Summary
一种方法是描述视觉伴奏用于同时进行可扩展，高吞吐量选择从噬菌体展示的组合合成的抗体文库针对数百抗原。使用这种平行的方式，我们已经分离，表现出对于不同的抗原有功能在标准免疫高亲和力和特异性的抗体片段。
Abstract
为满足这两个基础和临床研究应用中的需要的抗体的需求很高，将在未来的显着增加。然而，显而易见的是传统的单克隆技术并不单单达此任务。这导致了替代方法的发展，以满足对高品质的和可再生的亲和性试剂与蛋白质的所有可访问的元素的需求。为此，高通量的方法用于进行从噬菌体展示的合成抗体文库的选择已经设计出用于涉及多种抗原的应用和快速的吞吐量和成功进行了优化。在这里，协议进行了详细的视频演示说明对数百使用手动96道液体处理器或自动机器人系统目标并行选择的Fab噬菌体克隆的高度多样性库描述。使用此协议，一个用户可以产生数百抗原，选择抗体，它们在并行和验证抗体6-8周内约束力。高亮是：i）一个可行的抗原格式，ⅱ）预选抗原的表征，ⅲ）影响的特异性和高亲和性的克隆的选择关键步骤，以及iv）监测选择有效性和早期抗体克隆的表征方法。使用这种方法，我们已获得的合成抗体片段（Fab的），以许多目标类包括单通膜受体，分泌蛋白激素，和多域的胞内蛋白。这些片段被容易地转化为全长抗体并且已经验证，以表现出高的亲和性和特异性。此外，它们已被证明是功能性的各种标准的免疫测定，包括Western印迹，ELISA，细胞免疫荧光，免疫沉淀和相关测定法。这种方法将加速抗体的发现，并最终使我们更接近实现目标Ø˚F产生可再生能源，高品质的抗体的蛋白质组。
Introduction
与后基因组时代的到来，高品质的结合试剂的可用性来表征和调节蛋白是必不可少的，打开新的研究和治疗的途径。抗体继续成为学术界和工业界研究的基础研究和诊断工具和潜在的治疗至关重要。这并不奇怪，出现了合同抗体开发公司，其中大部分依靠常规的杂交瘤技术产生的抗体定制一个令人印象深刻的增长。然而， 在体外利用噬菌体展示抗体库的选择正在成为能够提供独特的优势和成功的地方传统技术可能面临限制1，2强大的替代技术。
鉴于高品质的抗体作为研究工具，产生两个主要的挑战相当大的需求的可再生抗体是1）选用吞吐量和2）抗原AVailability。一些团体现在已经在体外筛选管道旨在提高吞吐量和抗体识别率描述。这些描述详细介绍了各种可行的方法后，无论是全长，包括针对选择3,4，或结构相关领域5,6,7，无论是使用基于微珠6,8或板为基础的3,4-抗原固定的计划。此外，越来越多地采用的基因合成技术9取得了系统的抗原的产生，特别是分离的结构域，合理的成本效益，并且可以潜在地减轻在取得足够量的纯化的，全长抗原的难度。通过使用两种技术中串联，一个独立的，可伸缩的抗原的产生和抗体的选择管道被设计，这将使抗体大集表达的抗原结构域的并行分离和促进试剂对茶的发展racterizing结构或功能上相关的蛋白质的整个类。
为了实现这一目标，夫妇表达抗原域，基因合成，抗原和可扩展的噬菌体展示抗体选择高通量细菌表达的硅片鉴定已经开发了一个集成的管道。这条管道需要提供给大多数生命科学实验室（包括抗体库，这是越来越多可以通过许可或材料转让协定），只有基本的基础设施，而且还易于自动化的工业规模使用。使用该协议，有可能产生数百亲和标记的抗原结构域，并例行隔离高度特异性抗体片段的许多这些抗原。
噬菌体展示技术已经显示与多种重组亲和试剂的格式，包括的Fab，单链抗体，和自主的Fv结构域和一个的证明兼容性小“替代框架”（设计的锚蛋白重复蛋白（DARPINS），纤维连接蛋白（FN），脂质运载蛋白域多10）不断增长的阵列。讨论被限制于这个例子的Fab抗体片段的分离，尽管可以推测这些方法可以适用于其他类型的库。采用这种技术，具有低纳摩尔亲和力小的Fab，标记的蛋白质结构域，包括转录因子结构域，SH2结构域，RNA结合蛋白和其他人已成功选择，其中许多结合全长蛋白质和有功能的免疫测定，如免疫荧光，免疫和免疫组化。通过细菌生产提供增加的一致性，再现性和成本效益重要的是，重组结合克隆是完全可再生的，并从表达可以重新生成构建，从而证明了严格克隆验证为代价。
在这个普罗特ocol和附带视频，基本方法使用固定的抗原结构域噬菌体展示文库的抗体的选择被证明。这个特定的方法使用通过被动吸附在微孔板固定GST标记的蛋白质结构域，尽管其他标签11,12,13和选择格式13,14,2也已成功地使用。关键的考虑因素选择与平行监测选择参数旨在确定和隔离尤其丰富克隆抗体确认的设置和行为有详细。
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Protocol
1.抗原产生
注：抗原结构域可以被合成并且通过各种商业供应商的克隆到一个适当的IPTG可诱导的表达构建物。
- transform表达式建设成为化学感受，T1噬菌体抗性，BL21 E.大肠杆菌细胞通过混合10毫微克在96孔PCR板，随后通过加入20升化学感受态细胞的编码在20μl1X KCM的在冰上的DNA。
- 在冰上孵育细胞/ DNA混合物20分钟，在RT下进行10分钟，然后抢救用100μl预热的超级最佳肉汤与葡萄糖（SOC）的媒体，覆盖有透气板密封之前在冰上再次进行2分钟并摇动在37℃下进行1小时，在200rpm下在2.5cm的轨道摇床。
- 板5微升转化细胞上的Luria-BERTANI（LB）补充有羧苄青霉素/琼脂平板（100微克/毫升），并生长O / N，以获得用于单菌落生成甘油股票。
- 接种1毫升2YT /碳水化合物介质与5微升甘油和在96孔深孔块以200rpm在2.5cm的轨道摇床摇动生长12小时，在37℃。
- 接种NZY media15（补充有0.05％葡萄糖，2％乳糖，和100微克/毫升羧苄青霉素）以1:40稀释该培养物，然后振摇6-8小时，在30℃和200rpm下在2.5cm的轨道振动筛。
- 粒料细菌和纯化在高通量的抗原蛋白质中含有100微升的Ni-NTA树脂的按以前发表protocols16,17 96孔过滤板。
- 确定纯化蛋白通过Bradford染料结合assay18的浓度和表征为大小和纯度分离和10-50微克用考马斯染色可视化在SDS-PAGE凝胶上（参见图2）。
注：在此阶段的蛋白质可以进一步特征在于：评估蛋白质聚集19的方法20。
2.制备噬菌体抗体库和滴定
- 挑T1噬菌体抗性大肠杆菌的单个菌落大肠杆菌细胞在1ml 2YT培养基中补充有50微克/毫升四环素。
- 一旦细胞生长在视觉上确定，稀释培养在2YT的较大体积补充有50微克/毫升四环素的，以确保细胞的足够体积为感染（每个库通常稀释45微升，见下文）。
- 通过用高压灭菌的20％的PEG-8000的1/5体积，2.5M的NaCl（PEG-NaCl）中孵育在冰上30分钟，造粒沉淀从存储缓冲器的噬菌体制备文库用于在12000×g下沉淀的噬菌体通过离心。
- 弃去上清，重悬沉淀的噬菌体中的1×PBS中的pH 7.4，0.2％BSA和0.05％吐温（PBT）的一个适当的量，调整吨O的相应的噬菌体浓度为选择（如果需要的话），以确保有足够的库覆盖。见步骤2.9和讨论。
- 稀释5微升噬菌体等分入45微升的1×PBS pH 7.4的在无菌多孔板，混合，并在相同缓冲液创建一系列的10倍稀释液。
- 添加5微升每个噬菌体稀释至45微升T1噬菌体耐药的E。大肠杆菌细胞处于对数生长期（OD 600 = 0.4-0.8）的另一多孔板，盖上透气密封件和孵育在37℃下以200rpm在2.5cm的轨道摇床摇动30分钟。
- 板5微升感染的细胞从每个孔中的上到预先温热琼脂平板补充有100μg/ ml的羧苄青霉素和生长在o / n 37℃下，直至菌落是可见的。
- 计算总的噬菌体/ ml的如下：
噬菌体/ ml的数目=菌落在羧苄青霉素板上的最稀样品×200×10 i个（i =最大NUM稀释的误码率在殖民地是显而易见的）。 - 以确定包被抗原的孔的数量，以确保覆盖的文库多样性，计算如下：
要求包被抗原井数=
所需的折叠覆盖*库的多样性
＃每100微升噬菌体
3.抗体选择从噬菌体展示库
3.1）抗原固定
- 为了避免反复冻融，可以影响抗原质量，并促进稀释，在以非约束性的96孔板制备股票抗原蛋白板归一化到100倍工作浓度（ 例如，500微克/毫升）和等分。
- 通过从库存板用PBS稀释制备从库存蛋白质溶液的前一天，以每一轮选择的抗原包被的板。
- 涂层的96孔高蛋白质结合聚苯乙烯板用100μlGST-标记抗原蛋白或阴性对照的protein酶（GST，BSA，中性等）在PBS中5微克/毫升。摇晃在250转4°CO / N在微振动筛。
- 取下涂覆微量蛋白质溶液，阻断抗原包被和阴性选择平板用200μl封闭缓冲液（0.2％BSA的1×PBS pH 7.4）中，并以250rpm摇动，在室温下1-2小时。
- 封闭后，用200μl的1×PBS pH为7.4的含0.05％吐温（PT）的缓冲液手工或用自动洗板机或者洗涤阻断蛋白 - 包被的板4次。
3.2）图书馆前间隙和抗原噬菌体孵化
- 消耗的非库（或标签也即）通过在PBT的缓冲液中制备的噬菌体文库的100微升（10 12噬菌体）转让给数孔涂覆有阴性对照蛋白或游离的亲和标签的特异性结合噬菌体展示的抗体片段的克隆蛋白（ 例如，GST）等效于目标的数目和温育噬菌体在孔中1-2小时，在室温下振荡以250rpm。
注意：作为一个替代或阴性选择的附加 装置，孵化也可以在过量（5-25微米）的可溶性蛋白的亲和标签（ 例如，GST）的存在下进行，以进一步除去标签结合克隆和增强特定靶回收结合克隆。 - 转印噬菌体上清液从阴性选择到抗原包被的板并孵育1-2小时，在室温下用在250rpm摇动特异性结合克隆的捕获。
- 与PT缓冲手动除去未结合的噬菌体洗微孔板中8-15倍或使用洗板机。去除多余的洗涤液之前，为了洗脱。
3.3）洗脱，感染和噬菌体扩增
- 早于选择的天，挑T1噬菌体抗性大肠杆菌的单个菌落大肠杆菌细胞在1ml 2YT培养基中补充有50微克/毫升四环素和生长，在37℃的无线日以200转的2.5厘米轨道摇床或同等晃动。
- 一旦细胞生长被建立，并且可以用肉眼看出，增加介质的体积与2YT补充有50微克/毫升四环素的，以确保细胞感染的足够体积（通常每个选择100μl的孔）。
- 生长细胞直到OD达到600 0.4-0.8（约5-7小时），然后以洗脱结合的噬菌体加入100微升细胞对经洗涤的抗原板并摇动在37℃下30分钟。
- 添加M13K07辅助噬菌体，以1×10 10 CFU / ml的终浓度，并以200rpm振荡孵育在37℃下45分钟。
- 转移细胞到1.2 2YT毫升补充有150微克/毫升羧苄青霉素和75微克/ ml卡那霉素在96孔深孔块与V型底和生长O / N在37℃下以200rpm在2.5cm的振摇轨道摇床。
3.4）噬菌体制备及塞莱茨的反复多轮化
- 颗粒细菌离心在4000 XG为15分钟，在4℃。
- 混合从复制板噬菌体上清液等体积的微型管96孔无菌微量蓝色框，中和用的10X PBT 1/10体积并混合。重复轮筛选3-4轮（从步骤3.1.1开始），或直至富集观察（见第4和第7）相比，阴性对照蛋白。
注：在早期轮选择时预计不会显著/可检测的浓缩（ 即，轮1和2），输入和输出的噬菌体滴度（在图3中所示第7和代表性结果描述）的量化可以是在确保有帮助最低噬菌体浓度选择成功（在讨论中描述），比汇集ELISA试剂盒更合适。
4.表征汇集ELISA
- 涂层的96孔高蛋白质结合荷兰国际集团聚苯乙烯板带在2微克/毫升100微升GST标记抗原蛋白或阴性对照蛋白（GST，BSA，中性等）按3.1节和动摇，在4°CO / N。
- 除去过量的抗原，用200μl封闭缓冲液与在RT振荡1-2小时以250rpm在微孔板摇床上的遮挡板和洗4次用200μl缓冲液的PT或用手工或用自动洗板机。
- 应用100微升噬菌体上清液（稀释1：10-1：在PBT缓冲器20），摇动以250rpm进行15分钟，在室温，洗板8次用200μl缓冲液的PT。
- 加入100微升抗M13-HRP（1：在PBT缓冲区5000）。摇动以200rpm进行30分钟，在室温，然后洗涤平板6次用200μl缓冲液的PT和两次用200μlPBS中。
- 应用100微升的1：1的TMB底物，并发展为5-15分钟（或直到大量颜色已开发），然后通过加入100微升1 MH 3使反应停止4和读取该板在450nm处。
- 在一般情况下，富集噬菌体池可以在轮3-4被观察为特异性结合与非特异性结合之比> 2（参见图4）
注意：这是信息的要注意的亲和标记的蛋白质，高的绝对结合信号指示的标签特异性结合剂（而不是目标的粘合剂）富集，而在阴性对照蛋白，其高的绝对结合信号指示非特异性或富集“粘“粘合剂。
5.克隆选择，排序和表征
单的Fab噬菌体克隆5.1）隔离
- 要隔离进行测序和表征单个克隆，感染扩增噬菌体池的1/10体积为T1噬菌体性E.大肠杆菌细胞中生长的对数期（OD 600 = 0.4-0.8）中的圆底微量滴定板，盖上breathaBLE板密封并孵育以200rpm在37℃下振摇30分钟。
- 制备10倍系列稀释液在2YT培养基和板列于补充有100μg/ ml的羧苄青霉素分离琼脂平板上。
- 挑到450微升2YT / CARB媒体辅以1×10 9 M13K07噬菌体/ ml的单菌落并在微型管96孔微孔板无菌蓝盒子在37℃培养与200rpm振荡成长O / N。
- 颗粒由细菌在4000 XG在4℃旋转10分钟。
- 克隆噬菌体的上清液可用于的Fab噬菌体克隆测序或用于（如在第5.4节中所述）克隆直接结合ELISA中，以确定特异性针对固定化的抗原（如在第5.3和21中描述）的量代表性的结果显示在图5。
Fab克隆的表征5.2）表达
- 在继克隆到合适的éXPRESSION矢量（见讨论），接单E.大肠杆菌菌落转化的表达构建在到1ml 2YT /碳水化合物介质中的96孔深孔板用无菌牙签或枪头和200rpm振荡生长12-16小时，在37℃。这可以手动或用自动菌落选取器完成。
- 转移40微升生长培养物以1.5的NZY培养基毫升补充有葡萄糖/乳糖/甘油在96孔深孔块作为每Studier 等的方法。15
注意：可替换地，细胞可以在非补充和蛋白表达诱导通过加入1mM IPTG诱导培养3-4小时（OD 0.8-1.0）。 - 覆盖培养嵌段（S）具有一个可透气的密封件和表达Fab克隆为6-8小时，在30℃下200rpm振荡。旋板在4000×g离心15分钟以沉淀细菌细胞，去除上清，盖板用箔密封，并冻结粒料在-20℃，直到溶解。
- 解放表达的Fab从收集粒料用100μl裂解缓冲液（Tris盐酸的50mM，200 mM氯化钠，1.25％的Triton X-100的pH 8.0与1mg / ml的溶菌酶和10单位BENZONASE / ml的培养和蛋白酶抑制剂），并摇动2小时，在4℃。
- 通过离心除去细胞碎片，在4000×g离心15分钟，在4℃，并收集粗裂解物上清用于特异性通过ELISA板（见5.3节）初始特性的使用。
5.3）克隆了直接表征结合克隆的Fab ELISA
- 在3.1节中描述，而不是aliquotting 30微升2微克/毫升的抗原在PBS中于384孔板的孔中固定的抗原。在板的四型抗原的布局可以使用96通道为基础的胶头时方便试剂转移。洗和块ELISA板按3.1节。
- 从收集的清除裂解液 第5.2节可以直接应用到固定的抗原为EVAluation结合。孵育30微升每孔裂解液15分钟，在室温以200rpm振荡。
注：纯化的Fab克隆蛋白可交替地被用于稀释在PBT的缓冲器10微克/毫升和施加30微升的每个克隆，以阻塞孔含有抗原或阴性对照蛋白（GST，BSA等）和发展中所描述的相同方式下文。交替，的Fab噬菌体也可以使用通过稀释10微升噬菌体上清在20μl的PBT缓冲液（在第5.1节中描述）（1：3）中，用抗M13-HRP抗体检测（在步骤4.4中所述 - 4.5） - 去除多余的裂解和手动或使用自动洗板8倍速用100μlPT缓冲区，去除多余的缓冲液洗井。
- 孵育30微升1：5000稀释的二次抗FLAG抗体的PBT缓冲液30分钟，在RT下用200rpm振荡。
- 洗净，制定和量化为每节4.3 - 4.5。
注：代表性的成果示特异性和非特异性结合的克隆显示于图5。
5.4）克隆测序
- 制备PCR主混合物，如表2所示。
- 加入2微升适当的PCR模板（无论是噬菌体上清液或再暂停单含噬菌粒的细菌菌落）的20微升准备在一PCR板的孔中的合适的引物PCR主混合物。
注：分离主混合物都需要使用重链和轻链基因的测序。 - 运行使用表2中列出的参数的PCR反应- PCR设置。
- 通过混合5微升上样染料于补充有DNA的可视化染色和成像上的300纳米透射在1％琼脂糖凝胶上完成反应的核实PCR反应的成功。
- 添加2微升的PCR产物，以10微升含0.2无菌水;微升每种核酸外切酶和虾碱性磷酸酶和孵育在37℃下进行20分钟，随后酶失活，在80℃下进行10分钟，以除去过量的引物在制备用于测序。
6.缩放为自动选择
6.1）移液器为基础的液体处理
- 制备的1％（重量/体积）在水中的溴酚蓝和使用0.45毫升过滤除去不溶性颗粒。
- 以确定对板读数器吸光度的线性范围，制备1：1000稀释在水中的1％溴酚蓝溶液，并继续与2倍系列稀释液（16稀释总数）。
- 转移100μl的每种稀释液以平底96孔板并读取590nm吸光度。情节绝对吸光度与稀释系数，并选择一个稀释在中间，为随后的测试的线性范围的高端。
- 加入溴酚蓝水或实际的解决方案这将根据所选择在足够体积移液前一步骤，以3 96孔板中稀释，加在储存在死体积吸管。
- 校准单通道移液器通过吸取水到一个分析天平来提供测试体积（100微升的水的重量为100毫克，在室温。）
- 使用校准的吸移管，该染色溶液的测试体积转移到至少三个孔平底96孔板的并读取其吸光度在590nm处，一式三份。
- 权衡三个空平底96孔板在分析天平上，并记录它们的质量。
- 移液器测试容积从储存到每个3 96孔板，并测量它们的吸光度在590nm处，一式三份。
- 权衡各板，并计算质量差。
- 首先，评价在每个孔中的吸光度是否容忍的范围内是均匀的（ 例如 ，±5％）和它们是否与第一致通过手工移液与校准的Pipetman获得ê吸光度。如果特定的通道一直过度或提供（例如参见图6），请按照维修程序和重复的评估过程，直到所有通道提供统一卷。
- 第二，一旦所有的信道被证实能够提供均匀的体积，通过计算平均质量差检查体积的准确度，每孔。例如，对于100微升完全校准的液体处理程序集将传递9.60克水每板，0.10克水每孔。如果输送的实际卷中始终超过或期望的音量下，然后校正因子可以应用， 例如，编程110微升，以实际递送100微升。
注：对于小体积的， 例如，10微升，使用由手10倍的溴酚蓝在染色溶液中，并预先等分90微升水到96孔板中，以确保该ABsorbances是可测量的和下降的线性范围。
6.2）自动洗板
- 固定目标的积极和消极的控制蛋白96在3.1节描述的不同孔微孔板（被测试两个板块的每个条件）。
- 阻断非特异性结合位点通过孵育阻断溶液1小时，在室温。
- 添加10 13 cfu的相同100微升等份/毫升靶结合在PBT中的Fab噬菌体溶液在所有平板的所有孔中，并轻轻搅拌在室温下孵育2小时。
- 根据每个条件，一个板中进行感染和滴定和一个板用于ELISA洗两个板。
- 评价洗净直接感染的疗效为细菌和滴定法（如第3.3节（不M13K07加法）和7.2.1）或开发与抗M13 HRP抗体和显色底物（如在第4节）。
- 噬菌体滴度FR嗡特异性克隆通常在10 5 -10 7噬菌体/ ml的范围内，从固定化的蛋白质针对其克隆特异性结合得到。一些残留的结合的阴性对照蛋白（ 例如，BSA）是可以预料的，并通常为10 2 -10 5的噬菌体/ ml的被观察到的，但是非常低的滴度（ 即 ，<10 1）可以用信号过于严格的洗涤，这会损害选择。
- 噬菌体结合ELISA法测定，比较的绝对结合信号为阳性和阴性对照的蛋白质，以确定是否机器人洗涤相当于既定洗手结果（ 图7）。
6.3）平板洗衣机去污
- 要启动，运行去污协议进行测试。
注：我们建议至少使用双线路总音量，黄金和浸泡清洗头5分钟在0.5％次氯酸钠，新鲜稀释FR嗡市售漂白剂（通常是6％次氯酸钠）。 - 总理在无菌（蒸压）水浸泡清洗头5分钟，终于，素系统，直到线条充满空气。
- 素用无菌水或洗涤缓冲液中的行。
- 洗无菌96孔微孔板一次，从洗衣机取出，并用密封无菌板密封件。这是预污染控制板上。
- 等份加入100μl的O / N扩增噬菌体的培养上清于96孔板的所有孔中。
- 洗含噬菌体板一次，然后从洗涤器除去和密封用塑料或金属箔片密封。这是污染控制板上。
- 开展净化协议进行测试。在本实施例中，重复步骤6.3.1和6.3.2。
- 洗无菌微孔板一次，然后从洗衣机和印章删除。这是去污试验板。
- 板50微升数生长期的E.大肠杆菌滴定板;这是预infec化控板。
- 开封前污染，污染和净化96孔板，并添加100微升大肠杆菌的大肠杆菌在对数期生长阶段，所有的井，用新的提示每口井。
- 密封和孵育在37℃下进行30分钟，在200rpm。
- 板50微升感染细胞的三个随机的孔各96孔板至10cm 2YT /碳水化合物板的孵育在37℃CO / N。
- 转移50微升感染细胞从每个板的所有孔中，以含有1ml 2YT加上每孔100μg/ ml的羧苄青霉素深孔板并生长在o / n 37℃。
- 重复净化协议和离开垫圈线晾干。
注：无O / N生长在平板上或在液体培养基中应该对预感染控制，预污染控制或去污试验板进行观察。许多殖民地和增长应该在污染控制板可以观察到;如果不是，有关的疗效无结论去污协议可。理想的是，去污板将产生无菌落和无O / N的生长中的任何孔中的O / N平板。去污协议的严格性可以增加与更高的漂白剂的浓度，更长的浸泡时间和额外的循环。
7.输入/输出滴定
7.1）输入噬菌体滴定
- 稀释噬菌体的5微升等分至50微升用无菌过滤PBS混匀。
- 使用多通道移液器或96通道移液器在无菌过滤的PBS中制备系列稀释10倍至10 10。
- 接种5微升稀释的噬菌体中，以45微升的T1噬菌体抗性大肠杆菌的大肠杆菌细胞在对数生长期（OD 0.6-0.8），并孵育覆盖有在37℃的透气密封30分钟的。
- 板5微升感染细胞上的LB /琼脂平板上补充有100微克/毫升羧苄青霉素和孵育O / N一吨37℃。
- 噬菌体浓度可以从在其中菌落按照第2.8节中详述的计算出现最稀样品进行估计。
7.2）输出噬菌体Pitrations
- 通过加入大肠杆菌的下列板结合的噬菌体的洗脱大肠杆菌细胞，稀释的噬菌体感染的细胞的一个5微升等分至50微升用蒸压2YT培养基
- 使用多通道移液器或96通道移液器在蒸压2YT培养基制备系列稀释10倍至10 6。
- 板5微升感染细胞上的琼脂平板补充有100微克/毫升羧苄青霉素和孵育O / N在37℃。
- 噬菌体浓度可以从在其中菌落按照第2.8节中详述的计算出现最稀样品进行估计。
注意：在这两种情况下（ 即，输入和输出的噬菌体滴度，用集落数在两个四环素对比（总CEL升数）和卡那霉素（辅助噬菌体滴度）也可提供有用的信息。
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Representative Results
本文所描述的协议已被用于分离抗体片段的各种从并联组合噬菌体展示的Fab文库既structurally-和功能上相关的抗原结构域。相关抗原可用性问题可以回避，在许多情况下，通过在表达抗原结构域适合于抗体选择23的硅片鉴定。通过偶联抗原表达抗体的选择在相同的实验室（ 图1）它来构造一个集成的管线，在其中抗原参数来选择关键，可以更容易地控制变得可行。在大多数情况下，仔细确定域边界使得能够在抗体选择成功使用的表达和足够数量的高通量表达足够纯抗原在96或24孔深孔板的隔离（ 图2）。在连续轮的选择过程中，洗脱的噬菌体浓度和噬菌体的富集特异性结合抗原可以通过噬菌体滴定（ 图3）或用噬菌体池在ELISA测定中（ 图4）进行监测。的结合比（> 2）通常表示特定结合克隆的存在。相反，一个低比率（<2）可帮助确定的选择失败的原因。例如，一个比<2具有高的非特定的OD可以指示除去非特异性克隆（或粘性粘合剂）不足，可能有必要在选择协议的进一步优化。然而，一旦富集被检测到，个别的高亲和性克隆然后可以分离用于测序和定性。克隆结合的特点可以在一个比色免疫测定，能够实现所述的Fab噬菌体或Fab结合到固定的抗原相对于阴性对照蛋白，得到富集的量度（比较结合到ta比率rget与阴性对照蛋白或亲和标记物蛋白质）（ 图5）。
在缩放和这种方法的自动化，液体处理设备的关键功能评估可以帮助确保正确和精确的操作，类似于那些在实际选择使用的解决方案。在溶液中使用吸收发色团可以帮助检测何时在射流专用通道（吸入或分配）的任一堵塞或失去密封造成局部体积输送， 如图6。自动洗单位也可以是变异性的来源并且可能需要注意。利用已知结合克隆的使得能够控制靶蛋白之间的结合的比较，以确保靶结合被维持而背景结合除去（ 图7）时，洗涤等参数分配速度，洗涤体积和洗涤液的数量被优化。以下使用自动洗板机与噬菌体溶液，有效净化协议是必要的，以确保不存在交叉污染，从连续多轮的选择或不同的选择的程序和故障排除/解释引导件在表3中提供的。
图1.概述-高通量抗原生产和抗体的选择管道此概述显示了一个代表性的抗原的产生和抗体的选择管道的一步一步的可视化。在硅片中识别抗原域边界使基因合成，表达和选择时域的蛋白质可能很差特点。表达的抗原结构域被固定并用于从共分离的特异性高亲和性的抗体克隆池mbinatorial抗体文库展示在丝状噬菌体的表面上。抗体-噬菌体池洗脱和扩增从个体的抗原可以被用来监测特异性结合的克隆在基于ELISA测定中圆到圆的富集之前个别结合克隆用于表征隔离比较固定的靶相对于阴性对照蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2的SDS-PAGE的亲和标记的抗原可视化。有代表性的SDS-PAGE表达和纯化6X-HIS-GST标记的抗原结构域（5-10 kDa的结构域+ 26 kDa的GST）最初是由在抗原的硅片分析确定的域边界。蛋白质结构域表达和分离阿菲无穷大的净化是之前的选择特征的SDS-PAGE，以确保基于大小的身份，充分的产量和纯度，使噬菌体抗体选择使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3的噬菌体滴度输出可视化。噬菌体输出滴度通过电镀出感染的噬菌体，在10倍稀释系列琼脂培养基补充有各种抗生素（四环素，羧苄青霉素和卡那霉素）的细胞，以确定最低的稀释度来确定哪些集落可以观察到，并估计噬菌体结合靶抗原和洗脱的数量。 请点击此处查看大- [R版本，这个数字。
阴性对照蛋白的ELISA汇总图4.结合靶的比率。富集的进展可通过筛选个体扩增洗脱剂对两者的具体目标和阴性对照的蛋白质和/或分离的亲和标记物进行评估，如下轮选择。如图中的情节是浓缩比例为96个人的噬菌体抗体库对他们各自的96抗原与并行阴性对照蛋白结合。每个比率值是从两个吸光度测量噬菌体池的该量化结合到目标或使用特定的用于M13噬菌体的外壳蛋白的HRP融合抗体阴性对照蛋白衍生。 2或更大（通常范围从2-10或更多个如在红色描绘）的比率的阈值被用作富集的指示和特异性结合的克隆的可能性存在。较小的比率可以表示的故障或与可能保证协议的进一步优化选择的具体问题。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.直接结合克隆的Fab噬菌体或Fab的ELISA。单个克隆的结合（无论是在的Fab噬菌体或Fab形式）可通过基于ELISA的测定法对在384孔板固定蛋白进行评价。结合使用的是二次的HRP稠抗体针对上的Fab噬菌体或上的Fab的亲和标签的M13外壳蛋白进行检测。用于克隆的Fab噬菌体结合靶抗原，阴性对照蛋白和抗原亲和标签（GST）的原始吸光率值被描绘出的特定双nders（A01，A04，A06），而粘粘结剂（A05）。
图6.评估配送量由自动化液体处理单元组成。由机器人或手动96孔移液系统的一致和准确的交货量预期可使用染色解决方案和酶标仪进行评估。在这个例子中，10微升含有溶液溴酚蓝的是移液顺序地两个96孔板的使用单尖端框所有孔中。每口井含有90微升/孔卫生署2 O，类似于加辅助噬菌体来感染E.被读出以一式三份的大肠杆菌。每个板的吸光度在590nm处，并且这些卷是从标准曲线内插用校准单道的Pipetman制备。递送到单个行上的第一和第二板卷被示出。需要注意的是在冷杉吨板，以及E04没有收到染色溶液中，并在第二板，它接收到一个双重卷。这表明，尖触摸不足以一致交付，并需要进一步优化。示95％置信区间为一式三份的吸光度测量。
图7.评价的自动平板洗涤。有效去除未结合的噬菌体可以用ELISA来测量的Fab噬菌体结合于固定化的阳性（抗FLAG抗体）和阴性（BSA）对照蛋白而改变洗涤条件进行评估。在这个例子中，输入的噬菌体类似于幼稚库（10 13 CFU / ml，在PBT）是使用去掉8或16次洗涤，用手工或用机器人。残余噬菌体结合到牛血清白蛋白是在所有条件相同的，为的是特异性结合固定化的抗FLAG抗体，印度语阿婷，在这低流动速率，这两种方法是等效的且充分地严格。示从复孔的95％置信区间。
| SOLUTIONS | |||
| 2YT培养基 - 加水至1升，调节pH至7.0，高压釜中。 | 酵母抽提物 | 10克 | |
| 蛋白胨 | 16克 | ||
| 氯化钠 | 5克 | ||
| NZY培养基（1L） | NZ胺 | 10克 | |
| 酵母抽提物 | 5克 | ||
| 50X ZYM-5052 | 20毫升 | ||
| 20盐股票 | 50毫升 | ||
| 50X ZYM-5052糖股份（1升） | 葡萄糖 | 25克 | |
| 乳糖 | 100克 | ||
| 甘油 | 250毫升 | ||
| 20X盐股（1升） | 的Na 2 HPO 4 | 500毫米 | |
| KH 2 PO 4 | 500毫米 | ||
| 氯化铵 | 1M的 | ||
| 用Na 2 SO 4 | 100毫米 | ||
| 羧苄青霉素（CARB）： | 100毫克/毫升水。过滤消毒。 | ||
| 卡那霉素（菅直人）： | 25毫克/毫升水。过滤消毒。 | ||
| 四环素（TET）： | 10毫克/毫升水。过滤消毒。 | ||
| PEG-氯化钠 | PEG | ||
| 氯化钠 | 2.5M的 | ||
| 1X PBS（pH7.2）中 | 氯化钠 | 137毫米 | |
| 氯化钾 | 3毫米 | ||
| 的Na 2 HPO 4 | 8毫米 | ||
| KH 2 PO 4 | 1.5毫米 | ||
| 1X KCM | 氯化钾 | 500毫米 | |
| 氯化钙 | 150毫米 | ||
| 氯化镁 | 250毫米 | ||
| SOC媒体 | 酵母抽提物 | 5g / l的 | |
| 蛋白胨 | 20克/ L的 | ||
| 氯化钠 | 10毫 | ||
| 氯化钾 | 2.5毫米 | ||
| 硫酸镁 | 20毫米 | ||
| 葡萄糖 | 20毫米 | ||
| 封闭液 | PBS | 1X | |
| BSA | 0.20％ | ||
| PBT缓冲 | PBS | 1X | |
| BSA | 0.20％ | ||
| 吐温 | 0.05％ | ||
| PT缓冲区 | PBS | 1X | |
| 吐温 | 0.05％ | ||
| 磷酸 | H 3 PO 4 | 1M的 | |
表1.媒体和解决方案。
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ STRONG> | |||
| 部件 | 每反应μL | ||
| 水 | 19.45 | ||
| 10X Taq缓冲液 | 2.5 | ||
| 的dNTP（10毫米股票） | 0.675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| 的Taq酶 | 0.125 | ||
| 正向引物（100林M股票） | 0.25 | ||
| 反向引物（100林M股票） | 0.25 | ||
| 重链测序引物 | |||
| M13正向引物 | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13反向引物 | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| 轻链测序引物 | |||
| M13正向引物 | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13反向引物 | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| PCR SETTINGS | |||
| 第1步。 | 94℃3:00分钟 | ||
| 步骤2。 | 94℃零时30分钟 | ||
| 步骤3。 | 55℃，0点三十分钟 | ||
| 步骤4。 | 72℃1:00分钟 | ||
| 返回第2步，重复24倍 | 跳转到第2步 | ||
| 步骤5。 | 72 °下7:00分钟 | ||
| 步骤6。 | |||
表2. PCR预混和设置。
| 去污结果的解释 | |||
| 板 | 预计羧苄青霉素滴度 | 如果不是？ | |
| 预感染控制 | 0 | 细胞预先感染;没有什么可以从实验中得出的结论。 | |
| 污染控制 | 草坪 | 污染不足以能够评估后续去污的功效;考虑歧管淹没在噬菌体的解决方案，而不是吸它。 | |
| 去污试验 | 0 | 去污不彻底;增加浸泡时间，漂白剂concentra化或尝试SDS和乙醇清洗来代替。 | |
表3评价垫圈去污。为了确定去污的功效，这是必要的，以显示该垫圈被污染的噬菌体，并且该去污协议成功地消除了污染。使用噬菌体赋予羧苄青霉素抗性，从这样的测试预期结果都列出来，随着建议应该从预期成果的真正结局不同。
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Discussion
体外抗体选择导通时，选择成功的两个主要因素是：1）的良好折叠的抗原靶的隔离，用于选择后和2）的高功能的多样性抗体库的可用性。在许多情况下，足量的良好的折叠，全长蛋白质的可用性可以是限制性的。一种方法来克服这种限制是使用识别从生物信息学分析22并合成用于插入域到细菌表达载体与合适的亲和标签。
有各种各样的用于生物技术的应用，以增加溶解度，促进纯化并稳定不稳定域11，以合成几乎任何所需的插入序列可以使高度通用抗原代平台的能力的标记。虽然GST标签的格式是通用的，成功的结果以前一直制得使用六组氨酸，FC，晕，麦芽糖结合蛋白和位点特异性生物素化的标记，它被认为是无数的其它亲和标签可用于在类似的平台使用进行优化。然而，亲和标签可以具有有益和意外的不良后果在下游的应用11，并应建立基于特定格式的管道之前，彻底调查。
常新用户会对如何评价抗体库的质量问题，虽然没有直接的答案，应该试图评估的几个关键特性（无论是天然的还是合成的），包括整体的多样性，相对显示级别，性质和随机化的程度（即，库的设计与通过测序确认库含量）和抗体对预期的应用的物理化学性质。虽然超出了本协议的范围，更详细的treatme这些特征核苷酸以及它们如何可以影响抗体的选择可以在这里2,23找到。知识库多样性的，尤其重要的是要确保在选择的多样性充分覆盖。典型地，噬菌体浓度，提供100-1,000份库中的每个噬菌体克隆的期望，并应确保存在于库中的任何真正的粘合剂可以被回收。然而，噬菌体的非特异性结合到微孔板表面急剧增加高于10 13噬菌体/ ml，且对于非常多样文库，超过每抗原的单个井可能需要以确保足够的覆盖范围。另一方面，如果输入的库太稀，真阳性的粘合剂的绝对浓度将远低于对KD（通常nm）的，它们将不被恢复。鉴于这些限制，噬菌体文库一般应悬浮于十月12日至13日的噬菌体/ ml的用于第一轮选择的。0;在该浓度下，噬菌体的100L等分表示的10 9 -10 10多样性文库的1,000-100折叠的覆盖，并可以常规地产生结合克隆到不同的抗原。在更低的浓度，或增加的多样性，这可能是必要的，以增加在第一轮中选择的针对抗原的井的数量（见2.9节）。随后圆1，但是，大多数的库的非约束多样性已除去;采用单井的轮1输出的多样性超额保险是最常见的容易实现。在平行的选择在96孔板的情况下，这可以减少所需的只是一种抗原的选择板，该第一轮随后的编号。
在实际的选择，噬菌体滴定可以提供客观的措施，以表征和监测进展，同时又有助于确定关注特别是在早期轮选择的地方富集不足以被检测到。这可以是缩放选项，以确定协议的性能时特别有用。在一般情况下，输入的噬菌体滴度（ 即幼稚库或扩增后洗脱的噬菌体）应保持相对恒定（10 12 -10 13噬菌体/毫升）之间发，具有差的细胞生长/低噬菌体滴度指示潜在的污染和/或从上一轮的输出差。尽管输出的噬菌体滴度预期富集过程中，以增加在以后轮次的选择，预计前两轮的范围为10 3 -10 5 CFU /毫升。在此范围内的偏差可以表示与选择的潜在问题，如污染或过多的洗涤严格。在以后轮次的选择（ 即，轮3和4），克隆的富集特异性结合靶抗原可以通过噬菌体池对两个靶抗原和负该措施结合汇集的ELISA来评估控制蛋白（见第4节）。
后3-4轮选择（或一次富集的靶蛋白已到达靶抗原：2的阴性对照蛋白信号比：1或更高相比于背景蛋白），感染细菌细胞铺板以分离单个噬菌粒克隆用于测序，初步鉴定和克隆，如果必要的。在这个时候，这是非常可取转换的Fab噬菌体之前额外表征释放的Fab。虽然的Fab噬菌体可以通过稀释10微升噬菌体上清液被用于初始特性在20μl的PBT缓冲液和具有抗-M13-HRP抗体检测（在步骤4.4中所述 - 4.5）（在第5.1节中描述），在我们的经验，结合特性可以大大的任何地方从克隆的5-20％后，解放改变从噬菌体颗粒和早期的转换可以消除误报问题。用于转化的具体方法将取决于uniqu噬菌粒电子结构，因而将不进行处理明确地在这里。然而，在最常用的载体，这一般可以通过纯化的噬菌粒（或噬菌粒池）中的1）变换实现到一个主管非抑制大肠杆菌大肠杆菌菌株诸如HB2151或55244如果琥珀终止（TAG）的密码子的干预的Fab和PIII蛋白，2）插入的Fab和pIII的蛋白质之间的琥珀终止密码子，以允许在非抑制菌株的可溶性抗体片段的表达或3）通过在一个合适的表达载体中克隆的免疫球蛋白基因（来自个体的噬菌粒或噬菌体池）。进一步简化的选择和表征，汇集的克隆方法可用于将结合的克隆集体在表达构建体，既消除了潜在的Fab噬菌体颗粒并且其中表达裂解物用于早期鉴定假阳性结合提供有效的手段，即使的成本和纯化的努力最初可避免。
用于克隆直接从库F（在24中所述）分离，抗体可变结构域可以使用1-2微升噬菌体上清液为模板，以PCR法扩增的互补决定区（CDR）（对于库的F-定向引物见材料的表2进行测序）。利用这些引物，所述重和轻链可变区将产生〜700和〜500bp的产品，分别覆盖所有三个CDR。底漆包括退火用地使用最测序核心设备提供标准的引物M13引物，这样的产品可以清除后测序（如第5.4.5所述）。交替，对于已经在被克隆到表达载体和转化的直接向大肠杆菌的Fab噬菌体池大肠杆菌中表达，单菌落可被分离并重新悬浮于15微升的2YT和1-2微升细胞悬浮液直接用作模板用于单个Colony PCR使用合适的引物。
自动选择需要优化的几个关键机器人的功能和验证。在一般情况下，吸移管的基于液体处理必须准确和一致的所有96个通道，板洗涤必须有效地除去未结合的噬菌体不剥吸附抗原或结合的Fab噬菌体从选择板。在洗板有效的净化也是必要的回合，让丰富和有效的应对选择，随后之间选择，以防止交叉污染。为了帮助优化高通量选择过程，简单的方法，以评估这些功能已经被以前使用及以下，详细说明该协议之内。
为了评估由一个液体分配/抽吸头的所有通道输送卷的一致性，有色溶液吸移到一个平底96孔板和absorbanCE在每个孔上测量板读数器。发色团，如溴酚蓝是类似于那些用于真正的选择，以评估对交付量不同的表面张力和粘结性的影响染色解决方案有帮助的。确认所有频道分配一致的卷后，总输送量的精确度，可以通过测量液体转移到每个平板的质量来确定。
板洗涤去除未结合的克隆的自动化主要需要在哪些洗涤缓冲将被分配，也可以采用洗涤次数的比率的最优化。评估此参数的合理方法采用阳性对照（特异性Fab噬菌体结合克隆），以评估不同的分配速率和/或洗涤的次数，以确定是否1）吸附抗原或结合的噬菌体的作用是通过过于严格的洗涤被除去或2）非特异性结合的非同源蛋白质过量ðUE洗是不够严格条件。残余/结合的噬菌体可通过感染细菌进入和电镀单菌落计数，或通过使用ELISA特异性抗体的亲和标记或噬菌体外壳蛋白的第二抗体来检测和定量。阴性对照用于评估非结合性Fab噬菌体的残留水平到靶蛋白或特异性结合的Fab噬菌体对非同源/背景蛋白质，其可以是高，如果洗涤不充分严格。在这种情况下，我们使用固定化的BSA作为非特异性结合和抗FLAG抗体识别在所述的Fab噬菌体作为阳性对照一个FLAG表位标签的控制。我们使用机器人与手工洗，在中等流量，以表明这些技术分别相当于相比8和16次洗涤循环。或者，在持续的选择测量输入和输出的噬菌体滴度（见第7）也可以帮助使在洗涤参数微调。 最后，板垫圈去污用于选择必须是有效的，以消除从先前选择结转噬菌体。根据我们的经验，新鲜稀释0.5％次氯酸钠是快速，有效和廉价。洗涤剂例如SDS也是有效的，但需要更多的广泛洗涤以从体系中除去。检查试剂兼容性之前，任何测试系统。为了评估去污，我们根据表3测试残余噬菌体在由射流系统处理解决方案的存在和解释结果。
总之，这个协议提供了一种通过并联的体外选择针对蛋白质结构域隔离组合文库的Fab一个可伸缩的方法，并提供技术用于验证一个自动化噬菌体选择系统。该广泛的动物设施可能会带来成本和基础设施的障碍被减轻，因为这种方法不重新LY对动物的免疫接种。另外，通过将抗原产生与抗体 - 噬菌体选择，影响选择成功品质因素更容易地监测和调节。当从抗原表达来选择和初始特性的时限是6-8周的数量级上，制作一个更具响应系统可被实现。抗体在体外的选择分离也都容易地修改（由于基因型-表型联系）和可再生的，因此需要的表达构建体的唯一存储的DNA，以反复地和可重复性重新生成抗体。最后由表示，该协议可以使用一个准手动或完全自动化的方法，它采用一个专门设计的，机器人系统的选择进行，通过可扩展性和可访问的，以小的学术和工业实验室一样。
使用和上面描述的高通量方法的库˚F合成抗体库24 在体外免疫-和原位 -expressed蛋白质。尽管成功率对于任何给定的选择将上的抗原靶的品质（纯度，foldedness，单分散度等）以及抗体文库的质量和多样性取决于两者中，已经观察到，在任何地方从25-80 ％抗原的将产生的粘合剂为高通量选择。重要的是，值得注意的是，与以调制靶功能的能力的克隆也经常被选择。这个库是用一个完全的人构架，这使得这些抗体适合于潜在的治疗应用25构造，从而强调作为亲和试剂有广泛基础的新一代替代方法这条管道的重要性值。
综上所述，坚固性和在本协议中提出的方法的通用性将继续优化，工业化和最终的广泛使用这种技术，以帮助作为实现产生亲和试剂来的几乎所有成员的长期目标的可行途径人类蛋白质组。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢美国国立卫生研究院共同基金-蛋白捕获试剂项目获得资金的重组抗体网络的抗体筛选和鉴定管道和加拿大创新基金会拨款购买机器人选择平台的发展。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
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