Summary
En fremgangsmåde er beskrevet med visuel akkompagnement til udførelse skalerbare, højkapacitetsmetoder markeringer fra fagpræsenterede kombinatoriske syntetiske antistofbiblioteker mod hundreder af antigener på samme tid. Ved anvendelse af denne parallel tilgang har vi isoleret antistoffragmenter, der udviser høj affinitet og specificitet for forskellige antigener, der er funktionelle i standard immunoassays.
Abstract
Efterspørgslen efter antistoffer, der opfylder behovene hos både grundforskning og klinisk forskning applikationer er høj og vil dramatisk stige i fremtiden. Det er dog tydeligt, at de traditionelle monoklonale teknologier er ikke alene op til denne opgave. Dette har ført til udviklingen af alternative metoder til at tilfredsstille efterspørgslen efter høj kvalitet og vedvarende affinitetsreagenser til alle tilgængelige elementer i proteomet. Til den ende har høj kapacitet for udførelse markeringer fra fagpræsenterede syntetiske antistofbiblioteker blevet udtænkt til applikationer, der involverer forskellige antigener og optimeret til hurtig gennemløb og succes. Heri er en protokol, der er beskrevet i detaljer, illustrerer med video demonstration den parallelle udvalg af Fab-fagkloner fra høje mangfoldighed biblioteker mod hundredvis af mål, ved hjælp af enten en manuel 96 kanals flydende handleren eller automatisk robotteknologi system. Ved hjælp af denne protokol, kan en enkelt bruger generere hundredvis af antigener,vælge antistoffer mod dem parallelt og validere antistofbinding inden for 6-8 uger. Fremhævet er: i) en levedygtig antigen format, ii) foreløbige udvælgelse antigen karakterisering, iii) kritiske faser, der påvirker valget af specifikke og høj affinitet kloner, og iv) metoder til udvælgelse overvågning effektivitet og tidlig fase antistof klon karakterisering. Med denne tilgang, har vi fået syntetiske antistoffragmenter (FAB) til mange mål-klasser, herunder single-pass membranreceptorer, udskilte protein hormoner og multi-domæne intracellulære proteiner. Disse fragmenter omdannes let til fuld-længde antistoffer, og er blevet valideret til at udvise høj affinitet og specificitet. Endvidere har de vist sig at være funktionelle i en række standard immunoassays, herunder Western blotting, ELISA, cellulær immunofluorescens, immunopræcipitation og relaterede assays. Denne metode vil fremskynde antistof opdagelse og i sidste ende bringe os tættere på at realisere målet of generere vedvarende, høje antistoffer kvalitet til proteomet.
Introduction
Med udbruddet af den post-genom alder, er af afgørende betydning for adgangen til bindingsreagenser høj kvalitet til at karakterisere og modulere proteiner til at åbne ny forskning og terapeutiske muligheder. Antistoffer fortsat være afgørende for både akademiske og industrielle forskere som grundforskning og diagnoseværktøjer og potentielle lægemidler. Ikke overraskende har der været en imponerende vækst i kontrakten antistof udvikling virksomheder, hvoraf de fleste er afhængige af konventionelle hybridome teknologi til at generere tilpassede antistoffer. Ikke desto mindre er in vitro-selektion ved hjælp fagpræsenterede antistofbiblioteker blive en stærk alternativ teknologi, der kan tilbyde unikke fordele og succes, hvor konventionelle teknologier kan klare begrænsninger 1, 2.
I lyset af den store efterspørgsel efter høj kvalitet antistoffer som forskning værktøjer, to primære udfordringer for generering af vedvarende antistoffer er 1) valg gennemløb og 2) antigen availability. En række grupper har nu beskrevet in vitro-selektion rørledninger til formål at øge throughput og hastigheden af antistof identifikation. Disse beskrivelser detalje en række levedygtige tilgange, der omfatter udvælgelse af enten fuld længde henvender 3,4 eller strukturelt relaterede domæner 5,6,7, enten ved hjælp perle-baserede 6,8 eller plade-baserede 3,4 antigen immobiliseringsteknikker ordninger. Derudover har den stigende indførelse af gensyntese teknologier 9 systematiseres antigen generation, især af isolerede domæner, rimelighed omkostningseffektive og kan potentielt afhjælpe vanskelighederne med at få tilstrækkelige mængder af renset, fuld længde antigen. Ved at bruge de to teknologier i tandem blev en selvstændig og skalerbar antigen generation og Antibody Selection pipeline udtænkt som ville gøre det muligt parallelle isolation af antistoffer til store sæt af udtrykt antigen domæner og lette udviklingen af reagenser til characterizing hele grupper af strukturelt eller funktionelt beslægtede proteiner.
Mod dette mål er et integreret rørledning som par i silico identifikation af ekspressér antigen domæner, gensynteseteknikker, high-throughput bakteriel ekspression af antigener og skalerbar fagpræsenterede antistof valg er blevet udviklet. Denne rørledning kræver kun grundlæggende infrastruktur til rådighed for de fleste life science laboratorier (herunder antistofbiblioteker som i stigende grad tilgængelige via licens eller materiale transfer aftale), men er også egnet til automatisering til brug i industriel skala. Ved anvendelse af denne protokol, er det muligt at generere hundredvis af affinitetsmærkede antigen domæner, og rutinemæssigt isolere meget specifikke antistoffragmenter til mange af disse antigener.
Phage display teknologi har vist påvist kompatibilitet med en lang række rekombinante affinitetsreagens formater, herunder Fab, scFv og autonome Fv domæner, og envoksende vifte af små "alternative rammer« (designet ankyrin gentagne proteiner (DARPINS), fibronektin (FN), lipocalin domæner og mere 10). Diskussion er begrænset i dette eksempel til isolering af Fab antistoffragmenter, selv om det antages disse fremgangsmåder kan tilpasses til andre typer af biblioteker. Ved hjælp af denne teknologi, Fabs med lav nanomolær affinitet til små, mærkede proteindomæner herunder transkriptionsfaktor domæner, SH2-domæner, RNA-bindende proteiner og andre er med held blevet udvalgt, hvoraf mange binder protein i fuld længde og er funktionelle i immunoassays såsom immunfluorescens immunpræcipitation og immunhistokemi. Vigtigt er det, rekombinante bindende kloner er fuldt vedvarende og kan re-genereret fra ekspressionskonstrukter via bakteriel produktion tilbyder øget ensartethed, reproducerbarhed og omkostningseffektivitet, hvilket begrunder bekostning af streng klon validering.
I denne protocol og ledsagende video, er grundlæggende metoder til antistof markering fra fagpræsenterede biblioteker ved hjælp af immobiliserede antigen domæner demonstreret. Denne særlige fremgangsmåde anvender GST-mærket proteindomæner immobiliseret ved passiv adsorption i mikrobrøndsplader, selv om andre tags 11,12,13 og udvælgelse formater 13,14,2 er også blevet anvendt med succes. Kritiske overvejelser for opsætning og afvikling af valg med parallel overvågning af udvælgelsesparametrene til formål at identificere og isolere specifikt beriget klonale antistoffer til validering er nærmere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antigen Generation
BEMÆRK: Antigen domæner kan syntetiseres og klones ved en række kommercielle leverandører i en passende IPTG-inducerbare ekspressionskonstruktionen.
- Omdan ekspressionskonstruktioner i kemisk kompetente, T1-fag resistente, BL21 E. coli-celler ved at blande 10 ng af DNA i 20 ul 1X KCM på is i en 96-brønds PCR-plade, efterfulgt af tilsætning af 20 L af kemisk kompetente celler.
- Inkubér celle / DNA-blandingen på is i 20 min, ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter på is igen i 2 minutter før redning med 100 pi forvarmet super optimal bouillon med glucose (SOC) medier, der dækker med en åndbar plade tætning og rystning ved 37 ° C i 1 time ved 200 rpm i en 2,5 cm orbitalryster.
- Plade 5 pi af transformerede celler på Luria-Bertani (LB) / agarplader suppleret med carbenicillin (100 g / ml) og vokse O / N at opnå enkeltkolonier anvendes tilgenerering af glycerol lagre.
- Podes 1 ml 2YT / carb medier med 5 pi glycerol lager og vokse i 12 timer ved 37 ° C i en 96-brønds dybe brønd blok med rystning ved 200 rpm i en 2,5 cm orbitalryster.
- Podes NZY media15 (suppleret med 0,05% glucose, 2% lactose og 100 g / ml carbenicillin) med en 1:40 fortynding af denne kultur, og derefter omrystes i 6-8 timer ved 30 ° C og 200 rpm i en 2,5 cm orbital shaker.
- Pellet bakterier og oprense antigene proteiner i high-throughput i en 96-brønds filterplade indeholdende 100 pi Ni-NTA resin som pr tidligere offentliggjorte protocols16,17.
- Bestem koncentrationen af oprensede proteiner ved Bradford dye-binding assay18 og karakterisere for størrelse og renhed ved separation og visualisering af 10-50 ug med Coomassie plet på en SDS-PAGE-gel (se figur 2).
BEMÆRK: I denne fase proteiner kan yderligere karakteriseres ved fremgangsmåder, der vurderer proteinaggregering 19 20 afhængigt af arten af antigenet og kravene i udvælgelsen pipeline.
2. Fremstilling og Titrering af fag-bibliotek
- Vælg en enkelt koloni af T1-fag-resistente E. coli-celler i 1 ml af 2YT medier suppleret med 50 ug / ml tetracyclin.
- Når cellevækst visuelt etableret, fortynde kulturen i et større volumen 2YT suppleret med 50 ug / ml tetracyclin at sikre en tilstrækkelig mængde celler til infektion (generelt 45 pi per bibliotek fortynding, se nedenfor.).
- Forbered biblioteket til brug ved udfældning af fag fra lager buffer med 1 / 5th volumen autoklaveret 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) inkubering på is i 30 minutter og pelletering præcipiteret phag ved centrifugering ved 12.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender udfældet fag i et passende volumen af 1x PBS pH 7,4, 0,2% BSA og 0,05% Tween (PBT), tilpasning to en passende phag koncentration for valg (om nødvendigt) for at sikre passende bibliotek dækning. Se trin 2.9 og diskussion.
- Fortynd en 5 pi fag portion i 45 pi 1x PBS pH 7,4 i en steril multi-brønds plade, blandes, og skabe en serie på 10 gange fortyndinger i den samme buffer.
- Tilsæt 5 pi af hver fag fortynding til 45 pi T1 fag-resistente E. coli-celler i logaritmisk vækstfase (OD600 = 0,4-0,8) i en anden plade med flere brønde, dække med en åndbar tætning og inkuberes ved 37 ° C med rystning ved 200 rpm i 30 minutter i en 2,5 cm orbitalryster.
- Plade 5 pi af inficerede celler fra hver af brøndene på en forvarmet agarplade suppleret med 100 g / ml carbenicillin og vokse O / N ved 37 ° C, indtil kolonier er synlige.
- Beregn den samlede fag / ml som følger:
Fag / ml = antal kolonier på en carbenicillin plade i den mest fortyndede prøve x 200 x 10 i (hvor i = den maksimale numBER fortyndinger, hvor kolonier er synlige). - For at bestemme antallet af coatede antigen brønde til at sikre dækning af bibliotekets mangfoldighed, beregner som følger:
Antal coatede antigen brønde kræves =
Ønsket fold dækning * bibliotek mangfoldighed
# Af fag pr 100 pi
3. Antibody Selection fra fagpræsenterede biblioteker
3.1) Antigen Immobilisering
- For at undgå fryse-tø cykler, der kan påvirke antigen kvalitet og til at lette fortyndinger udarbejde en bestand antigenprotein plade normaliseret til 100x arbejdsdage koncentrationer (f.eks, 500 g / ml) og prøve, ikke-bindende 96-brønds plader.
- Forbered antigen-overtrukne plader fra lager proteinopløsninger en dag før hver runde af markeringer ved at fortynde fra Stamplader med PBS.
- Coat 96-brønds høje protein-bindende polystyrenplader med 100 pi GST-mærket antigen-protein eller negativ kontrol protein (GST, BSA, neutravidin, etc.) ved 5 ug / ml i PBS. Ryst ved 250 rpm 4 ° CO / N på en mikropladeryster.
- Fjern proteinopløsning fra det overtrukne mikroplader blokere antigen-coatede og negativ selektion plader med 200 pi blokeringspuffer (0,2% BSA i 1X PBS, pH 7,4) og rystes ved 250 rpm ved stuetemperatur i 1-2 timer.
- Efter blokering vaske de blokerede protein-belagte plader fire gange med 200 pi 1x PBS pH 7,4 med 0,05% Tween (PT) buffer enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret mikropladevasker.
3.2) Bibliotek Pre-clearance og Antigen-fag Inkubation
- Udtømme bibliotek af ikke (eller tag-) specifikke bindende fagpræsenterede antistof fragment kloner via overførsel af 100 pi (10 12 fag) af tilberedt fagbibliotek i PBT buffer til en række brønde overtrukket med negativ kontrol-protein eller frit affinitetsmærke protein (fx GST) svarende til antallet af mål og inkuberes fagi brønde i 1-2 timer ved stuetemperatur med rystning ved 250 rpm.
BEMÆRK: Som et alternativ eller yderligere hjælp af negativ selektion, inkubation kan også udføres i nærværelse af overskud (5-25 uM) opløseligt protein affinitetsmærke (fx GST) for yderligere at fjerne tag-bindende kloner og forbedre genvinding af specifikke mål bindende kloner. - Transfer fag supernatant fra negativ selektion til antigen-coatede plader og inkuberes i 1-2 timer ved stuetemperatur med rystning ved 250 rpm for indfangning af specifikke bindende kloner.
- Fjernelse af ubundet fag og vask brøndene af mikropladen 8-15 gange med PT buffer enten manuelt eller ved hjælp af en mikropladevasker. Fjern overskydende vaskebuffer lige før eluering.
3.3) Eluering, infektion og Phage Amplification
- Tidligt på dagen for valg, vælge en enkelt koloni af T1-fag-resistente E. coli-celler i 1 ml af 2YT medier suppleret med 50 ug / ml tetracyclin og vokse ved 37 ° C with rystning ved 200 rpm i en 2,5 cm orbitalryster eller tilsvarende.
- Når cellevækst er etableret, og kan ses med det blotte øje, øge mængden af medier med 2YT suppleret med 50 ug / ml tetracyklin for at sikre en tilstrækkelig mængde af celler til infektion (generelt 100 pi pr udvælgelse godt).
- Grow cellerne indtil en OD600 på 0,4-0,8 er nået (ca. 5-7 timer), og derefter at eluere bundne fag tilsættes 100 pi celler til den vaskede antigen plade og rystes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Tilføj M13K07 hjælperfag til en slutkoncentration på 1 x 10 10 cfu / ml og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter med rystning ved 200 rpm.
- Overfør celler til 1,2 ml 2YT suppleret med 150 ug / ml carbenicillin og 75 ug / ml kanamycin i en 96-brønds dyb brønd blok med V-bund og vokse O / N ved 37 ° C med rystning ved 200 rpm i en 2,5 cm orbitalryster.
3.4) Fag Forberedelse og Gentagne runder af Selection
- Pellet bakterier ved centrifugering ved 4.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Lige dele af fag supernatanter fra replikat plader i en mini-rør 96 brønde sterilt mikroplade blå kasse, neutraliseres med 1/10 th volumen 10X PBT og blandes. Gentag selektionsrunder (fra trin 3.1.1) i 3-4 runder, eller indtil berigelse observeres (se afsnit 4. og 7.) sammenlignet med negativ kontrol protein.
BEMÆRK: I de tidlige runder af selektion, når signifikant / påviselig berigelse forventes ikke (dvs. runder 1 og 2), kan kvantificering af input og output fag titre (beskrevet i afsnit 7 og repræsentative resultater vist i figur 3) være nyttigt at sikre minimum fagkoncentrationer for vellykkede valg (beskrevet i Discussion) og er mere velegnede end puljede ELISA'er.
4. Karakterisering af Pooled ELISA
- Coat 96-well høj protein-bindering polystyrenplader med 100 ul GST-mærket antigen-protein eller negativ kontrol protein (GST, BSA, neutravidin etc.) på 2 pg / ml i henhold til § 3.1 og ryst ved 4 ° CO / N.
- Fjern overskydende antigen, blokerer plade med 200 pi blokeringspuffer med omrystning i 1-2 timer ved stuetemperatur ved 250 rpm på en mikropladeryster og vaskes fire gange med 200 pi PT buffer enten manuelt eller ved automatiseret pladevasker.
- Påfør 100 pi fag supernatant (fortyndet 1: 10-1: 20 i PBT-buffer), rystes ved 250 rpm i 15 minutter ved stuetemperatur, og vask pladen otte gange med 200 pi PT buffer.
- Tilsæt 100 pi anti-M13-HRP (1: 5.000 i PBT buffer). Ryst ved 200 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur, derefter vaske pladen seks gange med 200 pi PT buffer og to gange med 200 pi PBS.
- Påfør 100 pi af 1: 1 TMB-substrat og udvikle i 5-15 minutter (eller indtil væsentlig farve er udviklet), og derefter standse reaktionen ved tilsætning af 100 pi 1 MH 3 4 og læse pladen ved 450 nm.
- I almindelighed kan der observeres berigelse fagpuljer i runder 3-4 som et forhold af specifik binding versus ikke-specifik binding af> 2 (se figur 4)
BEMÆRK: Det er informativt at bemærke, at høje absolutte bindende signal på affinitetsmærket protein indikerer berigelse af tag-specifikke bindere (snarere end target bindemidler), og at høje absolutte bindende signal på den negative kontrol protein indikerer berigelse af ikke-specifik eller " Stive "bindemidler.
5. Klon Selection, sekventering og karakterisering
5.1) Isolering af Single Fab-fagkloner
- For at isolere individuelle kloner til sekventering og karakterisering, inficere 1/10 volumen af det amplificerede fag pool på T1 phag-resistente E. coli-celler i log-vækstfase (OD600 = 0,4-0,8) i en rundbundet mikrotiterplade, dække med en BreathaBLE plade tætning og inkuberes med omrystning ved 200 rpm i 30 minutter ved 37 ° C.
- Forbered 10-fold seriefortyndinger i 2YT medier og pladen på separate agarplader suppleret med 100 g / ml carbenicillin.
- Pick enkelte kolonier i 450 pi 2YT / carb medier suppleret med 1 x 10 9 M13K07 fag / ml og vokse O / N i en mini-rør med 96 brønde sterilt mikroplade blå boks inkubering ved 37 ° C med rystning ved 200 rpm.
- Pellet bakterier ved centrifugering ved 4.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Klonal fag supernatant kan anvendes til sekventering af Fab-fag-klonerne (som beskrevet i afsnit 5.4) eller til klonal direkte bindende ELISA for at bestemme specificitet mod immobiliserede antigener (som beskrevet i afsnit 5.3 og 21), for hvilke repræsentative resultater er vist i figur 5.
5.2) Ekspression af Fab-kloner til karakterisering
- Efter kloning i en passende eXPRESSION vektor (se Diskussion), plukke enkelt E. coli kolonier transformeret med ekspressionskonstruktioner til 1 ml 2YT / carb medier i en 96-brønds dyb-brønds plade under anvendelse af en steril tandstikker eller pipettespids og vokse i 12-16 timer ved 37 ° C med rystning ved 200 rpm. Dette kan gøres enten manuelt eller med et automatiseret koloniudvælger.
- Transfer 40 pi voksende kultur til 1,5 ml NZY medier suppleret med glucose / lactose / glycerol i en 96-brønds Deepwell blok pr metoden i Studier et al. 15
BEMÆRK: Alternativt kan celler dyrkes i 3-4 timer (OD 0,8-1,0) i ikke-suppleret og proteinekspression induceret ved tilsætning af 1 mM IPTG. - Dæk kultur blok (r) med en åndbar tætning og udtrykke Fab-kloner til 6-8 timer ved 30 ° C med rystning ved 200 rpm. Spin plader ved 4.000 xg i 15 minutter for at pelletere bakterieceller, supernatanten fjernes, dækplader med en folieforsegling og fryse pellets ved -20 ° C indtil lysis.
- Befri udtrykt Fabs fra indsamlede pellets med 100 pi lysis buffer (Tris-HCI 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 med 1 mg / ml lysozym og 10 U benzonase / ml kultur og proteasehæmmere) og omrystning i 2 time ved 4 ° C.
- Fjerne cellerester ved centrifugering ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C og indsamle rålysat supernatant til anvendelse i første karakterisering af specificitet ved ELISA-plader (se afsnit 5.3).
5.3) Klon Karakterisering ved direkte binding Klonal Fab ELISA
- Immobilisere antigener som beskrevet i afsnit 3.1 i stedet aliquotting 30 pi 2 ug / ml antigen i PBS til brønde i en plade med 384 brønde. Quad-baserede antigen layouts i pladen kan lette reagens overførsel ved anvendelse 96 kanalbaserede dispensering hoveder. Vask og blokere ELISA-plader i henhold til § 3.1.
- Klarede lysater indsamlet fra Afsnit 5.2 kan anvendes direkte til immobiliseret antigen til evarevalueringskonto af binding. Inkuber 30 pi lysat per brønd i 15 minutter ved stuetemperatur med omrystning ved 200 rpm.
BEMÆRK: Oprenset Fab klon protein kan alternativt anvendes ved at fortynde til 10 ug / ml i PBT buffer og anvende 30 pi af hver klon til blokerede brønde indeholdende antigen eller negativ kontrol protein (GST, BSA etc.) og udvikler sig på samme måde som beskrevet nedenfor. Alternativt kan Fab-fag også anvendes ved at fortynde 10 pi fag supernatant (beskrevet i afsnit 5.1) i 20 pi PBT buffer (1: 3) og påvisning med anti-M13-HRP antistoffer (beskrevet i trin fra 4,4 til 4,5) - Fjern overskydende lysat og vask brøndene enten manuelt eller ved hjælp af en automatiseret plade vasket 8x med 100 pi PT buffer og fjerne overskydende buffer.
- Inkuber 30 pi af en 1: 5000 fortynding af sekundært anti-FLAG-antistof i PBT buffer i 30 minutter ved stuetemperatur med omrystning ved 200 rpm.
- Vask, udvikle og kvantificere som pr §§ 4,3-4,5.
BEMÆRK: Repræsentative resultaterillustrerer både specifikke og ikke-specifikke bindende kloner er vist i figur 5.
5.4) Klon Sequencing
- Forbered en PCR Master mix som angivet i tabel 2.
- Tilsæt 2 pi af passende PCR-skabelon (enten fag supernatant eller resuspenderede enkelt phagmid indeholdende bakteriekoloni) til 20 pi PCR Master mix fremstillet med de passende primere i brøndene i en PCR-plade.
BEMÆRK: Der kræves særskilte masterblandingerne til sekventering af både de tunge og lette kædegener. - Kør PCR-reaktionen ved hjælp af parametrene i tabel 2 - PCR indstillinger.
- Kontroller succes af PCR-reaktionen ved at blande 5 pi af den færdige reaktion med påføringsfarvestof på en 1% agarosegel suppleret med DNA visualisering pletten og billeddannelse på en 300 nm transilluminator.
- Tilsæt 2 pi PCR-produkt til 10 pi sterilt vand indeholdende 0,2; Pi hver af exonuclease og reje-alkalisk phosphatase og inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter efterfulgt af enzyminaktivering ved 80 ° C i 10 minutter for at fjerne overskydende primere som forberedelse til sekventering.
6. Skalering til automatiserede Selections
6.1) Pipette-baserede Væskehåndtering
- Der fremstilles en 1% (w / v) bromphenolblåt i vand og fjerne uopløselige partikler under anvendelse af en 0,45 ml filter.
- For at bestemme det lineære område af absorbans på pladelæser fremstille en 1: 1000 fortynding af 1% bromphenolblåt-opløsning i vand, og fortsætte med to-fold seriefortyndinger (16 fortyndinger i alt).
- Overfør 100 ul af hver fortynding til en fladbundet 96-brønds plade og læse absorbansen ved 590 nm. Plot absolut absorbans versus fortyndingsfaktor og vælg en fortynding på midten til høje ende af det lineære område for efterfølgende tests.
- Tilføj bromphenolblåt til vand eller til den faktiske løsningder vil blive pipetteret baseret på fortynding valgt i det foregående trin i tilstrækkeligt volumen til pipettering til tre 96-brønds plader, plus døde volumen i reservoiret.
- Kalibrer en enkelt-kanals pipette til at levere test volumen ved pipettering vand på en analysevægt (100 pi vand vejer 100 mg ved stuetemperatur.)
- Ved hjælp af kalibreret pipette, overfør prøvevolumenet af det farvede opløsning mindst tre brønde i en fladbundet plade med 96 brønde og læse deres absorbanser ved 590 nm, i tre eksemplarer.
- Tre tomme fladbundede plader med 96 brønde afvejes på en analysevægt og registrere deres masse.
- Pipette prøvevolumenet fra reservoiret til hver af tre 96-brønds plader og måle deres absorbanser ved 590 nm, i tre eksemplarer.
- Hver plade vejes, og beregne forskellen i masse.
- Først vurdere om absorbanser i hver brønd er ensartede inden for området af tolerance (f.eks., +/- 5%), og om de er i overensstemmelse med the absorbanser opnået ved hånd-pipettering med den kalibrerede Pipetman. Hvis bestemte kanaler er konsekvent over- eller under-leverer (f.eks se figur 6), skal du følge reparation procedurer og gentag evalueringsproceduren indtil alle kanaler levere ensartede mængder.
- For det andet, når alle kanaler er bekræftet til at levere ensartede mængder, kontrollere rigtigheden af denne mængde ved at beregne den gennemsnitlige masse forskel, pr godt. For eksempel vil et perfekt kalibreret væskehåndteringsudstyr sæt til 100 pi levere 9,60 g vand pr plade eller 0,10 g vand per brønd. Hvis den reelle mængde leverede er konsekvent over eller under den tilsigtede volumen, så en korrektionsfaktor kan anvendes, dvs programmering 110 pi for at rent faktisk levere 100 pi.
BEMÆRK: For små mængder, fx 10 pi bruge ti gange mere bromphenolblåt i den farvede opløsning, og præ-aliquot 90 pi vand til de 96-brønds plader med hånden, for at sikre, at absorbances er målbare og fald i det lineære område.
6.2) Automatiseret Plate Vask
- Immobilisere positivt mål og negativ kontrol proteiner i separate brønde i 96 brønds mikrotiterplader (to plader for hver betingelse, der skal testes) som beskrevet i punkt 3.1.
- Blokere ikke-specifikke bindingssteder ved inkubering med blokerende opløsning i en time ved stuetemperatur.
- Tilføj identiske 100 pi alikvoter af en 10 13 cfu / ml målbindende Fab-fag opløsning i PBT til alle brønde i alle plader og inkuberes med forsigtig omrøring ved stuetemperatur i 2 timer.
- Vask to plader i henhold til hver tilstand, en plade til infektion og titrering og en plade for ELISA.
- Evaluere effekten af vask ved direkte infektion i bakterier og titrering (som beskrevet i afsnit 3.3 (uden M13K07 tilføjelse) og 7.2.1) eller udvikling med anti-M13 HRP antistof og kolorimetrisk substrat (som beskrevet i afsnit 4).
- Fag titres from specifikke kloner vil ofte give i størrelsesordenen 10 5 -10 7 fag / ml fra et immobiliseret protein, mod hvilken klon binder specifikt. Nogle resterende binding til negativ kontrol protein (fx BSA) er forventeligt og generelt 10 2 -10 5 fag / ml observeres dog meget lave titre (dvs.., <10 1) kan signalere alt for stringent vask, der kan kompromittere en markering.
- For fag binding bestemt ved ELISA, sammenligne de absolutte bindende signaler for positive og negative kontrol-proteiner for at bestemme om robot vask svarer til etablerede håndvask resultater (figur 7).
6.3) pladevasker Dekontaminering
- For at starte, skal du køre dekontaminering protokol, der skal testes.
BEMÆRK: Vi anbefaler brug af mindst dobbelt samlede line volumen, og prime og suge skiven hovedet i 5 min i 0,5% natriumhypochlorit, frisk fortyndet from kommerciel blegemiddel (typisk 6% natriumhypochlorit). - Prime og suge skiven hovedet i 5 min i steril (autoklaveret) vand og endelig prime systemet, indtil linjerne er fuld af luft.
- Prime linjerne med sterilt vand eller vaskebuffer.
- Vask en steril 96 brønds mikroplade gang, fjerne fra vaskemaskine og forsegle med steril plade forsegling. Dette er præ-forurening styrepladen.
- Aliquot 100 pi O / N amplificerede fag kultursupernatant til alle brønde i en 96 brønds plade.
- Vask fag-holdige plade én gang, derefter fjerne fra vaskemaskine og forsegle med en plast eller folie plade forsegling. Dette er forurening kontrol pladen.
- Udfør dekontaminering protokol, der testes. I dette eksempel, skal du gentage trin 6.3.1 og 6.3.2.
- Vask steril mikrotiterplade én gang, derefter fjerne fra vaskemaskine og segl. Dette er dekontaminering testplade.
- Plate 50 pi log fase E. coli til titrering plader; dette er præ-Infection styrepladen.
- Bryde forseglingen pre-forurening, forurening og dekontaminering 96 brønde, og der tilsættes 100 pi E. coli i log-vækstfase etape til alle brønde, ved hjælp af nye tips til hver brønd.
- Seal og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter ved 200 rpm.
- Plate 50 pi af inficerede celler fra tre tilfældige brønde i hver plade med 96 brønde til 10 cm 2YT / carb plader og inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Transfer 50 pi inficerede celler fra alle brønde af hver plade til dybe brønde indeholdende 1 ml 2YT plus 100 g / ml carbenicillin per brønd og vokse O / N ved 37 ° C.
- Gentag dekontaminering protokol og lade skiven linjer tørre.
BEMÆRK: Ingen O / N vækst på plader eller i flydende medium bør observeres på pre-infektionskontrol, kontrol før forurening eller dekontaminering test plader. Mange kolonier og vækst bør observeres om kontrol forurening plade; Hvis ikke, ingen konklusioner om effektiviteten afdekontaminering protokol kan foretages. Ideelt set vil dekontaminering plader gav ingen kolonier og ingen O / N vækst i nogen af brøndene i O / N-plader. Den stringens dekontaminering protokol kan øges med højere koncentrationer blegemiddel, længere sættetider og yderligere cykler.
7. Input / Output Titreringer
7.1) Input Fag Titreringer
- Fortynd en 5 pi alikvot af fagen til 50 pi med sterilfiltreret PBS og blandes.
- Forbered serielle 10-fold fortynding i sterilfiltreret PBS til 10 10 ved anvendelse af multi-kanal pipette eller en 96-kanal pipette.
- Podes 5 pi fortyndet fag på 45 pi T1 phag-resistente E. coli-celler i log-vækstfase (OD 0,6-0,8) og inkuber dækket med en åndbar tætning til 30 minutter ved 37 ° C.
- Pladen 5 pi af inficerede celler på en LB / agarplade suppleret med 100 ug / ml carbenicillin og inkuberes O / N at 37 ° C.
- Koncentrationen af fag kan estimeres ud fra den mest fortyndede prøve, i hvilken kolonier vises ifølge beregninger er beskrevet i afsnit 2.8.
7.2) Output Fag Pitrations
- Efter eluering af plade-bundne fag ved tilsætning af E. coli celler, fortyndes en 5 pl portion af fag-inficerede celler til 50 pi med autoklaveret 2YT medier
- Forbered serielle 10-fold fortynding i autoklaverede 2YT medier til 10 6 under anvendelse af en multi-kanal pipette eller 96 kanal pipette.
- Plade 5 pi af inficerede celler på en agarplade suppleret med 100 ug / ml carbenicillin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Koncentrationen af fag kan estimeres ud fra den mest fortyndede prøve, i hvilken kolonier vises ifølge beregninger er beskrevet i afsnit 2.8.
BEMÆRK: I begge tilfælde (dvs. input og output fag titre, sammenligning med koloni numre på både tetracyclin (total cell nummer) og kanamycin (hjælperfag titer) kan også være oplysende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den heri beskrevne protokol er blevet anvendt til at isolere antistoffragmenter med en række både structurally- og funktionelt relateret antigen domæner fra kombinatoriske fagpræsenterede Fab biblioteker i parallel. Spørgsmål vedrørende antigen tilgængelighed kan omgås, i mange tilfælde med i silico identifikation af ekspressér antigen domæner der er egnet til Antibody Selection 23. Ved at koble antigenekspressionen til antistof valg inden for samme laboratorium (figur 1) bliver det muligt at konstruere en integreret pipeline, hvor antigen parametre kritiske for udvælgelsen lettere kan kontrolleres. I de fleste tilfælde omhyggelig bestemmelse af domænegrænser muliggør ekspression og isolering af tilstrækkelige mængder af tilstrækkeligt rent antigen fra high-throughput ekspression i 96 eller 24 brønde dybbrøndsplader (figur 2) for vellykket anvendelse i antistof markeringer. Under successiverunder af udvælgelsesprocessen kan eluerede fag koncentrationer og berigelse af fag, som specifikt binder antigen overvåges enten fagtitreringen (figur 3) eller med fagpuljer i et ELISA-assay (figur 4). En bindende ratio (> 2) viser generelt tilstedeværelsen af specifikke bindende kloner. Omvendt kan et lavt forhold (<2) hjælpe med at bestemme årsagen til en markering fiasko. For eksempel kan et forhold <2 med høj ikke-specifik OD angiver utilstrækkelig fjernelse af ikke-specifikke kloner (eller klæbende bindemidler) og kan føre til yderligere optimering af udvælgelsen protokollen. Desto mindre, når der detekteres berigelse individuelle høj affinitet kloner kan derefter isoleres til sekventering og karakterisering. Klon binding kan karakteriseres i et kolorimetrisk immunassay og muliggør sammenligning af binding af Fab-phag eller Fab til immobiliserede antigen versus negativ kontrol protein, hvilket gav et mål for berigelse (forholdet mellem binding til tarFå versus negativ kontrol protein eller affinitetsmærke protein) (figur 5).
Under skalering og automatisering af denne metode, kan vurderingen af centrale funktioner i den flydende håndteringsenhed være nyttigt at sikre korrekt og nøjagtig drift med løsninger, der ligner dem, der anvendes under faktiske valg. Brugen af absorberende kromoforer i løsninger kan hjælpe til at opdage, når bestemte kanaler i fluidikken (aspiration og udlevering) er enten tilstoppet eller har mistet sæl medfører dellevering volumen, som vist i figur 6. Kan Automatiserede vask enheder også være en kilde til variabilitet og kan kræve opmærksomhed. Anvendelsen af kendte bindende kloner muliggør sammenligning af binding mellem target kontrol protein at sikre, at target-bindende opretholdes mens baggrund binding fjernet (figur 7), når vask parametre såsom dispensering hastighed, vask volumen og antallet af vaske bliver optimeret. Efterbrugen af en automatiseret pladevasker med fag-løsninger, er nødvendige for at sikre fravær af krydskontaminering fra successive valg eller forskellige udvælgelsesprocedurer og en fejlfinding / tolkning vejledning er fastsat i tabel 3 effektive dekontaminering protokoller.
Figur 1. Oversigt -. Højkapacitetsforskning antigen produktion og Antibody Selection pipeline Denne oversigt viser en trin-for-trin visualisering af en repræsentativ antigen generation og Antibody Selection pipeline. Den i silico identifikation af antigen domænegrænser muliggør gensyntese, udtryk og udvælgelse af domæner for proteiner, der kan være dårligt karakteriseret. Udtrykte antigen domæner immobiliseres og anvendes til at isolere puljer af specifikke antistof med høj affinitet kloner fra et combinatorial antistofbibliotek vist på overfladen af filamentøs fag. Pools af antistof-fag elueret og amplificeret fra individuelle antigener kan derefter anvendes til at overvåge round-til-runde berigelse af specifikke bindende kloner i ELISA-baserede assays sammenligne immobiliserede target versus negativ kontrol protein før isolering af individuelle bindende kloner til karakterisering. Venligst klik her for en større version af dette tal.
Figur 2. SDS-PAGE visualisering af affinitetsmærkede antigener. Et repræsentativt SDS-PAGE af udtrykt og oprenset 6X-His-GST-mærket antigen domæner (5-10 kDa domæne + 26 kDa GST) oprindeligt identificeret ved in silico analyse af antigen domænegrænser. Proteindomæner udtrykt og isoleret ved Affiskabet rensning er karakteriseret ved SDS-PAGE før valg for at sikre størrelse baserede identitet, tilstrækkelige udbytter og renhed for at muliggøre brug i fag-antistof-valg. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Visualisering af fag output titre. Fag output titere bestemmes ved udpladning celler inficeret med fag over en 10-fold fortyndingsrække på agar medie suppleret med forskellige antibiotika (tetracyclin, carbenicillin og kanamycin) at bestemme den laveste fortynding, hvor kolonier kan observeres og estimere antallet af fag bundet til at målrette antigen og elueres. Klik her for at se et stortr version af denne figur.
Figur 4. Bindende forhold mellem mål for negativ kontrol protein ved puljet ELISA. Kan Forløbet af berigelse vurderes efter selektionsrunder ved screening enkelte forstærkede eluenter mod både de specifikke mål og negativ kontrol proteiner og / eller isolerede affinitetsmærke. Vist i plottet er berigelse nøgletal for binding af 96 individuelle fag-antistof puljer mod deres 96 respektive antigener versus negativ kontrol protein parallelt. Hver forholdet værdi stammer fra to absorbansmålinger at kvantificere binding af fag pool til enten mål eller negativ kontrol-protein under anvendelse af et HRP-fusioneret antistof specifikt for M13 fagkappeprotein. Et forhold tærskel på 2 eller højere (ofte i området 2-10 eller derover som afbildet i rød) anvendes som en indikation af berigelseog den sandsynlige tilstedeværelse af specifikke bindende kloner. Mindre forhold kan betyde svigt af eller særlige problemer med udvælgelsen, der kan berettige til yderligere optimering af protokollen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Direkte binding klonal Fab-fag eller Fab ELISA. Bindingen af enkelte kloner (uanset i Fab-fag eller Fab format) kan evalueres ved ELISA-baseret assay versus immobiliseret protein i 384-brønds plader. Binding detekteres ved anvendelse af en sekundær HRP-fusioneret antistof mod M13 coat protein på Fab-fag eller et affinitetsmærke på Fab. Rå absorbansværdier for binding af klonal Fab-fag til et målantigen, negativ kontrol protein og antigen affinitetsmærke (GST) er afbildet illustrerer specifikke binders (A01, A04, A06), og fedtede bindemidler (A05).
Figur 6. Evaluering af afgivne mængder efter automatiseret flydende aggregat. Konsekvent og præcis levering af beregnet mængder af robot eller manuel 96 brønde pipettering systemer kan evalueres ved hjælp af farvede løsninger og en plade-læser. I dette eksempel 10 pi af en opløsning indeholdende bromphenolblåt pipetteres sekventielt til alle brønde af to plader med 96 brønde under anvendelse af en enkelt spids boks. Hver brønd indeholder 90 pl / brønd dH2O analogt med tilsætning af hjælperfag til inficeret E. coli. Hver plade er absorbanser ved 590 nm aflæses i tre eksemplarer, og mængderne er interpoleret ud fra en standardkurve fremstillet ved hjælp af en kalibreret enkelt kanal Pipetman. Mængder, der leveres til en enkelt række på den første og anden plade er vist. Bemærk, at på first plade, godt E04 ikke modtager farvet løsning, og på den anden plade, den modtager en dobbelt volumen. Dette indikerer, at spidsen røre ikke er tilstrækkelig til konsekvent levering, og kræver yderligere optimering. 95% konfidensintervaller for tredobbelt absorbansmålinger er vist.
Figur 7. Vurdering af automatiseret plade vask. Effektiv fjernelse af ubundet fag kan vurderes under anvendelse af en ELISA for at måle Fab-fag-binding til immobiliseret positive (anti-FLAG-antistof) og negative (BSA) kontrol proteiner mens variere vaskebetingelser. I dette eksempel er input fag analog med naive bibliotek (10 13 cfu / ml i PBT) fjernes med otte eller seksten vaske med hånden eller ved hjælp af robotten. Resterende fag-binding til BSA, er den samme på tværs af alle betingelser, som er specifik binding til immobiliseret anti-FLAG-antistof, Indicating at på dette lave strømningshastighed, begge metoder er ækvivalente og tilstrækkeligt strenge. 95% konfidensintervaller fra dobbelte brønde er vist.
| LØSNINGER | |||
| 2YT medier - Tilsæt vand til 1 L, justere pH til 7,0, og autoklave. | gærekstrakt | 10 g | |
| trypton | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| NZY medium (1 L) | NZ Amine | 10 g | |
| gærekstrakt | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 ml | ||
| 20 salt lager | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 sukker lager (1 L) | glucose | 25 g | |
| lactose | 100 g | ||
| glycerol | 250 ml | ||
| 20x salt lager (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH4CI | 1 M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbenicillin (Carb): | 100 mg / ml i vand. Filter-sterilisere. | ||
| Kanamycin (Kan): | 25 mg / ml i vand. Filter-sterilisere. | ||
| Tetracyclin (Tet): | 10 mg / ml i vand. Filtersteriliser. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2,5 M | ||
| 1x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCI | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1,5 mM | ||
| 1X KCM | KCI | 500 mM | |
| CaCl2 | 150 mM | ||
| MgCI2 | 250 mM | ||
| SOC Media | gærekstrakt | 5 g / L | |
| trypton | 20 g / L | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCI | 2,5 mM | ||
| MgSO4 | 20 mM | ||
| Glucose | 20 mM | ||
| Blokeringsbuffer | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| PBT buffer | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| PT buffer | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| Phosphorsyre | H 3 P0 4 | 1 M | |
Tabel 1. Medier og løsninger.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Komponent | pi per reaktion | ||
| Vand | 19.45 | ||
| 10x Taq buffer | 2.5 | ||
| dNTP'er (10 mM lager) | 0,675 | ||
| DMSO | 0,75 | ||
| Taq enzym | 0,125 | ||
| Forward Primer (100 uM stock) | 0.25 | ||
| Reverse primer (100 uM stock) | 0.25 | ||
| Tung kæde sekventeringsprimere | |||
| M13 Forward primer | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 revers primer | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Let kæde sekventeringsprimere | |||
| M13 Forward primer | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 revers primer | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| PCR INDSTILLINGER | |||
| Trin 1. | 94 ° C i 3:00 min | ||
| Trin 2. | 94 ° C i 0:30 min | ||
| Trin 3. | 55 ° C i 0:30 min | ||
| Trin 4. | 72 ° C i 1:00 min | ||
| Vend tilbage til trin 2 og gentag 24x | springe til trin 2 | ||
| Trin 5. | 72 ° C i 7:00 min | ||
| Trin 6. | |||
Tabel 2. PCR Master Mix og indstillinger.
| Fortolkning af dekontaminering resultater | |||
| Tallerken | Forventet carbenicillin titer | Hvis ikke? | |
| Pre-infektionskontrol | 0 | Celler blev præ-smittede; intet kan udledes af forsøget. | |
| Forurening kontrol | græsplæne | Utilstrækkelig forurening for at kunne vurdere effekten af efterfølgende dekontaminering; Overvej nedsænke manifold i fagopløsning stedet opsugning det. | |
| Dekontaminering test | 0 | Dekontaminering ikke komplet; øge sættetid, blegemiddel koncentration eller prøv SDS og EtOH vasker i stedet. | |
Tabel 3. Vurdering af vaskemaskine dekontaminering. At fastlægge effekten af dekontaminering er det nødvendigt at vise, at skiven var forurenet med fag, og at dekontaminering protokollen held elimineret at forurening. Brug af fag, der giver carbenicillinresistens, er de forventede resultater af en sådan test på listen, sammen med forslag bør det reelle resultat afviger fra det forventede resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved udførelse af in vitro antistof valg, de to primære determinanter for udvælgelse succes er 1) isolering af godt foldede antigene mål for udvælgelse af og 2) muligheden for en høj funktionel diversitet antistofbibliotek. I mange tilfælde kan tilgængeligheden af tilstrækkelige mængder af godt foldet, fuld længde proteinet være begrænsende. En fremgangsmåde til at overvinde denne begrænsning er at bruge domæner identificeret fra bioinformatik analyse 22 og syntetiseret til indføring i en bakteriel ekspressionsvektor med en passende affinitetsmærke.
Der er en række af mærker, der anvendes i bioteknologiske applikationer for at øge opløselighed, lette oprensningen og stabilisere ustabile domæner. 11 evnen til at syntetisere næsten enhver ønsket insert sekvens muliggør en meget alsidig antigen generation platform. Selvom GST-mærket format er almindelig, er vellykkede resultater været tidligereopnået ved anvendelse af hexahistidin, Fc, halogen, maltosebindende protein og stedspecifikke biotinyleringsbetingelserne tags og det menes, at utallige andre affinitetsmærker kan optimeres til anvendelse i en lignende platform. Dog kan affinitetsmærker have både gavnlige og utilsigtede negative konsekvenser i efterfølgende anvendelser 11 og bør undersøges grundigt, inden der etableres en rørledning baseret på et bestemt format.
Ofte nye brugere vil stille spørgsmålet om, hvordan man vurdere kvaliteten af et antistof bibliotek og selvom der ikke er noget enkelt svar, bør man forsøge at vurdere en række vigtige funktioner (fysiske eller syntetisk), herunder den samlede mangfoldighed, relative visningsniveauer, karakteren af og omfanget af randomisering (dvs. bibliotek design versus bibliotek indholdet bestemt ved sekventering), og de fysisk-kemiske egenskaber af antistoffet versus tilsigtede anvendelse. Selv uden for rammerne af denne protokol, et mere detaljeret treatment af disse funktioner, og hvordan de kan påvirke valget af antistoffer kan findes her 2,23. Kendskab til bibliotekets mangfoldighed er især vigtigt at sikre tilstrækkelig dækning af mangfoldigheden i markeringer. Typisk en fag-koncentration, der giver 100-1000 eksemplarer af hver fagklon i biblioteket er ønskelig og bør sikre, at sande positive bindemidler til stede i biblioteket kan inddrives. Men ikke-specifik binding af fagen til mikrotiterplade overflader stiger drastisk over 10 13 fag / ml og for meget forskellige biblioteker, kan mere end en enkelt brønd pr antigen for at sikre tilstrækkelig dækning. På den anden side, hvis input-biblioteket er for fortyndet, vil den absolutte koncentration af sande positive bindemidler være så langt under KD (typisk nM) at de ikke vil blive genvundet. På baggrund af disse begrænsninger, bør fagbiblioteker generelt resuspenderet til Oktober 12-13 fag / ml for den første runde af valg.0; Ved denne koncentration en 100 L aliquot af fag repræsenterer en 1,000-100 fold dækning af en 10 9 -10 10 mangfoldighed bibliotek og kan rutinemæssigt give bindende kloner til forskellige antigener. Ved mindre koncentrationer, eller øgede forskelle, kan det være nødvendigt at øge antallet af brønde af antigen udvalgt imod i første runde (se afsnit 2.9). Efter runde 1, men de fleste af de ikke-bindende mangfoldighed af biblioteket er blevet fjernet; overdækning af produktionen mangfoldighed runde 1 er oftest let opnåelige ved hjælp af en enkelt brønd. I tilfælde af parallelle valg i plader med 96 brønde, kan dette reducere antallet af antigen selektionsskåle nødvendige for blot én, efter den første runde.
Under faktiske valg, kan fag titrering tilbyde objektive foranstaltninger til at karakterisere og overvåge fremskridt, og samtidig hjælpe til at identificere problemområder især i de tidlige runder af selektion, hvor berigelse ikke er tilstrækkeligt til atpåvises. Dette kan være særligt nyttigt under skalering af valg til at bestemme protokol ydeevne. Generelt input fag titre (dvs. naivt bibliotek eller post-amplifikation af eluerede fag) bør forblive relativt konstant (10 12 -10 13 fag / ml) mellem runder, med dårlig vækst celle / lav fag titre indikerer potentiel kontaminering og / eller dårlig output fra den foregående runde. Selvom output fag titre forventes at stige i løbet af berigelse i senere runder af udvælgelse, forventes en række 10 3 -10 5 cfu / ml i de første to runder. Afvigelse fra dette interval kan indikere potentielle problemer med udvælgelsen såsom forurening eller overskydende vask stringens. I senere runder af selektion (dvs. runder 3 og 4), kan berigelse af kloner, som specifikt binder målantigenet vurderes via poolede ELISA'er at måle binding af fag-pool mod både målantigen og negativekontrol protein (se afsnit 4).
Efter 3-4 udvælgelsesrunder (eller når berigelse målprotein har nået et målantigen: negativ kontrol protein signal forhold på 2: 1 eller højere i forhold til baggrunden protein), er inficerede bakterieceller udpladet at isolere enkelte fagmid kolonier til sekventering indledende karakterisering og kloning, hvis nødvendigt. På dette tidspunkt, er det yderst hensigtsmæssigt at konvertere Fab-fag for at frigøre Fab før yderligere karakterisering. Selvom Fab-fag kan bruges til første karakterisering ved at fortynde 10 pi fag supernatant (beskrevet i afsnit 5.1) i 20 pi PBT buffer og detektering med anti-M13-HRP-antistoffer (beskrevet i trin 4,4-4,5), i vores erfaring, bindende egenskaber kan ændre sig betydeligt i alt fra 5-20% af kloner ved frigørelse fra fagpartiklen og tidlig konvertering kan undgå problemer med falske positiver. Den specifikke metode, der anvendes til konvertering vil afhænge af unique arkitektur fagmidet og vil således ikke blive behandlet eksplicit her. Men i de mest almindeligt anvendte vektorer, dette kan i almindelighed opnås ved 1) omdannelse af oprenset fagmid (eller phagmid pool) i en kompetent non-suppressor E. coli-stamme, såsom HB2151 eller 55244, hvis en amber-stop (TAG) kodon griber Fab og pIII protein, 2) indsættelse af et amber stopkodon mellem Fab og pIII-proteinerne for at muliggøre ekspression af opløselige antistoffragmenter i en ikke-suppressor stamme eller 3) ved kloning af immunoglobulingener (fra individuelle fagmid eller phagmid pool) i en egnet ekspressionsvektor. For yderligere at strømline udvælgelse og karakterisering kan puljede kloningsmetoder tilbyde effektive midler til konvertering bindende kloner massevis på ekspressionskonstruktioner, både fjerne potentialet for falsk-positive binding af Fab-fag-partikler, og hvor udtrykket lysater anvendes til tidlig karakterisering, selv omkostningerne og indsats oprensningkan indledningsvis undgås.
For kloner isoleres direkte fra Library F (beskrevet i 24), kan variable antistofdomæner sekventeres ved hjælp 1-2 pi fag supernatant som template til PCR amplifikation af komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) (se tabel 2 Materialer for Bibliotek F rettede primere ). Ved anvendelse af disse primere, vil de variable regioner med tung og let kæde, hvilket gav produkter på ~ 700 og ~ 500 bp, der dækker alle tre CDR'er. Primere omfatter annealingsites for M13 primere, således at produkter kan sekventeres efter rensning (som beskrevet i afsnit 5.4.5) under anvendelse af standard primere til rådighed i de fleste sekventering core faciliteter. Alternativt, for Fab-fag-pools, der er blevet klonet i en ekspressionsvektor og transformeret direkte i E. coli til ekspression, kan enkelte kolonier isoleres og resuspenderet i 15 pi 2YT og 1-2 pi af cellesuspensionen anvendes direkte som skabelon for enkelt Colony PCR under anvendelse af passende primere.
Automatisering af markeringer vil kræve optimering og validering af flere vigtige robot funktioner. Generelt skal pipette-baserede væskehåndtering være nøjagtige og konsistent på tværs af alle 96 kanaler, skal plade vask fjerne ubundet fag effektivt uden stripning adsorberet antigen eller bundet Fab-fag fra markeringen pladen. Effektiv rensning af pladevasker er også nødvendigt mellem runder til at tillade berigelse og effektiv bekæmpelse af udvælgelsesprocedurer, og mellem de efterfølgende valg for at forhindre krydskontaminering. For at optimere udvælgelsesproceduren højt gennemløb, har enkle metoder til evaluering af disse funktioner er blevet anvendt tidligere, og er beskrevet nedenfor og detaljeret i protokollen.
For at vurdere sammenhængen i volumen effekt fra samtlige kanaler i en flydende dispensering / aspiration hoved, er en farvet løsning pipetteres på en fladbundet plade med 96 brønde og absorbance i hver brønd målt på en pladelæser. En kromofor såsom bromphenolblåt er nyttigt for farvning løsninger svarende til dem, der anvendes for rigtige valg til at vurdere virkningerne af forskellige overfladespænding og samhørighed egenskaber på det afgivne volumen. Efter bekræftelse af, at alle kanaler dispensering konsistente mængder, kan nøjagtigheden af den samlede leverede mængde bestemmes ved at måle massen af væske overføres til hver plade.
Automatisering af pladen vask for at fjerne ubundne kloner primært kræver optimering af den hastighed, hvormed vaskebuffer skal dispenseres, og antallet af vaske, der skal anvendes. En rimelig metode til at vurdere denne parameter anvender positive kontroller (specifikt Fab-fag bindende kloner) for at vurdere virkningerne af at variere afgivelseshastighed og / eller antal vaske at afgøre, om 1) adsorberet antigen eller bundne fag bliver fjernet ved overdrevent strenge vask eller 2) ikke-specifik binding til ikke-beslægtede proteiner er overdreven due at vaske betingelser, der ikke er tilstrækkeligt strenge. Resterende / bundet fag kan detekteres og kvantificeres enten ved infektion i bakterier og udpladning for enlige kolonitællinger eller ved ELISA under anvendelse af sekundære antistoffer specifikke for antistof affinitetsmærker eller fag kappeproteiner. Bruges Negative kontroller til at vurdere resterende niveauer af ikke-bindende Fab-fag til at målrette proteiner eller specifik binding Fab-fag til ikke-beslægtede / baggrund proteiner, som kan være højt, hvis vask ikke er tilstrækkeligt strenge. I dette tilfælde har vi brugt immobiliseret BSA som en kontrol for ikke-specifik binding og et anti-FLAG-antistof, der genkender et FLAG-epitopmærke på Fab-fag som en positiv kontrol. Vi sammenlignede otte og seksten vaskecykler hjælp af robotten versus vask i hånden, på et medium flow, for at vise, at disse teknikker var ækvivalente. Alternativt kan måle input og output fag titre (se afsnit 7) under igangværende valg også bidrage til at foretage finjusteringer i vask parametre. Endelig skal dekontaminering af pladevaskere anvendes til valg være effektive til at fjerne overførsel af fag fra tidligere valg. Det er vores erfaring, frisk fortyndet 0,5% natriumhypochlorit er hurtig, effektiv og billig. Detergenter, såsom SDS er også effektive, men kræver langt mere omfattende vask til fjernelse fra systemet. Tjek reagens kompatibilitet for systemet, før eventuelle prøvninger. For at vurdere dekontaminering, vi teste for tilstedeværelsen af resterende fag i opløsninger behandles af fluidiksystem og fortolke resultaterne i henhold til tabel 3.
Sammenfattende denne protokol giver en skalerbar metode til isolering Fabs fra kombinatoriske biblioteker af parallelle in vitro markeringer mod proteindomæner og tilbyder teknikker til validering et automatiseret fagselektion system. Omkostninger og infrastruktur barrierer, omfattende dyrefaciliteter kan udgøre afbødes da denne metode ikke rely på immunisering af dyr. Endvidere ved at integrere antigen generation med antistof-fag udvælgelse, kvalitet faktorer, der påvirker valget succes lettere overvåges og justeres. Når tidsrammen fra antigenekspression til valg og første karakterisering er i størrelsesordenen 6-8 uger, kan en mere lydhør produktionssystem realiseres. Antistoffer isoleret fra in vitro-markeringer er også begge let modificeret (på grund af genotype-fænotype-binding) og vedvarende, kræver kun lagret DNA af ekspressionskonstruktionen til gentagne gange og reproducerbart at generere et antistof. Endelig ved at vise, at denne protokol kan udføres ved hjælp af enten en kvasi-manual eller fuldautomatisk metode, der anvender en specialdesignet, robot udvælgelse system, kan throughput være skalerbar og tilgængelig for små akademiske og industrielle laboratorier ens.
Brug af high-throughput ovenfor beskrevne fremgangsmåder og biblioteket F syntetiske antistofbibliotek 24 både in vitro - og in situ -expressed proteiner. Selv succesrater for enhver given udvælgelse vil afhænge både af kvaliteten (renhed, foldedness, mono- dispersitet etc.) af antigenet mål såvel som kvaliteten og mangfoldigheden af antistoffet bibliotek, er det blevet observeret, at hvor som helst fra 25 til 80 % af antigener vil give bindemidler til en høj udvælgelse gennemløb. Vigtigere er det værd at bemærke, at også ofte vælges kloner med evnen til at modulere mål-funktion. Dette bibliotek konstrueres ved hjælp af et fuldt humant ramme, hvilket gør disse antistoffer modtagelig for potentiel terapeutisk anvendelse 25, således understrege betydningen af denne rørledning som en alternativ fremgangsmåde til generering af affinitetsreagenser med bredværdi.
Sammenfattende vil robusthed og alsidighed af den fremgangsmåde, der præsenteres i denne protokol fortsat at støtte i optimering, industrialisering og endelige udbredt anvendelse af denne teknologi som en levedygtig middel til at nå det langsigtede mål om at generere affinitetsreagenser til stort set alle medlemmer af den menneskelige proteom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende NIH fælles fond - Protein indfangningsreagenser Program til at finansiere udviklingen af rekombinante antistof Network antistof udvælgelse og karakterisering rørledning og den canadiske Foundation for Innovation for finansiering køb af robot udvælgelse platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
