Summary
Une méthode est décrite avec accompagnement visuel pour mener évolutives, des sélections à haut débit à partir de banques d'anticorps combinatoires synthétiques de phages contre des centaines d'antigènes simultanément. En utilisant cette approche parallèle, nous avons isolé des fragments d'anticorps qui présentent une affinité et une spécificité pour divers antigènes qui sont fonctionnelles dans des dosages immunologiques standard.
Abstract
La demande pour les anticorps qui répondent aux besoins des deux applications de la recherche fondamentale et clinique est élevé et va augmenter considérablement dans l'avenir. Cependant, il est évident que les techniques traditionnelles monoclonaux ne sont pas seuls à cette entrée. Cela a conduit au développement de méthodes alternatives pour satisfaire la demande de haute qualité et de réactifs d'affinité renouvelables accessibles à tous les éléments du protéome. À cette fin, méthodes à haut débit pour la conduite des sélections de bibliothèques d'anticorps synthétiques phages ont été conçus pour des applications impliquant divers antigènes et optimisé pour un débit rapide et le succès. Ici, un protocole est décrit en détail qui illustre avec la sélection vidéo manifestation parallèle clones de Fab-phage à partir de bibliothèques de grande diversité contre des centaines de cibles à l'aide soit d'un gestionnaire de liquide 96 manuel de canal automatique ou système robotique. En utilisant ce protocole, un seul utilisateur peut générer des centaines d'antigènes,sélectionner des anticorps à eux en parallèle et valider contraignant dans les six à huit semaines anticorps. Surbrillance sont: i) un format de l'antigène viable, ii) l'antigène pré-sélection caractérisation, iii) les étapes critiques qui influencent la sélection de clones spécifiques et de haute affinité, et iv) les moyens de l'efficacité de la sélection de la surveillance et stade précoce anticorps clone caractérisation. Avec cette approche, nous avons obtenu des fragments d'anticorps synthétiques (FABS) à de nombreuses catégories de cibles, y compris les récepteurs à passage unique membranaires, hormones protéiques sécrétées et les protéines intracellulaires multi-domaines. Ces fragments sont facilement convertis à des anticorps pleine longueur et ont été validés à présenter une grande affinité et spécificité. En outre, il a été démontré pour être fonctionnels dans une variété de dosages immunologiques standard, y compris Western blot, ELISA, l'immunofluorescence cellulaire, des dosages d'immunoprécipitation et connexes. Cette méthodologie permettra d'accélérer la découverte d'anticorps et, finalement, de nous rapprocher de la réalisation de l'objectif of générer renouvelables, des anticorps de haute qualité à la protéome.
Introduction
Avec le début de l'ère post-génomique, la disponibilité des réactifs de liaison de haute qualité pour caractériser et de moduler les protéines est essentiel pour ouvrir de nouvelles recherches et avenues thérapeutiques. Anticorps continuent d'être critique à la fois aux chercheurs universitaires et industriels que la recherche fondamentale et outils de diagnostic et thérapeutiques potentiels. Sans surprise, il ya eu une croissance impressionnante des entreprises de développement d'anticorps du contrat, dont la plupart se appuient sur des technologies classiques d'hybridomes pour générer des anticorps personnalisés. Néanmoins, la sélection in vitro en utilisant des bibliothèques d'anticorps phages devient une technologie alternative puissante qui peut offrir des avantages et des succès uniques où les technologies conventionnelles peuvent rencontrer des limitations 1, 2.
À la lumière de la demande considérable pour les anticorps de haute qualité comme outils de recherche, deux principaux défis pour générer des anticorps renouvelables sont 1) le débit de sélection et 2) l'antigène availability. Un certain nombre de groupes ont maintenant décrit dans les pipelines de sélection in vitro visant à augmenter le débit et le taux de l'identification d'anticorps. Ces descriptions en détail une variété d'approches viables qui incluent le choix soit sur toute la longueur cible 3,4, 5,6,7 ou des domaines structurellement liée, en utilisant soit 6,8 ou une plaque à base de 3,4 régimes antigène d'immobilisation sur la base de perles. En outre, l'adoption croissante des technologies de synthèse de gènes neuf a fait la production de l'antigène systématique, en particulier des domaines isolés, raisonnablement rentable et peut potentiellement atténuer la difficulté d'obtenir des quantités suffisantes de l'antigène purifié, pleine longueur. En utilisant les deux technologies en tandem, un pipeline autonome et la production de l'antigène évolutive et la sélection d'anticorps a été conçu qui permettrait l'isolement d'anticorps parallèle pour les grands ensembles de domaines antigène exprimé et faciliter le développement de réactifs pour characterizing classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement liés.
Vers cet objectif, un pipeline intégré que les couples dans l'identification in silico de domaines d'antigène exprimables, synthèse de gènes, expression bactérienne à haut débit des antigènes et des sélections d'anticorps de phages évolutives a été développé. Ce pipeline ne nécessite que l'infrastructure de base disponible pour la plupart des laboratoires de sciences de la vie (y compris les bibliothèques d'anticorps qui sont de plus en plus disponible via une licence ou un accord de transfert de matériel), mais est également prête à l'automatisation pour une utilisation à l'échelle industrielle. En utilisant ce protocole, il est possible de générer des centaines de domaines d'antigène étiqueté par affinité, et d'isoler des fragments d'anticorps habituellement hautement spécifiques à un grand nombre de ces antigènes.
La technologie de présentation de phage a montré la compatibilité démontrée avec une grande variété de formats de réactifs d'affinité recombinants, y compris les fragments Fab, scFv, Fv et des domaines autonomes et unnombre croissant de petites «cadres alternatifs» (protéines de répétition ankyrine conçus (DARPINS), fibronectine (Fn), domaines de LIPOCALINE et plus 10). Discussion est limité dans cet exemple à l'isolement de fragments d'anticorps Fab, même si on suppose ces procédés peuvent être adaptés à d'autres types de bibliothèques. En utilisant cette technologie, Fab ayant un faible nanomolaire affinité à petit, tagged domaines de protéines y compris des domaines de facteurs de transcription, des domaines SH2, de l'ARN des protéines de liaison et d'autres ont été sélectionnés avec succès, dont plusieurs se lient protéine de pleine longueur et sont fonctionnels dans des analyses immunologiques telles que l'immunofluorescence , immunoprécipitation et immunohistochimie. Fait important, les clones de liaison recombinantes sont entièrement renouvelables et peuvent être re-générés à partir de constructions d'expression via bactérienne offre de production accrue cohérence, la reproductibilité et la rentabilité, justifiant ainsi la charge de la validation de clone rigoureuse.
Dans cette protocol et vidéo qui l'accompagne, les méthodes de base pour la sélection d'anticorps à partir de banques de phages en utilisant les domaines d'antigènes immobilisés sont démontrés. Cette méthode particulière emploie domaines protéiques étiquetée GST immobilisées par adsorption passive dans des plaques de microtitration, bien que d'autres mots-clés 11,12,13 et les formats de sélection 13,14,2 ont également été utilisés avec succès. Considérations critiques pour la configuration et la conduite des sélections avec contrôle parallèle de paramètres de sélection visant à identifier et isoler anticorps monoclonaux spécifiquement enrichis pour la validation sont détaillées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antigène Generation
REMARQUE: domaines antigène peut être synthétisé et clone par une variété de fournisseurs commerciaux dans un produit d'assemblage d'expression inductible par l'IPTG approprié.
- Transformer constructions d'expression dans chimiquement compétente, T1-phage résistant, BL21 E. cellules de E. coli en mélangeant 10 ng d'ADN codant dans 20 ul de KCM 1X sur de la glace dans une plaque à 96 puits PCR suivi par l'ajout de 20 L de cellules chimiquement compétentes.
- Incuber le mélange cellules / ADN sur de la glace pendant 20 min, à température ambiante pendant 10 min, puis sur la glace à nouveau pendant 2 minutes avant de sauver avec 100 pi de super bouillon optimale préchauffé avec glucose (SOC) médias, couvrant avec un joint de plaque respirant et agitation à 37 ° C pendant 1 heure à 200 rpm dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
- Planche 5 ul de cellules transformées sur de Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose complété avec de la carbénicilline (100 g / ml) et de se développer O / N afin d'obtenir des colonies uniques utilisées pourgénérer des stocks de glycerol.
- Inoculer 1 ml de milieu 2YT / carb avec 5 pi stock de glycérol et de croître pendant 12 heures à 37 ° C dans un bloc de 96 puits en puits profond avec agitation à 200 tpm dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
- Inoculer NZY media15 (complété avec 0,05% de glucose, 2% de lactose et 100 g / ml de carbénicilline) avec une dilution 1:40 de cette culture, puis agiter pendant 6-8 heures à 30 ° C et 200 tpm dans un 2,5 cm orbitale shaker.
- bactéries Pellet et purifier des protéines antigéniques à haut débit dans une plaque filtrante à 96 puits contenant 100 pi de résine Ni-NTA selon protocols16,17 précédemment publié.
- Déterminer la concentration de protéines purifiées par Bradford assay18 de fixation de colorant et de caractériser la taille et la pureté par séparation et la visualisation de 10-50 ug avec Coomassie sur un gel SDS-page (voir Figure 2).
NOTE: A ce stade protéines peut être caractérisé par des méthodes qui permettent d'évaluer l'agrégation des protéines 19 20 en fonction de la nature de l'antigène et les exigences de la canalisation de sélection.
2. Préparation et titrage de la Bibliothèque Phage
- Choisissez une seule colonie de E. T1 résistants aux phages coli cellules dans 1 ml de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline.
- Une fois que la croissance cellulaire est établie visuellement, diluer la culture dans un plus grand volume de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline pour assurer un volume suffisant de cellules pour l'infection (généralement de 45 ul par dilution bibliothèque, voir ci-dessous.).
- Préparation de la bibliothèque pour une utilisation par précipitation du phage à partir du tampon de stockage avec 1 / 5ème du volume de l'autoclave 20% de PEG-8000, 2,5 M de NaCl (PEG-NaCl) à incuber sur de la glace pendant 30 min et la granulation phage précipité par centrifugation à 12 000 x g.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le phage précipité dans un volume approprié de PBS 1x pH 7,4, 0,2% de BSA et 0,05% de Tween (PBT), en ajustant to une concentration de phage appropriée pour les sélections (si nécessaire) pour assurer une couverture adéquate de la bibliothèque. Voir l'étape 2.9 et discussion.
- Diluer une aliquote de 5 ul phage dans 45 pi de PBS 1x pH 7,4 dans une plaque multi-puits stérile, mélanger, et de créer une série de 10 dilutions dans le même tampon.
- Ajouter 5 ul de chaque dilution de phage à 45 ul de phage T1-E résistant. coli cellules en phase de croissance journal (DO 600 = 0,4 à 0,8) dans une autre plaque multi-puits, couvrir avec un joint respirant et incuber à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute pendant 30 min dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
- Planche 5 ul de cellules infectées de chacun des puits sur une plaque de gélose préchauffé additionné de 100 g / ml de carbénicilline et de croître O / N à 37 ° C jusqu'à ce que des colonies soient visibles.
- Calculez le total phage / ml comme suit:
Phage / ml = nombre de colonies sur une plaque carbénicilline dans le diluer échantillon x 200 x 10 i (où i = le num plupart maximalebre de dilutions dans lequel les colonies sont visibles). - Pour déterminer le nombre de puits revêtus d'antigène pour assurer une couverture de la diversité bibliothèque, calculer comme suit:
Nombre de puits revêtus d'antigène requise =
Pli couverture souhaitée * la diversité de la bibliothèque
# De phage pour 100 ul
3. Anticorps Sélection de bibliothèques de phages
3.1) Immobilisation Antigen
- Pour éviter les cycles de gel-dégel peuvent affecter la qualité antigène et pour faciliter dilutions, préparer une plaque de protéine antigène stock normalisée à 100x concentrations de travail (par exemple, 500 g / ml) et aliquotes dans des plaques à 96 puits non contraignant.
- Préparer des plaques recouvertes d'antigène de solutions de protéines du stock un jour avant chaque tour de sélections par dilution du stock plaques avec du PBS.
- Manteau 96 puits polystyrène plaques de liaison de protéines avec 100 pi de TPS-étiqueté protéine d'antigène ou contrôle négatif protein (TPS, BSA, neutravidine, etc.) à 5 ug / ml dans PBS. Agiter à 250 rpm 4 ° CO / N sur un agitateur de microplaques.
- Enlever la solution de protéine à partir de l'enduit microplaques, bloquer les plaques revêtues d'antigène et de sélection négative avec 200 pi de tampon de blocage (0,2% de BSA dans PBS 1x pH 7,4) et agiter à 250 rpm à température ambiante pendant 1-2 heures.
- Après blocage, les plaques de laver revêtus de protéine bloqués quatre fois avec 200 ul de 1 x PBS, pH 7,4 avec 0,05% de Tween (PT) en mémoire tampon soit manuellement, soit en utilisant un laveur de microplaques automatique.
3.2) Bibliothèque pré-dédouanement et Antigen-phage Incubation
- Appauvrissent la bibliothèque de non (ou tag-) fragment de liaison d'anticorps clones spécifiques de phages par virement de 100 pi (10 12 phages) de bibliothèque de phages préparés dans un tampon PBT à un certain nombre de puits revêtus de protéine de contrôle négatif ou sans étiquette d'affinité protéine (par exemple, TPS) équivalent au nombre de cibles et incuber phagedans les puits pour 1-2 heures à température ambiante avec agitation à 250 rpm.
Remarque: Comme alternative ou d'autres moyens de sélection négative, l'incubation peut également être effectuée en présence d'un excès (5 à 25 uM) protéine soluble dans l'étiquette d'affinité (par exemple, TPS) pour éliminer davantage les clones de balises de liaison et améliorer la récupération de la cible spécifique clones de liaison. - Transfert phage surnageant de sélection négative sur des plaques revêtues d'antigène et incuber pendant 2/1 heure à température ambiante avec agitation par secousses à 250 tours par minute pour la capture de clones de liaison spécifique.
- Retirer les phages non liés et laver les puits de la microplaque 8-15 fois avec un tampon de PT soit manuellement ou en utilisant un laveur de microplaques. Éliminer le tampon de lavage en excès juste avant élution.
3.3) élution, maladies infectieuses et Phage Amplification
- Tôt le jour de sélections, choisissez une seule colonie de E. T1 résistants aux phages coli cellules dans 1 ml de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline et de croissance à 37 ° C wie agitation à 200 rpm dans un shaker ou équivalent orbitale 2,5 cm.
- Une fois que la croissance cellulaire est établie et peut être vu à l'oeil nu, d'augmenter le volume de milieu 2YT avec additionné de 50 ug / ml de tetracycline pour assurer un volume suffisant de cellules pour l'infection (généralement 100 ul par puits sélection).
- Cultiver les cellules jusqu'à une DO 600 de 0,4-0,8 est atteint (environ 5-7 heures), puis à éluer le phage lié ajouter 100 pi de cellules à la plaque d'antigène lavé et agiter à 37 ° C pendant 30 min.
- Ajouter le phage auxiliaire M13K07 à une concentration finale de 1 x 10 10 cfu / ml et incuber à 37 ° C pendant 45 min sous agitation à 200 tours par minute.
- cellules de transfert à 1,2 ml de 2YT complétées avec 150 pg / ml de carbénicilline et 75 pg / ml de kanamycine dans un 96 puits bloc profonde de bien avec V-bas et de grandir O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tpm dans un 2,5 cm agitateur orbital.
3.4) Phage Préparation et cycles répétés de Selection
- Bactéries pellets par centrifugation à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Mélanger des volumes égaux de surnageant de phages à partir de plaques répliquées dans un mini-tube de 96 puits boîte bleue de microplaque stérile, neutraliser avec 1/10 ème volume de 10X PBT et mélanger. Répéter les tours de sélection (à partir de l'étape 3.1.1) pendant 3-4 tours ou jusqu'à ce que l'enrichissement est observée (voir les sections 4. et 7.) par rapport à la protéine de contrôle négatif.
NOTE: Dans les premiers tours de sélection lorsque ne est pas prévu enrichissement significatif / détectable (par exemple, les séries 1 et 2), la quantification des titres d'entrée et de sortie phages (décrites à la section 7 et des résultats représentatifs de la figure 3) peut être utile pour se assurer concentrations minimales de phages pour les sélections succès (décrites dans Discussion) et sont plus appropriées que ELISA communs.
4. Caractérisation par Pooled ELISA
- Manteau de 96 puits à haute valeur protéique-bindtion des plaques de polystyrène avec 100 pi de TPS-étiqueté protéine d'antigène ou une protéine de contrôle négatif (TPS, BSA, neutravidine etc.) à 2 pg / ml conformément à la section 3.1 et agiter à 4 ° CO / N.
- Retirer l'excès d'antigène, bloquer la plaque avec 200 pi de tampon de blocage avec agitation pendant 1-2 heures à la température ambiante à 250 tpm sur un agitateur de microplaque et laver quatre fois avec le tampon de PT 200 pi soit à la main ou en automatique de lavage de plaques.
- Appliquer 100 pi de surnageant de phage (dilué 1: 10-1: 20 dans un tampon PBT), serrer à 250 tours par minute pendant 15 min à température ambiante, et laver la plaque huit fois avec le tampon de PT 200 pi.
- Ajouter 100 ul d'anticorps anti-M13-HRP (1: 5000 dans du tampon PBT). Agiter à 200 tours par minute pendant 30 min à température ambiante, puis laver la plaque six fois avec le tampon de PT 200 pi et deux fois avec 200 pi de PBS.
- Appliquer 100 pi de 1: 1 substrat de TMB et développer pour 5-15 min (ou jusqu'à ce que la couleur substantielle a développé), puis arrêter la réaction par addition de 100 pi d'une MH 3 4 et de lire la plaque à 450 nm.
- En général, l'enrichissement en pools de phage peut être observé dans les tours 4/3 comme un rapport de liaison spécifique par rapport à la liaison non spécifique de> 2 (voir figure 4)
NOTE: Il est instructif de noter que signal élevé liaison absolue sur la protéine affinité tag indique enrichissement de liants spécifiques tag (plutôt que liants cibles), et que le signal de liaison absolue élevée sur la protéine de contrôle négatif indique enrichissement de non-spécifique ou " «liants collantes.
5. Clone sélection, séquençage et la caractérisation
5.1) Isolement de simples Fab-phage Clones
- Pour isoler les clones individuels pour le séquençage et la caractérisation, infecter 1/10 ème volume du pool de phages amplifiés dans de phage T1 résistant E. coli cellules en phase logarithmique de croissance (DO 600 = 0,4 à 0,8) dans une plaque de microtitrage à fond rond, couvrent avec un Breathajoint de plaque ble et incuber sous agitation à 200 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C.
- Préparer 10 fois des dilutions en série dans un milieu 2YT et plaque sur des plaques d'agar-agar supplémenté avec distinctes 100 g / ml de carbénicilline.
- Prélever des colonies simples dans 450 pi de milieu 2YT / carb complétées avec 1 x 10 9 M13K07 phage / ml et de grandir O / N dans un mini-tube de 96 de la boîte bleue de puits de microplaque stérile incubation à 37 ° C avec agitation à 200 rpm.
- Bactéries pellets par centrifugation à 4000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Clonale phage surnageant peut être utilisé pour le séquençage de clones Fab-phage (comme décrit à la section 5.4) ou pour clonale directe contraignant ELISA pour déterminer la spécificité contre des antigènes immobilisés (comme décrit dans les sections 5.3 et 21) pour lesquels des résultats représentatifs sont présentés dans la figure 5.
5.2) Expression de clones Fab pour la caractérisation
- Après clonage dans un e appropriéevecteur xpression (voir Discussion), prendre seul E. coli colonies transformées avec constructions d'expression dans 1 ml de milieu 2YT / carb dans une plaque de 96 puits profonds puits en utilisant un cure-dent ou embout de pipette stérile et croître pendant 12-16 heures à 37 ° C avec agitation à 200 rpm. Cela peut être fait soit manuellement ou avec un sélecteur de colonie automatisé.
- Transfert 40 ul de culture en croissance à 1,5 ml de milieu NZY supplémenté avec du glucose / lactose / glycérol dans un bloc et à arbre long 96 selon la méthode de Studier et al. 15
NOTE: En variante, les cellules peuvent être cultivées pendant 3-4 h (DO de 0,8 à 1,0) dans l'expression non supplémenté et la protéine induite par l'addition de 1 mM IPTG. - Couvrir le bloc (s) de culture avec un joint respirante et d'exprimer clones Fab pour 6-8 heures à 30 ° C avec agitation à 200 rpm. plaques de tourner à 4000 g pendant 15 min pour sédimenter les cellules bactériennes, éliminer le surnageant, plaques de recouvrement avec un sceau de papier d'aluminium et congeler pastilles à -20 ° C jusqu'à ce que la lyse.
- Libérer Fab exprimés à partir de granulés collectés avec 100 ul de tampon de lyse (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% de Triton X-100 à pH 8,0 avec 1 mg / ml de lysozyme et 10 des inhibiteurs de la benzonase / culture et la protéase ml U) et agitation pendant 2 h à 4 ° C.
- Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C et de recueillir brut surnageant de lysat pour une utilisation dans la caractérisation initiale de spécificité par des plaques ELISA (voir section 5.3).
5.3) Caractérisation Clone par liaison directe de clones Fab ELISA
- Immobiliser antigènes comme décrit dans la section 3.1 à la place aliquotage 30 pi de 2 pg antigène / ml dans du PBS dans les puits d'une plaque de 384 puits. Dispositions de l'antigène à base de Quad-dans la plaque peuvent faciliter le transfert de réactif lors de l'utilisation 96 têtes de distribution basés sur un canal. Lavez et blocs plaques ELISA conformément à la section 3.1.
- Lysats clarifiés recueillies auprès Section 5.2 peut être appliqué directement à l'antigène immobilisé pour Evaluation de la liaison. Incuber 30 ul de lysat par puits pendant 15 min à température ambiante avec agitation par secousses à 200 tours par minute.
Remarque: Purified Fab protéine clone peut alternativement être utilisée par dilution à 10 pg / ml dans du tampon PBT et en appliquant 30 ul de chaque clone dans des puits bloqués contenant l'antigène ou négatif protéine de contrôle (TPS, BSA, etc.) et le développement de la même manière que décrit ci-dessous. En variante, Fab-phage peut également être utilisé en diluant 10 ul de surnageant de phage (décrite dans la Section 5.1) dans 20 ul de tampon PBT (1: 3) et la détection avec des anticorps anti-M13-HRP (décrit dans les étapes 4.4 à 4.5) - Enlever l'excès de lysat et laver puits soit manuellement, soit en utilisant une plaque automatisé lavé 8x avec 100 pi de tampon PT et enlever l'excès de tampon.
- Incuber 30 ul d'une dilution 1: 5000 d'anticorps secondaire anti-FLAG dans du tampon PBT pendant 30 min à température ambiante avec agitation par secousses à 200 tours par minute.
- Laver, développer et quantifier selon Sections 4.3 à 4.5.
REMARQUE: Les résultats représentatifsillustrant les clones de liaison à la fois spécifiques et non spécifiques sont présentés sur la figure 5.
5.4) Clone séquençage
- Préparer un mélange maître PCR comme indiqué dans le tableau 2.
- Ajouter 2 pi de la matrice de PCR approprié (ou surnageant de phage remis en suspension seule colonie bactérienne contenant un phagémide-) à 20 pi de mélange maître préparé par PCR avec les amorces appropriées dans les puits d'une plaque PCR.
REMARQUE: Les mélanges maîtres distincts sont nécessaires pour le séquençage des deux gènes de chaînes lourdes et légères. - Exécutez la réaction PCR en utilisant les paramètres listés dans le Tableau 2 - Paramètres de PCR.
- Vérifier le succès de la réaction PCR en mélangeant 5 ul de la réaction se est achevée avec colorant de charge sur un gel d'agarose à 1% complété avec de l'ADN de visualisation et d'imagerie tache sur un transilluminateur 300 nm.
- Ajouter 2 ul de produit de PCR de 10 ul d'eau stérile contenant 0,2; Ul de chaque exonucléase et phosphatase alcaline de crevette et incuber à 37 ° C pendant 20 min suivie d'une inactivation enzymatique à 80 ° C pendant 10 min pour éliminer les amorces en excès dans la préparation pour le séquençage.
6. Mise à l'échelle des sélections automatiques
6.1) sur la base de la pipette Liquid Handling
- Préparer un 1% (p / v) de bleu de bromophénol dans de l'eau et éliminer les particules insolubles en utilisant un filtre de 0,45 ml.
- Pour déterminer la gamme linéaire de l'absorbance sur le lecteur de plaque, préparer un 1: 1000 dilution de la solution de bleu de bromophénol 1% dans l'eau, et continuer avec deux dilutions successives (16 dilutions au total).
- Transférer 100 ul de chaque dilution à un fond plat plaque de 96 puits et lire l'absorbance à 590 nm. Terrain absorbance absolue par rapport facteur de dilution et choisissez une dilution au milieu à haut de gamme de la gamme linéaire pour les essais suivants.
- Ajouter le bleu de bromophénol à l'eau ou à la solution réellequi sera introduit à la pipette sur la base de la dilution choisie à l'étape précédente dans un volume suffisant pour le pipetage de trois plaques à 96 puits, ainsi que le volume mort dans le réservoir.
- Étalonner une pipette à canal unique de livrer le volume de test par pipetage eau sur une balance analytique (100 pi d'eau pèse 100 mg à la température ambiante.)
- Utilisation de la pipette calibrée, transférer le volume d'essai de la solution teints à au moins trois puits d'une plaque de 96 puits fond plat et lire leurs absorbances à 590 nm, en trois exemplaires.
- Peser trois vides à fond plat de 96 plaques ainsi sur une balance analytique et enregistrer leurs masses.
- volume d'essai de la pipette à partir du réservoir à chacune des trois plaques de 96 puits et de mesurer leurs absorbances à 590 nm, en triple.
- Peser chaque plaque et calculer la différence de masse.
- Tout d'abord, évaluer si les absorbances dans chaque puits sont uniformes dans la plage de tolérance (par exemple., +/- 5%) et si elles sont compatibles avec eabsorbances e obtenus par la main-pipetage avec le Pipetman calibré. Si des canaux particuliers sont constamment sur- ou sous-prestation (voir par exemple la figure 6), suivre les procédures de réparation et répéter la procédure d'évaluation jusqu'à ce que tous les canaux offrent volumes uniformes.
- Deuxièmement, une fois tous les canaux sont confirmées de livrer des volumes uniformes, vérifier l'exactitude de ce volume en calculant la différence de masse moyenne, par puits. Par exemple, un ensemble de manipulateur de liquide parfaitement calibrée pour 100 pi livrera 9,60 g d'eau par plaque, ou 0,10 g d'eau par puits. Si le volume réel délivrée est toujours supérieur ou inférieur au volume prévu, alors un facteur de correction peut être appliquée, à savoir 110 pi de programmation afin de délivrer en fait 100 ul.
NOTE: Pour les petits volumes, par exemple, 10 pi, utiliser dix fois plus de bleu de bromophénol dans la solution teinte, et pré-partie aliquote de 90 ul d'eau pour les plaques à 96 puits à la main, pour se assurer que l'absorbances sont mesurables et à l'automne dans le domaine linéaire.
6.2) à laver automatique de plaques
- Immobiliser cible positive et protéines de contrôle négatif dans des puits séparés de microplaques 96 puits (deux plaques pour chaque condition à tester) tels que décrits dans la section 3.1.
- Bloquer les sites de liaison non spécifiques par incubation avec une solution de blocage pendant une heure à température ambiante.
- Ajouter des parties aliquotes identiques de 100 ul d'une 10 13 cfu / ml, solution cible de liaison Fab-phage dans du PBT à tous les puits dans les plaques et incuber sous agitation douce à température ambiante pendant 2 h.
- Laver deux plaques en fonction de chaque état, une plaque d'infection et de titrage et une plaque pour ELISA.
- Évaluer l'efficacité du lavage par une infection directe dans des bactéries et titration (tels que décrits dans la section 3.3 (sans ajout M13K07) et 7.2.1) ou de développement avec anticorps anti-M13 HRP et substrat colorimétrique (comme décrit à la section 4).
- Titres de phages from clones spécifiques seront souvent donné dans la plage de 10 5 -10 7 phage / ml à partir d'une protéine immobilisée contre le clone qui se lie spécifiquement. Certains liaison résiduelle à la protéine de contrôle négatif (par exemple, BSA) est à prévoir et généralement 10 2 -10 5 phage / ml sont observées, cependant très faibles titres (ie., <10 1) peut signaler laver trop rigoureuses, ce qui peut compromettre une sélection.
- Pour phage liaison déterminée par ELISA, comparer les signaux de liaison absolus pour les protéines de contrôle positifs et négatifs afin de déterminer si le lavage robotique est équivalent aux résultats de lavage des mains établies (figure 7).
6.3) laveur de plaques Décontamination
- Pour démarrer, exécuter le protocole de décontamination à tester.
NOTE: Nous vous recommandons d'utiliser au moins le double du volume totale de la ligne, et le premier et faire tremper la tête de la rondelle pour l'hypochlorite de sodium à 5 min à 0,5%, fr fraîchement diluéeeau de javel commerciale om (typiquement hypochlorite de sodium 6%). - Premier et faire tremper la tête de la rondelle pendant 5 min dans (autoclave) de l'eau stérile et enfin, amorcer le système jusqu'à ce que les lignes sont pleins d'air.
- Premier les lignes avec de l'eau stérile ou un tampon de lavage.
- Laver une microplaque 96 puits stérile fois, retirez de la laveuse et sceller avec joint de plaque stérile. Ce est la plaque de commande pré-contamination.
- Aliquoter 100 ul de S / N amplifiés culture surnageant de phage à tous les puits d'une plaque à 96 puits.
- Laver la plaque contenant phage-fois, puis retirez de la laveuse et sceller avec un joint de plaque de plastique ou du papier. Il se agit de la plaque de contrôle de la contamination.
- Effectuer le protocole de décontamination à l'essai. Dans cet exemple, répétez les étapes 6.3.1 et 6.3.2.
- Laver microplaque stérile une fois, puis retirer de la rondelle et le joint. Ce est la plaque d'essai de décontamination.
- Plate 50 pi de phase log E. coli sur des plaques de titrage; ce est le pré-infectionplaque de contrôle de la tion.
- Desceller pré-contamination, la contamination et la décontamination des plaques à 96 puits et ajouter 100 ul de E. coli dans le stade de croissance en phase logarithmique à tous les puits, en utilisant de nouvelles astuces pour chaque puits.
- Sceller et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes à 200 tours par minute.
- Plate 50 pi de cellules infectées de trois puits aléatoires de chaque plaque de 96 puits à 10 cm plaques 2YT / glucides et incuber à 37 ° CO / N.
- Transférer 50 ul de cellules infectées à partir de tous les puits de chaque plaque sur des plaques à puits profonds contenant 1 ml de 2YT, plus 100 g / ml de carbénicilline par puits et croître O / N à 37 ° C.
- Répétez le protocole de décontamination et de laisser la rondelle lignes sécher.
NOTE: Non O / N croissance sur des plaques ou en milieu liquide doit être observée sur les plaques pré-commande de l'infection, de contrôle de pré-contamination ou essai de décontamination. Beaucoup de colonies et la croissance doivent être respectées sur la plaque de contrôle de la contamination; Sinon, pas de conclusions quant à l'efficacité de laprotocole de décontamination peut être effectuée. Idéalement, les plaques de décontamination produiront pas de colonies et ne O / N croissance dans l'un des puits dans les plaques d'O / N. La stringence du protocole de décontamination peut être augmentée avec des concentrations plus élevées d'agent de blanchiment, plus tremper temps et des cycles supplémentaires.
7. Entrée / titrages de sortie
7.1) Les titrages de phages d'entrée
- Diluer une aliquote de 5 ul de phage à 50 ul avec du PBS filtré stérile et mélanger.
- Préparer série 10 dilution dans du PBS stérile filtrée à 10 10 en utilisant une pipette multicanaux ou une pipette 96 canaux.
- Inoculer 5 ul de phage dilué dans 45 pi de E. T1 résistants aux phages cellules coli Identifiant phase de croissance (DO 0,6 à 0,8) et incuber recouvert d'un joint respirant pendant 30 min à 37 ° C.
- Planche 5 pi de cellules infectées sur une / plaque de gélose LB additionné de 100 pg / ml de carbénicilline et incuber O / N at 37 ° C.
- La concentration de phage peut être estimée à partir de l'échantillon le plus dilué dans lequel les colonies apparaissent selon les calculs détaillés à la section 2.8.
7.2) Sortie Phage Pitrations
- Après l'élution des phages liés en forme de plaque par l'addition de E. coli cellules, diluer une partie aliquote de 5 ul de cellules infectées par le phage à 50 ul avec des milieux 2YT autoclavées
- Préparer une dilution en série 10 fois dans un milieu 2YT autoclave à 10 6 à l'aide d'une pipette multi-canal ou canal 96 pipette.
- Planche 5 ul de cellules infectées sur une plaque de gélose complété avec 100 ug / ml de carbénicilline et incuber O / N à 37 ° C.
- La concentration de phage peut être estimée à partir de l'échantillon le plus dilué dans lequel les colonies apparaissent selon les calculs détaillés à la section 2.8.
NOTE: Dans les deux cas (ce est à dire, les titres d'entrée et de sortie phages, la comparaison avec le nombre de colonies à la fois sur la tétracycline (cel totalel Numéro) et à la kanamycine (phage auxiliaire titre) peuvent également être informatif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole décrit ci-après a été utilisé pour isoler des fragments d'anticorps à une variété de deux domaines antigéniques structurellement et fonctionnellement liées à partir de banques combinatoires de phages de Fab en parallèle. Les problèmes liés à la disponibilité de l'antigène peuvent être contournés, dans de nombreux cas, par l'identification in silico des domaines antigéniques exprimables qui sont appropriés pour la sélection 23 d'anticorps. En couplant l'expression d'antigènes à la sélection d'anticorps dans le même laboratoire (figure 1), il devient possible de construire un pipeline intégré, dans lequel des paramètres critiques de l'antigène à la sélection peuvent être plus facilement contrôlées. Dans la plupart des cas, la détermination minutieuse des limites de domaine permet l'expression et l'isolement de quantités suffisantes de l'antigène suffisamment pur de l'expression à haut débit dans 96 ou 24 plaques ainsi deepwell (Figure 2) pour une utilisation réussie dans les sélections d'anticorps. Pendant successivecycles du processus de sélection, des concentrations de phages élues et l'enrichissement de phage qui se lient spécifiquement à l'antigène peuvent être surveillés par titrage, soit de phage (Figure 3) ou avec des pools de phage dans un dosage ELISA (figure 4). Un rapport de liaison (> 2) indique généralement la présence de clones de liaison spécifiques. Inversement, un faible ratio (<2) peut aider à déterminer la cause d'une défaillance de sélection. Par exemple, un rapport <2 avec une grande OD non spécifique peut indiquer élimination insuffisante de clones non spécifiques (ou des liants et adhésifs) peut justifier l'optimisation du protocole de sélection. Néanmoins, une fois que l'enrichissement est détectée, des clones individuels de haute affinité peuvent ensuite être isolés pour le séquençage et la caractérisation. Clone liaison peut être caractérisée dans un dosage immunologique colorimétrique et permet la comparaison de la liaison du phage Fab ou Fab-antigène immobilisé par rapport à la protéine de contrôle négatif, ce qui donne une mesure de l'enrichissement (rapport de se lier à taTARGET contre la protéine de contrôle négatif ou d'affinité protéine étiquette) (figure 5).
Au cours de mise à l'échelle et de l'automatisation de cette méthode, l'évaluation des fonctions clés de l'unité de manipulation de liquides peut être utile pour assurer un fonctionnement correct et précis avec des solutions similaires à celles utilisées lors de sélections réels. L'utilisation de chromophores absorbant dans des solutions peut aider à détecter le moment où des canaux spécifiques dans les fluidique (d'aspiration ou la distribution) sont soit bouché ou ont perdu joint résultant dans la prestation de volume partiel comme illustré sur la figure 6. Unités de lavage automatiques peuvent aussi être une source de variabilité et peut nécessiter une attention. L'utilisation de clones de liaison connue permet la comparaison de la liaison entre la protéine de contrôle de la cible afin de se assurer que la liaison est maintenue pendant liaison de fond enlevé cible (figure 7) lorsque des paramètres de lavage telles que la vitesse de distribution, les volumes de lavage et le nombre de lavages sont optimisés. Suivantl'utilisation d'un laveur de plaques automatisé avec des solutions de phages, des protocoles de décontamination efficaces sont nécessaires pour garantir l'absence de contamination croisée des cycles successifs de sélections ou différentes procédures de sélection et un guide / d'interprétation de dépannage est fourni dans le tableau 3.
Figure 1. Vue d'ensemble -. La production d'antigène haut débit et une canalisation de sélection d'anticorps Cet aperçu montre une visualisation étape par étape d'un pipeline représentant de production d'antigène et la sélection d'anticorps. L'identification in silico des limites du domaine de l'antigène permet la synthèse de gènes, l'expression et la sélection lors de domaines pour des protéines qui peuvent être mal caractérisés. Domaines d'antigènes exprimés sont immobilisés et utilisés pour isoler pools de clones d'anticorps spécifiques de haute affinité à partir d'un combinatorial banque d'anticorps présentée sur la surface d'un phage filamenteux. Pools d'anticorps-phages élues et amplifiés à partir d'antigènes individuels peuvent ensuite être utilisés pour surveiller l'enrichissement tour à tour des clones de liaison spécifiques dans des essais basés sur ELISA comparant cible immobilisée par rapport protéines de contrôle négatif avant l'isolement de clones individuels de fixation pour la caractérisation. Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. SDS-PAGE visualisation des antigènes d'affinité marqués. Un SDS-PAGE représentant de 6x-His TPS-étiqueté domaines d'antigènes exprimés et purifiés (5-10 kDa domaine + 26 kDa TPS) à l'origine identifié par l'analyse in silico de l'antigène les limites du domaine. Les domaines protéiques exprimés et isolés par Affipurification de l'infini se caractérisent par SDS-PAGE avant sélections pour assurer l'identité basée sur la taille, les rendements et la pureté adéquates pour permettre une utilisation dans les sélections de phages-anticorps. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Visualisation des titres de sortie de phage. Les titres de sortie de phages sont déterminés par étalement des cellules infectées avec le phage sur une série de dilutions de 10 fois sur des milieux d'agar supplémenté avec divers antibiotiques (tétracycline, la carbénicilline et de la kanamycine) pour déterminer la dilution la plus faible dans laquelle colonies peut être observé et estimer le nombre de phage lié à un antigène cible et élue. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une grandeversion r de ce chiffre.
Figure 4. rapport de liaison de la cible à la protéine de contrôle négatif par ELISA commun. Les progrès de l'enrichissement peut être évaluée tours de sélection suivants par criblage éluants amplifiés individuelles contre les deux objectifs spécifiques et des protéines de contrôle négatif et / ou isolée marqueur d'affinité. Montré dans la parcelle sont les ratios d'enrichissement pour la liaison de 96 piscines de phages-anticorps individuels contre leurs 96 antigènes respectifs contre un solde négatif protéine de contrôle en parallèle. Chaque valeur de rapport est dérivé de deux mesures d'absorbance qui permettent de quantifier la liaison du pool de phage pour chaque cible ou une protéine témoin négatif en utilisant un anticorps HRP-condensé M13 spécifique pour la protéine d'enveloppe de phage. Un seuil de rapport de deux ou plus (souvent allant de 2 à 10 ou plus comme cela est représenté en rouge) est utilisée comme une indication de l'enrichissementet la présence probable de clones de liaison spécifique. Petites ratios peuvent signifier une défaillance ou questions spécifiques avec la sélection qui peut justifier la poursuite de l'optimisation du protocole. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Fab-phage clonale liaison directe ou Fab ELISA. La liaison des clones individuels (que ce soit dans le phage Fab ou Fab Format) peut être évaluée par un dosage ELISA à base de protéine immobilisée par rapport à plaques à 384 puits. La liaison est détectée en utilisant un anticorps secondaire HRP-condensé contre la protéine d'enveloppe de M13 sur Fab-phage ou un marqueur d'affinité sur le Fab. Valeurs d'absorbance premières pour la liaison de Fab-phage clonale à un antigène cible, la protéine de contrôle négatif et l'étiquette d'affinité antigène (TPS) sont représentés illustrant bi spécifiquenders (A01, A04, A06), et de liants collantes (A05).
Figure 6. Évaluation des volumes distribués par unité de traitement automatisé de liquide. De livraison cohérente et précise des volumes destinés par les systèmes de pipetage de 96 puits robotiques ou manuel peut être évaluée en utilisant des solutions colorées et un lecteur de plaque. Dans cet exemple, 10 ul d'une solution contenant du bleu de bromophénol est séquentiellement pipetté à tous les puits de deux plaques de 96 puits en utilisant une boîte de pointe unique. Chaque puits contient 90 ul / puits dH 2 O, analogue à l'addition d'un phage auxiliaire pour E. infecté coli. Les absorbances les de chaque plaque à 590 nm sont lus en triple exemplaire, et les volumes sont interpolées à partir d'une courbe standard préparée en utilisant un Pipetman unique canal calibré. Volumes livrés à une seule rangée sur la première et la deuxième plaque sont présentés. Notez que sur les sapinst plaque, ainsi E04 reçoit pas de solution teints, et sur la seconde plaque, il reçoit un volume double. Cela indique que la pointe tactile ne est pas suffisante pour la livraison conforme, et nécessite une optimisation plus poussée. Intervalles de confiance à 95% pour les mesures d'absorbance trois exemplaires sont présentés.
Figure 7. Évaluation des automatique pour le lavage de la plaque. La suppression effective des phages non liés peut être évaluée en utilisant un test ELISA pour mesurer la liaison au positif immobilisé (anticorps anti-FLAG) et des protéines négatives (BSA) contrôle tout en faisant varier les conditions de lavage Fab-phage. Dans cet exemple, analogue à l'entrée phage bibliothèque naïve (10 13 cfu / ml dans du PBT) est éliminé en utilisant huit ou seize lavages, à la main ou à l'aide du robot. Liaison à BSA phage résiduelle est le même dans toutes les conditions, comme ce est la liaison spécifique de l'anticorps anti-FLAG immobilisé, indicAting qu'à ce faible débit, les deux méthodes sont équivalentes et suffisamment strictes. Intervalles de confiance à 95% de puits en double sont affichés.
| SOLUTIONS | |||
| 2YT médias - Ajouter de l'eau à 1 L, ajuster le pH à 7,0 et autoclave. | extrait de levure | 10 g | |
| tryptone | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| Médias NZY (1 L) | NZ Amine | 10 g | |
| extrait de levure | 5 g | ||
| ZYM 50X-5052 | 20 ml | ||
| 20 sel stocks | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 sucre stock (1 L) | glucose | 25 g | |
| lactose | 100 g | ||
| glycérol | 250 ml | ||
| 20x sel stock (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH 4 Cl | M 1 | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbénicilline (Carb): | 100 mg / ml dans l'eau. Filtre stériliser. | ||
| La kanamycine (Kan): | 25 mg / ml dans l'eau. Filtre stériliser. | ||
| Tétracycline (Tet): | 10 mg / ml dans l'eau. Stériliser par filtration. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2,5 M | ||
| 1 x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCl | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1,5 mM | ||
| 1X KCM | KCl | 500 mM | |
| CaCl 2 | 150 mM | ||
| MgCl 2 | 250 mM | ||
| SOC médias | extrait de levure | 5 g / L | |
| tryptone | 20 g / l | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCl | 2,5 mM | ||
| MgSO 4 | 20 mM | ||
| Glucose | 20 mM | ||
| Le tampon de blocage | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| Tampon PBT | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| Tampon PT | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| L'acide phosphorique | H 3 P0 4 | M 1 | |
Tableau 1. Médias et Solutions.
| PCR MASTER MIX-SET-UP </ Strong> | |||
| Composant | ul par réaction | ||
| Eau | 19,45 | ||
| Tampon 10x Taq | 2,5 | ||
| dNTP (10 mM) | 0,675 | ||
| DMSO | 0,75 | ||
| Enzyme Taq | 0,125 | ||
| Forward Primer (100 uM de stock) | 0,25 | ||
| Amorce inverse (100 uM de stock) | 0,25 | ||
| Chaîne lourde des amorces de séquençage | |||
| M13 Amorce | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 Amorce | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Chaîne légère amorces de séquençage | |||
| M13 Amorce | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 Amorce | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| REGLAGES PCR | |||
| Etape 1. | 94 ° C pendant 03 heures 00 min | ||
| Étape 2. | 94 ° C pendant 00 heures 30 min | ||
| Étape 3. | 55 ° C pendant 00 heures 30 min | ||
| Etape 4. | 72 ° C pendant 01 heures 00 min | ||
| Revenez à l'étape 2 et répétez 24x | passez à l'étape 2 | ||
| Etape 5. | 72 ° C pendant 07 heures 00 min | ||
| Etape 6. | |||
Tableau 2. PCR Master Mix et de paramètres.
| Interprétation des résultats de décontamination | |||
| Plaque | Attendu titre de carbénicilline | Si non? | |
| Le contrôle pré-infection | 0 | Les cellules ont été pré-infectées; rien ne peut être conclu de l'expérience. | |
| Contrôle de la contamination | pelouse | Contamination insuffisante pour pouvoir évaluer l'efficacité de la décontamination subséquente; envisager submergeant collecteur dans une solution de phage plutôt que l'aspiration il. | |
| test de décontamination | 0 | Décontamination pas terminé; augmenter le temps d'immersion, l'eau de Javel concentrationtion ou essayer SDS et lavages EtOH place. | |
Tableau 3. Evaluation de la rondelle décontamination. Pour déterminer l'efficacité de la décontamination, il est nécessaire de démontrer que la rondelle a été contaminé par un phage, et que le protocole de décontamination qui a réussi à éliminer la contamination. Utilisation de phage qui confère la résistance à la carbénicilline, les résultats attendus d'un tel test sont énumérés, ainsi que des suggestions devrait le résultat réel différer des résultats attendus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lors de la conduite dans les sélections d'anticorps in vitro, les deux principaux déterminants de la réussite de sélection sont: 1) l'isolement des cibles antigéniques bien pliés de sélection sur et 2) la disponibilité d'une bibliothèque d'anticorps de la diversité fonctionnelle élevée. Dans de nombreux cas, la disponibilité de quantités suffisantes de bien plié, protéine de pleine longueur peut être un facteur limitant. Une approche pour surmonter cette limitation est d'utiliser des domaines identifiés à partir de l'analyse bioinformatique 22 et synthétisés pour l'insertion dans un vecteur d'expression bactérienne avec une étiquette d'affinité appropriée.
Il existe une variété de balises qui sont utilisés dans des applications biotechnologiques pour accroître la solubilité, faciliter la purification et de stabiliser domaines instables. 11 La capacité à synthétiser pratiquement ne importe quelle séquence de l'insert souhaité permet une plateforme hautement polyvalente de production d'antigène. Bien que le format de la TPS-étiqueté est commun, de bons résultats ont déjà étéobtenu en utilisant hexahistidine, Fc, Halo, protéine de liaison de maltose et balises biotinylation spécifiques au site et on croit que myriade d'autres marqueurs d'affinité peuvent être optimisés pour une utilisation dans une plate-forme similaire. Cependant, des marqueurs d'affinité peuvent avoir des conséquences négatives inattendues bénéfiques et dans les applications en aval 11 et doivent être soigneusement étudiée avant d'établir un pipeline basée sur un format particulier.
Souvent les nouveaux utilisateurs seront poser la question de savoir comment évaluer la qualité d'une banque d'anticorps et se il n'y a pas de réponse simple, on devrait essayer d'évaluer plusieurs éléments clés (naturelle ou synthétique) y compris la diversité globale, les niveaux d'affichage relatifs, la nature de et l'étendue de la répartition aléatoire (ce est à dire, la conception bibliothèque bibliothèque fonction de la teneur déterminée par séquençage) et les propriétés physico-chimiques de l'anticorps par rapport à l'application prévue. Bien au-delà du champ d'application de ce protocole, un Treatme plus détailléent de ces caractéristiques et comment ils peuvent influer sur la sélection d'anticorps peuvent être trouvés ici 2,23. Connaissance de la diversité bibliothèque est, en particulier, important de se assurer une couverture adéquate de la diversité lors de sélections. Typiquement, une concentration de phage qui fournit 100-1,000 copies de chaque clone de phage dans la bibliothèque est souhaitable et doit se assurer que tous les vrais positifs liants présents dans la bibliothèque peuvent être récupérés. Cependant, la liaison non-spécifique de phage à microplaque surfaces augmente considérablement au-dessus 10 13 phage / ml, et pour très diverses bibliothèques, plus d'un seul puits par antigène peuvent être nécessaires pour assurer une couverture suffisante. D'autre part, si la bibliothèque d'entrée est trop dilué, la concentration absolue des vrais positifs liants sera donc bien en dessous du KD (typiquement nM) qu'ils ne seront pas récupérés. Compte tenu de ces contraintes, les bibliothèques de phages devraient généralement être remises en suspension à 12 au 13 octobre phage / ml pour le premier tour des sélections.0; A cette concentration, une partie aliquote de 100 L représente un phage couverture 1,000-100 de pliage d'une bibliothèque 10 9 -10 10 diversité et peut produire systématiquement des clones de liaison à divers antigènes. À des concentrations plus faibles, ou l'augmentation des diversités, il peut être nécessaire d'augmenter le nombre de puits de l'antigène contre sélectionnés au premier tour (voir section 2.9). Suite à arrondir une, cependant, la plupart de la diversité non contraignant de la bibliothèque a été enlevé; couverture excédentaire de la diversité de sortie ronde 1 est le plus souvent facilement réalisable en utilisant un seul puits. En cas de sélections parallèles en plaques à 96 puits, ce qui peut réduire le nombre de plaques de sélection d'antigènes nécessaires à un seul, après la première ronde.
Pendant sélections réels, phage titrage peut offrir des mesures objectives pour caractériser et surveiller les progrès, tout en aidant à identifier les domaines de préoccupation particulier dans les premiers tours de sélection où l'enrichissement ne est pas suffisante pourdétecter. Cela peut être particulièrement utile lors de mise à l'échelle des sélections pour déterminer la performance de protocole. En général, les titres d'entrée de phage (par exemple, une bibliothèque naïve ou post-amplification de phage élue) doivent rester relativement constante (10 12 -10 13 phages / ml) entre les tours, avec / faibles titres de phages de croissance cellulaire médiocre indiquant une contamination potentielle et / ou mauvaise sortie de la ronde précédente. Bien qu'on se attende titres sortie de phages à augmenter au cours enrichissement en cycles de sélection plus tard, une gamme de 10 3 -10 5 UFC / ml dans les deux premiers tours est prévu. Écart par rapport à cette plage peut indiquer des problèmes potentiels avec la sélection tels que la contamination ou lavage de rigueur excessive. En tours de sélection ultérieures (ce est à dire, rondes 3 et 4), l'enrichissement de clones qui se lient spécifiquement l'antigène cible peut être évaluée par ELISA communs que mesure contraignante de la piscine de phage à la fois contre l'antigène cible et négativeprotéine de contrôle (voir la section 4).
Après trois à quatre cycles de sélection (ou une fois que l'enrichissement en protéine cible a atteint un antigène cible: témoin négatif rapport de signal de protéine de 2: 1 ou plus par rapport à la protéine de fond), les cellules bactériennes infectées sont plaquées à isoler les colonies de phagémides individuels pour le séquençage , caractérisation initiale et le clonage si nécessaire. A cette époque, il est fortement conseillé de convertir Fab-phage pour libérer Fab avant caractérisation supplémentaire. Bien que Fab-phage peut être utilisé pour la caractérisation initiale en diluant 10 pi de surnageant de phage (décrit au paragraphe 5.1) dans un tampon de PBT de 20 pi et la détection des anticorps anti-M13-HRP (décrit dans les étapes 4.4 à 4.5), dans notre expérience, propriétés de liaison peuvent changer sensiblement dans ne importe où de 5 à 20% des clones sur la libération de la particule de phage et la conversion précoce peut éviter des problèmes avec des faux positifs. La méthode spécifique utilisée pour la conversion dépend de la unique architecture du phagemide et ne seront donc pas traitées explicitement ici. Cependant, dans les vecteurs les plus couramment utilisés, cela peut généralement être réalisée par 1) la transformation de phagémide purifié (ou la piscine phagemide) pour un non-suppresseur compétente E. souche de E. coli comme HB2151 ou 55 244 si un arrêt ambre (TAG) codon intervient le Fab et pIII protéines, 2) l'insertion d'un codon d'arrêt ambre entre les protéines Fab et pIII pour permettre l'expression de fragments d'anticorps solubles dans une souche non suppressive ou 3) par clonage de gènes d'immunoglobuline (de phagémide piscine individuelle ou phagemide) dans un vecteur d'expression approprié. Afin de rationaliser davantage la sélection et la caractérisation, les méthodes de clonage regroupées peuvent offrir des moyens efficaces pour convertir des clones de liaison en masse pour les constructions d'expression, à la fois éliminer le potentiel de liaison de faux positifs de particules Fab-phage et où lysats d'expression sont utilisés pour la caractérisation précoce, même le coût et l'effort de la purificationpeut être initialement évitée.
Pour les clones isolés directement à partir de la bibliothèque F (décrit dans 24), des domaines variables d'anticorps peuvent être séquences en utilisant 1 à 2 pi de surnageant de phage en tant que matrice pour amplifier par PCR les régions déterminant la complémentarité (CDR) (voir le tableau 2 pour des matériaux amorces dirigées bibliothèque F ). L'utilisation de ces amorces, les régions variables des chaînes lourdes et légères se donner des produits de ~ 700 et ~ 500 pb, couvrant respectivement les trois CDR. Amorces comprennent des sites de recuit pour des amorces M13 tels que les produits peuvent être séquencés après le nettoyage (tel que décrit à la section 5.4.5) en utilisant des amorces standard disponibles dans la plupart des installations de base de séquençage. En variante, pour les piscines Fab-phage qui ont été clonés dans un vecteur d'expression et transformés directement dans E. coli pour l'expression, des colonies uniques peut être isolé et remis en suspension dans 15 pi de 2YT et 2.1 ul de la suspension de cellules utilisées directement en tant que matrice pour seul colony PCR en utilisant des amorces appropriées.
Automatisation des sélections auront besoin optimisation et la validation de plusieurs fonctions robotiques clés. En général, la manipulation de liquide à base pipette doit être précise et cohérente dans tous les canaux 96, plaque lavage doit supprimer les phages non liés efficacement sans décapage antigène adsorbé ou lié Fab-phage de la plaque de sélection. Décontamination efficace de la rondelle en forme de plaque est également nécessaire entre les tours pour permettre d'enrichissement et de contre-sélection efficace, et entre les sélections suivantes pour empêcher la contamination croisée. Pour aider à optimiser la procédure de sélection à haut débit, des approches simples pour l'évaluation de ces fonctions ont déjà été utilisés et sont décrits ci-dessous et détaillées dans le protocole.
Pour évaluer la cohérence des volumes livrés par tous les canaux d'un liquide tête de distribution / aspiration, une solution colorée est pipette à une plaque de 96 puits à fond plat et de la absorbanCE dans chaque puits mesurée sur un lecteur de plaques. Un chromophore comme le bleu de bromophénol est utile pour les solutions de teinture similaires à celles utilisées pour les vrais sélections pour évaluer les effets de différentes tension et de cohésion propriétés de surface sur les volumes livrés. Après avoir confirmé que tous les canaux sont la distribution de volumes constants, la précision du volume totale délivrée peut être déterminée en mesurant la masse du liquide transféré à chaque plaque.
Automatisation de la plaque lavage pour éliminer clones non liés nécessite principalement l'optimisation de la vitesse à laquelle le tampon de lavage doit être distribué et le nombre de lavages pour être employé. Une méthode raisonnable d'évaluer ce paramètre emploie contrôles positifs (Fab-phage spécifique de clones de liaison) pour évaluer les effets de la variation du taux de distribution et / ou le nombre de lavages afin de déterminer si 1) adsorbé antigène ou phage lié est étant éliminé par lavage trop rigoureuses ou 2) la liaison non spécifique à des protéines non apparentées est excessive due pour laver conditions qui ne sont pas suffisamment strictes. Résiduelle phage / liée peut être détectée et quantifiée soit par infection dans des bactéries et de placage pour le nombre de colonies simples, ou par ELISA en utilisant des anticorps secondaires spécifiques pour des marqueurs d'affinité d'anticorps ou des protéines d'enveloppe de phage. Des contrôles négatifs sont utilisés pour évaluer les niveaux résiduels de Fab-phage non contraignant à des protéines cibles ou de liaison Fab-phage spécifiques des protéines non apparentées / fond, qui peut être élevée si le lavage ne est pas suffisamment rigoureuse. Dans ce cas, nous avons utilisé immobilisés BSA comme témoin pour la liaison non-spécifique et un anticorps anti-FLAG qui reconnaît une étiquette d'épitope FLAG sur le Fab-phage comme un contrôle positif. Nous avons comparé huit et seize cycles de lavage à l'aide du robot par rapport lavage à la main, à un taux d'écoulement du milieu, de montrer que ces techniques étaient équivalentes. Alternativement, mesure entrée et de sortie des titres de phages (voir la section 7) lors de sélections en cours peut également aider à effectuer des réglages fins dans les paramètres de lavage. Enfin, la décontamination des laveurs de plaques utilisées pour la sélection doit être efficace afin d'éliminer report de phage à partir de sélections antérieures. Dans notre expérience, fraîchement diluée d'hypochlorite de sodium à 0,5% est rapide, efficace et pas cher. Les détergents tels que le SDS sont également efficaces, mais exigent beaucoup plus vaste lavage pour éliminer du système. Vérifier la compatibilité de réactif pour le système avant toute tests. Pour évaluer la décontamination, nous testons la présence du phage résiduel dans les solutions traitées par le système fluidique et interpréter les résultats selon le tableau 3.
En résumé, ce protocole fournit une méthode évolutive pour isoler Fabs de bibliothèques combinatoires par parallèlement dans les sélections in vitro contre domaines protéiques et propose des techniques pour la validation d'un système de sélection de phages automatisé. barrières de coût et d'infrastructure que de vastes installations pour les animaux peuvent poser sont atténués puisque cette méthode ne rement sur la vaccination des animaux. En outre, par l'intégration de la génération antigène avec la sélection d'anticorps phages, les facteurs de qualité qui influent sur la réussite de sélection sont plus facilement contrôlés et ajustés. Lorsque le laps de temps à partir de l'expression d'antigènes à la sélection et la caractérisation initiale est de l'ordre de 6 à 8 semaines, un système plus sensible de la production peut être réalisée. Les anticorps isolés à partir de sélections in vitro sont également facilement modifiés à la fois (en raison de liaison génotype-phénotype) et renouvelable, nécessitant seulement l'ADN stocké de la construction d'expression à re-générer de façon répétée et de façon reproductible anticorps. Enfin, en montrant que ce protocole peut être effectuée en utilisant soit une approche quasi-manuel ou entièrement automatisé qui utilise un système de sélection robotique conçu sur mesure, le débit peut être évolutive et accessible aux petits laboratoires académiques et industriels de même.
En utilisant les méthodes à haut débit décrites ci-dessus et de la Bibliothèque F bibliothèque d'anticorps synthétique 24 in vitro - et en protéines in situ avons exprimé. Bien que les taux de réussite pour toute sélection donnée dépendront à la fois sur la qualité (pureté, foldedness, mono-dispersité etc.) des cibles d'antigènes ainsi que la qualité et la diversité de la bibliothèque d'anticorps, il a été observé que partout 25-80 % d'antigènes donnera liants pour une sélection à haut débit. Fait important, il convient de noter que les clones ayant la capacité de moduler la fonction cible peuvent aussi souvent être sélectionnés. Cette banque est construite en utilisant un cadre entièrement humain, ce qui rend ces anticorps prêtent à une application thérapeutique potentielle 25, mettant ainsi en évidence l'importance de ce pipeline comme une autre approche pour la génération de réactifs d'affinité avec la base largevaleur.
En résumé, la robustesse et la polyvalence de l'approche présentée dans ce protocole continueront à aider à l'optimisation, l'industrialisation et l'utilisation généralisée ultime de cette technologie comme un moyen viable d'atteindre l'objectif à long terme de générer des réactifs d'affinité à pratiquement tous les membres de protéome humain.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Fonds commun NIH - Protein Programme des réactifs de capture pour le financement du développement de la sélection d'anticorps et la caractérisation pipeline anticorps recombinants Réseau et la Fondation canadienne pour l'innovation pour l'achat de financement de la plate-forme de sélection robotique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
