Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Skalerbar høy gjennomstrømning Utvalg fra fag-vises Syntetiske antistoffbiblioteker

Published: January 17, 2015 doi: 10.3791/51492
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,3, 1,4, 1,4, 1,3, 1,4, 1,4, 1,2
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

Summary

En metode er beskrevet med visuell akkompagnement for å gjennomføre skalerbare, høy gjennomstrømning valg fra fag-vises kombinatoriske syntetiske antistoffbiblioteker mot hundrevis av antigener samtidig. Ved hjelp av denne parallell tilnærmingen, har vi isolert antistoff-fragmenter som utviser høy affinitet og spesifisitet for forskjellige antigener som er funksjonelle i standard immunoanalyser.

Abstract

Etterspørselen etter antistoffer som oppfyller behovene til både grunnforskning og klinisk forskning programmer er høy og vil dramatisk øke i fremtiden. Det er imidlertid åpenbart at monoklonale tradisjonelle teknologier er ikke alene til denne oppgaven. Dette har ført til utvikling av alternative metoder for å tilfredsstille behovet for høy kvalitet og fornybare affinitet reagenser til alle tilgjengelige elementer av proteom-. Mot dette formål, har høy gjennomstrømming metoder for å gjennomføre valg fra fag-vises syntetiske antistoffbiblioteker blitt utviklet for applikasjoner som involverer ulike antigener og optimalisert for rask gjennomstrømming og suksess. Her, er en protokoll som er beskrevet i detalj som illustrerer med video demonstrasjon parallell utvalg av Fab-fagklonene fra høye mangfold biblioteker mot hundrevis av målene ved hjelp av enten en manuell 96 kanal væskebehandler eller automatisert robotsystem. Ved hjelp av denne protokollen, kan en enkelt bruker generere hundrevis av antigener,velg antistoffer mot dem i parallell og validere antistoffbinding innen 6-8 uker. Uthevet er: i) en levedyktig antigen format, ii) forhåndsvalg antigen karakterisering, iii) kritiske trinn som påvirker valg av konkrete og høye affinitet kloner, og iv) måter overvåking utvalg effektivitet og tidlig stadium antistoff klone karakterisering. Med denne tilnærmingen, har vi fått syntetiske antistoffragmenter (Fabs) til mange målgrupper klasser inkludert single-pass membranreseptorer, utskilt protein hormoner, og multi-domene intracellulære proteiner. Disse fragmentene blir lett omdannet til full-lengde antistoffer og har blitt validert for å fremvise høy affinitet og spesifisitet. Videre har de vist seg å være funksjonelle i en rekke standard immunoanalyser inkludert Western-blotting, ELISA, cellulær immunfluorescens, immunoutfelling og relaterte analyser. Denne metodikken vil akselerere antistoff funn og til slutt bringe oss nærmere å realisere målet of generere fornybare, høykvalitets antistoffer mot proteomet.

Introduction

Med utbruddet av den post-genomisk alder, er tilgjengeligheten av høy kvalitet bindingsreagenser å karakterisere og modulere proteiner viktig å åpne ny forskning og terapeutiske muligheter. Antistoffer fortsette å være kritisk til både akademiske og industrielle forskere som grunnforskning og diagnostiske verktøy og potensielle therapeutics. Ikke overraskende har det vært en imponerende vekst av kontrakt antistoffutvikling bedrifter, hvorav de fleste er avhengige av konvensjonelle hybridomceller teknologier for å generere egendefinerte antistoffer. Likevel er in vitro valg med fag-vises antistoffbiblioteker bli en kraftig alternativ teknologi som kan tilby unike fordeler og suksess der konvensjonelle teknologier kan møte begrensninger 1, 2.

I lys av den betydelige behov for kvalitets antistoffer som forskningsverktøy, to primære utfordringer for å generere fornybar antistoffer er 1) utvalg gjennomstrømming og 2) antigen availability. Et antall grupper har nå beskrives in vitro seleksjons rørledninger med sikte på å øke gjennomstrømningen og frekvensen av antistoff identifikasjon. Disse beskrivelsene detalj en rekke levedyktige tilnærminger som inkluderer valg på enten full-lengde er rettet mot 3,4, eller strukturelt relaterte domener 5,6,7, enten ved hjelp perle baserte 6,8 eller plate-baserte 3,4 antigen immobilisering ordninger. I tillegg har den økende bruk av gen-syntese teknologier 9 gjort systematisk antigen generasjon, spesielt av isolerte domener, rimelig kostnadseffektivt og kan potensielt eliminere problemer med å skaffe tilstrekkelige mengder av renset, full-lengde antigen. Ved å bruke de to teknologiene i tandem, ble en selvstendig og skalerbar antigen generasjon og antistoff utvalg rørledning utviklet som ville gjøre det mulig parallell isolering av antistoffer for store sett med uttrykt antigen domener og legge til rette for utvikling av reagenser for characterizing hele klasser av strukturelt eller funksjonelt relaterte proteiner.

Mot dette målet, en integrert rørledning som par i silico identifikasjon av uttrykk antigen domener, gen syntese, høy gjennomstrømming bakteriell uttrykk for antigener og skalerbare fag-vises antistoff valg har blitt utviklet. Denne rørledningen krever bare grunnleggende infrastruktur tilgjengelig for de fleste life science laboratorier (herunder antistoffbiblioteker som er stadig mer tilgjengelig gjennom lisens eller materialoverføringsavtalen), men er også mottagelig for automatisering for bruk i industriell skala. Ved bruk av denne protokollen, er det mulig å generere hundrevis av affinitet-merket antigen domener, og rutinemessig isolerer høyspesifikke antistoff-fragmenter til mange av disse antigenene.

Phage display teknologi har vist demonstrert kompatibilitet med en rekke forskjellige rekombinante affinitetsreagens formater, inkludert Fab, scFv, Fv og autonome domener og envoksende utvalg av små "alternative rammeverk" (designet ankyrin gjenta proteiner (DARPINS), fibronektin (FN), lipokalin domener og mer 10). Diskusjonen er begrenset i dette eksempel til isolasjon av Fab-antistoff-fragmenter, selv om det er antatt disse metodene kan tilpasses andre typer av biblioteker. Ved hjelp av denne teknologien, Fab-fragmenter med lav nanomolar affinitet til små, merket proteindomener inkludert transkripsjonsfaktordomener, SH2-domener, RNA-bindende proteiner og andre har blitt valgt, og mange av disse binder full-lengde protein, og som er funksjonelle i immunoanalyser som immunfluorescens , immunopresipitering og immunhistokjemi. Viktigere, rekombinante bindende kloner er fullt fornybar og kan bli re-genereres fra uttrykk konstruerer via bakteriell produksjon gir økt konsistens, reproduserbarhet og kostnadseffektivitet, og dermed rettferdiggjøre bekostning av strenge klone validering.

I denne protocol og tilhørende video, er grunnleggende metoder for antistoff utvalg fra fag-vises biblioteker bruker immobilisert antigen domener demonstrert. Denne metoden benytter GST-merket proteindomener immobilisert ved passiv absorpsjon i mikroplater, selv om andre koder 11,12,13 og utvelgelses formater 13,14,2 har også vært brukt med hell. Kritiske betraktninger for oppsett og gjennomføring av valg med parallell overvåking av valgparametere som tar sikte på å identifisere og isolere spesielt beriket klonale antistoffer for validering er detaljert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Antigen Generation

MERK: Antigen domener kan bli syntetisert og klonet ved en rekke forskjellige kommersielle leverandører i en egnet IPTG-induserbar ekspresjon konstruksjon.

  1. Forvandle ekspresjonskonstruksjoner inn kjemisk kompetente, T1-fag motstandsdyktig, BL21 E. coli-celler ved å blande 10 ng av kodende DNA i 20 ul av 1 x KCM på is i en 96-brønners PCR-plate, etterfulgt av tilsetning av 20 l av kjemisk kompetente celler.
  2. Inkuber celle / DNA-blandingen på is i 20 min, ved romtemperatur i 10 minutter og deretter på is igjen i 2 minutter før redning med 100 ul av forvarmet super optimal kokes med glukose (SOC) medier, og dekker med et pustende plate tetning og risting ved 37 ° C i 1 time ved 200 rpm i en 2,5 cm orbital shaker.
  3. Plate 5 ul av transformerte celler på Luria-Bertani (LB) / agarplater supplert med karbenicillin (100 g / ml) og vokse O / N for å oppnå enkle kolonier anvendes forgenererer glyserol aksjer.
  4. Inokuler 1 ml 2YT / carb media med 5 ul glycerol lager og vokse i 12 timer ved 37 ° C i en 96-brønners dyp brønn blokk med risting ved 200 rpm i en 2,5 cm orbital shaker.
  5. Inokulere NZY media15 (supplert med 0,05% glukose, 2% laktose og 100 g / ml karbenicillin) med en 1:40 fortynning av denne kulturen, deretter rystes i 6-8 timer ved 30 ° C og 200 rpm i en 2,5 cm orbital shaker.
  6. Pellet bakterier og rense antigene proteiner i høy gjennomstrømning i en 96-brønners filterplate inneholdende 100 ul av Ni-NTA-harpiks som pr tidligere publisert protocols16,17.
  7. Bestemme konsentrasjonen av rensede proteiner ved Bradford fargebindings assay18 og karakter for størrelse og renhet ved separering og visualisering av 10-50 ug med Coomassie flekk på en SDS-PAGE-gel (se figur 2).
    NB: I denne fasen proteiner kan bli ytterligere karakterisert ved hjelp av metoder som vurderer proteinaggregering 19 20 avhengig av naturen av antigenet, og kravene til det merkede rør.

2. Utarbeidelse og Titrering av fagbibliotek

  1. Plukke en enkelt koloni av T1 fag-resistente E. coli-celler i 1 ml 2YT medier supplert med 50 ug / ml tetracyklin.
  2. Når celleveksten blir visuelt etablert, fortynne kulturen i et større volum av 2YT supplert med 50 ug / ml tetracyklin for å sikre et tilstrekkelig volum av celler for infeksjon (vanligvis 45 ul per bibliotek fortynning, se nedenfor.).
  3. Klargjør bibliotek for bruk ved utfelling av fag fra lagringsbuffer med 1 / femte volum av autoklaveres 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCl) inkubering på is i 30 min og pelletering utfelt fagen ved sentrifugering ved 12.000 x g.
  4. Kast supernatanten og resuspender utfelt fagen i et passende volum av 1 x PBS pH 7,4, 0,2% BSA og 0,05% Tween (PBT), justering to en hensiktsmessig fag-konsentrasjonen for valg (om nødvendig) for å sikre tilstrekkelig bibliotek dekning. Se trinn 2.9 og diskusjon.
  5. Fortynne en 5 pl fag delmengde i 45 mL av 1x PBS pH 7,4 i et sterilt multi-brønn plate, mikse og lage en serie med 10 gangers fortynning i samme buffer.
  6. Tilsett 5 ul av hver fortynning til 45 fag ul T1 fag-resistente E. coli-celler i log-fase vekst (OD 600 = 0,4 til 0,8) i en annen plate for flere brønner, dekk med en pustende tetning og inkuber ved 37 ° C med rysting ved 200 rpm i 30 minutter i en 2,5 cm orbital shaker.
  7. Plate 5 ul av infiserte celler fra hver av brønnene på en forvarmet agarplate supplert med 100 ug / ml carbenicillin og vokse O / N ved 37 ° C inntil kolonier er synlige.
  8. Beregn det totale fag / ml som følger:
    Fag / ml = antall kolonier på en carbenicillin plate i den mest fortynne prøven x 200 x 10 i (hvor i = maksimal number fortynninger der kolonier er tilsynelatende).
  9. Å bestemme antall belagte antigen brønner for å sikre dekning av biblioteket mangfold, beregne som følger:
    Antall belagte antigen brønner nødvendig =
    Ønsket fold dekning * bibliotek mangfold
    # Av fag per 100 mL

3. Antistoff Utvalg fra fag-vises biblioteker

3.1) Antigen Immobilisering

  1. For å unngå fryse-tine sykluser som kan påvirke antigen kvalitet og for å lette fortynninger, forberede et lager antigen protein plate normalisert 100x arbeider konsentrasjoner (f.eks 500 g / ml) og alikvote i å uforpliktende 96-brønners plater.
  2. Forberede antigen-belagte plater fra lager proteinløsninger én dag før hver runde av valg ved å fortynne fra lager plater med PBS.
  3. Coat 96-brønners høy proteinbindings isopor plater med 100 mL av GST-merket antigen protein eller negativ kontroll protein (GST, BSA, neutravidin, etc.) ved 5 ug / ml i PBS. Riste på 250 rpm 4 ° CO / N på en mikroplaterister.
  4. Fjerne proteinoppløsning fra det belagte mikroplater, blokker antigen-belagte og negative seleksjons plater med 200 ul blokkeringsbuffer (0,2% BSA i 1 x PBS, pH 7,4) og riste ved 250 opm ved romtemperatur i 1-2 timer.
  5. Etter blokkering, vaske de blokkerte protein-belagte plater fire ganger med 200 ul 1x PBS pH 7,4 med 0,05% Tween (PT) buffer enten manuelt eller ved hjelp av en automatisert mikrotiterplatevasker.

3.2) Bibliotek Pre-clearance og Antigen-fag Inkubasjon

  1. Utarme bibliotek av ikke- (eller tag-) spesifikke bindings fag-displayed antistoffragment kloner via overføring på 100 ul (10 12) av fag-forberedt fagbibliotek i PBT-buffer til et antall brønner belagt med negativ kontroll protein eller fri affinitetsmerkelapp protein (f.eks GST) tilsvarer antallet av mål og inkuber fageni brønner i 1-2 timer ved romtemperatur med risting ved 250 rpm.
    MERK: Som en alternativ eller ytterligere middel for negativ seleksjon, inkubering kan også utføres i nærvær av et overskudd (5-25 pM) oppløselig protein affinitetsmerkelapp (f.eks GST) for ytterligere å fjerne tag-bindende kloner og øke utvinningen av bestemt mål bindende kloner.
  2. Overføring fag supernatanten fra negativ seleksjon til antigen-belagte plater og inkuberes i 1-2 timer ved romtemperatur med risting ved 250 rpm for fangst av spesifikke bindende kloner.
  3. Fjern ubundet fag og vaske brønnene av mikroplate 8-15 ganger med PT-buffer, enten manuelt eller ved hjelp av en mikroplatevasker. Fjern overflødig vaskebuffer like før eluering.

3.3) Elueringen, Infeksjon og Phage Amplification

  1. Tidlig på dagen for valg, plukke en enkelt koloni av T1 fag-resistente E. coli-celler i 1 ml 2YT medier supplert med 50 ug / ml tetracyklin og vokser ved 37 ° C with rysting ved 200 rpm i en 2,5 cm orbital shaker eller tilsvarende.
  2. Når cellevekst er etablert og kan sees av øyet, øke volumet av mediet med 2YT supplert med 50 ug / ml tetracyklin for å sikre et tilstrekkelig volum av celler for infeksjon (som regel 100 ul pr alternativ brønn).
  3. Dyrke cellene til en OD 600 på 0,4 til 0,8 er nådd (ca. 5-7 timer), og deretter å eluere bundet fage tilsett 100 ul av celler til den vaskede antigen plate og rist ved 37 ° C i 30 min.
  4. Legg M13K07 hjelper-fagen til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10 10 cfu / ml og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter med risting ved 200 rpm.
  5. Overfør cellene til 1,2 ml 2YT supplert med 150 ug / ml karbenicillin og 75 ug / ml kanamycin i en 96-brønners dyp brønn blokk med V-bunn og vokse O / N ved 37 ° C med rysting ved 200 rpm i en 2,5 cm orbitalrister.

3.4) Fag Forberedelse og Gjentatte Helg Selecsjon

  1. Pellet bakterier ved sentrifugering ved 4000 xg i 15 min ved 4 ° C.
  2. Bland like mengder av fag-supernatanter fra duplikate plater i en mini-røret 96-brønns mikroplate steril blå boks, nøytraliser med 1/10 volum av 10X PBT og bland. Gjenta runder med valg (fra Trinn 3.1.1) i 3-4 runder eller til berikelse er observert (se Avsnitt 4. og 7.) sammenlignet med negativ kontroll protein.
    MERK: I de tidlige rundene av utvalget når betydelige / påviselig berikelse er ikke forventet (dvs. runder 1 og 2), kan kvantifisering av inngangs- og utgangs fag titre (beskrevet i kapittel 7 og representative resultatene vist i Figur 3) være nyttig for å sikre minimums fag konsentrasjoner for vellykkede valg (beskrevet i diskusjon) og er mer hensiktsmessig enn sammenslåtte ELISA.

4. Karakterisering av Pooled ELISA

  1. Coat 96-vel høyt protein-binding isopor plater med 100 mL av GST-merket antigen protein eller negativ kontroll protein (GST, BSA, neutravidin etc.) på 2 mikrogram / ml som per punkt 3.1 og rist ved 4 ° CO / N.
  2. Fjern overskudd av antigen, blokkere platen med 200 ul blokkeringsbuffer med risting i 1-2 timer ved romtemperatur ved 250 rpm i en mikroplaterister og vask fire ganger med 200 ul PT-buffer, enten for hånd eller ved automatisk platevasker.
  3. Anvende 100 ul av fag-supernatanten (fortynnet 1: 10-1: 20 i PBT-buffer), riste ved 250 opm i 15 min ved RT, og platen vaskes åtte ganger med 200 ul PT-buffer.
  4. Tilsett 100 mL av anti-M13-HRP (1: 5000 i PBT buffer). Riste ved 200 opm i 30 minutter ved romtemperatur, deretter platen vaskes seks ganger med 200 ul PT-buffer og to ganger med 200 ul PBS.
  5. Anvende 100 ul av 1: 1 TMB-substrat og utvikle etter 5-15 minutter (eller inntil en vesentlig farge utviklet), og deretter stanse reaksjonen ved tilsetning av 100 ul av en 3 MH 4 og lese platen på 450 nm.
  6. Generelt kan anrikning i fag-bassenger holdes i 3-4 runder som forholdet mellom spesifikk binding versus ikke-spesifikk binding av> 2 (se figur 4)
    NB: Det er rikt å merke seg at høy absolutt bindingssignalet på affinitetsmerkelapp protein angir anriking av tag-spesifikke bindemidler (i stedet for mål- bindemidler), og at høy absolutt bindingssignalet på den negative kontroll protein indikerer anrikning av ikke-spesifikk eller " sticky "permer.

5. Clone Selection, Sequencing og karakterisering

5.1) Isolering av enkelt Fab-fagkloner

  1. Å isolere enkelte kloner for sekvensering og karakterisering, infisere 1/10 volum av den forsterkede fag bassenget i å T1 fag-resistente E. coli-celler i logaritmisk vekstfase (OD 600 = 0,4 til 0,8) i en rundbunnet mikrotiterplate dekket med en Breathabare plate tetning og inkuber med risting ved 200 rpm i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Forberede 10-fold seriefortynninger i 2YT media og plate ut på separate agar plater supplert med 100 g / ml carbenicillin.
  3. Pick enkeltkolonier i 450 ul av 2YT / carb media supplert med 1 x 10 9 M13K07 fag / ml og vokse O / N i en mini-røret 96 godt steril mikroplate blå boksen inkubering ved 37 ° C med risting ved 200 rpm.
  4. Pellet bakterier ved å spinne ved 4000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  5. Klonal fag-supernatanten kan brukes for sekvensering av Fab-fag-kloner (som beskrevet i avsnitt 5.4) eller for klonal direkte bindende ELISA for å bestemme spesifisiteten mot immobiliserte antigener (som beskrevet i avsnitt 5.3 og 21) hvor det representative resultater er vist i figur 5.

5.2) Uttrykk for Fab kloner for karakterisering

  1. Etter kloning inn i en passende eXpression vektor (se diskusjon), plukke enkelt E. coli kolonier transformert med ekspresjonskonstruksjoner inn i 1 ml 2YT / karbo media i en 96-brønners dyp-brønners plate ved anvendelse av en steril tannpirker eller pipettespissen og vokse i 12-16 timer ved 37 ° C med risting ved 200 rpm. Dette kan gjøres enten manuelt eller med en automatisert koloni velgeren.
  2. Overføring 40 ul voksende kultur i 1,5 ml NZY medier supplert med glukose / laktose / glycerol i en 96-brønners Deepwell blokk i henhold til metoden av Studier et al. 15
    MERK: Alternativt, kan cellene dyrkes i 3-4 timer (OD 0,8-1,0) i ikke-supplert og protein ekspresjon indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG.
  3. Dekk kultur blokken (e) med en pustende tetning og uttrykke Fab-kloner for 6-8 timer ved 30 ° C med risting ved 200 rpm. Ring plater ved 4000 xg i 15 minutter for å pelletere bakterieceller, fjern supernatanten, dekkplater med en folie tetning og fryse pellets ved -20 ° C inntil lyse.
  4. Frigjøre Fab-fragmentene som blir uttrykt fra oppsamlede pelleter med 100 ul lyseringsbuffer (Tris-HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100, pH 8,0 med 1 mg / ml lysozym og 10 U benzonase / ml kultur og proteaseinhibitorer) og risting i 2 time ved 4 ° C.
  5. Fjerne celleavfall ved sentrifugering ved 4000 xg i 15 min ved 4 ° C og samle rått lysat supernatant for bruk i innledende karakterisering av spesifisitet ved ELISA-plater (se avsnitt 5.3).

5.3) Clone Karakterisering av Direct Binding Klonal Fab ELISA

  1. Immobilisere antigener som beskrevet i avsnitt 3.1 i stedet aliquotting 30 pl 2 pg / ml antigen i PBS til brønner i en 384 brønns plate. Quad-baserte antigen oppsett i platen kan lette reagens overføring når du bruker 96 kanalbaserte dispenserer hoder. Vask og blokkere ELISA-plater som per punkt 3.1.
  2. Slettet lysates samlet inn fra Avsnitt 5.2 kan brukes direkte til immobilisert antigen for evarings av bindende. Inkuber 30 ul lysat per brønn i 15 min ved RT med risting ved 200 rpm.
    MERK: Renset Fab-klon protein kan vekselvis anvendes ved fortynning til 10 ug / ml i PBT-buffer og anvendelse av 30 ul av hver klon til blokkerte brønner inneholdende antigen eller negativt kontrollprotein (GST, BSA etc.) og å utvikle på samme måte som beskrevet nedenfor. Alternativt kan Fab-fagen også benyttes ved å fortynne 10 pl fag-supernatanten (beskrevet i avsnitt 5.1) i 20 ul PBT-buffer (1: 3) og påvisning med anti-M13-HRP-antistoff (beskrevet i trinn 4.4 til 4.5)
  3. Fjern overflødig lysat og vaske brønner enten manuelt eller ved hjelp av en automatisert plate vasket 8x med 100 mL av PT buffer og fjerne overflødig buffer.
  4. Inkuber i 30 pl av en 1: 5000 fortynning av sekundær anti-FLAG-antistoff i PBT-buffer i 30 minutter ved romtemperatur med risting ved 200 rpm.
  5. Vask, utvikle og kvantifisere som per §§ 04.03 til 04.05.
    MERK: Representative resultaterillustrerer både spesifikke og ikke-spesifikke bindings kloner er vist i figur 5.

5.4) Clone Sekvense

  1. Forberede en PCR mester blanding som angitt i tabell 2.
  2. Tilsett 2 ul av den passende PCR-templat (enten fag-supernatanten eller re-suspendert enkelt fagmid-inneholdende bakteriekoloni) til 20 ul av PCR masterblanding fremstilt med de egnede primere i brønner i en PCR-plate.
    MERK: Separate Master Mix er nødvendig for sekvensering av både de tunge og lette kjedegener.
  3. Kjør PCR reaksjon ved hjelp av parametrene som er oppført i Tabell 2 - PCR innstillinger.
  4. Kontroller suksess for PCR-reaksjonen ved å blande 5 pl av den fullførte omsetning med laste fargestoff på en 1% agarosegel supplert med DNA visualisering flekken og avbildning på en 300 nm transilluminator.
  5. Tilsett 2 pl av PCR-produktet til 10 pl sterilt vann inneholdende 0,2; Ul hver av eksonuklease og reker alkalisk fosfatase og inkuber ved 37 ° C i 20 min, etterfulgt av enzyminaktivering ved 80 ° C i 10 minutter for å fjerne overskudd av primere som forberedelse for sekvensering.

6. Skalering for Automated Selections

6.1) Pipette-basert Væskehåndtering

  1. Tilbered en 1% (w / v) bromfenolblått i vann og fjerne uoppløselige partikler ved anvendelse av en 0,45 ml filter.
  2. For å bestemme den lineære området av absorbans på plate-leser, fremstille en 1: 1000 fortynning av 1% bromfenolblått-oppløsning i vann, og videre med to-gangers seriefortynninger (16 fortynninger totalt).
  3. Overfør 100 ul av hver fortynning til en flatbunnet 96-brønners plate og lese absorbansen ved 590 nm. Plot absolutt absorbans mot fortynningsfaktoren og velge en fortynning på midten av høye enden av lineære området for etterfølgende tester.
  4. Legg bromfenolblått til vann eller til den faktiske løsningensom vil bli pipettert basert på fortynning velges i foregående trinn i tilstrekkelig volum for pipettering til tre 96 brønns plater, pluss dødvolumet i reservoaret.
  5. Kalibrere en enkelt-kanals pipette for å levere testvolumet ved å pipettere vann på en analytisk vekt (100 ul vann veier 100 mg ved RT).
  6. Ved hjelp av den kalibrerte pipetten, overfører testvolumet av det fargede løsningen til minst tre brønner i en flatbunnet 96-brønners plate og lese sine absorbanser ved 590 nm, i tre eksemplarer.
  7. Veie tre tomme flatbunnede 96 brønners plater på en analytisk balanse og registrere sine massene.
  8. Pipetter testvolum fra reservoaret til hver av tre 96-brønners plater og måle deres absorbanser ved 590 nm, i tre eksemplarer.
  9. Veie hver plate, og beregning av differansen i massen.
  10. Først må vurdere om absorbansene i hver brønn er ensartet innenfor toleranseområdet (f.eks., +/- 5%), og om de er forenlige med the absorbansene innhentet av hånd pipettering med kalibrert pipetman. Dersom spesielle kanaler er konsekvent over- eller under levere (for eksempel se figur 6), følger reparasjonsprosedyrer og gjenta evalueringen prosedyren til alle kanaler levere ensartede volumer.
  11. For det andre, når alle kanalene er bekreftet å levere ensartede volumer, sjekke nøyaktigheten av at volumet ved å beregne den gjennomsnittlige masse forskjell, per brønn. For eksempel vil en perfekt kalibrert væskebehandler satt til 100 ul gi 9,60 g vann per plate, eller 0,10 g vann per brønn. Dersom den virkelige volumet levert er konsekvent over eller under den tiltenkte volumet, deretter en korreksjonsfaktor kan brukes, dvs. programmering 110 mikroliter for å faktisk levere 100 mL.
    NB: For små volumer, for eksempel, 10 ul, bruker ti ganger mer bromfenolblått i det fargede løsningen, og pre-delmengde 90 pl vann til de 96-brønners plater for hånd, for å sikre at absorbances er målbare og fall i den lineære området.

6.2) Automatisert Plate Vaske

  1. Immobilisere positiv målet og negative kontrollproteiner i separate brønner i 96-brønners mikroplater (to plater for hver tilstand som skal testes), som beskrevet i avsnitt 3.1.
  2. Blokkere ikke-spesifikke bindingssteder ved inkubering med blokkeringsløsning i en time ved RT.
  3. Legg identiske 100 ul porsjoner av en 10 13 cfu / ml target-bindende Fab-fag-oppløsning i PBT til alle brønner i alle plater og inkuberes med forsiktig omrøring ved RT i 2 timer.
  4. Vask to plater i henhold til hver tilstand, en plate for infeksjon og titrering og en plate for ELISA.
  5. Evaluere effekten av vaske ved direkte smitte inn bakterier og titrering (som beskrevet i punkt 3.3 (uten M13K07 tillegg) og 7.2.1) eller utvikling med anti-M13 HRP-antistoff og kolo substrat (som beskrevet i punkt 4).
  6. Fag titre from spesifikke kloner vil ofte gi i området fra 10 5 -10 7 fag / ml av en immobilisert protein mot hvilken klon binder spesifikt. Noe gjenværende binding til negativt kontrollprotein (f.eks BSA) er å forvente, og generelt 10 2 -10 5 fag / ml observeres imidlertid svært lave titere (dvs., <10 1) kan signal altfor strenge vasking, som kan kompromittere et utvalg.
  7. For fag-binding bestemmes ved hjelp av ELISA, sammenligne absolutte bindingssignaler for positive og negative kontrollproteiner for å bestemme om robot vasking tilsvarer etablerte hånd vaskeresultatet (Figur 7).

6.3) Plate Washer dekontaminering

  1. For å starte, kjøre dekontaminering protokollen som skal testes.
    MERK: Vi anbefaler at du bruker minst dobbelt total linje volum, og prime og suge vaskemaskinen hodet i 5 min i 0,5% natriumhypokloritt, fersk utvannet from kommersielt blekemiddel (vanligvis 6% natrium hypokloritt).
  2. Prime og suge vaskemaskinen hodet i 5 min i sterile (autoklaveres) vann, og til slutt, prime systemet til linjene er fulle av luft.
  3. Prime linjene med sterilt vann eller vaskebuffer.
  4. Vaske en steril 96 brønns mikro gang, fjern fra vaskemaskin og forsegle med sterilt plate segl. Dette er den pre-forurensningskontroll plate.
  5. Alikvoter 100 ul O / N amplifiserte fag-kultur supernatanten til alle brønner i en 96-brønners plate.
  6. Vask fagen inneholdende plate en gang, deretter fjerne fra vaskemaskin og forsegle med en plast eller folie plate segl. Dette er forurensningskontroll plate.
  7. Utføre dekontaminering protokollen blir testet. I dette eksempelet, gjenta trinn 6.3.1 og 6.3.2.
  8. Vask steril mikro en gang, deretter fjerne fra vaskemaskin og segl. Dette er dekontaminering testplaten.
  9. Plate 50 mL av logfase E. coli til titrering plater; Dette er den pre-Infecsjon kontroll plate.
  10. Unseal pre-forurensning, forurensning og dekontaminering 96-brønners plater og tilsett 100 mL av E. coli i log-fase vekstfase til alle brønnene, ved hjelp av nye tips for hver brønn.
  11. Forsegl og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter ved 200 rpm.
  12. Plate 50 ul av infiserte celler fra tre tilfeldige brønner for hver 96-brønners plate i 10 cm 2YT / carb plater og inkuberes ved 37 ° CO / N.
  13. Overføring 50 ul av infiserte celler fra alle brønner av hver plate til dype brønnplater inneholdende 1 ml 2YT pluss 100 g / ml karbenicillin per brønn og vokse O / N ved 37 ° C.
  14. Gjenta dekontaminering protokollen og la vaskemaskinen linjer tørke.
    MERK: Nei O / N vekst på tallerkener eller i flytende medium bør observeres på pre-infeksjonskontroll, pre-forurensning kontroll eller dekontaminering prøveplater. Mange kolonier og vekst bør observeres på forurensningskontroll plate; Hvis ikke, kan ingen konklusjoner om effekten avdekontaminering protokollen kan gjøres. Ideelt sett vil dekontaminerings platene ga ingen kolonier og ingen O / N vekst i noen av brønnene i O / N platene. Skjerpe inn dekontaminering protokollen kan økes med høyere blekemiddel konsentrasjoner lenger suge tider og tilleggssykluser.

7. Input / Output Titreringer

7.1) Input Fag Titreringer

  1. Fortynn en 5 ul delmengde av fagen til 50 ul med sterilfiltrert PBS og bland.
  2. Forberede serie 10 ganger fortynning i sterilfiltrert PBS til 10 10 ved hjelp av multi-kanals pipette eller en 96 kanal pipettor.
  3. Vaksinere 5 mL fortynnet fag i 45 mL av T1 fag-resistente E. coli-celler i log-vekstfase (OD 0,6-0,8) og inkuber dekket med et pustende tetning i 30 minutter ved 37 ° C.
  4. Plate 5 ul av infiserte celler på en LB / agarplate supplert med 100 ug / ml carbenicillin og inkuberes O / N-ent 37 ° C.
  5. Fagen konsentrasjon kan estimeres fra de mest fortynnet prøve hvor vises kolonier ifølge beregningene er beskrevet i punkt 2.8.

7.2) Utgangs Fag Pitrations

  1. Etter eluering av plate-bundet fag ved tilsetning av E. coli-celler, fortynne en 5 ul delmengde av fag-infiserte celler i 50 pl med autoklaverte medier 2YT
  2. Forbered serie 10-gangers fortynning i 2YT autoklaverte medier til 10 6 ved hjelp av en flerkanals pipette eller 96 kanal pipette.
  3. Plate 5 ul av infiserte celler på en agarplate supplert med 100 ug / ml carbenicillin og inkuber O / N ved 37 ° C.
  4. Fagen konsentrasjon kan estimeres fra de mest fortynnet prøve hvor vises kolonier ifølge beregningene er beskrevet i punkt 2.8.
    MERK: I begge tilfeller (dvs., inngang og utgang fag titre sammenligning med koloni tall på både tetracyklin (totalt cell nummer) og kanamycin (helper fag titer) kan også være informativ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokoll som er beskrevet her har blitt brukt for å isolere antistoff-fragmenter til et utvalg av både structurally- og funksjonelt relaterte antigen domener fra kombinatoriske fag-displayed Fab-biblioteker i parallell. Problemer knyttet til antigen tilgjengelighet kan omgås, i mange tilfeller, ved in silico identifisering av uttrykkbare antigen domener som er egnet for antistoff valget 23. Ved kobling av antigenet til antistoffet ekspresjon valg innenfor samme laboratorium (figur 1) blir det mulig å konstruere en integrert rørledning, hvori antigen kritiske parametre for valg kan lettere kontrolleres. I de fleste tilfeller vil imidlertid bestemmelse av domenegrenser muliggjør ekspresjon og isolering av tilstrekkelige mengder tilstrekkelig rent antigen fra high-throughput-ekspresjon i 96 eller 24 godt Deepwell plater (figur 2) for en vellykket anvendelse i antistoff valg. Under påfølgenderunder av utvelgelsesprosessen, kan eluerte fag-konsentrasjoner og anrikning av fag som spesifikt binder antigen overvåkes ved enten fag-titrering (figur 3) eller med fag-bassenger i en ELISA-analyse (figur 4). En bindingsgrad (> 2) angir generelt tilstedeværelse av spesifikke bindende kloner. Omvendt kan en lav ratio (<2) bidra til å finne årsaken til et utvalg fiasko. For eksempel kan en ratio <2 med høy uspesifikk OD indikere utilstrekkelig fjerning av ikke-spesifikke kloner (eller klissete permer) og kan tilsi ytterligere optimalisering av utvalget protokollen. Likevel, når anrikning detekteres, individuelle høyaffinitet kloner kan så isoleres for sekvensering og karakterisering. Klon binding kan karakterisert ved en kolorimetrisk immunoassay og muliggjør sammenligning av binding av Fab-fagen eller Fab til immobiliserte antigen versus negative kontrollprotein, noe som ga et mål for anrikning (forholdet mellom binding til TArget versus negativ kontroll protein eller affinitetsmerkelapp protein) (figur 5).

Under skalering og automatisering av denne metoden, kan vurdering av sentrale funksjoner i flytende aggregat være nyttig for å sikre korrekt og presis funksjon med løsninger som ligner de som brukes under faktiske valgene. Bruken av absorberende kromoforer i løsninger kan bidra til å oppdage når bestemte kanaler i fluidumskretser (aspirasjonskrav eller dispense) er enten tett eller har mistet segl som resulterer i delvolum levering som vist i Figur 6. Automatiserte Vask enhetene kan også være en kilde til variasjon og kan kreve oppmerksomhet. Bruken av kjente binde kloner muliggjør sammenligning av binding mellom target-kontroll-protein for å sikre at målet binding opprettholdes mens bakgrunnsbinding fjernet (figur 7) når vaske parametere som utleveringshastighet, vaskevolum og antallet vaskinger blir optimalisert. Følgendebruk av en automatisert platevasker med fag løsninger, effektive dekontaminering protokoller er nødvendige for å sikre fravær av krysskontaminering fra påfølgende runder med valg eller ulike utvelgelsesprosedyrer og en feilsøking / tolkning guide er gitt i tabell 3.

Figur 1
Figur 1. Oversikt -. High-throughput-antigen produksjon og antistoff valg rørledning Denne oversikt viser en trinn-for-trinn-visualisering av en representativ antigen og antistoffgenerering valg rørledningen. Den in silico identifisering av antigen domenenavn grenser gjør at genet syntese, uttrykk og utvalg på domener for proteiner som kan være dårlig preget. Uttrykt antigen domener er immobilisert og brukes til å isolere bassenger av spesifikke høy affinitet antistoff kloner fra en combinatorial antistoffbibliotek fremvist på overflaten av filamentøse fage. Bassenger av antistoff-fage eluert og amplifisert fra individuelle antigener kan deretter brukes til å overvåke runde til runde anrikning av spesifikke bindings kloner i ELISA-baserte analyser sammenligne immobiliserte mål i forhold til negativ kontroll protein før isolering av individuelle bindende kloner for karakterisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. SDS-PAGE visualisering av affinitet-merket antigener. En representant SDS-PAGE av uttrykte og rensede 6X-HIS-GST-merket antigen domener (5-10 kDa domene + 26 kDa GST) opprinnelig identifisert av i silico analyse av antigen domenenavn grenser. Proteindomener uttrykt og isolert av Affinity rensing er preget av SDS-PAGE før valg for å sikre størrelse baserte identitet, tilstrekkelig avkastning og renhet for å muliggjøre bruk i fag-antistoff valg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Visualisering av fag utgangs titre. Fag-utgangs titere blir bestemt ved utsåing av celler infisert med fag over en 10-gangers fortynningsserie på agar-mediet supplert med forskjellige antibiotika (tetracyklin, carbenicillin og kanamycin) for å bestemme den laveste fortynning som kolonier kan observeres og beregne antall fag bundet til å målrette antigen og eluert. Klikk her for å se en storr versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4. Binding forhold av målet til negative kontrollprotein ved sammenslått ELISA. Fremdriften av anrikning kan evalueres følgende runder med utvelgelse ved screening av individuelle forsterkede elueringsmidler mot begge de spesifikke mål og negative kontrollproteiner og / eller isolert affinitetsmerkelapp. Vist i plottet er de berikelse forholdstall for binding av 96 individuelle fag-antistoff bassenger mot sine 96 respektive antigener versus negativ kontroll protein parallelt. Hver forholdsverdi er avledet fra to absorbansmålinger som kvantifisere binding av fagen bassenget til enten målet eller negativ kontroll-protein ved hjelp av et HRP-kondensert antistoff spesifikt for M13-fag-kappeproteinet. Et forhold terskel på 2 eller høyere (ofte fra 2-10 eller mer, som vist i rødt) blir brukt som en indikasjon på anrikningog den sannsynlige tilstedeværelsen av spesifikke bindende kloner. Lesser forholdstall kan bety svikt eller spesifikke problemer med utvalget som kan rettferdiggjøre ytterligere optimalisering av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Direkte binding klonale Fab-fag-Fab eller ELISA. Bindingen av enkle kloner (enten i Fab-fagen eller Fab-format) kan bli evaluert ved hjelp av ELISA-basert assay versus immobilisert protein i 384-brønners plater. Binding er oppdaget ved hjelp av en sekundær HRP-smeltet antistoff mot M13 frakk protein på Fab-fag eller et affinitetsmerkelapp på Fab. Rå absorbansverdier for binding av klonal Fab-fag å målrette antigen, negativ kontroll protein og antigenaffinitet tag (GST) er avbildet som illustrerer bestemt binders (A01, A04, A06), og klissete bindemidler (A05).

Figur 6
Figur 6. Evaluering av utleverte volumer av automatiserte flytende aggregat. Konsekvent og nøyaktig levering av beregnet volum av robot eller manuelle 96-brønners pipetteringssykluser systemer kan evalueres ved hjelp av farget løsninger og en plateleser. I dette eksempel er 10 ul av en oppløsning inneholdende bromfenolblått pipettert sekvensielt til alle brønnene i to 96-brønners plater ved bruk av en enkelt spiss boks. Hver brønn inneholder 90 ul / brønn dH 2 O, analogt med tilsetningen av hjelper-fag-infiserte E. coli. Hver plate er absorbanser ved 590 nm blir lest i triplikat, og volumene er interpolert fra en standardkurve fremstilt ved anvendelse av en kalibrert enkelt kanal pipetman. Volumer levert til en enkelt rad på den første og andre plate er vist. Legg merke til at på first plate, vel E04 mottar ingen farget løsning, og på den andre plate, mottar det et dobbelt volum. Dette indikerer at tuppen kontakten ikke er tilstrekkelig for konsistent levering, og krever ytterligere optimalisering. 95% konfidensintervall for tre eksemplarer absorbansmålinger vises.

Figur 7
Figur 7. Evaluering av automatisert plate vasking. Effektiv fjerning av ubundet fag kan vurderes ved hjelp av en ELISA for å måle Fab-fag-binding til immobilisert positive (anti-FLAG-antistoff) og negative (BSA) reguleringsproteinene samtidig å variere vaskebetingelser. I dette eksempel er inngangs fagen analog med naivt bibliotek (10 13 cfu / ml i PBT) fjernes ved hjelp av åtte eller seksten vaskinger, for hånd eller ved hjelp av roboten. Rest fag binding til BSA er de samme i alle forhold, som er spesifikk binding til immobilisert anti-FLAG antistoff, indiskating at på dette lav strømningshastighet, begge metodene er likeverdige og tilstrekkelig strenge. 95% konfidensintervall fra to brønner er vist.

LØSNINGER
2YT media - Tilsett vann til en L, justere pH til 7,0, og autoklav. gjærekstrakt 10 g
trypton 16 g
NaCl 5 g
NZY media (1 L) NZ Amine 10 g
gjærekstrakt 5 g
50X zym-5052 20 ml
20 salt lager 50 ml
50x zym-5052 sukker lager (1 L) glukose 25 g
laktose 100 g
glyserol 250 ml
20x salt lager (1 L) Na 2 HPO 4 500 mM
KH 2 PO 4 500 mM
NH4CI 1 M
Na 2 SO 4 100 mM
Carbenicillin (Carb): 100 mg / ml i vann. Filter-sterilisere.
Kanamycin (Kan): 25 mg / ml i vann. Filter-sterilisere.
Tetracyklin (Tet): 10 mg / ml i vann. Filter sterilisere.
PEG-NaCl PEG
NaCl 2,5 M
1x PBS (pH 7,2) NaCl 137 mM
KCl 3 mm
Na 2 HPO 4 8 mm
KH 2 PO 4 1,5 mm
1X KCM KCl 500 mM
CaCl2 150 mm
MgCl2 250 mm
SOC Media gjærekstrakt 5 g / l
trypton 20 g / l
NaCl 10 mm
KCl 2,5 mM
MgSO4 20 mm
Glukose 20 mm
Blokkeringsbuffer PBS 1x
BSA 0.20%
PBT buffer PBS 1x
BSA 0.20%
Tween 0,05%
PT buffer PBS 1x
Tween 0,05%
Fosforsyre H 3 P0 4 1 M

Tabell 1. Media og løsninger.

PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong>
Komponent ul pr reaksjon
Vann 19.45
10x Taq buffer 2,5
dNTPs (10 mM lager) 0,675
DMSO 0.75
Taq enzymet 0.125
Forward Primer (100 um lager) 0,25
Revers primer (100 um lager) 0,25
Heavy Chain sekvenseringsprimere
M13 Forward primer GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC
M13 Reverse primer CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA
Lys Chain sekvenseringsprimere
M13 Forward primer TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG
M13 Reverse primer CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG
PCR INNSTILLINGER
Trinn 1. 94 ° C i 3:00 min
Trinn 2. 94 ° C i 0:30 min
Trinn 3. 55 ° C i 0:30 min
Trinn 4. 72 ° C i 1:00 min
Tilbake til trinn 2 og gjenta 24x hoppe til trinn to
Trinn 5. 72 ° C i 7:00 min
Trinn 6.

Tabell 2. PCR Master Mix og innstillinger.

Tolkning av dekontaminering resultater
Tallerken Forventet carbenicillin titer Hvis ikke?
Pre-smittevern 0 Celler ble pre-smittet; intet kan konkluderes fra eksperimentet.
Forurensningskontroll plen Utilstrekkelig forurensning å kunne vurdere effekten av senere dekontaminering; vurdere senke manifolden i fag-oppløsning i stedet for å aspirere den.
Dekontaminering test 0 Dekontaminering ikke fullføre; øke suge tid, bleike konsensjon eller prøve SDS og EtOH vasker i stedet.

Tabell 3. Evaluering av skiven rensing. For å bestemme effekten av rensing, er det nødvendig å vise at skiven var forurenset med fag, og at dekontaminering protokollen hell eliminert som forurensning. Ved å bruke fag som bibringer carbenicillin motstand, blir de forventede resultater fra en slik test er oppført sammen med forslag skal det virkelige resultat forskjellig fra det forventede resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når du driver in vitro antistoff valg, de to viktigste faktorer som bestemmer valg suksess er 1) isolering av godt foldet antigene mål for valg på og 2) tilgjengeligheten av en høy funksjonell mangfold antistoff bibliotek. I mange tilfeller kan tilgjengeligheten av tilstrekkelige mengder av godt foldet, full-lengde protein være begrensende. En tilnærming for å overvinne denne begrensningen er å bruke domener identifisert fra bioinformatiske analyse 22 og syntetisert for innsetting i en bakteriell ekspresjonsvektor med en passende affinitetsmerkelapp.

Det finnes en rekke koder som brukes i bioteknologiske applikasjoner for å øke løseligheten, legge til rette for rensing og for å stabilisere ustabile domener. 11 Evnen til å syntetisere nesten alle ønsket innsats sekvens gjør en svært allsidig antigen generasjons plattform. Selv om GST-merket formatet er vanlig, har gode resultater vært tidligereoppnås ved hjelp av hexahistidine, Fc, halo, maltosebindende protein og spesifikke biotinylering koder, og det antas at utallige andre affinitet koder kan bli optimalisert for anvendelse i en tilsvarende plattform. Imidlertid kan affinitet tags ha både positive og utilsiktede negative konsekvenser i nedstrøms applikasjoner 11 og bør være grundig undersøkt før etablering av en rørledning basert på et bestemt format.

Ofte nye brukere vil stille spørsmålet om hvordan man skal vurdere kvaliteten av et antistoff bibliotek og om det er noe entydig svar, bør man prøve å vurdere flere viktige funksjoner (enten naturlig eller syntetisk), inkludert generelle mangfold, relative visningsnivåer, natur og graden av randomisering (dvs. bibliotek utforming versus bibliotek innholdet bestemt ved sekvensering), og de fysikalsk-kjemiske egenskapene til antistoffet versus tiltenkt applikasjon. Selv utenfor rammen av denne protokollen, en mer detaljert renseanleggnt av disse funksjonene og hvordan de kan påvirke valg av antistoffer kan bli funnet her 2,23. Kjennskap til biblioteket mangfold er særlig viktig å sikre tilstrekkelig dekning av mangfoldet under valg. Vanligvis er et fag konsentrasjon som gir 100-1000 eksemplarer av hver fagklon i biblioteket ønskelig og bør sikre at alle sanne positive permer stede i biblioteket kan gjenopprettes. Imidlertid kan ikke-spesifikk binding av fagen til mikroplate overflater øker dramatisk over 10 13 fag / ml, og for svært ulike biblioteker, kan mer enn en enkelt brønn per antigen være nødvendig for å sikre en tilstrekkelig dekning. På den annen side, hvis inngangs biblioteket blir for tynn, vil den absolutte konsentrasjon av sanne positive bindemidler være så langt under KD (typisk nM) at de ikke vil bli gjenopprettet. Gitt disse begrensningene, bør fagbiblioteker generelt resuspenderes til 12 til 13 oktober fag / ml for den første runden av valg.0; Ved denne konsentrasjonen, en 100 l aliquot av fag representerer en 1,000-100 gangers dekning av en 10 9 -10 10 mangfold bibliotek og kan rutinemessig gi bindende kloner til forskjellige antigener. Med lavere konsentrasjoner, eller økte forskjeller, kan det være nødvendig å øke antallet av brønner med antigen valgt mot i den første runden (se avsnitt 2.9). Etter en runde, men det meste av den ikke-bindende mangfold av biblioteket har blitt fjernet; skytende dekning av runden en utgang mangfold er oftest lett oppnåelig ved hjelp av en enkelt brønn. I tilfeller av parallelle valg i 96 brønners plater, kan dette redusere antall antigen seleksjonsplater som kreves for å bare ett, følgende til den første runden.

Under faktiske valgene, kan fag titrering tilby objektive mål å karakterisere og overvåke utviklingen, og samtidig bidra til å identifisere områder av bekymring spesielt i de tidlige rundene av valg der berikelse er ikke tilstrekkelig til åpåvises. Dette kan være spesielt nyttig under skalering av valg å bestemme protokollen ytelse. Generelt, innspill fag titre (dvs. naive bibliotek eller post-forsterkning av eluert fag) bør holde seg relativt konstant (10 12 -10 13 fag / ml) mellom rundene, med dårlig cellevekst / lav fag titre indikerer potensiell forurensning og / eller dårlig utgang fra forrige runde. Selv om produksjonen fag titrene forventes å øke i løpet av berikelse i senere runder av utvalget, er et utvalg av 10 3 -10 5 cfu / ml i de to første rundene forventet. Avvik fra dette området kan indikere potensielle problemer med utvalget som forurensning eller overflødig vask stringens. I senere runder med seleksjon (dvs. runder 3 og 4), kan berikelse av kloner som spesifikt bindes til målantigenet bli vurdert via sammenslåtte ELISA som måler binding av fagen bassenget mot både målantigen og negativekontroll protein (se kapittel 4).

Etter 3-4 runder med utvelgelse (eller når anrikning på målprotein har nådd et målantigen: negativ kontroll proteinsignal-forhold på 2: 1 eller høyere i forhold til bakgrunnen protein), er infiserte bakterieceller belagt for å isolere enkeltkolonier fagmidpartikler for sekvense , innledende karakterisering og kloning om nødvendig. På dette tidspunktet er det svært fornuftig å konvertere Fab-fag for å frigjøre Fab før ytterligere karakterisering. Selv Fab-fag kan brukes til innledende karakterisering ved å fortynne 10 mL av fag supernatant (beskrevet i kapittel 5.1) i 20 ul PBT buffer og oppdager med anti-M13-HRP antistoffer (beskrevet i trinn 4.4 til 4.5), i vår erfaring, bindeegenskaper kan endre seg vesentlig i alt fra 5-20% av kloner på frigjøring fra fagpartikkelen og tidlig konvertering kan overflødig problemer med falske positiver. Den spesifikke metoden som benyttes for konvertering vil avhenge av unique arkitektur av fagmidet, og dermed vil ikke bli behandlet her uttrykkelig. Imidlertid, i de mest benyttede vektorer, kan dette vanligvis oppnås ved 1) transformering av renset fagemid (eller fagmid pool) i en kompetent ikke-suppressor E. coli-stamme slik som HB2151 eller 55244 hvis en ravfarget stopper (TAG) kodon griper Fab og PIII protein, 2) innsetting av en ravfarget stoppkodon mellom Fab og PIII proteiner for å tillate ekspresjon av antistoff-fragmenter oppløselige i et ikke-suppressor-stamme eller 3) ved å klone immunglobulin-gener (fra individuelle fagemid eller fagmid pool) i en egnet ekspresjonsvektor. For ytterligere å effektivisere utvelgelse og karakterisering, kan sammenslåtte kloningsmetoder gir effektive midler for å konvertere bindende kloner en masse i å ekspresjonskonstruksjoner, både eliminerer muligheten for falske-positive binding av Fab-fagpartikler og hvor expression lysater blir brukt for tidlig karakterisering, selv kostnaden og innsats for rensingkan i utgangspunktet unngås.

For kloner isolert direkte fra biblioteket F (beskrevet i 24), kan antistoff-variable domener blir sekvensert ved anvendelse av 1-2 ul av fag-supernatanten som templat for PCR-amplifisere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) (se tabell 2 i Materialer for Library F rettede primere ). Ved anvendelse av disse primere, vil de tunge og lett-kjede variable områder gi produkter av ~ 700 og ~ 500 bp, respektivt dekker alle tre CDR. Primere inkluderer annealing nettsteder for M13 primere slik at produkter kan bli sekvensert etter opprydding (som beskrevet i avsnitt 5.4.5) ved hjelp av standard primere tilgjengelig i de fleste sekvensekjernefasiliteter. Vekselvis, for Fab-fag bassenger som har blitt klonet inn til et uttrykk vektor og transformert direkte til E. coli for ekspresjon, kan enkeltkolonier isoleres og resuspendert i 15 ul 2YT og 1-2 ul av cellesuspensjonen som brukes direkte som templat for enkelt colony PCR ved hjelp av egnede primere.

Automat valg vil kreve optimalisering og validering av flere viktige robotfunksjoner. Generelt må pipette baserte væskehåndtering være nøyaktig og konsekvent på tvers av alle 96 kanaler, må tallerken vaske fjerne ubundet fag effektivt uten stripping adsorbert antigen eller bundet Fab-fag fra utvalget plate. Effektiv dekontaminering av platen vaskemaskin er også nødvendig mellom rundene for å tillate berikelse og effektiv mot valg, og mellom påfølgende valg for å unngå krysskontaminering. Å bidra til å optimalisere høy gjennomstrømming utvelgelsesprosedyre, har enkle tilnærminger for å vurdere disse funksjonene blitt brukt tidligere, og er beskrevet nedenfor og detaljert i protokollen.

For å evaluere konsistensen av volum som leveres av alle kanaler i en væskeutleverende / aspirasjon hode, er en farget oppløsning pipetteres i en flatbunnet 96-brønners plate og absorbance i hver brønn målt på en plateleser. En kromofor som bromfenolblått er nyttig for farging løsninger som ligner på de som brukes for reelle valg for å evaluere effekten av ulike overflatespenning og samhold egenskaper på volumer levert. Etter å ha bekreftet at alle kanalene er dispense konsistente volumer, kan nøyaktigheten av den totale leverte volum bestemmes ved å måle massen av væske overført til hver plate.

Automatisering av platen vasking for å fjerne ubundet kloner primært krever optimalisering av den hastighet med hvilken vaskebuffer som skal dispenseres, og antall vaskinger som skal anvendes. En rimelig metode for å vurdere denne parameteren benytter positive kontroller (spesifikt Fab-fag-bindende kloner) for å vurdere effekten av å variere dispenseringshastigheten og / eller flere vaskinger for å fastslå hvorvidt 1) adsorbert antigen eller bundet fag blir fjernet ved altfor strenge vaske eller 2) ikke-spesifikk binding til ikke-beslektede proteiner er overdreven due å vaske forhold som ikke er tilstrekkelig strenge. Rest / bundet fag kan oppdages og kvantifiseres enten ved infeksjon i bakterier og plating for enkelt kimtall, eller ved ELISA bruke sekundære antistoffer spesifikke for antistoffaffiniteten tags eller fag kappeproteiner. Negative kontroller brukes for å vurdere gjenværende nivåer av ikke-bindende Fab-fagen til målproteiner eller spesifikt bindende Fab-fagen til ikke-beslektede / bakgrunns proteiner, som kan være høy hvis vasking ikke er tilstrekkelig strenge. I dette tilfelle brukte vi immobilisert BSA som en kontroll for ikke-spesifikk binding, og et anti-FLAG-antistoff som gjenkjenner en FLAG-epitop tag på Fab-fage som en positiv kontroll. Vi sammenlignet med åtte og seksten vaskesykluser ved hjelp av roboten versus vasking for hånd, ved en middels strømningshastighet, for å vise at disse teknikkene var ekvivalente. Vekselvis, måle input og output fag titre (se kapittel 7) under pågående valg kan også bidra til å gjøre finjusteringer i vaskeparametre. Endelig må dekontaminering av plateskiver som brukes for valg være effektiv for å eliminere overhenget av fag fra tidligere valg. I vår erfaring, fersk utvannet 0,5% natriumhypokloritt er rask, effektiv og billig. Detergenter slik som SDS er også effektive, men krever mye mer omfattende vasking for å fjerne fra systemet. Sjekk reagent kompatibilitet for systemet før noen tester. For å vurdere dekontaminering, vi teste for tilstedeværelse av gjenværende fagen Oppløsnings håndtert av den fluidics systemet og tolke resultatene i henhold til tabell 3.

Oppsummert gir denne protokollen en skalerbar fremgangsmåte for isolering av Fab-fragmenter fra kombinatoriske biblioteker ved parallell in vitro valg mot proteindomener og gir teknikker for validering av en automatisert fag-seleksjonssystemet. Kostnads- og infrastruktur barrierer som omfattende dyre anlegg kan utgjøre motvirkes siden denne metoden ikke rely ved immunisering av dyr. Videre, ved å integrere antigen generasjon med antistoff-fag seleksjon, kvalitetsfaktorer som påvirker valget suksess er lettere overvåkes og justeres. Når tidsrammen fra antigen uttrykk for å velge og innledende karakterisering er i størrelsesorden 6-8 uker, kan et mer responsivt system av produksjonen bli realisert. Antistoffer isolert fra in vitro valgene er også både enkelt endres (på grunn av genotype-fenotype linkage) og fornybar, krever bare lagret DNA av uttrykket konstruere å gjentatte ganger og reproduserbart re-generere antistoff. Endelig ved å vise at denne protokollen kan gjennomføres ved hjelp av enten en kvasi-manuell eller helautomatisk tilnærming som benytter en spesialdesignet, robot utvalg systemet, kan gjennomstrømningen være skalerbar og tilgjengelig for små akademiske og industrielle laboratorier likt.

Ved hjelp av high-throughput metodene beskrevet ovenfor, og biblioteket F syntetisk antistoff-bibliotek 24 in vitro - og in situ -expressed proteiner. Selv om suksess for et gitt valg vil avhenge både av den kvalitet (renhet, foldedness, mono-dispersitet etc.) av de antigen mål så vel som kvaliteten og mangfoldet av antistoff-bibliotek, er det blitt observert at alt 25-80 % av antigener vil gi bindemidler for en høy gjennomstrømning markering. Viktigere er det verdt å merke seg at kloner med evne til å modulere target funksjonen kan også ofte bli valgt. Dette bibliotek konstrueres ved å bruke et humant rammeverk, noe som gjør disse antistoffene mottagelig for potensiell terapeutisk program 25, således som understreker viktigheten av denne rørledning som en alternativ tilnærming for generering av affinitets-reagenser med bredverdi.

Oppsummert vil robusthet og allsidighet av tilnærmingen presenteres i denne protokollen fortsette å hjelpe i optimalisering, industrialisering og ultimate utbredt bruk av denne teknologien som et levedyktig middel for å oppnå det langsiktige målet om å skape tilhørighet reagenser til nesten alle medlemmer av den menneskelige proteom-.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke NIH felles fond - Protein oppbringelsesreagensene Program for å finansiere utviklingen av rekombinant antistoff Network antistoff utvalg og karakterisering rørledning og den kanadiske Foundation for innovasjon for finansiering kjøp av robot utvalg plattformen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker Eppendorf M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system Anachem Ltd LIQ-96-200
Microplate shaker VWR 12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge Thermo Product 75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer Biotek ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml VWR 21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml VWR 89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes Corning MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate Sigma M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block Corning 3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box Corning AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film VWR 60941-084
REAGENTS
Name Company Catalog Number
polyethylene glycol Bioshop PEG800.1
yeast extract Bioshop YEX401.1
bio-tryptone Bioshop TRP402.1
N-Z amine Sigma C7290
glucose Sigma G8270-1KG
lactose Bioshop LAC234
glycerol Bioshop GLY001.500
carbenicillin  Bioshop CAR544.10
kanamycin Bioshop KAN201.25
tetracycline  Bioshop TET701.25
Tween 20 Bioshop TWN510.500
monobasic potassium phophate Bioshop PPM302.1
dibasic sodium phosphate Anachemia 84486-440
sodium chloride Bioshop SOD001.10
potassium chloride Bioshop POC308.1
calcium chloride Bioshop CCL302.500
magnesium sulphate EMD MX0070-1
magnesium chloride Bioshop MAG510.500
NH4Cl Amresco 0621-1KG
Na2SO4 Bioshop SOS513.500
agar Bioshop AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain Invitrogen S33102
phosphoric acid Acros Organics 201140010
lysozyme Bioshop LYS702.25
benzonase Novagen 71205
Triton X-100 Bioshop TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets Roche 11 836 170 001
Ni-NTA resin  Qiagen 1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) NEB N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). GE Healthcare 27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate  KPL 50-76-00
dNTPs Biobasic DD0056
Taq polymerase Genscript E00007
Exonuclease GE Healthcare  EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase GE Healthcare E70092Z-EZ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
  4. Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
  5. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
  6. Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
  7. Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
  8. Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
  9. Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
  10. Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
  11. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
  12. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  13. Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
  14. Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
  16. Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
  17. McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
  18. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  19. den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
  20. Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
  21. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
  22. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
  23. Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
  24. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
  25. Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).

Tags

Immunologi bakterier virus aminosyrer peptider og proteiner nukleinsyrer nukleotider og Nucleosides Life Sciences (General) fagfremvisning syntetiske antistoffer høy gjennomstrømning antistoff utvalg skalerbar metodikk
Skalerbar høy gjennomstrømning Utvalg fra fag-vises Syntetiske antistoffbiblioteker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miersch, S., Li, Z., Hanna, R.,… More

Miersch, S., Li, Z., Hanna, R., McLaughlin, M. E., Hornsby, M., Matsuguchi, T., Paduch, M., Sääf, A., Wells, J., Koide, S., Kossiakoff, A., Sidhu, S. S. Scalable High Throughput Selection From Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries. J. Vis. Exp. (95), e51492, doi:10.3791/51492 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter