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Immunology and Infection

फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल उच्च Throughput चुनाव

Published: January 17, 2015 doi: 10.3791/51492
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,3, 1,4, 1,4, 1,3, 1,4, 1,4, 1,2
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

Summary

एक विधि एक साथ एंटीजन के सैकड़ों के खिलाफ फेज-प्रदर्शित मिश्रित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल, उच्च throughput चयन के संचालन के लिए दृश्य संगत के साथ वर्णित है। इस समानांतर दृष्टिकोण का प्रयोग, हम मानक immunoassays में कार्य कर रहे हैं कि विविध एंटीजन के लिए उच्च आत्मीयता और विशिष्टता है कि प्रदर्शन एंटीबॉडी टुकड़े अलग-थलग पड़ गए हैं।

Abstract

दोनों बुनियादी और नैदानिक ​​अनुसंधान अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं को पूरा करने कि एंटीबॉडी के लिए मांग अधिक है और नाटकीय रूप से भविष्य में वृद्धि होगी। हालांकि, यह पारंपरिक मोनोक्लोनल टेक्नोलॉजीज इस कार्य को करने के लिए ऊपर अकेले नहीं हैं कि स्पष्ट है। इस proteome के सभी सुलभ तत्वों के लिए उच्च गुणवत्ता और अक्षय आत्मीयता अभिकर्मकों के लिए मांग को पूरा करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का विकास करने के लिए प्रेरित किया है। यह अंत की ओर है, फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से चयन के संचालन के लिए उच्च तरीकों विविध एंटीजन से जुड़े अनुप्रयोगों के लिए तैयार किया गया है और तेजी से throughput और सफलता के लिए अनुकूलित। इस के साथ साथ, एक प्रोटोकॉल वीडियो प्रदर्शन के साथ एक मैनुअल 96 चैनल तरल हैंडलर या स्वचालित रोबोटिक्स प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्य के सैकड़ों के खिलाफ उच्च विविधता पुस्तकालयों से फैब-फेज क्लोन के समानांतर चयन दिखाता है कि विस्तार से वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक ही उपयोगकर्ता एंटीजन के सैकड़ों उत्पन्न कर सकते हैं,समानांतर में उन्हें एंटीबॉडी का चयन करें और 6-8 हफ्तों के भीतर बाध्यकारी एंटीबॉडी मान्य। हाइलाइट किया जाता है: मैं) एक व्यवहार्य प्रतिजन प्रारूप, द्वितीय) पूर्व चयन प्रतिजन लक्षण, III) गंभीर विशिष्ट और उच्च आत्मीयता क्लोन के चयन को प्रभावित करने वाले कदम है, और चतुर्थ) की निगरानी के चयन प्रभावशीलता और प्रारंभिक चरण एंटीबॉडी क्लोन लक्षण वर्णन करने के तरीके। इस दृष्टिकोण के साथ, हम एकल पास झिल्ली रिसेप्टर्स, स्रावित प्रोटीन हार्मोन, और बहु-डोमेन intracellular प्रोटीन सहित कई लक्ष्य वर्गों के लिए सिंथेटिक एंटीबॉडी टुकड़े (Fabs) प्राप्त किया है। इन टुकड़ों को तत्काल पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के लिए परिवर्तित कर रहे हैं और उच्च आत्मीयता और विशिष्टता प्रदर्शन करने के लिए मान्य किया गया है। इसके अलावा, वे पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, सेलुलर इम्यूनोफ्लोरेसेंस, immunoprecipitation और संबंधित assays के सहित मानक immunoassays की एक किस्म में कार्य करने का प्रदर्शन किया गया है। इस पद्धति एंटीबॉडी की खोज में तेजी लाने और अंततः लक्ष्य ओ को साकार करने के लिए करीब हमें लाना होगाएफ proteome के लिए अक्षय, उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी पैदा होता है।

Introduction

पोस्ट-जीनोमिक उम्र की शुरुआत के साथ, विशेषताएँ और प्रोटीन मिलाना करने के लिए उच्च गुणवत्ता के बंधन अभिकर्मकों की उपलब्धता के नए अनुसंधान और चिकित्सीय रास्ते खोलने के लिए आवश्यक है। एंटीबॉडी बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक ​​उपकरण और संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में दोनों शैक्षणिक और औद्योगिक शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण हो रहे हैं। आश्चर्य नहीं कि कस्टम एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए पारंपरिक हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकियों पर भरोसा करते हैं, जिनमें से अधिकांश अनुबंध एंटीबॉडी विकास फर्मों, के एक प्रभावशाली वृद्धि हुई है। फिर भी, फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी पुस्तकालयों का उपयोग कर इन विट्रो चयन परम्परागत तकनीकों सीमाओं 1, 2 का सामना कर सकते हैं जहां अद्वितीय फायदे और सफलता की पेशकश कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली वैकल्पिक प्रौद्योगिकी होता जा रहा है।

अनुसंधान उपकरण, पैदा करने के लिए दो प्राथमिक चुनौतियों के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के लिए काफी मांग के आलोक में अक्षय एंटीबॉडी 1) चयन throughput और 2) प्रतिजन ए वी कर रहे हैंailability। समूहों की संख्या अब throughput और एंटीबॉडी पहचान की दर बढ़ाने के उद्देश्य से इन विट्रो चयन पाइपलाइनों में वर्णन किया है। ये विवरण विस्तार से पूर्ण लंबाई या तो पर चयन शामिल है कि आर्थिक रूप से व्यावहारिक दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग, 3,4 को लक्षित करता है, या संरचनात्मक रूप डोमेन के 5,6,7 संबंधित या तो मनका-आधारित 6,8 या 3,4 प्रतिजन स्थिरीकरण योजनाओं आधारित थाली। इसके अलावा, जीन संश्लेषण प्रौद्योगिकियों 9 के बढ़ते गोद लेने यथोचित लागत प्रभावी और संभावित शुद्ध, पूर्ण लंबाई प्रतिजन के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने में कठिनाई कम कर सकते हैं, विशेष रूप से अलग डोमेन की, व्यवस्थित प्रतिजन पीढ़ी बना दिया है। मिलकर में दो प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके, एक घुन्ना और स्केलेबल प्रतिजन पीढ़ी और एंटीबॉडी चयन पाइपलाइन व्यक्त प्रतिजन डोमेन के बड़े सेट के लिए एंटीबॉडी के समानांतर अलगाव को सक्षम और चा के लिए अभिकर्मकों के विकास की सुविधा होगी कि तैयार किया गया थासंरचनात्मक रूप या कार्यात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन की पूरी वर्गों racterizing।

इस उद्देश्य के लिए, व्यक्त प्रतिजन डोमेन, जीन संश्लेषण, एंटीजन और स्केलेबल फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी चयन के उच्च throughput बैक्टीरियल अभिव्यक्ति की सिलिको पहचान में जोड़े विकसित किया गया है कि एक एकीकृत पाइप लाइन की ओर। इस पाइपलाइन (लाइसेंस या सामग्री हस्तांतरण समझौते के माध्यम से तेजी से उपलब्ध हैं, जो एंटीबॉडी पुस्तकालयों सहित) सबसे जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए ही उपलब्ध आधारभूत संरचना की आवश्यकता है, लेकिन यह भी एक औद्योगिक पैमाने पर उपयोग के लिए स्वचालन करने के लिए उत्तरदायी है। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, यह आत्मीयता टैग प्रतिजन डोमेन के सैकड़ों उत्पन्न करने के लिए संभव है, और नियमित रूप से इन एंटीजन के कई लोगों के लिए अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी टुकड़े को अलग।

फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी फैब, scFv, और स्वायत्त Fv डोमेन और एक सहित पुनः संयोजक आत्मीयता अभिकर्मक प्रारूपों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रदर्शन किया अनुकूलता दिखाया गया हैछोटे 'वैकल्पिक व्यवस्थाएं' (डिजाइन किए ankyrin दोहराने प्रोटीन (DARPINS), फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन), lipocalin डोमेन और अधिक 10) की बढ़ती सरणी। यह इन तरीकों पुस्तकालयों के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है माना जाता है, हालांकि चर्चा, फैब एंटीबॉडी टुकड़े के अलगाव के लिए इस उदाहरण में प्रतिबंधित है। इस प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, छोटा करने के लिए कम nanomolar आत्मीयता के साथ Fabs, पूर्ण लंबाई प्रोटीन बाँध और ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में immunoassays में कार्य कर रहे हैं, जिनमें से कई शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन और दूसरों को सफलतापूर्वक चयनित किया गया है प्रतिलेखन कारक डोमेन, SH2 डोमेन, सहित प्रोटीन डोमेन में चिह्नित , immunoprecipitation और immunohistochemistry। महत्वपूर्ण बात है, पुनः संयोजक बंधन क्लोन पूरी तरह से अक्षय कर रहे हैं और अभिव्यक्ति से फिर से उत्पन्न किया जा सकता है, इस प्रकार के कठोर क्लोन सत्यापन की कीमत को न्यायोचित ठहरा, बैक्टीरियल उत्पादन भेंट वृद्धि की स्थिरता, reproducibility और लागत प्रभावशीलता के माध्यम से निर्माण करती है।

इस prot मेंocol और साथ वीडियो, स्थिर प्रतिजन डोमेन का उपयोग फेज-प्रदर्शित पुस्तकालयों से एंटीबॉडी के चयन के लिए बुनियादी तरीकों का प्रदर्शन कर रहे हैं। अन्य टैग 11,12,13 और चयन प्रारूपों भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है 13,14,2 हालांकि इस विशेष विधि, microwell प्लेटों में निष्क्रिय सोखना द्वारा immobilized जीएसटी टैग प्रोटीन डोमेन कार्यरत हैं। पहचान और सत्यापन के लिए विशेष रूप से समृद्ध प्रतिरूप एंटीबॉडी को अलग-थलग करने के उद्देश्य से चयन मापदंडों के समानांतर निगरानी के साथ चयन की स्थापना और संचालन के लिए महत्वपूर्ण विचार विस्तृत रहे हैं।

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Protocol

1. एंटीजन जनरेशन

नोट: एंटीजन डोमेन के संश्लेषित और एक उचित IPTG-inducible अभिव्यक्ति निर्माण में वाणिज्यिक विक्रेताओं की एक किस्म के द्वारा क्लोन किया जा सकता है।

  1. रासायनिक सक्षम, T1-फेज में अभिव्यक्ति निर्माणों रूपांतरण प्रतिरोधी, BL21 ई रासायनिक सक्षम कोशिकाओं के 20 एल के अलावा द्वारा पीछा एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में बर्फ पर 1X KCM के 20 μl में डीएनए एन्कोडिंग के 10 एनजी के मिश्रण से कोलाई कोशिकाओं।
  2. 10 मिनट के लिए आरटी पर 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेल / डीएनए मिश्रण को सेते हैं और फिर बर्फ पर फिर से के लिए 2 मिनट के एक सांस थाली मुहर के साथ, ग्लूकोज (समाज) मीडिया के साथ पूर्व गर्म सुपर इष्टतम शोरबा के 100 μl के साथ बचाव कवर करने से पहले और एक 2.5 सेमी कक्षीय प्रकार के बरतन में 200 rpm पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए।
  3. Luria-Bertani (पौंड) कार्बेनिसिलिन के साथ पूरक / अगर प्लेट (100 ग्राम / एमएल) और के लिए इस्तेमाल एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए ओ / एन विकसित करने के लिए पर बदल कोशिकाओं की प्लेट 5 μlग्लिसरॉल शेयरों पैदा होता है।
  4. 5 μl ग्लिसरॉल स्टॉक के साथ 2YT / कार्बोहाइड्रेट मीडिया के 1 मिलीलीटर टीका लगाना और 2.5 सेमी कक्षीय प्रकार के बरतन में 200 rpm पर झटकों के साथ एक 96 अच्छी तरह से गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए बढ़ता है।
  5. NZY media15 टीका लगाना इस संस्कृति का एक 1:40 कमजोर पड़ने के साथ (0.05% ग्लूकोज, 2% लैक्टोज, और 100 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन के साथ पूरक), तो एक 2.5 सेमी कक्षीय में 30 डिग्री सेल्सियस और 200 rpm पर 6-8 घंटे के लिए हिला प्रकार के बरतन।
  6. गोली बैक्टीरिया पहले प्रकाशित protocols16,17 अनुसार नी NTA राल के 100 μl युक्त एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट में उच्च throughput में प्रतिजनी प्रोटीन शुद्ध और।
  7. ब्रैडफोर्ड डाई-बाध्यकारी assay18 द्वारा शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण और एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर जुदाई और Coomassie दाग के साथ 10-50 माइक्रोग्राम प्रति के दृश्य से आकार और पवित्रता के लिए विशेषताएँ (चित्र 2 देखें)।
    नोट: इस अवस्था में प्रोटीन आगे प्रोटीन एकत्रीकरण 19 का आकलन है कि विधियों द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है 20 तह।

फेज लाइब्रेरी 2. तैयारी और अनुमापन

  1. T1 के फेज-प्रतिरोधी ई की एक भी कॉलोनी उठाओ 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक 2YT मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोलाई कोशिकाओं।
  2. सेल के विकास नेत्रहीन स्थापित हो जाने के बाद, संक्रमण के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक 2YT की एक बड़ी मात्रा में संस्कृति को कमजोर (पुस्तकालय कमजोर पड़ने के अनुसार आम तौर पर 45 μl, नीचे देखें।)।
  3. 30 मिनट और pelleting के लिए बर्फ पर incubating autoclaved 20% खूंटी-8000 के 1/5 मात्रा 2.5 एम NaCl (खूंटी NaCl) के साथ भंडारण बफर से फेज precipitating द्वारा उपयोग के लिए पुस्तकालय की तैयारी के 12,000 एक्स जी पर centrifugation द्वारा फेज उपजी।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और resuspend टी समायोजन, 1x पीबीएस पीएच 7.4, 0.2% BSA और 0.05% के बीच (पीबीटी) के एक उचित मात्रा में फेज उपजीओ चयन के लिए एक उपयुक्त फेज एकाग्रता (यदि आवश्यक) पर्याप्त पुस्तकालय कवरेज सुनिश्चित करने के लिए। चरण 2.9 और चर्चा देखें।
  5. एक बाँझ बहु अच्छी तरह से थाली में 1x पीबीएस 7.4 पीएच के 45 μl में एक 5 μl फेज विभाज्य पतला मिश्रण है, और एक ही बफर में दस गुना dilutions की एक श्रृंखला बनाने के लिए।
  6. T1 के फेज-प्रतिरोधी ई के 45 μl के लिए प्रत्येक फेज कमजोर पड़ने के 5 μl जोड़ें। कोलाई एक और multiwell थाली में प्रवेश चरण विकास में कोशिकाओं (= 0.4-0.8 आयुध डिपो 600), एक सांस की मुहर के साथ कवर और एक 2.5 सेमी कक्षीय प्रकार के बरतन में 30 मिनट के लिए 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. प्लेट 5 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन 100 के साथ पूरक एक पूर्व गर्म अगर प्लेट पर कुओं में से प्रत्येक से संक्रमित कोशिकाओं के μl और कालोनियों दिखाई दे रहे हैं, जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है।
  8. इस प्रकार के रूप में कुल फेज / एमएल की गणना:
    सबसे पतला नमूना एक्स 200 एक्स 10 मैं (जहां मैं = अधिकतम NUM में एक कार्बेनिसिलिन प्लेट पर कालोनियों के फेज / एमएल = संख्याdilutions की संख्या में जो कालोनियों) स्पष्ट कर रहे हैं।
  9. इस प्रकार के रूप पुस्तकालय विविधता के कवरेज सुनिश्चित करने के लिए लेपित प्रतिजन कुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, गणना:
    लेपित प्रतिजन कुओं की संख्या अपेक्षित =
    वांछित गुना कवरेज * पुस्तकालय विविधता
    100 μl प्रति फेज की #

फेज-प्रदर्शित पुस्तकालयों से 3. एंटीबॉडी चयन

3.1) एंटीजन स्थिरीकरण

  1. प्रतिजन गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं और इस dilutions की सुविधा के लिए, 96 अच्छी तरह प्लेटें गैर बाध्यकारी करने में 100x काम कर रहे सांद्रता (जैसे, 500 ग्राम / एमएल) और विभाज्य के लिए सामान्यीकृत एक शेयर प्रतिजन प्रोटीन थाली तैयार है कि फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए।
  2. पीबीएस के साथ शेयर प्लेटों से गिराए द्वारा चयन के प्रत्येक दौर के लिए एक दिन पहले शेयर प्रोटीन समाधान से प्रतिजन-लेपित प्लेटें तैयार करें।
  3. कोट 96 अच्छी तरह से जीएसटी टैग प्रतिजन प्रोटीन या नकारात्मक नियंत्रण पी के 100 μl के साथ उच्च प्रोटीन बाध्यकारी योग्य polystyrene प्लेटेंrotein पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (जीएसटी, बीएसए, neutravidin, आदि)। एक microplate प्रकार के बरतन पर 250 आरपीएम 4 डिग्री सीओ / एन पर हिला।
  4. Microplates लेपित से प्रोटीन समाधान निकालें, (1x पीबीएस 7.4 पीएच में 0.2% बीएसए) बफर अवरुद्ध 200 μl साथ प्रतिजन में लिपटे और नकारात्मक चयन प्लेटें ब्लॉक और 1-2 घंटे के लिए आरटी पर 250 rpm पर हिला।
  5. अवरुद्ध करने के बाद, 0.05% के बीच (पीटी) या तो स्वयं या एक स्वचालित microplate वॉशर का उपयोग कर बफर के साथ 1x पीबीएस 7.4 पीएच के 200 μl के साथ अवरुद्ध प्रोटीन लेपित प्लेटें चार बार धो लें।

3.2) लाइब्रेरी पूर्व निकासी और एंटीजन-फेज ऊष्मायन

  1. गैर के पुस्तकालय खलाना (या tag-) नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन या मुफ्त आत्मीयता टैग के साथ लेपित कुओं में से एक नंबर के लिए पीबीटी बफर में तैयार फेज पुस्तकालय के 100 μl (10 से 12 फेज) के हस्तांतरण के माध्यम से विशिष्ट बंधनकारी फेज-प्रदर्शित एंटीबॉडी टुकड़ा क्लोन प्रोटीन (जैसे, जीएसटी) लक्ष्य की संख्या के बराबर है और फेज सेते250 rpm पर झटकों के साथ आरटी पर 1-2 घंटे के लिए कुओं में।
    नोट: एक वैकल्पिक या नकारात्मक चयन के अतिरिक्त साधन के रूप में, ऊष्मायन भी आगे विशिष्ट लक्ष्य की वसूली टैग बाध्यकारी क्लोन को दूर करने और बढ़ाने के लिए अतिरिक्त (5-25 माइक्रोन) घुलनशील प्रोटीन आत्मीयता टैग (जैसे, जीएसटी) की उपस्थिति में किया जा सकता है क्लोन बाध्यकारी।
  2. प्रतिजन में लिपटे प्लेटों के लिए नकारात्मक चयन से स्थानांतरण फेज सतह पर तैरनेवाला और विशिष्ट बंधनकारी क्लोन के कब्जा करने के लिए 250 rpm पर झटकों के साथ आरटी पर 1-2 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. अनबाउंड फेज निकालें और microplate के कुओं धो 8-15 गुना पीटी बफर के साथ या तो स्वयं या एक microplate वॉशर का उपयोग कर। क्षालन के लिए सिर्फ पूर्व अतिरिक्त धोने बफर निकालें।

3.3) क्षालन, संक्रमण और फेज प्रवर्धन

  1. प्रारंभिक चयन के दिन पर, T1 के फेज-प्रतिरोधी ई की एक भी कॉलोनी उठाओ 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस वाई से बढ़ने 2YT मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोलाई कोशिकाओंएक 2.5 सेमी कक्षीय प्रकार के बरतन या समकक्ष में 200 rpm पर मिलाते वें।
  2. सेल के विकास की स्थापना की है और आंखों से देखा जा सकता है एक बार 2YT (आम तौर पर चयन के प्रति 100 μl अच्छी तरह से) संक्रमण के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए 50 स्नातकीय / एमएल टेट्रासाइक्लिन के साथ पूरक के साथ, मीडिया की मात्रा में वृद्धि।
  3. तो बाध्य फेज 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धोया प्रतिजन थाली करने के लिए कोशिकाओं के 100 μl जोड़ने और हिला elute करने के लिए, 0.4-0.8 के 600 तक पहुँच जाता है एक आयुध डिपो (लगभग 5-7 घंटे) तक कोशिकाओं को विकसित।
  4. 1 एक्स 10 10 CFU / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए M13K07 सहायक फेज जोड़ें और 200 rpm पर झटकों के साथ 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. 2YT के 1.2 मिलीलीटर कोशिकाओं स्थानांतरण 150 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और 75 माइक्रोग्राम प्रति के साथ पूरक / एमएल केनामाइसिन 2.5 सेमी में 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वी के नीचे और बढ़ने हे / एन के साथ एक 96 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में कक्षीय प्रकार के बरतन।

3.4) फेज तैयारी और Selec का बार-बार राउंडtion के

  1. Centrifugation द्वारा गोली बैक्टीरिया 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4000 XG पर।
  2. 10X पीबीटी के 1/10 वें मात्रा के साथ बेअसर और मिश्रण, एक मिनी ट्यूब 96 अच्छी तरह से बाँझ microplate नीले बॉक्स में दोहराने प्लेटों से फेज supernatants की बराबर मात्रा मिलाई। चयन के दोहराएँ राउंड 3-4 राउंड के लिए (चरण 3.1.1 से शुरू) या संवर्धन मनाया जाता है जब तक नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन की तुलना में (धारा 4 और 7 देखें)।
    नोट: चयन के शुरुआती दौर में महत्वपूर्ण / पहचाने जाने संवर्धन की उम्मीद नहीं है जब (यानी, एक राउंड और 2), (3 चित्र में दिखाया धारा 7 और प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित) इनपुट और आउटपुट फेज titres की मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने में मददगार हो सकता है न्यूनतम फेज (चर्चा में वर्णित) सफल चयन के लिए सांद्रता और जमा ELISAs की तुलना में अधिक उपयुक्त हैं।

जमा एलिसा द्वारा 4. विशेषता

  1. कोट 96 अच्छी तरह से उच्च प्रोटीन बाँधधारा 3.1 के अनुसार दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर प्रतिजन प्रोटीन या नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन (जीएसटी, बीएसए, neutravidin आदि) जीएसटी टैग की 100 μl के साथ योग्य polystyrene प्लेटें आईएनजी और 4 डिग्री सीओ / एन पर हिला।
  2. अतिरिक्त प्रतिजन निकालें एक microplate प्रकार के बरतन पर 250 rpm पर आरटी पर 1-2 घंटे के लिए झटकों के साथ अवरुद्ध बफर के 200 μl के साथ थाली ब्लॉक और या तो हाथ से या स्वचालित थाली वॉशर द्वारा 200 μl पीटी बफर के साथ चार बार धो लें।
  3. (: 10-1: एक पतला पीबीटी बफर में 20) फेज सतह पर तैरनेवाला के 100 μl लागू करें, 200 μl पीटी बफर के साथ आठ बार आरटी पर 15 मिनट के लिए 250 rpm पर हिला, और थाली धोने।
  4. (: पीबीटी बफर में 5000 1) 100 विरोधी M13 एचआरपी की μl जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए 200 rpm पर हिला, तो पीबीएस के 200 μl के साथ थाली में दो बार छह 200 μl पीटी बफर के साथ बार और धो लें।
  5. 1 के 100 μl लागू करें: एक TMB सब्सट्रेट और 5-15 मिनट के लिए विकसित (या पर्याप्त रंग विकसित की है, जब तक), तो एक महाराष्ट्र 3 के 100 μl के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया रोक 4 और 450 एनएम पर थाली पढ़ें।
  6. सामान्य में, फेज पूल में संवर्धन> 2 (चित्रा 4 देखें) की गैर विशिष्ट बंधन बनाम बाध्यकारी विशिष्ट के अनुपात के रूप में राउंड 3-4 में मनाया जा सकता है
    नोट: यह आत्मीयता टैग प्रोटीन पर कि उच्च निरपेक्ष बंधन संकेत नोट करने के लिए जानकारीपूर्ण है टैग विशिष्ट बाँधने (बल्कि लक्ष्य बाँधने से अधिक) के संवर्धन को इंगित करता है, और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन पर कि उच्च निरपेक्ष बंधन संकेत "गैर विशिष्ट या के संवर्धन को इंगित करता है चिपचिपा "बाँधने।

5. क्लोन चयन, अनुक्रमण और विशेषता

एकल फैब-फेज क्लोन के 5.1) अलगाव

  1. , अनुक्रमण और लक्षण वर्णन के लिए व्यक्तिगत क्लोन को अलग T1 के फेज-प्रतिरोधी ई में परिलक्षित फेज पूल के 1/10 वें मात्रा संक्रमित करने के लिए कोलाई एक दौर नीचे microtiter प्लेट में विकास की प्रवेश चरण में कोशिकाओं (= 0.4-0.8 आयुध डिपो 600), एक breatha के साथ कवरble थाली मुहर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 200 rpm पर झटकों के साथ सेते हैं।
  2. 2YT मीडिया में 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार है और ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन 100 के साथ पूरक अलग अगर प्लेटों पर बाहर थाली।
  3. 1 एक्स 10 9 M13K07 फेज / एमएल के साथ पूरक 2YT / कार्बोहाइड्रेट मीडिया के 450 μl में एकल कालोनियों उठाओ और 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating एक मिनी ट्यूब 96 अच्छी तरह से बाँझ microplate नीले बॉक्स में हे / एन बढ़ता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4000 XG पर कताई द्वारा गोली बैक्टीरिया।
  5. या के लिए (धारा 5.4 में वर्णित) प्रतिरूप फेज सतह पर तैरनेवाला फैब-फेज क्लोन के अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रतिरूप प्रत्यक्ष बाध्यकारी (धारा 5.3 और 21 में वर्णित है) जिसके लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा में दिखाए जाते हैं immobilized एंटीजन के खिलाफ विशिष्टता निर्धारित करने के लिए ELISAs 5।

लक्षण वर्णन के लिए फैब क्लोन के 5.2) अभिव्यक्ति

  1. के बाद एक उपयुक्त ई में क्लोनिंगहै xpression वेक्टर (चर्चा देखें), एक ई लेने कोलाई अभिव्यक्ति के साथ तब्दील कालोनियों एक बाँझ दन्तखुदनी या विंदुक टिप का उपयोग और 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए बढ़ने एक 96 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली में 2YT / कार्बोहाइड्रेट मीडिया के 1 एमएल में निर्माण करती है। यह या तो स्वयं या एक स्वचालित कॉलोनी बीनने के साथ किया जा सकता है।
  2. Studier एट अल की पद्धति के अनुसार एक 96 अच्छी तरह से deepwell ब्लॉक में ग्लूकोज / लैक्टोज / ग्लिसरॉल के साथ पूरक NZY मीडिया के 1.5 मिलीलीटर के लिए बढ़ संस्कृति के 40 μl स्थानांतरण। 15
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं 1 मिमी IPTG के अलावा द्वारा प्रेरित पूरक गैर और प्रोटीन अभिव्यक्ति में 3-4 घंटा (आयुध डिपो 0.8-1.0) के लिए विकसित किया जा सकता है।
  3. एक सांस मुहर के साथ संस्कृति ब्लॉक (एस) को कवर किया और 200 rpm पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 घंटे के लिए फैब क्लोन व्यक्त करते हैं। 15 मिनट के लिए 4000 XG पर स्पिन प्लेटें, बैक्टीरियल गोली कोशिकाओं सेल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों एक पन्नी मुहर के साथ सतह पर तैरनेवाला, कवर प्लेटों को हटाने और फ्रीज करने के लिए।
  4. Lysis बफर के 100 μl (Tris एचसीएल 50 मिमी, 200 मिमी NaCl, 1.25% ट्राइटन X-100 पीएच 1mg / एमएल लाइसोजाइम और 10 यू Benzonase / एमएल संस्कृति और protease inhibitors के साथ 8.0) के साथ एकत्र छर्रों से व्यक्त Fabs आजाद और 2 के लिए मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर घंटा।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटाने और एलिसा प्लेट (धारा 5.3 देखें) द्वारा विशिष्टता के प्रारंभिक लक्षण वर्णन में उपयोग के लिए कच्चे तेल की lysate सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।

Clonal फैब एलिसा बंधन प्रत्यक्ष द्वारा 5.3) क्लोन विशेषता

  1. बजाय एक 384 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए पीबीएस में दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / प्रतिजन के 30 μl aliquotting धारा 3.1 में वर्णित के रूप में एंटीजन स्थिर। 96 चैनल आधारित वितरण सिर का उपयोग करते समय थाली में ट्रैक्टर-आधारित प्रतिजन लेआउट अभिकर्मक हस्तांतरण की सुविधा कर सकते हैं। धारा 3.1 के अनुसार धो लें और ब्लॉक एलिसा प्लेटें।
  2. से एकत्र मंजूरी दे दी lysates धारा 5.2 ईवा के लिए स्थिर प्रतिजन को सीधे लागू किया जा सकता हैबंधन का luation। 200 rpm पर झटकों के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति lysate के 30 μl सेते हैं।
    नोट: शुद्ध फैब क्लोन प्रोटीन बारी-बारी से वर्णित एक ही तरीके से पीबीटी बफर में 10 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर गिराए और प्रतिजन या नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन (जीएसटी, बीएसए आदि) युक्त अवरुद्ध कर वेल्स को प्रत्येक क्लोन के 30 μl लागू करने और विकास के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है बिलो। वैकल्पिक रूप से, फैब-फेज भी फेज सतह पर तैरनेवाला के 10 μl गिराए द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है 20 μl पीबीटी बफर में (धारा 5.1 में वर्णित) (1: 3) और (कदम 4.4 में वर्णित - 4.5) विरोधी M13 एचआरपी एंटीबॉडी के साथ पता लगाने
  3. अतिरिक्त lysate निकालें और या तो स्वयं या एक स्वचालित थाली पीटी बफर के 8x 100 के साथ μl धोया और अतिरिक्त बफर निकालें का उपयोग कुओं धो लें।
  4. 200 rpm पर झटकों के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीटी बफर में माध्यमिक विरोधी झंडा एंटीबॉडी के 5,000 कमजोर पड़ने: एक एक के 30 μl सेते हैं।
  5. धो, विकसित करने और धारा 4.3 के अनुसार यों - 4.5।
    नोट: प्रतिनिधि परिणामillustrating विशिष्ट और गैर विशिष्ट दोनों बंधन क्लोन चित्रा 5 में दिखाया जाता है।

5.4) क्लोन अनुक्रमण

  1. तालिका 2 में संकेत के रूप में एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  2. एक पीसीआर थाली के कुओं में उपयुक्त प्राइमरों के साथ तैयार पीसीआर मास्टर मिश्रण के 20 μl के लिए उपयुक्त पीसीआर टेम्पलेट (फेज सतह पर तैरनेवाला या फिर निलंबित एकल phagemid युक्त बैक्टीरियल कॉलोनी या तो) के 2 μl जोड़ें।
    नोट: अलग-अलग मास्टर घोला जा सकता है दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला जीन का अनुक्रमण के लिए आवश्यक हैं।
  3. पीसीआर सेटिंग्स - 2 टेबल में सूचीबद्ध मापदंडों का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएँ।
  4. एक 300 एनएम transilluminator पर डीएनए दृश्य दाग और इमेजिंग के साथ पूरक एक 1% agarose जेल पर लोड हो रहा है डाई के साथ पूरा प्रतिक्रिया के 5 μl मिश्रण से पीसीआर प्रतिक्रिया की सफलता की जाँच करें।
  5. 0.2 युक्त बाँझ पानी के 10 μl के लिए पीसीआर उत्पाद के 2 μl जोड़ें; और exonuclease और झींगा alkaline फॉस्फेट के प्रत्येक μl अनुक्रमण के लिए तैयार करने में अतिरिक्त प्राइमरों दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रियता के द्वारा पीछा किया 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

स्वचालित चयन के लिए 6. प्रक्षेपित

6.1) पिपेट आधारित तरल हैंडलिंग

  1. एक 1% की तैयारी के पानी में (डब्ल्यू / वी) bromophenol नीले और एक 0.45 मिलीलीटर फिल्टर का उपयोग अघुलनशील कणों को हटा दें।
  2. (16 dilutions के कुल) पानी में 1% bromophenol नीले समाधान के 1,000 कमजोर पड़ने, और दो गुना धारावाहिक dilutions के साथ जारी: प्लेट रीडर पर absorbance के के रैखिक सीमा निर्धारित करने के लिए, एक एक तैयार करते हैं।
  3. एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl स्थानांतरण और 590 एनएम पर absorbance पढ़ें। प्लॉट निरपेक्ष कमजोर पड़ने कारक बनाम absorbance के और बाद के परीक्षण के लिए रैखिक सीमा के उच्च अंत के मध्य में एक कमजोर पड़ने का चयन करें।
  4. पानी के लिए या वास्तविक समाधान के लिए नीले bromophenol जोड़ेंकि तीन 96 अच्छी तरह प्लेटें pipetting के लिए पर्याप्त मात्रा में पिछले चरण में चुना कमजोर पड़ने, प्लस जलाशय में मृत मात्रा के आधार पर pipetted किया जाएगा।
  5. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर पानी pipetting द्वारा परीक्षण मात्रा देने के लिए एक एकल चैनल pipettor का जांचना (पानी के 100 μl आरटी पर 100 मिलीग्राम वजन का होता है।)
  6. Calibrated pipettor का उपयोग, तीन प्रतियों में, 590 एनएम पर उनके absorbances एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में कम से कम तीन कुओं को रंगे समाधान का परीक्षण मात्रा हस्तांतरण और पढ़ें।
  7. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर तीन खाली फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें वजन और उनकी जनता रिकॉर्ड है।
  8. जलाशय से तीन 96 अच्छी तरह प्लेटें से प्रत्येक के लिए और तीन प्रतियों में, 590 एनएम पर उनके absorbances मापने पिपेट परीक्षण मात्रा।
  9. प्रत्येक थाली वजन और जन में अंतर की गणना।
  10. सबसे पहले, (उदाहरण के लिए।, +/- 5%) प्रत्येक कुएं में absorbances सहनशीलता की सीमा के भीतर एक समान हैं, चाहे मूल्यांकन और वे वें के साथ संगत कर रहे हैं कि क्याcalibrated Pipetman के साथ हाथ-pipetting द्वारा प्राप्त ई absorbances। विशेष चैनलों लगातार खत्म या के तहत वितरित कर रहे हैं, (उदाहरण के लिए 6 चित्रा देखें) मरम्मत प्रक्रियाओं का पालन करें और सभी चैनलों वर्दी मात्रा में वितरित जब तक मूल्यांकन प्रक्रिया को दोहराने।
  11. दूसरा, एक बार सभी चैनलों में अच्छी तरह से प्रति, वर्दी मात्रा में वितरित औसत बड़े पैमाने पर अंतर की गणना करके उस मात्रा की सटीकता की जाँच करने के लिए इस बात की पुष्टि कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, 100 μl के लिए एक पूरी तरह से calibrated तरल हैंडलर सेट थाली के अनुसार पानी की 9.60 ग्राम, या पानी की 0.10 ग्राम प्रति अच्छी तरह से वितरित करेंगे। वितरित वास्तविक मात्रा लगातार अधिक या इच्छित मात्रा के अधीन है, तो एक सुधार कारक यानी, वास्तव में 100 μl देने के क्रम में 110 μl प्रोग्रामिंग, लागू किया जा सकता है।
    नोट: छोटे संस्करणों के लिए, उदाहरण के लिए, 10 μl, अटल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए हाथ से 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए पानी के 90 μl रंगे समाधान में अधिक bromophenol नीले, और पूर्व विभाज्य दस गुना का उपयोगsorbances रैखिक रेंज में measureable और गिर रहे हैं।

6.2) स्वचालित प्लेट धोने

  1. धारा 3.1 में वर्णित के रूप में 96 के अलग कुओं अच्छी तरह से (हर हालत के लिए दो प्लेटों का परीक्षण किया जा सकता है) microplates में सकारात्मक लक्ष्य और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन स्थिर।
  2. आरटी पर एक घंटा के लिए अवरुद्ध समाधान के साथ ऊष्मायन द्वारा गैर विशिष्ट बंधन साइटों को ब्लॉक।
  3. एक 10 से 13 CFU के समान 100 μl aliquots के जोड़ें / सभी प्लेटों में सभी कुओं को पीबीटी में फैब-फेज समाधान बाध्यकारी-लक्ष्य और दो ​​घंटे के लिए आरटी पर कोमल आंदोलन के साथ सेते एमएल।
  4. हर हालत में, संक्रमण और अनुमापन और एलिसा के लिए एक थाली के लिए एक थाली के हिसाब से दो प्लेटें धो लें।
  5. (धारा 4 में वर्णित) विरोधी M13 एचआरपी एंटीबॉडी और वर्णमिति सब्सट्रेट के साथ या विकास ((M13K07 अलावा) और 7.2.1 के बिना धारा 3.3 में वर्णित) बैक्टीरिया और अनुमापन में प्रत्यक्ष संक्रमण से धोने की प्रभावकारिता का मूल्यांकन।
  6. फेज titres frओम विशिष्ट क्लोन अक्सर क्लोन विशेष रूप से बांधता है जिसके खिलाफ एक स्थिर प्रोटीन से 10 5 -10 7 फेज / एमएल की रेंज में निकलेगा। नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन (जैसे, बीएसए) को कुछ अवशिष्ट बंधन जो समझौता कर सकते हैं, उम्मीद की जा रही है और आम तौर पर 10 से 2 -10 5 फेज / एमएल मनाया जाता है, फिर भी बहुत कम titres (यानी।, <10 1) पीढ़ी कड़े धोने संकेत कर सकते है एक चयन।
  7. फेज एलिसा द्वारा निर्धारित बंधन के लिए रोबोट धोने स्थापित हाथ धोने परिणाम (चित्रा 7) के बराबर है अगर सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन का निर्धारण करने के लिए, पूर्ण बंधन संकेतों की तुलना करें।

6.3) थाली वॉशर परिशोधन

  1. प्रारंभ करने के लिए परीक्षण किया जा परिशोधन प्रोटोकॉल चलाते हैं।
    नोट: हम कम से कम दोगुना कुल लाइन मात्रा का उपयोग करते हुए, और प्रधानमंत्री और 5 मिनट 0.5 में% सोडियम हाइपोक्लोराइट के लिए वॉशर सिर सोख की सलाह देते हैं, हौसले से पतला frओम वाणिज्यिक ब्लीच (आमतौर पर 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट)।
  2. लाइनों जब तक प्रधानमंत्री और बाँझ (autoclaved) पानी में 5 मिनट के लिए वॉशर सिर लेना और अंत में, प्रधानमंत्री प्रणाली हवा से भरे हुए हैं।
  3. प्रधानमंत्री बाँझ पानी या धोने बफर के साथ लाइनों।
  4. एक बार एक बाँझ 96 अच्छी तरह से microplate धो वॉशर से निकालें और बाँझ थाली मुहर के साथ सील। इस पूर्व प्रदूषण नियंत्रण थाली है।
  5. विभाज्य ओ के 100 μl / एन एक 96 अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं के लिए फेज संस्कृति सतह पर तैरनेवाला परिलक्षित।
  6. एक बार फेज-युक्त थाली धो, तो वॉशर से हटाने और एक प्लास्टिक या पन्नी थाली मुहर के साथ सील। इस प्रदूषण नियंत्रण थाली है।
  7. परिशोधन प्रोटोकॉल बाहर ले जाने का परीक्षण किया जा रहा है। इस उदाहरण में, दोहराने 6.3.1 और 6.3.2 कदम।
  8. एक बार, बाँझ microplate धो लें तो वॉशर और मुहर से हटा दें। इस परिशोधन परीक्षण थाली है।
  9. लॉग चरण ई की प्लेट 50 μl अनुमापन प्लेटों के लिए कोलाई; इस पूर्व infec हैtion के नियंत्रण थाली।
  10. पूर्व संदूषण, प्रदूषण और परिशोधन 96 अच्छी तरह प्लेटें खोल देना और ई के 100 μl जोड़ने प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सुझावों का उपयोग सभी कुओं के लिए लॉग-चरण विकास के चरण में कोलाई,।
  11. सील और 200 rpm पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  12. प्लेट 50 10 सेमी 2YT / कार्बोहाइड्रेट प्लेटों के लिए प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के तीन यादृच्छिक कुओं से संक्रमित कोशिकाओं के μl और 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  13. 1 मिलीलीटर 2YT प्लस अच्छी तरह से प्रति 100 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन युक्त गहरी अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक थाली के सभी कुओं से स्थानांतरण संक्रमित कोशिकाओं के 50 μl और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है।
  14. परिशोधन प्रोटोकॉल दोहराएँ और लाइनों सूखी वॉशर छोड़ दें।
    नोट: प्लेटों पर या तरल माध्यम में नहीं हे / एन वृद्धि पूर्व संक्रमण नियंत्रण, पूर्व प्रदूषण नियंत्रण या परिशोधन परीक्षण प्लेटों पर मनाया जाना चाहिए। कई कालोनियों और विकास प्रदूषण नियंत्रण प्लेट पर मनाया जाना चाहिए; की प्रभावोत्पादकता के बारे में नहीं तो, कोई निष्कर्षपरिशोधन प्रोटोकॉल बनाया जा सकता है। आदर्श रूप में, परिशोधन प्लेटों कोई कालोनियों और हे / एन प्लेटों में कुओं में से किसी में कोई हे / एन वृद्धि निकलेगा। परिशोधन प्रोटोकॉल की तंगी, उच्च ब्लीच सांद्रता के साथ वृद्धि हुई है अब समय और अतिरिक्त चक्र सोख जा सकता है।

7. इनपुट / आउटपुट अनुमापन

7.1) इनपुट फेज अनुमापन

  1. बाँझ फ़िल्टर पीबीएस के साथ 50 μl के लिए फेज के 5 μl विभाज्य पतला और मिश्रण।
  2. मल्टी चैनल पिपेट या एक 96 चैनल pipettor का उपयोग 10 से 10 बाँझ फ़िल्टर पीबीएस में धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने को तैयार है।
  3. T1 के फेज-प्रतिरोधी ई के 45 μl में पतला फेज के 5 μl टीका लगाना विकास (आयुध डिपो 0.6-0.8) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक सांस की मुहर के साथ कवर सेते के प्रवेश चरण में कोलाई कोशिकाओं।
  4. 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और ओ / एन एक सेते के साथ पूरक एक पौंड / अगर प्लेट पर संक्रमित कोशिकाओं की प्लेट 5 μlटी 37 डिग्री सेल्सियस।
  5. फेज एकाग्रता कालोनियों की धारा 2.8 में विस्तृत गणना के अनुसार दिखाई देते हैं, जिसमें सबसे पतला नमूना से अनुमान लगाया जा सकता है।

7.2) आउटपुट फेज Pitrations

  1. ई के अलावा द्वारा थाली बाध्य फेज की क्षालन के बाद कोलाई कोशिकाओं, autoclaved 2YT मीडिया के साथ 50 μl के लिए फेज संक्रमित कोशिकाओं के 5 μl विभाज्य पतला
  2. एक मल्टी चैनल पिपेट या 96 चैनल pipettor का उपयोग 10 से 6 autoclaved 2YT मीडिया में धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने को तैयार है।
  3. 5 प्लेट 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन के साथ पूरक एक अगर प्लेट पर संक्रमित कोशिकाओं के μl और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  4. फेज एकाग्रता कालोनियों की धारा 2.8 में विस्तृत गणना के अनुसार दिखाई देते हैं, जिसमें सबसे पतला नमूना से अनुमान लगाया जा सकता है।
    नोट: दोनों ही मामलों (में यानी, इनपुट और आउटपुट फेज titres, दोनों टेट्रासाइक्लिन पर कॉलोनी की संख्या के साथ तुलना (कुल सेलएल संख्या) और केनामाइसिन (सहायक फेज अनुमापांक) भी जानकारीपूर्ण हो सकता है।

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Representative Results

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल समानांतर में मिश्रित फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों से structurally- और कार्यात्मक रूप से संबंधित प्रतिजन डोमेन दोनों की एक किस्म के लिए एंटीबॉडी के टुकड़े को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रतिजन उपलब्धता से संबंधित मुद्दों एंटीबॉडी चयन 23 के लिए उपयुक्त हैं कि व्यक्त प्रतिजन डोमेन के सिलिको पहचान में से, कई मामलों में, उन्हें धोखा दिया जा सकता है। एक ही प्रयोगशाला के भीतर एंटीबॉडी चयन करने के लिए (चित्रा 1) प्रतिजन अभिव्यक्ति युग्मन यह चयन करने के लिए महत्वपूर्ण प्रतिजन मापदंडों और अधिक आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है जिसमें एक एकीकृत पाइपलाइन का निर्माण करने के लिए संभव हो जाता है। ज्यादातर मामलों में, डोमेन सीमाओं से सावधान दृढ़ संकल्प एंटीबॉडी चयन करने में सफल प्रयोग के लिए अभिव्यक्ति और 96 या 24 अच्छी तरह से deepwell प्लेटों में उच्च throughput अभिव्यक्ति से पर्याप्त शुद्ध प्रतिजन की पर्याप्त मात्रा के अलगाव (चित्रा 2) सक्षम बनाता है। लगातार दौरानचयन प्रक्रिया के दौर, विशेष रूप से प्रतिजन कि बाँध eluted फेज सांद्रता और फेज के संवर्धन एक एलिसा परख में या तो फेज अनुमापन (चित्रा 3) या फेज पूल के साथ (चित्रा 4) द्वारा नजर रखी जा सकती है। एक बाध्यकारी अनुपात (> 2) आम तौर पर विशिष्ट बंधनकारी क्लोन की उपस्थिति इंगित करता है। इसके विपरीत, एक कम अनुपात (<2) एक चयन की विफलता के कारण का पता लगाने में मदद कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च गैर विशिष्ट आयुध डिपो के साथ एक अनुपात <2 गैर विशिष्ट क्लोन (या चिपचिपा बाँधने) की अपर्याप्त हटाने का संकेत कर सकते हैं और चयन के प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन वारंट सकता है। संवर्धन का पता चला है एक बार फिर भी, व्यक्तिगत उच्च आत्मीयता क्लोन तो अनुक्रमण और लक्षण वर्णन के लिए अलग किया जा सकता है। क्लोन एक वर्णमिति Immunoassay में विशेषता और संवर्धन का एक उपाय है, नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन बनाम स्थिर प्रतिजन के लिए फैब-फेज या फैब के बंधन उपज की तुलना (टीए के लिए बाध्य करने के अनुपात में सक्षम बनाता जा सकता बंधननकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन या आत्मीयता टैग प्रोटीन) (चित्रा 5) बनाम rget।

स्केलिंग और इस विधि के स्वचालन के दौरान, तरल से निपटने इकाई के महत्वपूर्ण कार्यों के मूल्यांकन के वास्तविक चयन के दौरान इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह के समाधान के साथ उचित और सही संचालन को सुनिश्चित करने के लिए सहायक हो सकता है। समाधान में अवशोषित chromophores के उपयोग fluidics में विशिष्ट चैनल (आकांक्षा या वितरण) या तो भरा रहे हैं या चित्र में सचित्र के रूप में आंशिक मात्रा वितरण में जिसके परिणामस्वरूप मुहर खो दिया है जब पता लगाने के लिए मदद कर सकते हैं 6। स्वचालित धोने इकाइयों को भी परिवर्तनशीलता का एक स्रोत हो सकता है और ध्यान देने की आवश्यकता होती है सकते हैं। नाम से जाना जाता बंधन क्लोन के उपयोग इस तरह के वितरण की गति, धोने की मात्रा और washes की संख्या के रूप में धोने के मापदंडों अनुकूलित किया जा रहा है जब पृष्ठभूमि हटाया बंधन जबकि बनाए रखा है बाध्यकारी लक्ष्य है कि चित्रा (7) सुनिश्चित करने के लिए लक्ष्य नियंत्रण प्रोटीन के बीच बंधन की तुलना में सक्षम बनाता है। निन्नलिखितफेज समाधान के साथ एक स्वचालित थाली वॉशर का उपयोग करते हैं, प्रभावी परिशोधन प्रोटोकॉल चयन या अलग चयन प्रक्रियाओं और एक समस्या निवारण / व्याख्या गाइड तालिका 3 में प्रदान की जाती है की लगातार राउंड से पार संदूषण के अभाव सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1. अवलोकन -। उच्च throughput प्रतिजन उत्पादन और एंटीबॉडी चयन पाइपलाइन यह अवलोकन एक प्रतिनिधि प्रतिजन पीढ़ी और एंटीबॉडी चयन पाइप लाइन के एक कदम-दर-कदम दृश्य से पता चलता है। प्रतिजन डोमेन सीमाओं की में सिलिको पहचान खराब होती जा सकता है कि प्रोटीन के लिए डोमेन पर जीन संश्लेषण, अभिव्यक्ति और चयन सक्षम बनाता है। अभिव्यक्त किए जाते हैं प्रतिजन डोमेन के स्थिर और एक सह से विशिष्ट उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी क्लोन के पूल को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंmbinatorial एंटीबॉडी पुस्तकालय filamentous फेज की सतह पर प्रदर्शित होता है। व्यक्तिगत एंटीजन से eluted और प्रवर्धित एंटीबॉडी फेज की ताल तो। पूर्व लक्षण वर्णन के लिए अलग-अलग बंधन क्लोन के अलगाव के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन बनाम स्थिर लक्ष्य की तुलना एलिसा आधारित assays में विशिष्ट बंधनकारी क्लोन के दौर करने वाली दौर संवर्धन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
आत्मीयता टैग एंटीजन चित्रा 2. एसडीएस पृष्ठ दृश्य। व्यक्त की और शुद्ध 6X उसका जीएसटी टैग प्रतिजन डोमेन (5-10 केडीए डोमेन + 26 केडीए जीएसटी) मूल प्रतिजन की सिलिको विश्लेषण में से पहचान का एक प्रतिनिधि एसडीएस पृष्ठ डोमेन सीमाओं। प्रोटीन डोमेन व्यक्त की और Affi से अलग-थलगसामुदायिक शुद्धि आकार के आधार पर पहचान, पर्याप्त पैदावार और फेज-एंटीबॉडी चयन में उपयोग को सक्षम करने के लिए शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए पूर्व चयन करने के लिए एसडीएस पृष्ठ की विशेषता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3 फेज उत्पादन titres का दृश्य। फेज उत्पादन titres सबसे कम कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं (टेट्रासाइक्लिन, कार्बेनिसिलिन और केनामाइसिन) के साथ पूरक अगर मीडिया पर एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला पर फेज से संक्रमित कोशिकाओं को बाहर चढ़ाना द्वारा निर्धारित कर रहे हैं जो कालोनियों में मनाया और प्रतिजन लक्ष्य और eluted करने के लिए बाध्य फेज की संख्या का अनुमान किया जा सकता है। एक बड़ी देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के आर संस्करण।

चित्रा 4
जमा एलिसा द्वारा नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन के लिए लक्ष्य की चित्रा 4. बाध्यकारी अनुपात। संवर्धन की प्रगति विशिष्ट लक्ष्यों और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन और / या पृथक आत्मीयता टैग दोनों के खिलाफ अलग-अलग परिलक्षित eluents स्क्रीनिंग द्वारा चयन के निम्नलिखित राउंड का मूल्यांकन किया जा सकता है। साजिश में दिखाया गया समानांतर में नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन की तुलना में उनके 96 संबंधित एंटीजन के खिलाफ 96 अलग-अलग फेज-एंटीबॉडी पूल के बंधन के लिए संवर्धन अनुपात हैं। प्रत्येक अनुपात मूल्य लक्ष्य या M13 फेज कोट प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक एचआरपी-दूसरे से जुड़ने एंटीबॉडी का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन या तो फेज पूल के बंधन यों कि दो absorbance के माप से ली गई है। दो या अधिक से अधिक (लाल रंग में दर्शाया के रूप में अक्सर 2-10 या अधिक से लेकर) के अनुपात दहलीज संवर्धन का एक संकेत के रूप में प्रयोग किया जाता हैऔर विशिष्ट बंधनकारी क्लोन की संभावना उपस्थिति। कम अनुपात की विफलता या प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन वारंट सकता है कि चयन के साथ विशिष्ट मुद्दों सूचित कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रत्यक्ष बंधन प्रतिरूप फैब-फेज या फैब एलिसा। (फैब-फेज या फैब स्वरूप में चाहे) 384 अच्छी तरह से प्लेट में स्थिर प्रोटीन बनाम एलिसा आधारित परख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता एकल क्लोन के बंधन। फैब-फेज या फैब पर एक समानता टैग पर M13 कोट प्रोटीन के खिलाफ एक माध्यमिक एचआरपी-दूसरे से जुड़ने एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया है, बाइंडिंग। प्रतिजन, नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन और प्रतिजन आत्मीयता टैग (जीएसटी) को लक्षित करने प्रतिरूप फैब-फेज के बंधन के लिए कच्चे absorbance के मूल्यों विशिष्ट द्वि illustrating चित्रित कर रहे हैंnders (A01, A04, A06), और चिपचिपा बाँधने (A05)।

चित्रा 6
स्वचालित तरल हैंडलिंग इकाई द्वारा तिरस्कृत संस्करणों की चित्रा 6 मूल्यांकन। रोबोट या मैनुअल 96 अच्छी तरह से pipetting सिस्टम द्वारा इरादा संस्करणों के अनुरूप और सही वितरण रंगे समाधान और एक प्लेट रीडर का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। इस उदाहरण में, एक समाधान युक्त bromophenol नीले रंग के 10 μl एक भी टिप बॉक्स का उपयोग कर दो 96 अच्छी तरह से प्लेटों के सभी कुओं के लिए pipetted क्रमिक रूप से है। हर अच्छी तरह से संक्रमित ई करने के लिए सहायक फेज के अलावा करने के लिए 90 μl / अच्छी तरह से DH 2 हे, अनुरूप होता है कोलाई। 590 एनएम पर प्रत्येक थाली के absorbances तीन प्रतियों में पढ़ रहे हैं, और मात्रा में एक मानक वक्र से interpolated एक calibrated एक चैनल Pipetman का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं। पहली और दूसरी प्लेट पर एक ही पंक्ति के लिए दिया वॉल्यूम दिखाए जाते हैं। एफआइआर पर ध्यान दें किटी थाली, अच्छी तरह से इ 04 कोई रंगे समाधान प्राप्त करता है, और दूसरी प्लेट पर, यह एक डबल मात्रा प्राप्त करता है। इस टिप स्पर्श लगातार वितरण के लिए पर्याप्त नहीं है कि इंगित करता है, और आगे अनुकूलन की आवश्यकता है। तीन प्रतियों absorbance के मापन के लिए 95% विश्वास अंतराल दिखाए जाते हैं।

चित्रा 7
स्वचालित थाली धोने की चित्रा 7. मूल्यांकन। अनबाउंड फेज के प्रभावी हटाने धोने की स्थिति बदलती है, जबकि स्थिर सकारात्मक (विरोधी झंडा एंटीबॉडी) और नकारात्मक (बीएसए) नियंत्रण प्रोटीन के लिए बाध्य फैब-फेज को मापने के लिए एक एलिसा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। इस उदाहरण में, भोले पुस्तकालय (पीबीटी में 10 से 13 CFU / एमएल) के अनुरूप इनपुट फेज हाथ से, आठ या सोलह washes के उपयोग कर या रोबोट का उपयोग कर निकाल दिया जाता है। स्थिर विरोधी झंडा एंटीबॉडी के लिए बाध्य विशिष्ट है के रूप में बीएसए के लिए बाध्य अवशिष्ट फेज, सभी शर्तों भर में एक ही है, इंडिकइस कम प्रवाह दर पर कि ating, दोनों तरीकों बराबर और पर्याप्त कड़े हैं। डुप्लिकेट कुओं से 95% विश्वास अंतराल दिखाए जाते हैं।

समाधान
2YT मीडिया - 7.0, और आटोक्लेव के लिए समायोजित, 1 एल पीएच पानी जोड़ें। खमीर निकालने 10 ग्राम
tryptone 16 जी
NaCl 5 ग्राम
NZY मीडिया (1 एल) न्यूजीलैंड अमाइन 10 ग्राम
खमीर निकालने 5 ग्राम
50X ZYM-5052 20 मिलीलीटर
20 नमक शेयर 50 मिलीलीटर
50x ZYM-5052 चीनी स्टॉक (1 एल) ग्लूकोज़ 25 ग्राम
लैक्टोज 100 ग्राम
ग्लिसरॉल 250 मिलीलीटर
20x नमक शेयर (1 एल) ना 2 HPO 4 500 मिमी
के.एच. 2 पीओ 4 500 मिमी
एनएच 4 सीएल 1 एम
ना 2 अतः 4 100 मिमी
कार्बेनिसिलिन (CARB): 100 मिलीग्राम / पानी में मिली। फिल्टर बाँझ।
Kanamycin (कान): 25 मिलीग्राम / पानी में मिली। फिल्टर बाँझ।
टेट्रासाइक्लिन (TET): 10 मिलीग्राम / पानी में मिली। फ़िल्टर बाँझ।
खूंटी NaCl खूंटी
NaCl 2.5 मीटर
1x पीबीएस (pH7.2) NaCl 137 मिमी
KCl 3 मिमी
ना 2 HPO 4 8 मिमी
के.एच. 2 पीओ 4 1.5 मिमी
1X KCM KCl 500 मिमी
2 CaCl 150 मिमी
2 MgCl 250 मिमी
समाज मीडिया खमीर निकालने 5 ग्राम / एल
tryptone 20 ग्राम / एल
NaCl 10 मिमी
KCl 2.5 मिमी
MgSO 4 20 मिमी
ग्लूकोज़ 20 मिमी
बफर अवरुद्ध पीबीएस 1x
बीएसए 0.20%
पीबीटी बफर पीबीएस 1x
बीएसए 0.20%
बीच 0.05%
पीटी बफर पीबीएस 1x
बीच 0.05%
फॉस्फोरिक एसिड एच 3 P0 4 1 एम

तालिका 1. मीडिया और समाधान।

पीसीआर मास्टर मिक्स सेट अप <> / मजबूत
अवयव प्रतिक्रिया प्रति μl
वाटर 19.45
10x Taq के बफर 2.5
dNTPs (10 मिमी शेयर) 0.675
DMSO के 0.75
Taq एंजाइम 0.125
आगे प्राइमर (100 उम शेयर) 0.25
रिवर्स प्राइमर (100 उम शेयर) 0.25
भारी चेन अनुक्रमण प्राइमरों
M13 आगे प्राइमर GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC
M13 रिवर्स प्राइमर CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA
प्रकाश श्रृंखला अनुक्रमण प्राइमरों
M13 आगे प्राइमर TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG
M13 रिवर्स प्राइमर CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG
पीसीआर सैटिंग्स
चरण 1। 3:00 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
चरण 2। 0:30 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
चरण 3। 0:30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
चरण 4। 1:00 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
चरण 2 और 24x दोहराने के लिए लौटें चरण 2 पर कूद
चरण 5। 72 7:00 मिनट के लिए सी °
चरण 6।

तालिका 2 पीसीआर मास्टर मिक्स और सेटिंग्स।

परिशोधन परिणामों की व्याख्या
थाली उम्मीद की कार्बेनिसिलिन अनुमापांक यदि नहीं, तो?
पूर्व संक्रमण नियंत्रण 0 प्रकोष्ठों पूर्व संक्रमित थे; कुछ भी नहीं प्रयोग से यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है।
प्रदूषण नियंत्रण लान अपर्याप्त संदूषण बाद परिशोधन की प्रभावकारिता का आकलन करने में सक्षम हो; यह aspirating बजाय फेज समाधान में कई गुना जलमग्न पर विचार करें।
परिशोधन परीक्षण 0 परिशोधन पूरा नहीं; समय सोख वृद्धि, ब्लीच concentration या कोशिश एसडीएस और EtOH washes के बजाय।

टेबल वॉशर परिशोधन 3. मूल्यांकन। परिशोधन की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, यह है कि वॉशर फेज के साथ दूषित किया गया था दिखाने के लिए आवश्यक है, और परिशोधन प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक संदूषण कि सफाया कि। प्रतिरोध कार्बेनिसिलिन प्रदान कि फेज का उपयोग करना, इस तरह के एक परीक्षण से उम्मीद परिणामों वास्तविक परिणाम की उम्मीद है और परिणाम से अलग कर देना चाहिए सुझावों के साथ-साथ सूचीबद्ध कर रहे हैं।

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Discussion

इन विट्रो एंटीबॉडी चयन में आयोजित करते हैं, चयन सफलता के दो प्राथमिक निर्धारकों पर चयन के लिए) अच्छी तरह से मुड़ा हुआ प्रतिजनी लक्ष्य के अलगाव हैं 1 और 2) एक उच्च कार्यात्मक विविधता एंटीबॉडी पुस्तकालय की उपलब्धता। कई मामलों में, अच्छी तरह से मुड़ा हुआ, पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा की उपलब्धता को सीमित किया जा सकता है। इस सीमा पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण एक उपयुक्त आत्मीयता टैग के साथ एक जीवाणु अभिव्यक्ति वेक्टर में सम्मिलन के लिए पहले से पंजीकृत विश्लेषण 22 से पहचान की है और संश्लेषित डोमेन का उपयोग करने के लिए है।

, विलेयता वृद्धि शुद्धि की सुविधा और अस्थिर डोमेन के स्थिर करने के लिए। 11 किसी भी वांछित डालने अनुक्रम एक अत्यंत बहुमुखी प्रतिजन पीढ़ी मंच में सक्षम बनाता है वस्तुतः synthesize करने की क्षमता के लिए जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है कि टैग की एक किस्म है। जीएसटी में चिह्नित प्रारूप आम है, सफल परिणाम पहले से कर दिया गया हैhexahistidine, एफसी, हेलो, माल्टोज़ बाध्यकारी प्रोटीन और साइट विशेष biotinylation टैग का उपयोग कर प्राप्त की है और यह असंख्य अन्य आत्मीयता टैग एक समान मंच में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि माना जाता है। हालांकि, आत्मीयता टैग बहाव के अनुप्रयोगों 11 में लाभकारी है और अनायास ही नकारात्मक परिणाम दोनों हो सकते हैं और अच्छी तरह से एक विशेष प्रारूप के आधार पर एक पाइप लाइन स्थापित करने से पहले जांच की जानी चाहिए।

अक्सर नए उपयोगकर्ताओं को एक एंटीबॉडी पुस्तकालय की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कैसे का सवाल खड़ा हो जाएगा और कोई सीधा जवाब है, हालांकि एक समग्र विविधता, रिश्तेदार प्रदर्शन का स्तर, की प्रकृति सहित (प्राकृतिक या कृत्रिम चाहे) कई प्रमुख विशेषताओं का आकलन करने के लिए प्रयास करना चाहिए और यादृच्छिकीकरण की हद तक (यानी, अनुक्रमण द्वारा निर्धारित पुस्तकालय सामग्री बनाम पुस्तकालय डिजाइन) और इरादा आवेदन बनाम एंटीबॉडी के भौतिक गुणों। इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे, एक अधिक विस्तृत treatme यद्यपिइन सुविधाओं के NT और कैसे वे एंटीबॉडी के चयन को प्रभावित कर सकते हैं यहां 2,23 पाया जा सकता है। पुस्तकालय विविधता का ज्ञान, विशेष रूप से, महत्वपूर्ण चयन के दौरान विविधता की पर्याप्त कवरेज सुनिश्चित करना है। आमतौर पर, पुस्तकालय में प्रत्येक फेज क्लोन की 100-1,000 प्रतियां प्रदान करता है कि एक फेज एकाग्रता वांछनीय है और पुस्तकालय में मौजूद किसी भी सच सकारात्मक बाँधने बरामद किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए। हालांकि, फेज की गैर विशिष्ट बंधन में नाटकीय रूप से ऊपर 10 से 13 फेज / एमएल, और बहुत ही विविध पुस्तकालयों के लिए सतहों बढ़ जाती है microplate करने के लिए, प्रतिजन के प्रति एक अच्छी तरह से अधिक से अधिक पर्याप्त कवरेज सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इनपुट पुस्तकालय भी कमजोर है, तो दूसरी ओर, सच है, सकारात्मक बाँधने का पूर्ण एकाग्रता अब तक वे बरामद नहीं किया जाएगा कि केडी (आमतौर पर एनएम) से नीचे हो जाएगा। इन बाधाओं को देखते हुए, फेज पुस्तकालयों आम तौर पर चयन के पहले दौर के लिए 12-13 अक्टूबर फेज / मिलीलीटर resuspended किया जाना चाहिए।0; इस एकाग्रता में, फेज की 100 एल विभाज्य एक 10 9 -10 10 विविधता पुस्तकालय का एक 1,000-100 गुना कवरेज का प्रतिनिधित्व करता है और नियमित रूप से विविध एंटीजन को बंधन क्लोन उपज कर सकते हैं। कम सांद्रता, या बढ़ा विविधताओं से कम, यह (धारा 2.9 देखें) पहले दौर में के खिलाफ चयनित प्रतिजन के कुओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एक दौर के बाद, हालांकि, पुस्तकालय के गैर-बाध्यकारी विविधता के सबसे निकाल दिया गया है; 1 दौर उत्पादन विविधता के अतिरिक्त कवरेज एक भी अच्छी तरह से उपयोग करते हुए सबसे अधिक बार आसानी से प्राप्त है। 96 अच्छी तरह से प्लेट में समानांतर चयन के मामलों में, यह पहले दौर के बाद सिर्फ एक करने के लिए आवश्यक प्रतिजन चयन प्लेटें, की संख्या को कम कर सकते हैं।

संवर्धन करने के लिए पर्याप्त नहीं है, जहां विशेष रूप से चयन के शुरुआती दौर में चिंता के क्षेत्रों की पहचान करने में मदद कर रहा है, जबकि वास्तविक चयन के दौरान, फेज अनुमापन, विशेषताएँ और प्रगति की निगरानी करने के उद्देश्य के उपायों की पेशकश कर सकते हैंपता लगाया जा। इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए चयन की स्केलिंग के दौरान विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। सामान्य में, इनपुट फेज titres (यानी, भोले पुस्तकालय या eluted फेज के पद-प्रवर्धन) संभावित संदूषण का संकेत गरीब सेल के विकास / कम फेज titres के साथ, (10 से 12 -10 13 फेज / एमएल) के दौर के बीच अपेक्षाकृत स्थिर रहना चाहिए और / या पिछले दौर से गरीब उत्पादन। उत्पादन फेज titres चयन के बाद के दौर में संवर्धन के दौरान वृद्धि की उम्मीद कर रहे हैं, पहले दो राउंड में 10 3 -10 5 CFU / एमएल की एक श्रृंखला की उम्मीद है। इस रेंज से विचलन ऐसे संदूषण या अतिरिक्त धोने तंगी के रूप में चयन के साथ संभावित समस्याओं का संकेत कर सकते हैं। चयन के बाद के दौर में (यानी, 3 राउंड और 4), विशेष रूप से लक्ष्य प्रतिजन कि बाँध क्लोन के संवर्धन के लक्ष्य प्रतिजन और नकारात्मक दोनों के खिलाफ फेज पूल के बंधन उपाय है कि जमा ELISAs के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकतानियंत्रण प्रोटीन (धारा 4 देखें)।

चयन के 3-4 राउंड के बाद (: 2 के नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन संकेत अनुपात: या लक्ष्य प्रोटीन पर संवर्धन एक लक्ष्य प्रतिजन तक पहुँच गया है एक बार पृष्ठभूमि प्रोटीन की तुलना में एक या अधिक), संक्रमित बैक्टीरियल कोशिकाओं अनुक्रमण के लिए एकल phagemid कालोनियों को अलग-थलग करने के लिए चढ़ाया जाता है , प्रारंभिक लक्षण वर्णन और क्लोनिंग यदि आवश्यक है। इस समय, यह अतिरिक्त लक्षण वर्णन से पहले फैब मुक्त करने के लिए फैब-फेज कन्वर्ट करने के लिए अत्यधिक की सलाह दी जाती है। फैब-फेज फेज सतह पर तैरनेवाला के 10 μl गिराए द्वारा प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (कदम 4.4 में वर्णित - 4.5) 20 μl पीबीटी बफर में और विरोधी M13 एचआरपी एंटीबॉडी के साथ पता लगाने (धारा 5.1 में वर्णित) हमारे अनुभव में, फेज कण और जल्दी रूपांतरण झूठी सकारात्मक के साथ मुद्दों का निराकरण कर सकते हैं से बाध्यकारी गुण मुक्ति पर क्लोन के 5-20% से कहीं भी काफी हद तक बदल सकते हैं। रूपांतरण के लिए इस्तेमाल विशिष्ट पद्धति uniqu पर निर्भर करेगाई phagemid की वास्तुकला और इस तरह यहाँ स्पष्ट रूप से निपटा नहीं किया जाएगा। हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया वैक्टर में, यह आम तौर पर एक सक्षम गैर-शमन ई में शुद्ध phagemid (या phagemid पूल) की 1) परिवर्तन के द्वारा पूरा किया जा सकता है ऐसे HB2151 या 55,244 एक एम्बर स्टॉप (टैग) कोडोन फैब और PIII प्रोटीन, फैब और PIII प्रोटीन के बीच एक एम्बर स्टॉप कोडोन के 2) प्रविष्टि एक गैर-शमन तनाव में घुलनशील एंटीबॉडी टुकड़े की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए हस्तक्षेप यदि या के रूप में कोलाई तनाव 3) एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर करने में व्यक्तिगत phagemid या phagemid पूल) से इम्युनोग्लोबुलिन जीन (क्लोनिंग द्वारा। आगे चयन और लक्षण वर्णन को कारगर बनाने के लिए, जमा क्लोनिंग तरीकों को भी, दोनों अभिव्यक्ति lysates जल्दी लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया जाता है, जहां फैब-फेज कणों और की झूठी सकारात्मक बंधन के लिए क्षमता को नष्ट करने, अभिव्यक्ति निर्माणों में सामूहिक रूप से बाध्यकारी क्लोन परिवर्तित करने के लिए प्रभावी साधन प्रदान कर सकता है लागत और शुद्धि का प्रयासशुरू में बचा जा सकता है।

(24 में वर्णित) लाइब्रेरी एफ से सीधे पृथक क्लोन के लिए, एंटीबॉडी चर डोमेन (लाइब्रेरी एफ निर्देशित प्राइमरों के लिए सामग्री की तालिका 2 देखें क्षेत्रों (CDRs) का निर्धारण करने पूरकता बढ़ाना पीसीआर को टेम्पलेट के रूप में फेज सतह पर तैरनेवाला के 1-2 μl का उपयोग कर अनुक्रम किया जा सकता है )। इन प्राइमरों का प्रयोग, भारी और प्रकाश श्रृंखला चर क्षेत्रों क्रमशः सभी तीन CDRs को कवर, ~ 700 और ~ 500 बीपी के उत्पादों निकलेगा। प्राइमर सबसे अनुक्रमण कोर सुविधाओं में उपलब्ध मानक प्राइमरों का उपयोग (धारा 5.4.5 में वर्णित के रूप में) उत्पादों की सफाई के बाद अनुक्रम किया जा सकता है कि इस तरह के M13 प्राइमरों के लिए annealing के साइटों में शामिल हैं। वैकल्पिक रूप से, ई में सीधे एक अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन और तब्दील कर दिया गया है कि फैब-फेज पूल के लिए कोलाई अभिव्यक्ति के लिए, एकल कालोनियों अलग किया जा सकता है और एकल ग के लिए टेम्पलेट के रूप में सीधे इस्तेमाल किया 2YT के 15 μl और सेल निलंबन के 1-2 μl में resuspendedउपयुक्त प्राइमरों का उपयोग olony पीसीआर।

स्वचालित चयन कई महत्वपूर्ण रोबोट कार्यों के अनुकूलन और सत्यापन की आवश्यकता होगी। सामान्य में, पिपेट आधारित तरल से निपटने सभी 96 चैनलों में सटीक और सुसंगत होना चाहिए, थाली धोने चयन थाली से adsorbed के प्रतिजन या बाध्य फैब-फेज अलग करना बिना कुशलतापूर्वक अनबाउंड फेज को दूर करना होगा। राउंड संवर्धन और प्रभावी जवाबी चयन, और बीच बाद में चयन के पार संदूषण को रोकने के लिए अनुमति देने के लिए बीच थाली वॉशर के प्रभावी परिशोधन भी आवश्यक है। उच्च throughput चयन प्रक्रिया का अनुकूलन में मदद करने के लिए, इन कार्यों के मूल्यांकन के लिए सरल दृष्टिकोण पहले से इस्तेमाल किया गया है और प्रोटोकॉल के भीतर नीचे और विस्तृत वर्णन किया गया हैं।

एक तरल वितरण / आकांक्षा सिर के सभी चैनलों द्वारा दिया संस्करणों की निरंतरता का मूल्यांकन करने के लिए, एक रंग का समाधान एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली और absorban को pipetted हैप्रत्येक में सीई अच्छी तरह से एक प्लेट रीडर पर मापा जाता है। ऐसे bromophenol नीले रंग के रूप में एक क्रोमोफोर वितरित वॉल्यूम पर अलग सतह तनाव और सामंजस्य गुणों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक चयन के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह की रंगाई के समाधान के लिए उपयोगी है। सभी चैनलों लगातार संस्करणों वितरण कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के बाद, कुल वितरित मात्रा की सटीकता प्रत्येक थाली को हस्तांतरित तरल की बड़े पैमाने पर मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

अनबाउंड क्लोन दूर करने के लिए थाली धोने के स्वचालन मुख्य रूप से बफर तिरस्कृत किया जा करने के लिए और washes की संख्या में नियोजित किया जा रहा है धोने जिस दर के अनुकूलन की आवश्यकता है। इस पैरामीटर का मूल्यांकन करने का एक उचित विधि सकारात्मक नियंत्रण (विशिष्ट फैब-फेज क्लोन बाध्यकारी) 1) प्रतिजन या बाध्य फेज adsorbed कि क्या यह निर्धारित करने के लिए बग़ैर दर और / या washes की संख्या बदलती के प्रभाव का आकलन करने के लिए पीढ़ी कड़े धोने से हटाया जा रहा है को रोजगार या गैर आत्मीय प्रोटीन के लिए बाध्य 2) गैर विशिष्ट अत्यधिक घ हैUE पर्याप्त कड़े नहीं हैं कि शर्तों को धोने के लिए। अवशिष्ट / बाध्य फेज बैक्टीरिया में संक्रमण से और एकल कॉलोनी की गिनती के लिए चढ़ाना, या एलिसा एंटीबॉडी आत्मीयता टैग या फेज कोट प्रोटीन के लिए विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके या तो पता लगाया है और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। नकारात्मक नियंत्रण धोने पर्याप्त कड़े नहीं है अगर उच्च किया जा सकता है, जो गैर आत्मीय / पृष्ठभूमि प्रोटीन, प्रोटीन या विशिष्ट बंधनकारी फैब-फेज लक्षित करने के लिए गैर बाध्यकारी फैब-फेज के अवशिष्ट के स्तर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस मामले में, हम बाध्यकारी और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में फैब-फेज पर एक झंडा मिलान टैग पहचानता है कि एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी गैर विशिष्ट के लिए एक नियंत्रण के रूप में बीएसए immobilized इस्तेमाल किया। हम इन तकनीकों के बराबर थे कि दिखाने के लिए, एक माध्यम के प्रवाह की दर पर, हाथ से धोने बनाम रोबोट का उपयोग आठ और सोलह धोने चक्र की तुलना में। वैकल्पिक रूप से, चल रही चयन के दौरान इनपुट और आउटपुट फेज titres (धारा 7 देखें) को मापने भी धोने के मापदंडों में ठीक समायोजन करने के लिए कर सकते हैं। अंत में, चयन के लिए इस्तेमाल किया प्लेट वाशर के परिशोधन से पहले सेलेक्शन फेज का कैरी ओवर समाप्त करने के लिए आदेश में प्रभावी होना चाहिए। हमारे अनुभव में, हौसले से पतला 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट तेजी से, प्रभावी और सस्ता है। ऐसे एसडीएस के रूप में डिटर्जेंट भी प्रभावी रहे हैं लेकिन इस प्रणाली से दूर करने के लिए और अधिक व्यापक धोने की आवश्यकता होती है। किसी भी परीक्षण करने से पहले सिस्टम के लिए अभिकर्मक संगतता की जाँच करें। परिशोधन का आकलन करने के लिए, हम 3 टेबल के अनुसार परिणाम fluidics प्रणाली द्वारा नियंत्रित समाधान में अवशिष्ट फेज की उपस्थिति के लिए परीक्षण और व्याख्या।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन डोमेन के खिलाफ इन विट्रो चयन में समानांतर द्वारा मिश्रित पुस्तकालयों से Fabs अलग-थलग करने के लिए एक स्केलेबल तरीका प्रदान करता है और एक स्वचालित फेज चयन प्रणाली मान्य करने के लिए तकनीक प्रदान करता है। इस विधि को फिर से नहीं करता है के बाद से व्यापक पशु सुविधाएं खड़ी कर सकते हैं कि लागत और बुनियादी ढांचे की बाधाओं को कम कर रहे हैंपशुओं के टीकाकरण पर है ly। इसके अलावा, एंटीबॉडी फेज चयन के साथ प्रतिजन पीढ़ी को एकीकृत करके, चयन सफलता को प्रभावित है कि गुणवत्ता कारकों और अधिक आसानी से नजर रखी और समायोजित कर रहे हैं। चयन और प्रारंभिक लक्षण वर्णन करने के प्रतिजन अभिव्यक्ति से समय सीमा के 6-8 सप्ताह के आदेश पर है, उत्पादन का एक और अधिक उत्तरदायी प्रणाली महसूस किया जा सकता है। इन विट्रो चयन से अलग एंटीबॉडी भी दोनों आसानी से बार-बार और reproducibly एंटीबॉडी फिर से उत्पन्न करने के लिए अभिव्यक्ति का निर्माण का केवल संग्रहीत डीएनए की आवश्यकता होती है, (कारण जीनोटाइप-फेनोटाइप लिंकेज के लिए) संशोधित और अक्षय कर रहे हैं। अंत में इस प्रोटोकॉल एक कस्टम डिजाइन, रोबोट चयन प्रणाली है कि रोजगार एक अर्ध-पुस्तिका या पूरी तरह से स्वचालित दृष्टिकोण या तो उपयोग किया जा सकता है कि दिखाकर, throughput के एक जैसे छोटे शैक्षणिक और औद्योगिक प्रयोगशालाओं के लिए स्केलेबल और सुलभ हो सकता है।

ऊपर वर्णित उच्च throughput तरीकों और लाइब्रेरी एफ सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालय 24 का प्रयोग में इन विट्रो के इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहित इम्युनो आवेदनों की एक किस्म में कार्य कर रहे हैं हो सकता है - और सीटू -expressed प्रोटीन में। किसी भी चयन के लिए सफलता की दर प्रतिजन लक्ष्यों की गुणवत्ता (पवित्रता, foldedness, मोनो dispersity आदि) के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी पुस्तकालय की गुणवत्ता और विविधता पर दोनों निर्भर करेगा हालांकि, यह 25-80 कहीं भी देखा गया है कि एंटीजन का% एक उच्च throughput चयन के लिए बाँधने निकलेगा। महत्वपूर्ण बात है, यह लक्ष्य समारोह मिलाना करने की क्षमता के साथ क्लोन भी अक्सर चुना जा सकता है कि ध्यान देने योग्य है। इस पुस्तकालय इस प्रकार व्यापक आधार के साथ आत्मीयता अभिकर्मकों की पीढ़ी के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में इस पाइप लाइन के महत्व को रेखांकित संभावित चिकित्सीय आवेदन 25 तक इन एंटीबॉडी उत्तरदायी बनाता है जो एक पूरी तरह से मानव ढांचे का उपयोग करते हुए निर्माण किया हैमूल्य।

सारांश में, मजबूती और इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा के लगभग सभी सदस्यों के लिए आत्मीयता अभिकर्मकों पैदा करने के लिए लंबी अवधि के लक्ष्य को प्राप्त करने का एक व्यावहारिक साधन के रूप में अनुकूलन, औद्योगीकरण और इस तकनीक का अंतिम व्यापक प्रयोग में सहायता करने के लिए जारी रहेगा मानव proteome।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम एनआईएच आम कोष स्वीकार करना चाहते हैं - प्रोटीन कैद अभिकर्मकों कार्यक्रम संयोजक एंटीबॉडी नेटवर्क एंटीबॉडी चयन और लक्षण वर्णन पाइपलाइन और रोबोट चयन मंच के वित्त पोषण खरीद के लिए अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन के विकास के वित्त पोषण के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MATERIALS
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker Eppendorf M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system Anachem Ltd LIQ-96-200
Microplate shaker VWR 12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge Thermo Product 75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer Biotek ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 ml VWR 21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 ml VWR 89039-668
Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes Corning MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate Sigma M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block Corning 3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box Corning AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film VWR 60941-084
REAGENTS
Name Company Catalog Number
polyethylene glycol Bioshop PEG800.1
yeast extract Bioshop YEX401.1
bio-tryptone Bioshop TRP402.1
N-Z amine Sigma C7290
glucose Sigma G8270-1KG
lactose Bioshop LAC234
glycerol Bioshop GLY001.500
carbenicillin  Bioshop CAR544.10
kanamycin Bioshop KAN201.25
tetracycline  Bioshop TET701.25
Tween 20 Bioshop TWN510.500
monobasic potassium phophate Bioshop PPM302.1
dibasic sodium phosphate Anachemia 84486-440
sodium chloride Bioshop SOD001.10
potassium chloride Bioshop POC308.1
calcium chloride Bioshop CCL302.500
magnesium sulphate EMD MX0070-1
magnesium chloride Bioshop MAG510.500
NH4Cl Amresco 0621-1KG
Na2SO4 Bioshop SOS513.500
agar Bioshop AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain Invitrogen S33102
phosphoric acid Acros Organics 201140010
lysozyme Bioshop LYS702.25
benzonase Novagen 71205
Triton X-100 Bioshop TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets Roche 11 836 170 001
Ni-NTA resin  Qiagen 1018240
1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) NEB N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). GE Healthcare 27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate  KPL 50-76-00
dNTPs Biobasic DD0056
Taq polymerase Genscript E00007
Exonuclease GE Healthcare  EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase GE Healthcare E70092Z-EZ

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References

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