e anticorpi selezione gasdotto Questa panoramica mostra una visualizzazione step-by-step di una generazione antigene e selezione di anticorpi gasdotto rappresentante. L'identificazione in silico di antigene confini del dominio consente la sintesi genica, espressione e la selezione su domini per le proteine ​​che possono essere caratterizzati male. Domini antigene espresso sono immobilizzati e utilizzati per isolare pool di specifici cloni di anticorpi ad alta affinità da un cobiblioteca anticorpo mbinatorial visualizzata sulla superficie del fago filamentoso. Piscine di anticorpi-fago eluiti e amplificati dai singoli antigeni possono essere utilizzati per monitorare l'arricchimento round-a-round di specifici cloni vincolanti in test basati su ELISA confrontando bersaglio immobilizzato contro proteine ​​controllo negativo prima dell'isolamento del singolo clone vincolanti per la caratterizzazione. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. SDS-PAGE visualizzazione di antigeni affinità-tag. Un rappresentante SDS-PAGE di-HIS 6X-GST-tagged domini antigene espresse e purificate (5-10 kDa dominio + 26 kDa GST), originariamente identificato da analisi in silico di antigene confini del dominio. Domini di proteine ​​espresse e isolati da affipurificazione nità sono caratterizzate da SDS-PAGE prima di selezioni per garantire l'identità basata dimensioni, i rendimenti adeguati e purezza per consentire l'uso in selezioni fagi-anticorpi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Visualizzazione dei titoli in uscita fago. I titoli in uscita fagi sono determinati dalla placcatura le cellule infettate con fago su una serie di diluizioni di 10 volte su supporti agar integrato con vari antibiotici (tetracicline, carbenicillina e kanamicina) per determinare la diluizione più basso in cui colonie si possono osservare e stimare il numero di fago legata a bersaglio antigene e eluito. Cliccate qui per vedere una grander versione di questa figura.

Figura 4
Figura 4. vincolante rapporto bersaglio alla proteina controllo negativo dal pool ELISA. Il progresso di arricchimento può essere valutata seguenti turni di selezione di screening singoli eluenti amplificati contro entrambi gli obiettivi specifici e le proteine ​​di controllo negativo e / o tag affinità isolato. Indicato nella trama sono i rapporti di arricchimento per il legame di 96 singoli pool fagi-anticorpi contro i loro 96 rispettivi antigeni contro proteine ​​di controllo negativo in parallelo. Ogni valore del rapporto deriva da due misure di assorbanza che quantificano vincolanti della piscina fago a uno di destinazione o di proteine ​​di controllo negativo utilizzando un anticorpo HRP-fuso specifico per M13 proteina di rivestimento del fago. Una soglia rapporto di 2 o superiore (spesso 2-10 o più come rappresentato in rosso) viene usato come indicazione di arricchimentoe la probabile presenza di specifici cloni vincolanti. Rapporti Lesser possono indicare guasti o problemi specifici con la selezione che può giustificare un'ulteriore ottimizzazione del protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Diretto clonale Fab-fago vincolante o Fab ELISA. Il legame di singoli cloni (sia in formato Fab Fab-fago o) può essere valutata mediante saggio basato su ELISA contro la proteina immobilizzata in 384 pozzetti. Binding viene rilevato mediante un anticorpo secondario HRP-fuso contro la proteina di rivestimento M13 on Fab-fago o un tag affinità sul Fab. Valori di assorbanza prime per legame di clonale Fab-fago all'antigene, proteina di controllo negativo e tag antigene affinità (GST) bersaglio sono raffigurati illustrano bi specificoritornati (A01, A04, A06) e leganti appiccicoso (A05).

Figura 6
Figura 6. Valutazione di volumi erogati con modalità automatizzate unità di gestione dei liquidi. Consegna costante e accurata dei volumi destinati dai sistemi di pipettaggio 96 pozzetti robotici o manuale può essere valutato utilizzando soluzioni tinti e un lettore di piastre. In questo esempio, 10 ml di una soluzione contenente blu di bromofenolo è sequenzialmente pipettato a tutti i pozzetti due 96 pozzetti utilizzando una singola scatola tip. Ciascun pozzetto contiene 90 microlitri / pozzetto dH 2 O, analogo all'aggiunta di fago helper di E. infetti coli. assorbanza di ogni piatto a 590 nm vengono letti in triplice copia, ei volumi sono interpolati da una curva standard preparata utilizzando un unico canale di Pipetman calibrato. Volumi consegnati ad una singola riga sulla prima e seconda piastra sono mostrati. Si noti che le abetit piatto, ben E04 riceve nessuna soluzione tinto, e sulla seconda piastra, riceve un doppio volume. Ciò indica che il tocco punta non è sufficiente per la consegna costante e richiede un'ulteriore ottimizzazione. Sono indicati al 95% intervallo di confidenza per le misure di assorbanza triplice copia.

Figura 7
Figura 7. Valutazione di lavaggio piatto automatizzato. Efficace rimozione di fago non legato può essere valutata con un test ELISA per misurare legame positivo immobilizzato (anticorpo anti-FLAG) e le proteine ​​di controllo (BSA) negativi, mentre variando le condizioni di lavaggio Fab-fago. In questo esempio, ingresso fago analoga alla libreria naïve (10 13 ufc / ml in PBT) viene rimosso con otto o sedici lavaggi, a mano o con il robot. Legame BSA fago residuo è la stessa in tutte le condizioni, come è specifico legame immobilizzato anticorpo anti-FLAG, indicope- che a questo flusso basso, entrambi i metodi sono equivalenti e sufficientemente rigorose. Sono indicati al 95% intervallo di confidenza da pozzetti in duplicato.

SOLUZIONI
2YT media - Aggiungere acqua per 1 L, aggiustare il pH a 7,0, e autoclave. estratto di lievito 10 g
tryptone 16 g
NaCl 5 g
NZY supporti (1 L) NZ Amine 10 g
estratto di lievito 5 g
50X ZYM-5052 20 ml
20 sale stock 50 ml
50x ZYM-5052 zucchero stock (1 L) glucosio 25 g
lattosio 100 g
glicerina 250 ml
Sale 20x magazzino (1 L) Na 2 HPO 4 500 mm
KH 2 PO 4 500 mm
NH 4 Cl 1 M
Na 2 SO 4 100 MM
Carbenicillin (Carb): 100 mg / ml in acqua. Filtro-sterilizzare.
Kanamicina (Kan): 25 mg / ml in acqua. Filtro-sterilizzare.
Tetracycline (Tet): 10 mg / ml in acqua. Filtro sterilizzare.
PEG-NaCl PEG
NaCl 2.5 M
1x PBS (pH7.2) NaCl 137 mm
KCl 3 mM
Na 2 HPO 4 8 mm
KH 2 PO 4 1.5 mM
1X KCM KCl 500 mm
CaCl 2 150 mm
MgCl 2 250 mm
SOC multimediale estratto di lievito 5 g / L
tryptone 20 g / L
NaCl 10 mM
KCl 2,5 mm
MgSO4 20 mm
Glucosio 20 mm
Blocco del buffer PBS 1x
BSA 0.20%
Buffer PBT PBS 1x
BSA 0.20%
Tween 0,05%
Buffer PT PBS 1x
Tween 0,05%
Acido fosforico H 3 P0 4 1 M

Tabella 1. Media e soluzioni.

PCR MASTER MIX-SET-UP </ Strong>
Componente microlitri per reazione
Acqua 19.45
Buffer 10x Taq 2.5
dNTP (10 stock mM) 0,675
DMSO 0.75
Taq enzima 0,125
Forward Primer (100 uM magazzino) 0.25
Primer Reverse (100 uM magazzino) 0.25
Pesante catena primer di sequenziamento
M13 Forward Primer GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC
M13 Reverse Primer CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA
Catena leggera primer di sequenziamento
M13 Forward Primer TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG
M13 Reverse Primer CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG
IMPOSTAZIONI PCR
Fase 1. 94 ° C per 03:00 min
Step 2. 94 ° C per 00:30 min
Step 3. 55 ° C per 00:30 min
Passo 4. 72 ° C per 01:00 min
Tornare al punto 2 e ripetere 24x passare al punto 2
Passo 5. 72 ° C per 07:00 min
Passo 6.

Tabella 2. PCR Master Mix e impostazioni.

Interpretazione dei risultati di decontaminazione
Piastra Atteso titolo carbenicillina In caso contrario?
Controllo pre-infezione 0 Le cellule sono state pre-infettati; nulla può concludere l'esperimento.
Controllo della contaminazione prato Contaminazione insufficiente per poter valutare l'efficacia della successiva decontaminazione; considerare sommergendo collettore in soluzione fago piuttosto che aspirare esso.
Test Decontaminazione 0 Decontaminazione non completa; aumentare il tempo di immersione, candeggina ConcentraSDS zione o provare e lavaggi EtOH invece.

Tabella 3. Valutazione della rondella decontaminazione. Per determinare l'efficacia di decontaminazione, è necessario dimostrare che la rondella è stato contaminato con fago, e che il protocollo di decontaminazione eliminato con successo che la contaminazione. Utilizzando fago che conferiscono carbenicillina resistenza, i risultati attesi da un tale test sono elencati, insieme con i suggerimenti se il risultato vero differire dal risultato atteso.

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Discussion

Nel condurre nelle selezioni di anticorpi in vitro, i due fattori determinanti principali di successo di selezione sono: 1) l'isolamento di obiettivi antigeniche ben piegati, per la selezione su e 2) la disponibilità di una libreria di anticorpi diversità funzionale. In molti casi, la disponibilità di quantità sufficienti di ben piegata, proteina intera può essere limitante. Un approccio per superare questa limitazione è quello di utilizzare i domini individuati dall'analisi bioinformatica 22 e sintetizzati per l'inserimento in un vettore di espressione batterica con un tag affinità appropriata.

Vi sono una varietà di etichette che vengono utilizzati in applicazioni biotecnologiche per aumentare la solubilità, facilitare la purificazione e stabilizzare domini instabili. 11 La capacità di sintetizzare qualsiasi sequenza desiderata inserto consente una piattaforma altamente versatile generazione antigene. Anche se il formato GST-tag è comune, risultati positivi sono stati in precedenzaottenuto utilizzando hexahistidine, Fc, Halo, maltosio proteina legante e tag biotinilazione site-specific e si ritiene che una miriade di altri tag affinità possono essere ottimizzati per l'utilizzo in una piattaforma simile. Tuttavia, i tag di affinità possono avere conseguenze sia negative benefiche e non voluti in applicazioni a valle 11 e devono essere oggetto di studi approfonditi prima di stabilire una condotta sulla base di un particolare formato.

Spesso i nuovi utenti potranno porre la questione di come valutare la qualità di una libreria di anticorpi e anche se non c'è una risposta diretta, si dovrebbe cercare di valutare diverse caratteristiche chiave (sia naturale o sintetica) e la diversità globale, i livelli di visualizzazione relativi, la natura di e l'estensione della randomizzazione (ad esempio, la progettazione biblioteca rispetto dei contenuti della libreria determinato dal sequenziamento) e le proprietà fisico-chimiche della anticorpi contro applicazione prevista. Anche se oltre la portata di questo protocollo, un lavor più dettagliatant di queste caratteristiche e come possono influenzare la selezione di anticorpi possono essere trovati qui 2,23. La conoscenza della diversità biblioteca è, in particolare, importante per garantire un'adeguata copertura della diversità durante le selezioni. In genere, una concentrazione fago che fornisce 100-1.000 copie di ogni clone fago nella libreria è auspicabile e dovrebbe garantire che qualsiasi veri raccoglitori positive presenti nella libreria possono essere recuperati. Tuttavia, legame non specifico del fago per micropiastra superfici aumenta drammaticamente sopra 10 13 fago / ml, e per le librerie molto diverse, più di un pozzo per l'antigene può essere necessario per garantire una copertura sufficiente. D'altra parte, se la libreria ingresso è troppo diluita, la concentrazione assoluta di veri positivi leganti sarà talmente inferiore KD (tipicamente nM) che non saranno recuperati. Dati questi vincoli, librerie fagiche dovrebbero generalmente essere risospesa per 12-13 Ottobre fago / ml per il primo turno di selezioni.0; A questa concentrazione, una 100 L aliquota di fago rappresenta una copertura 1,000-100 piega di una biblioteca diversità 10 9 -10 10 e può regolarmente produrre cloni vincolanti per diversi antigeni. A concentrazioni minori, o l'aumento delle diversità, può essere necessario aumentare il numero di pozzi di antigeni selezionati contro nel primo turno (vedi Sezione 2.9). Dopo arrotondare 1, tuttavia, la maggior parte della diversità non vincolante della biblioteca è stato rimosso; eccesso copertura della diversità uscita turno 1 è il più spesso facilmente realizzabile utilizzando un singolo pozzo. In caso di selezioni paralleli in piastre da 96 pozzetti, questo può ridurre il numero di piastre di selezione dell'antigene necessario a solo, successivi al primo turno.

Durante le selezioni attuali, fago titolazione può offrire misure oggettive per caratterizzare e monitorare i progressi, contribuendo a identificare le aree di preoccupazione soprattutto nei primi turni di selezione in cui l'arricchimento non è sufficiente peressere rilevato. Questo può essere particolarmente utile durante il ridimensionamento delle selezioni per determinare le prestazioni di protocollo. In generale, titoli di ingresso fagi (cioè, biblioteca ingenuo o post-amplificazione del fago eluita) dovrebbero rimanere relativamente costante (10 12 -10 13 fago / ml) tra un round, con la crescita delle cellule poveri / basso titolo fago indica contaminazione potenziale e / o povero uscita dal turno precedente. Sebbene titoli uscita fagi dovrebbero aumentare durante l'arricchimento in successivi turni di selezione, è previsto un intervallo di 10 3 -10 5 cfu / ml nei primi due turni. Deviazione di questa gamma può indicare potenziali problemi con la selezione, come la contaminazione o l'eccesso di lavaggio rigore. In successivi turni di selezione (ad esempio, arrotonda 3 e 4), l'arricchimento di cloni che specificamente legano l'antigene bersaglio può essere valutata mediante test ELISA mescolate che misura vincolante della piscina fago sia contro l'antigene bersaglio e negativoproteina di controllo (vedi sezione 4).

Dopo 3-4 cicli di selezione (o una volta arricchimento sulla proteina bersaglio ha raggiunto un antigene bersaglio: rapporto segnale proteine ​​controllo negativo di 2: 1 o superiore in confronto alle proteine ​​sfondo), cellule batteriche infette sono placcati per isolare le colonie fagemide singoli per il sequenziamento , caratterizzazione iniziale e la clonazione, se necessario. In questo momento, è altamente consigliabile convertire Fab-fago per liberare Fab prima caratterizzazione supplementare. Sebbene Fab-fago può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale diluendo 10 ml di fago surnatante (descritto nella Sezione 5.1) in tampone PBT 20 microlitri e rilevando con anticorpi anti-M13-HRP (descritto nei passaggi 4,4-4,5), nella nostra esperienza, proprietà di legame possono cambiare sostanzialmente ovunque da 5-20% di cloni al momento della liberazione dalla particella fago e conversione anticipata può ovviare problemi con falsi positivi. Il metodo specifico usato per la conversione dipenderà dalla unique architettura del fagemide e quindi non verranno trattate esplicitamente qui. Tuttavia, nei vettori più comunemente utilizzato, questo può essere realizzato generalmente 1) trasformazione di fagemide purificato (o piscina fagemide) in un non-soppressore competente E. coli quali HB2151 o 55.244 se un arresto di ambra (TAG) codone interviene la proteina Fab e pIII, 2) l'inserimento di un codone di stop ambra tra le proteine ​​Fab e PIII per consentire l'espressione di frammenti di anticorpi solubili in un ceppo non-soppressore o 3) clonando i geni delle immunoglobuline (da fagemidi individuale o in piscina fagemidi) in un vettore di espressione adatta. Per semplificare ulteriormente la selezione e caratterizzazione, metodi di clonazione pool possono offrire strumenti efficaci per convertire i cloni vincolanti in massa di costrutti di espressione, sia eliminando la possibilità di legame di falsi positivi di particelle Fab-fagi e in cui sono utilizzati lisati di espressione per la caratterizzazione presto, anche il costo e lo sforzo di purificazionepuò essere inizialmente evitato.

Per cloni isolati direttamente dalla libreria F (descritto in 24), domini variabili anticorpi possono essere sequenziati usando 1-2 ml di fago surnatante come modello per PCR amplifica complementarità determinare regioni (CDR) (vedi Tabella 2 dei Materiali per primer Biblioteca F-diretti ). L'utilizzo di questi fondi, le regioni variabili della catena pesante e leggera produrrà prodotti di ~ 700 ~ 500 bp e, rispettivamente, che copre tutti e tre i CDR. Primer includono siti di ricottura per primer M13 tale che i prodotti possono essere sequenziati dopo la pulizia (come descritto nella sezione 5.4.5) utilizzando primer standard disponibili nella maggior parte delle strutture centrali di sequenziamento. In alternativa, per le piscine Fab-fagi che sono stati clonati in un vettore di espressione e trasformati direttamente in E. coli per l'espressione, singole colonie può essere isolato e risospeso in 15 ml di 2YT e 1-2 ml di sospensione cellulare utilizzati direttamente come modello per singola colony PCR usando primer appropriati.

Automatizzare le selezioni richiedono l'ottimizzazione e la convalida di diverse funzioni robotiche chiave. In generale, gestione dei liquidi pipetta a base deve essere accurata e coerente in tutti i 96 canali, piastra lavaggio deve rimuovere fago non legato in modo efficiente senza togliere antigene adsorbito o legato Fab-fago dalla piastra di selezione. Decontaminazione efficace della rondella piastra è anche necessario tra un round e per consentire di arricchimento ed efficace contro-selezione, e tra le successive selezioni per evitare la contaminazione incrociata. Per ottimizzare la procedura di selezione ad alto rendimento, semplici approcci per la valutazione di queste funzioni sono state utilizzate in precedenza e sono descritti di seguito e dettagliato all'interno del protocollo.

Per valutare la consistenza dei volumi fornite da tutti i canali di una testa di erogazione / aspirazione di liquidi, una soluzione colorata è pipettato a 96 pozzetti a fondo piatto e il absorbance in ogni pozzetto misurata su un lettore di piastre. Un cromoforo come blu di bromofenolo è utile per soluzioni coloranti simili a quelli utilizzati per le selezioni reali per valutare gli effetti di differenti proprietà di tensione superficiale e di coesione per i volumi. Dopo aver verificato che tutti i canali sono dispensare volumi consistenti, la precisione del volume totale erogata può essere determinata misurando la massa di liquido trasferito a ciascuna piastra.

Automazione della piastra lavaggio per rimuovere cloni non legato richiede principalmente l'ottimizzazione della velocità di tampone di lavaggio deve essere erogato e il numero di lavaggi da impiegare. Un metodo ragionevole di valutazione di questo parametro impiega controlli positivi (specifico Fab-fago cloni vincolante) per valutare gli effetti della variazione della velocità di erogazione e / o il numero di lavaggi per determinare se 1) adsorbiti antigene o fago legato viene rimosso mediante lavaggio eccessivamente rigorosi o 2) il legame alle proteine ​​non affini non specifico è eccessivo due per lavare condizioni che non sono sufficientemente rigorose. Residuo / fago legato può essere rilevato e quantificato sia da infezione nei batteri e placcatura per i conteggi singola colonia, oppure ELISA utilizzando anticorpi secondari specifici per i tag anticorpi affinità o proteine ​​cappotto fago. I controlli negativi sono usati per valutare i livelli di residui di non vincolante Fab-fago a bersaglio le proteine ​​o specifiche Fab-fago legame alle proteine ​​non cognate / sfondo, che può essere alto se il lavaggio non è sufficientemente rigoroso. In questo caso, abbiamo usato immobilizzato BSA come controllo per legami non specifici e un anticorpo anti-FLAG che riconosce un epitopo FLAG tag sul Fab-fago come controllo positivo. Abbiamo confrontato otto e sedici cicli di lavaggio utilizzando il robot rispetto lavaggio a mano, con una portata media, per indicare che queste tecniche erano equivalenti. In alternativa, in ingresso e in uscita titoli fagi (vedi sezione 7) la misura durante le selezioni in corso può anche contribuire a rendere regolazioni fini dei parametri di lavaggio. Infine, decontaminazione di rondelle piastra utilizzata per le selezioni deve essere efficace per eliminare riporto di fago dalle selezioni precedenti. Nella nostra esperienza, appena diluito allo 0,5% di ipoclorito di sodio è veloce, efficace ed economico. Detergenti come SDS sono anche efficaci ma richiedono molto più ampia di lavaggio per rimuovere dal sistema. Verificare la compatibilità del reagente per il sistema prima di ogni test. Per valutare la decontaminazione, ci prova per la presenza di fago residua nelle soluzioni gestite dal sistema fluidica e interpretare i risultati in base alla tabella 3.

In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo scalabile per isolare Fabs da librerie combinatorie dal parallelo selezioni vitro contro i domini di proteine ​​e offre tecniche per la validazione di un sistema di selezione dei fagi automatizzato. Costi e infrastrutture barriere che ampie strutture animali possono rappresentare sono mitigate dal momento che questo metodo non rily momento l'immunizzazione degli animali. Inoltre, integrando la generazione antigene con la selezione di anticorpi-fago, fattori di qualità che influenzano il successo di selezione sono più facilmente controllati e regolati. Quando il periodo di tempo da espressione dell'antigene di selezione e caratterizzazione iniziale è dell'ordine di 6-8 settimane, un sistema più reattivo di produzione può essere realizzato. Anticorpi isolati da selezioni in vitro sono entrambi facilmente modificati (a causa di genotipo-fenotipo linkage) e rinnovabile, che richiede il DNA conservato solo il costrutto espressione più volte e riproducibile ri-generare anticorpi. Infine, mostrando che questo protocollo può essere effettuata utilizzando un approccio quasi-manuale o completamente automatizzato che si avvale di un sistema di selezione robot progettati su misura, il throughput può essere scalabile e accessibile a piccoli laboratori accademici e industriali simili.

Utilizzando i metodi high-throughput sopra descritti e la Biblioteca F biblioteca anticorpo sintetico 24 in vitro - e in situ -expressed proteine. Sebbene il tasso di successo per ogni selezione dipenderà sia sulla qualità (purezza, foldedness, mono-dispersity etc.) degli obiettivi antigene nonché la qualità e la diversità della biblioteca anticorpi, è stato osservato che ovunque 25-80 % di antigeni produrrà leganti per una selezione ad alta produttività. Importante, vale la pena notare che possono spesso essere selezionati cloni con la capacità di modulare la funzione di destinazione. Questa libreria è costruito utilizzando un quadro pienamente umana, che rende questi anticorpi suscettibili di potenziale applicazione terapeutica 25, evidenziando così l'importanza di questo gasdotto come un approccio alternativo per la generazione di reagenti di affinità con larga base-valore.

In sintesi, la robustezza e la versatilità dell'approccio presentato in questo protocollo continuerà per aiutare nella ottimizzazione, industrializzazione e ultimo l'uso diffuso di questa tecnologia come mezzo vitale di raggiungere l'obiettivo a lungo termine di generare reagenti affinità a quasi tutti i membri del il proteoma umano.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere il Fondo comune NIH - proteine ​​reagenti acquisire il programma per finanziare lo sviluppo della selezione e caratterizzazione di anticorpi ricombinanti gasdotto anticorpo Network e la Fondazione canadese per l'innovazione per l'acquisto il finanziamento della piattaforma di selezione robotica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker Eppendorf M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system Anachem Ltd LIQ-96-200
Microplate shaker VWR 12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge Thermo Product 75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer Biotek ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml VWR 21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml VWR 89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes Corning MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate Sigma M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block Corning 3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box Corning AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film VWR 60941-084
REAGENTS
Name Company Catalog Number
polyethylene glycol Bioshop PEG800.1
yeast extract Bioshop YEX401.1
bio-tryptone Bioshop TRP402.1
N-Z amine Sigma C7290
glucose Sigma G8270-1KG
lactose Bioshop LAC234
glycerol Bioshop GLY001.500
carbenicillin  Bioshop CAR544.10
kanamycin Bioshop KAN201.25
tetracycline  Bioshop TET701.25
Tween 20 Bioshop TWN510.500
monobasic potassium phophate Bioshop PPM302.1
dibasic sodium phosphate Anachemia 84486-440
sodium chloride Bioshop SOD001.10
potassium chloride Bioshop POC308.1
calcium chloride Bioshop CCL302.500
magnesium sulphate EMD MX0070-1
magnesium chloride Bioshop MAG510.500
NH4Cl Amresco 0621-1KG
Na2SO4 Bioshop SOS513.500
agar Bioshop AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain Invitrogen S33102
phosphoric acid Acros Organics 201140010
lysozyme Bioshop LYS702.25
benzonase Novagen 71205
Triton X-100 Bioshop TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets Roche 11 836 170 001
Ni-NTA resin  Qiagen 1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) NEB N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). GE Healthcare 27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate  KPL 50-76-00
dNTPs Biobasic DD0056
Taq polymerase Genscript E00007
Exonuclease GE Healthcare  EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase GE Healthcare E70092Z-EZ

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Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato
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Miersch, S., Li, Z., Hanna, R.,More

Miersch, S., Li, Z., Hanna, R., McLaughlin, M. E., Hornsby, M., Matsuguchi, T., Paduch, M., Sääf, A., Wells, J., Koide, S., Kossiakoff, A., Sidhu, S. S. Scalable High Throughput Selection From Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries. J. Vis. Exp. (95), e51492, doi:10.3791/51492 (2015).

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