Summary
Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.
Abstract
A demanda por anticorpos que atendam às necessidades de ambas as aplicações básicas e clínicas de pesquisa é alto e vai aumentar drasticamente no futuro. No entanto, é evidente que as tecnologias tradicionais não são monoclonais sozinho até esta tarefa. Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos alternativos para satisfazer a procura de alta qualidade e reagentes de afinidade renováveis para todos os elementos acessíveis do proteoma. Para este fim, os métodos de alto rendimento para a realização de seleções a partir de bibliotecas de anticorpos sintéticos exibido em fagos foram concebidos para aplicações que envolvem diversos antígenos e otimizado para o rendimento e sucesso rápido. Nisto, um protocolo é descrito em detalhe que ilustra com demonstração de vídeo a selecção de clones paralelo Fab-fago a partir de bibliotecas de alta diversidade contra centenas de alvos quer utilizando um manipulador de líquidos 96 canal manual ou sistema de robótica automatizado. Usando este protocolo, um único usuário pode gerar centenas de antígenos,selecionar anticorpos para-los em paralelo e validar a ligação do anticorpo dentro de 6-8 semanas. Destacam-se: i) um formato de antígeno viável, ii) caracterização antígeno pré-selecção, iii) passos críticos que influenciam a seleção de clones específicos de afinidade e alta, e iv) formas de eficácia seleção monitoramento e fase inicial de anticorpos clone caracterização. Com esta abordagem, temos obtido os fragmentos de anticorpos sintéticos (FAB) para muitas classes alvo, incluindo os receptores de uma só passagem de membrana, hormônios proteína secretada e proteínas intracelulares multi-domínio. Estes fragmentos são facilmente convertidos em anticorpos de comprimento total e foram validados para apresentar uma elevada afinidade e especificidade. Além disso, eles têm sido demonstrados para ser funcional em uma variedade de imunoensaios convencionais, incluindo Western blot, ELISA, imunofluorescência celular, ensaios de imunoprecipitação e afins. Esta metodologia irá acelerar a descoberta de anticorpos e, finalmente, trazer-nos mais perto de realizar o objetivo of gerar anticorpos qualidade renováveis, elevadas para o proteoma.
Introduction
Com o início da era pós-genômica, a disponibilidade de reagentes de ligação de alta qualidade para caracterizar e modular proteínas é fundamental para abrir novas pesquisas e avenidas terapêuticas. Os anticorpos continuam a ser fundamentais para ambos os pesquisadores acadêmicos e industriais como a pesquisa básica e ferramentas de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Não surpreendentemente, tem havido um crescimento impressionante de empresas de desenvolvimento de anticorpos contrato, a maioria dos que dependem de tecnologias de hibridoma convencionais para gerar anticorpos personalizados. No entanto, a seleção in vitro utilizando bibliotecas de anticorpos exibidos-fago está se tornando uma poderosa tecnologia alternativa que pode oferecer vantagens únicas e sucesso em que as tecnologias convencionais podem enfrentar limitações 1, 2.
À luz do que uma considerável procura de anticorpos de alta qualidade como ferramentas de investigação, dois desafios principais para a produção de anticorpos são renováveis 1) selecção de transferência e 2) av antigénioailability. Um certo número de grupos têm agora descrito em condutas de selecção in vitro com vista a aumentar o rendimento e a taxa de identificação de anticorpos. Estas descrições detalhe uma variedade de abordagens que incluem seleccionar viáveis em cima ou de comprimento completo como alvo 3,4, 5,6,7 ou domínios estruturalmente relacionado, usando 6,8 ou a placa de base de 3,4-regimes de antigénio de imobilização à base de grânulo. Além disso, o crescente adopção de tecnologias de síntese de genes 9 fez geração antigénio sistemática, particularmente de domínios isolados, razoavelmente custo eficaz e potencialmente pode aliviar a dificuldade na obtenção de quantidades suficientes de antigénio purificado, de comprimento completo. Ao utilizar as duas tecnologias em conjunto, um oleoduto auto-contido e geração antigénio escalável e selecção de anticorpos foi concebida que permita o isolamento de anticorpos para paralelo de grandes conjuntos de domínios de antigénios expressos e facilitar o desenvolvimento de reagentes para a characterizing classes inteiras de proteínas estruturalmente ou funcionalmente relacionados.
Para atingir esse objectivo, um pipeline integrado que casais em silico identificação de domínios de antigénio, a síntese de genes expressáveis, expressão bacteriana de alto rendimento de antigénios e selecções de anticorpo exibido em fagos tem sido desenvolvido escaláveis. Este gasoduto requer apenas infra-estrutura básica disponível para a maioria dos laboratórios de ciências da vida (incluindo bibliotecas de anticorpos que são cada vez mais disponíveis através de licença ou de transferência de material acordo), mas também é passível de automação para uso em escala industrial. Usando este protocolo, é possível gerar centenas de domínios de antigénio marcado com afinidade, e rotineiramente isolar fragmentos de anticorpos altamente específicos para muitos destes antigénios.
A tecnologia de apresentação de fagos demonstrou compatibilidade demonstrado com uma ampla variedade de formatos de reagentes de afinidade recombinantes incluindo Fab, scFv, Fv e domínios autónomos e umcrescente conjunto de pequenos 'estruturas alternativas' (proteínas ankyrin repetição projetados (DARPINS), fibronectina (FN), domínios lipocalina e mais 10). Discussão é limitado neste exemplo para o isolamento de fragmentos de anticorpos Fab, embora se presume estes métodos podem ser adaptados a outros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnologia, os Fabs com baixa afinidade nanomolar para pequeno, marcaram domínios proteicos, incluindo domínios de factor de transcrição, domínios SH2, proteínas e outros ligação RNA foram seleccionadas com sucesso, muitos dos quais se ligam a proteína de comprimento completo e são funcionais em imunoensaios tais como imunofluorescência , imunoprecipitação e imuno-histoquímica. Importante, clones de ligação recombinantes são totalmente renovável e pode ser re-gerada a partir de construções de expressão via oferta de produção bacteriana maior coerência, reprodutibilidade e custo-efetividade, justificando, assim, a despesa de validação clone rigorosa.
Neste protOCOL e vídeo acompanhante, métodos básicos para a selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos utilizando domínios de antigénios imobilizados são demonstradas. Este método particular emprega domínios de proteínas marcadas com GST imobilizados por adsorção passiva em placas de micropoços, embora outras marcações 11,12,13 13,14,2 e formatos de selecção, também têm sido utilizados com sucesso. Considerações críticas para a instalação e condução das seleções com acompanhamento paralelo de parâmetros de seleção que visam identificar e isolar anticorpos clonais especificamente enriquecido para validação são detalhados.
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Protocol
1. Antigen Generation
NOTA: os domínios de antigénios pode ser sintetizado e clonado por uma variedade de fornecedores comerciais para uma construção de expressão de IPTG induzível adequado.
- Transformar as construções de expressão em quimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. células de E. coli por mistura de 10 ng de ADN que codifica em 20 ul de 1X KCM sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR, seguida pela adição de 20 L de células quimicamente competentes.
- Incubar a mistura de célula / DNA em gelo durante 20 min, à RT durante 10 min e, em seguida, novamente em gelo durante 2 min antes de emergência com 100 ul de pré-aquecida de super caldo óptima com glucose (SOC) meios, cobrindo com uma placa de vedação respirável e agitação a 37 ° C durante 1 hora a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetros.
- Placa 5 ul de células transformadas em Luria-Bertani (LB) / placas de agar suplementado com carbenicilina (100 g / ml) e cultivam O / N para se obter colónias isoladas são usadas paragerando stocks de glicerol.
- Inocular 1 ml de 2YT media / carb com 5 ul de glicerol e crescer durante 12 horas a 37 ° C num bloco de 96 poços profundos bem com agitação a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetros.
- Inocular NZY MC15 (suplementado com 0,05% de glucose, 2% de lactose e 100 g / ml de carbenicilina) com uma diluição de 1:40 esta cultura, em seguida, agita-se durante 6-8 horas a 30 ° C e 200 rpm num orbital 2,5 centímetros shaker.
- Pellets bactérias e purificar proteínas antigênicas de alto rendimento em uma placa de filtro de 96 poços contendo 100 ul de resina Ni-NTA conforme protocols16,17 publicado anteriormente.
- Determinar a concentração de proteínas purificadas por ligação de corante de Bradford-assay18 e para caracterizar o tamanho e pureza por separação e visualização de 10-50 ug com Coomassie mancha num gel de SDS-PAGE (ver Figura 2).
NOTA: Nesta fase, as proteínas podem ser ainda caracterizada por métodos que avaliam a agregação da proteína de 19 20, dependendo da natureza do antigénio e os requisitos de selecção do oleoduto.
2. Preparação e Titulação da biblioteca de fagos
- Escolha uma única colônia de E. resistente ao fago T1 coli células em 1 ml de meio 2YT suplementados com 50 ug / ml de tetraciclina.
- Uma vez que o crescimento celular é estabelecida visualmente, dilui-se a cultura de um volume maior de 2YT suplementado com 50 ug / ml de tetraciclina para assegurar um volume suficiente de células para a infecção (geralmente 45 ul por biblioteca de diluição, ver abaixo.).
- Preparar a biblioteca para uso por precipitação a partir de um tampão de armazenamento de fagos com 1/5 volume de autoclavada 20% de PEG-8000, 2,5 M de NaCl (PEG-NaCl) incubar em gelo durante 30 min e peletização fago precipitado por centrifugação a 12.000 x g.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado de fagos num volume apropriado de 1x PBS pH 7,4, 0,2% de BSA e 0,05% de Tween (PBT), ajustando to uma concentração apropriada para a selecção de fagos (se necessário) para assegurar a cobertura adequada biblioteca. Veja o Passo 2.9 e Discussão.
- Dilui-se uma alíquota de 5 ul de fagos em 45 ul de 1x PBS a pH 7,4 numa placa de multi-poços estéril, misturar, e criar uma série de diluições de 10 vezes no mesmo tampão.
- Adiciona-se 5 ul de cada diluição de fagos a 45 ul de fago T1-resistente E. coli células em fase de crescimento logarítmico (DO600 = 0,4-0,8) em uma outra placa de poços múltiplos, cobrir com uma vedação respirável e incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 30 min num agitador orbital 2,5 centímetros.
- Placa 5 ul de células infectadas a partir de cada um dos poços de uma placa de agar pré-aquecido suplementado com 100 g / ml de carbenicilina e crescer O / N a 37 ° C até as colónias são visíveis.
- Calcular o total de fagos / mL, como se segue:
Fago / ml = número de colônias em uma placa carbenicilina no mais, diluir a amostra x 200 x 10 i (i = onde o num máximober de diluições em que as colônias são aparentes). - Para determinar o número de poços de antigénio revestidos para assegurar uma cobertura da diversidade da biblioteca, calcular como se segue:
Número de poços de antígenos revestidos required =
Cobertura de vezes desejado * biblioteca diversidade
# De fago por 100 ul
3. Selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos
3.1) A imobilização Antigénio
- Para evitar ciclos de congelação-descongelação que podem afectar a qualidade do antigénio e para facilitar as diluições, preparar uma placa de proteína antigénio de estoque normalizado para 100x concentrações de trabalho (por exemplo, 500 g / ml) e em alíquotas para placas de 96 poços não-ligação.
- Prepare placas revestidas com antigénio de soluções de proteína estoque um dia antes de cada rodada de seleções diluindo a partir de placas de ações com PBS.
- Revestimento-96 bem altas placas de poliestireno de ligação de proteína com 100 ul de proteína GST-antigénio marcado ou um controlo negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a de 5 ug / ml em PBS. Agitar a 250 rpm, 4 ° CO / N em um agitador de microplacas.
- Remover proteínas a partir da solução microplacas revestidas, bloquear as placas revestidas com antigénio e selecção negativa com 200 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,2% em 1x PBS, pH 7,4) e agitar a 250 rpm à temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Após o bloqueio, lavar as placas revestidas com proteína bloqueadas quatro vezes com 200 ul de 1x PBS a pH 7,4 com 0,05% de Tween (PT) tampão, quer manualmente ou utilizando um lavador de microplacas automático.
3.2) Biblioteca Pré-apuramento e Antigen-fago Incubação
- Esgotar a biblioteca de não (ou tag-) clones específicos de ligação exibida por fagos de fragmentos de anticorpos através de transferência de 100 uL (10 12) de fagos de biblioteca de fagos preparada em tampão PBT para uma série de poços revestidos com proteína de controlo negativo ou etiqueta de afinidade livre proteína (por exemplo, GST) equivalente ao número de alvos e incubar fagonos poços durante 1-2 horas à temperatura ambiente com agitação a 250 rpm.
NOTA: Como uma alternativa ou um meio adicional de selecção negativa, a incubação pode também ser realizada na presença de excesso (5-25 uM) de tag de afinidade da proteína solúvel (por exemplo, GST) para remover adicionalmente os clones de ligação a tag e aumentar a recuperação de alvo específico clones obrigatório. - Transferência do sobrenadante de fagos para selecção negativa placas revestidas com antigénio e incubar durante 1-2 horas à temperatura ambiente com agitação a 250 rpm durante a captura de clones específicos de ligação.
- Remover o fago não ligado e lavar os poços da microplaca de 8-15 vezes com tampão PT manualmente ou utilizando um lavador de microplacas. Retire o excesso de tampão de lavagem pouco antes de eluição.
3.3) eluição, Infecção e Phage Amplification
- Logo no início do dia de seleções, escolher uma única colônia de E. resistente ao fago T1 coli células em 1 ml de meio 2YT suplementados com 50 ug / ml de tetraciclina e crescer a 37 ° C with agitação a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetro, ou equivalente.
- Uma vez que o crescimento celular é estabelecida e pode ser visto a olho nu, aumentar o volume do meio com 2YT suplementado com 50 ug / ml de tetraciclina para assegurar um volume suficiente de células para a infecção (geralmente 100 ul por poço de selecção).
- Crescer as células até uma OD 600 de 0,4-0,8 é atingido (aproximadamente 5-7 h), em seguida, para eluir os fagos ligados adicionar 100 uL de células para o antigénio placa lavada e agitar a 37 ° C durante 30 min.
- Adicionar o fago auxiliar M13K07 para uma concentração final de 1 x 10 10 ufc / ml e incubar a 37 ° C durante 45 min com agitação a 200 rpm.
- Transferência de células a 1,2 ml de 2YT suplementado com 150 ug / ml de carbenicilina e 75 ug / ml de canamicina, num bloco de 96 poços poços profundos com fundo em V e crescer O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm em 2,5 cm de agitador orbital.
3.4) Fago Preparação e Rondas repetidas de Selecção
- Pellets bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Misturar volumes iguais de sobrenadantes de fagos de placas replicadas em uma mini-câmara de ar de 96 poços caixa azul microplaca estéril, neutralizar com 1/10 volume de 10X PBT e misture. Repita as rodadas de seleção (a partir do passo 3.1.1) por 3-4 rodadas ou até que o enriquecimento é observado (ver secções 4. e 7.) em comparação com proteína de controlo negativo.
NOTA: Nas primeiras rodadas de seleção quando não é esperado significativo enriquecimento / detectável (ou seja, arredonda 1 e 2), a quantificação de entrada e saída de fagos títulos (descritos na Seção 7 e resultados representativos mostrado na Figura 3) pode ser útil no sentido de garantir concentrações mínimas de fagos para seleções de sucesso (descritos na discussão) e são mais adequados do que ELISAs em pool.
4. Caracterização por Pooled ELISA
- Brasão de 96 poços de alta proteína-binding placas de poliestireno com 100 ul de proteína marcada GST-antigénio ou proteína de controlo negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 ug / ml, como por Secção 3.1 e agitar a 4 ° CO / N.
- Remover o excesso de antigénio, bloquear a placa com 200 ul de tampão de bloqueio com agitação durante 1-2 horas à temperatura ambiente a 250 rpm num agitador de microplacas e lavar quatro vezes com tampão PT 200 ul à mão ou pelo lavador de placas automatizado.
- Adicionar 100 ul de sobrenadante de fagos (diluído 1: 10-1: 20 em tampão PBT), agitar a 250 rpm durante 15 min à temperatura ambiente, e lava-se a placa oito vezes com tampão PT 200 ul.
- Adicionar 100 ul de anti-M13-HRP (1: 5000 em tampão PBT). Agitar a 200 rpm durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida lava-se a placa de seis vezes com tampão PT 200 ul e duas vezes com 200 ul de PBS.
- Adicionar 100 ul de 1: 1 de substrato TMB para desenvolver e 5-15 minutos (ou até que a cor substancial desenvolveu), em seguida, parar a reacção por adição de 100 ul de 1 MH 3 4 e ler a placa a 450 nm.
- Em geral, o enriquecimento em conjuntos de fagos pode ser observada em rodadas 3-4 como uma razão de ligação específica em relação a ligação não específica de> 2 (Ver Figura 4)
NOTA: É informativo notar sinal de ligação absoluta que a alta na proteína tag afinidade indica enriquecimento de ligantes específicos de tag (em vez de ligantes alvo), e que sinal de ligação absoluta no alto da proteína de controlo negativo indica enriquecimento de não-específica ou " "ligantes pegajosas.
5. Clone Selection, Sequenciamento e Caracterização
5.1) O isolamento de solteiro Clones Fab-fagos
- Para isolar os clones individuais para sequenciação e caracterização, infectar 1/10 do volume do conjunto de fagos amplificados em T1 para fagos resistentes E. coli células em fase logarítmica de crescimento (DO600 = 0,4-0,8) em uma placa de microtitulação de fundo redondo, cubra com um Breathable junta da placa e incubar com agitação a 200 rpm durante 30 min a 37 ° C.
- Preparar diluições em série de 10 vezes em meio 2YT e placa em placas de agar suplementadas separadas com 100 g / ml de carbenicilina.
- Escolher colónias únicas em 450 ul de meio 2YT / carb suplementado com 1 x 10 9 fago M13K07 / ml e crescem S / N em um mini-tubo 96 caixa azul microplaca estéril incubação a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
- Pellets bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Clonal sobrenadante de fagos pode ser utilizada para a sequenciação de clones Fab-fagos (tal como descrito na Secção 5.4) ou para clonal ELISA para determinar a especificidade contra antigénios imobilizados (como descrito nas Secções 5.3 e 21) para os quais os resultados representativos são apresentados na Figura ligação directa 5.
5.2) A expressão de clones Fab para a caracterização
- Após clonagem em um e adequadovector xpression (ver discussão), escolher único E. coli colónias transformadas com construções de expressão em 1 ml de 2YT media / carb em uma placa de 96 poços profundos poços utilizando um palito ou ponta de pipeta estéril e crescer durante 12-16 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm. Isto pode ser feito manualmente ou com uma máquina desbastadora de colónias automatizado.
- 15 Transferir 40 uL de cultura de crescimento de 1,5 ml de meio NZY suplementado com glucose / lactose / glicerol num bloco de 96 poços fundos bem como por metodologia de Studier et ai.
NOTA: Como alternativa, as células podem ser cultivadas durante 3-4 horas (0,8-1,0 OD) na expressão não-suplementado e proteína induzida pela adição de IPTG 1 mM. - Cobrir o bloco (s) de cultura com um selo respirável e expressar clones de Fab para 6-8 horas a 30 ° C com agitação a 200 rpm. Placas de spin em 4000 xg durante 15 min para sedimentar as células bacterianas, remover o sobrenadante, placas de cobertura com um selo de alumínio e congelar peletes a -20 ° C até a lise.
- Libertar Fabs expressos a partir de sedimentos recolhidos com 100 ul de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% de Triton X-100 a pH 8,0 com 1 mg / ml de lisozima e 10 U benzonase / ml de cultura e inibidores de protease) e agitação durante 2 hora a 4 ° C.
- Remover os detritos celulares por centrifugação a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante lisado bruto para utilização na caracterização inicial da especificidade por placas de ELISA (ver Secção 5.3).
5.3) Clone Caracterização pelo Direct Encadernação Clonal Fab ELISA
- Imobilizar antígenos conforme descrito na Seção 3.1, em vez aliquotting 30 ul de antigénio / ml 2 mg em PBS para poços de uma placa de 384 poços. Layouts de antígenos baseados em Quad na placa pode facilitar a transferência de reagente quando utiliza 96 cabeças de distribuição baseada em canais. Lave e placas de ELISA bloco conforme Seção 3.1.
- Lisados desmatadas coletados a partir de Seção 5.2 pode ser aplicado diretamente ao antígeno imobilizado por evaavalia- de ligação. Incubar 30 ul de lisato por poço, durante 15 min à temperatura ambiente com agitação a 200 rpm.
NOTA: proteína purificada clone Fab podem ser utilizados alternadamente por diluição de 10 ug / ml em tampão de aplicação de PBT e 30 ul de cada clone a poços bloqueados contendo antigénio ou proteína de controlo negativo (GST, BSA, etc.) e no desenvolvimento da mesma maneira descrita abaixo. Alternativamente, Fab-fago também pode ser utilizado por diluição de 10 ul de sobrenadante de fagos (descrito na Secção 5.1) em 20 ul de tampão PBT (1: 3) e a detecção com anticorpos anti-M13-HRP (descrito nos Passos 4,4-4,5) - Remover o excesso de lisado e lavar os poços, quer manualmente ou utilizando uma placa automatizado lavado com 8x 100 ul de tampão de PT e remover o excesso de tampão.
- Incubar 30 ul de uma diluição de 1: 5000 de anticorpo secundário anti-FLAG em tampão PBT durante 30 min à temperatura ambiente com agitação a 200 rpm.
- Wash, desenvolver e quantificar como por secções 4,3-4,5.
NOTA: Os resultados representativosilustram ambos os clones de ligação específicos e não-específicos são apresentados na Figura 5.
5.4) Clone Sequencing
- Prepara-se uma mistura principal de PCR, como indicado na Tabela 2.
- Adicionar 2 mL de modelo de PCR apropriado (ou sobrenadante de fago ou única colónia bacteriana contendo fagemídeo re-suspenso) a 20 ul de PCR master mix preparado com os iniciadores apropriados em poços de uma placa de PCR.
NOTA: misturas principais separadas são necessárias para a sequenciação de ambos os genes de cadeia pesada e leve. - Executar a reacção de PCR utilizando os parâmetros listados na Tabela 2 - Definições PCR.
- Verificar o sucesso da reacção de PCR por mistura de 5 ul da reacção completada com corante de carga sobre um gel de agarose a 1% suplementado com mancha de ADN e visualização de imagem num transiluminador de 300 nm.
- Adicionar 2 l de produto de PCR de 10 uL de água estéril contendo 0,2; Ul cada uma exonuclease e fosfatase alcalina de camarão e incubar a 37 ° C durante 20 minutos, seguido de inactivação da enzima a 80 ° C durante 10 min para remover os iniciadores em excesso na preparação para a sequenciação.
6. Scaling para Automated Seleções
6.1) à base de manuseamento de líquidos Pipeta
- Prepara-se uma 1% (w / v) de azul de bromofenol em água e remover partículas insolúveis utilizando um filtro de 0,45 ml.
- Para determinar a gama linear de absorvância no leitor de placa, preparar uma diluição de 1: a uma solução de azul de bromofenol a 1% em água 1.000, e continuar com duas diluições em série (16 diluições no total).
- Transferir 100 ul de cada diluição a um plano inferior placa de 96 poços e ler a absorvância a 590 nm. Plot absorção absoluta contra fator de diluição e escolher uma diluição no médio a alto final do intervalo linear de provas posteriores.
- Adicionar azul de bromofenol à água ou à solução realque vai ser pipetadas com base na diluição escolhida na etapa anterior em volume suficiente para pipetagem para três placas de 96 poços, mais o volume morto no reservatório.
- Calibrar uma pipeta de canal único para entregar o volume de teste pipetando água sobre uma balança analítica (100 l de água pesa 100 mg na RT.)
- Utilizando a pipeta calibrada, transferir o volume de teste da solução tingidos com pelo menos três cavidades de um plano inferior placa de 96 poços e ler as suas absorvâncias a 590 nm, em triplicado.
- Pesar três de fundo plano placas de 96 poços vazios em uma balança analítica e gravar suas massas.
- Pipeta volume de ensaio de reservatório para cada um dos três placas de 96 poços e medir as suas absorvâncias a 590 nm, em triplicado.
- Pesar cada placa e calcular a diferença em massa.
- Em primeiro lugar, avaliar se as absorvâncias em cada poço são uniformes dentro do intervalo de tolerância (por exemplo., +/- 5%) e se são compatíveis com the absorbâncias obtidas por mão-de pipetagem com a Pipetman calibrado. Se os canais particulares são consistentemente acima ou abaixo da entrega (por exemplo, ver Figura 6), siga os procedimentos de reparo e repita o processo de avaliação até que todos os canais de entregar volumes uniformes.
- Em segundo lugar, uma vez que todos os canais estão confirmados para entregar volumes uniformes, verificar a exatidão de que o volume através do cálculo da diferença de massa média, por poço. Por exemplo, um conjunto manipulador de líquidos perfeitamente calibrado para 100 l entregará 9,60 g de água por placa, ou 0,10 g de água por poço. Se o real volume entregue é consistentemente acima ou abaixo do volume pretendido, em seguida, um fator de correção pode ser aplicada, ou seja, a programação de 110 mL, a fim de realmente entregar 100 l.
NOTA: Para pequenos volumes, por exemplo, 10 ul, usam dez vezes mais azul de bromofenol na solução tingidos e pré-aliquota de 90 ul de água para as placas de 96 poços à mão, para assegurar que a absorbances são mensuráveis e queda na faixa linear.
6.2) Lavagem da placa automatizado
- Imobilizar alvo positivo e proteínas de controlo negativo em poços separados de microplacas de 96 poços (duas placas para cada condição a ser testada), conforme descrito na Seção 3.1.
- Bloquear locais de ligação não específicos por incubação com solução de bloqueio durante uma hora à TA.
- Adicionar idênticos alíquotas de 100 ul de uma 10 13 ufc / ml alvo de ligação de solução de Fab-fago em PBT a todos os poços em todas as placas e incuba-se com agitação suave à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Lavar duas placas de acordo com cada condição, uma placa para infecção e titulação e uma placa para ELISA.
- Avaliar a eficácia da lavagem por infecção direta em bactérias e titulação (conforme descrito na Seção 3.3 (sem M13K07 adição) e 7.2.1) ou desenvolvimento com anti-anticorpo M13 HRP e substrato colorimétrico (conforme descrito na Seção 4).
- Titres fagos from clones específicos, muitas vezes, dar na gama de 10 -10 5 7 fago / ml a partir de uma proteína imobilizada contra o qual se liga especificamente o clone. Alguns ligação residual a proteína de controlo negativo (por exemplo, BSA), deve ser esperado e geralmente 10 2 -10 5 fago / ml são observadas, no entanto títulos muito baixos (isto é., <10 1) pode sinalizar excessivamente rigorosas de lavagem, o que pode comprometer uma selecção.
- Para a ligação do fago determinado por ELISA, comparar os sinais de ligação absolutos para proteínas de controlo positivas e negativas para determinar se a lavagem robótico é equivalente a estabelecidas resultados de lavagem das mãos (Figura 7).
6.3) Washer Placa Descontaminação
- Para começar, executar o protocolo de descontaminação para ser testado.
NOTA: Recomendamos a utilização de, pelo menos, o dobro do volume total da linha e privilegiada e mergulhe a cabeça com arruela de hipoclorito de sódio a 5 min em 0,5%, fr recentemente diluídolixívia comercial om (tipicamente de hipoclorito de sódio a 6%). - Prime e mergulhe a cabeça com arruela por 5 minutos em (autoclavado) água estéril e, finalmente, preparar o sistema até que as linhas estão cheios de ar.
- Primeiro as linhas com água esterilizada ou tampão de lavagem.
- Lave a estéril microplaca de 96 poços uma vez, retire do lavadora e marque com um selo placa estéril. Esta é a placa de controlo antes da contaminação.
- Aliquota de 100 ul de O / N fago amplificado cultura sobrenadante de todos os poços de uma placa de 96 poços.
- Lave a placa contendo fago uma vez, em seguida, retire da máquina de lavar e selar com um selo de plástico ou folha de placa. Esta é a placa de controlo de contaminação.
- Realizar o protocolo de descontaminação está sendo testado. Neste exemplo, repita os passos 6.3.1 e 6.3.2.
- Lave microplaca estéril uma vez, em seguida, retire da arruela e selo. Este é o teste de placa de descontaminação.
- Placa 50 ul de fase log E. coli para placas de titulação; esta é a pré-infecplaca de controle ção.
- Desselar pré-contaminação, contaminação e descontaminação placas de 96 poços e adicionar 100 ul de E. coli em fase de crescimento de fase log de todos os poços, utilizando novas dicas para cada poço.
- Selar e incubar a 37 ° C durante 30 min a 200 rpm.
- Placa 50 uL de células infectadas de três poços aleatórios de cada placa de 96 poços de placas de 10 cm de 2YT / carb e incubar a 37 ° CO / N.
- Transferir 50 uL de células infectadas de todos os poços de cada placa para placas de poços profundos contendo 1 ml de 2YT com 100 g / ml de carbenicilina por poço e crescer O / N a 37 ° C.
- Repita o protocolo de descontaminação e deixar a máquina de lavar linhas secar.
NOTA: Não O crescimento / N em placas ou em meio líquido deve ser observado nas placas de controlo de pré-infecção, controle de pré-contaminação ou teste de descontaminação. Muitas colônias e de crescimento deve ser observado na placa de controle de contaminação; Se não, não há conclusões sobre a eficácia doprotocolo de descontaminação pode ser feito. Idealmente, as placas de descontaminação produzirá nenhuma colónia e não O / N crescimento em qualquer um dos poços das placas de S / N. O rigor do protocolo de descontaminação pode ser aumentado com as concentrações mais elevadas do branqueamento, mais tempos de imersão e ciclos adicionais.
7. Entrada / Saída de titulações
7.1) Titulações de Entrada de fagos
- Dilui-se uma alíquota de 5 ul de fago de 50 ul com PBS estéril-filtrada e misturar.
- Prepare a diluição em série de 10 vezes em PBS estéril-filtrada para 10 10 utilizando uma pipeta multi-canal ou um pipetador de 96 canais.
- Inocular 5 ul de fago diluído em até 45 ul de E. resistente ao fago T1 células de E. coli em log-fase de crescimento (DO de 0,6-0,8) e incuba-se coberto com um selo respirável durante 30 min a 37 ° C.
- Placa 5 ul de células infectadas a uma sobre / placa de agar LB suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina e incubar S / N, umt 37 ° C.
- A concentração de fago pode ser estimada a partir da amostra mais diluída em que colônias aparecem de acordo com os cálculos detalhados na Seção 2.8.
7.2) de saída do fago Pitrations
- Após eluição dos fagos ligados a placa através da adição de E. coli células, dilui-se uma alíquota de 5 ul de células infectadas com o fago a 50 ul com meios 2YT autoclavados
- Prepare a diluição em série de 10 vezes em meio 2YT autoclavados a 10 6 utilizando uma pipeta multi-canal ou canal 96 pipetador.
- Placa 5 ul de células infectadas para sobre uma placa de agar suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina e incubar O / N a 37 ° C.
- A concentração de fago pode ser estimada a partir da amostra mais diluída em que colônias aparecem de acordo com os cálculos detalhados na Seção 2.8.
NOTA: Em ambos os casos (isto é, entrada e saída de fagos títulos, a comparação com os números de colônias em ambos tetraciclina (cel total del número) e canamicina (fago auxiliar título) também pode ser informativo.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito foi utilizado para isolar fragmentos de anticorpo a uma variedade de ambos os domínios de antigénios structurally- e funcionalmente relacionados com o de bibliotecas combinatórias exibida por fagos de Fab em paralelo. Problemas relacionados com a disponibilidade de antigénio pode ser contornado, em muitos casos, por na identificação de domínios de antigénios silico expressáveis que são apropriados para selecção de anticorpos 23. Ao acoplar a expressão de antigénio para selecção de anticorpos dentro do mesmo laboratório (Figura 1), torna-se possível construir um pipeline integrado, na qual os parâmetros de antigénios críticos para a selecção pode ser mais facilmente controlada. Na maioria dos casos, a determinação cuidadosa de limites de domínio permite a expressão e o isolamento de quantidades adequadas de antigénio suficientemente puro a partir da expressão de elevado rendimento em placas de 96 ou 24 poços profundos assim (Figura 2) para o uso bem sucedido em selecções de anticorpos. Durante sucessivosrodadas do processo de selecção, as concentrações de fagos eluídos e enriquecimento de fagos que se ligam especificamente ao antigénio pode ser monitorizado por qualquer titulação de fagos (Figura 3) ou com conjuntos de fagos num ensaio de ELISA (figura 4). Uma razão de ligação (> 2), geralmente indica a presença de clones específicos de ligação. Por outro lado, uma relação baixa (<2) pode ajudar a determinar a causa de uma falha de selecção. Por exemplo, uma proporção <2 com OD não específica elevada pode indicar a remoção insuficiente de clones não específicos (ou pegajosas) ligantes e pode necessitar de uma maior optimização do protocolo de selecção. No entanto, uma vez que é detectado enriquecimento, os clones individuais de elevada afinidade podem então ser isolados para sequenciação e caracterização. O clone A ligação pode ser caracterizada por um imunoensaio colorimétrico e permite a comparação da ligação do fago de Fab ou Fab-antigénio imobilizados contra a proteína de controlo negativo, dando origem a uma medida de enriquecimento (razão de se ligar a tarPegue contra proteína de controlo negativo ou proteína marcador de afinidade) (Figura 5).
Durante a raspagem e automatização deste método, a avaliação das funções principais da unidade de tratamento de líquido pode ser útil para assegurar um funcionamento adequado e preciso, com soluções semelhantes aos usados nas selecções reais. O uso de cromóforos que absorvem em soluções podem ajudar a detectar quando os canais específicos nos fluidos (aspiração) ou de distribuição ou são obstruídos ou perderam vedante resultante na entrega do volume parcial, como ilustrado na Figura 6. Unidades de lavagem automatizadas também pode ser uma fonte de variabilidade e pode exigir atenção. A utilização de clones de ligação conhecidos permite a comparação entre a proteína de ligação alvo de controlo para garantir que a ligação é mantida enquanto o fundo ligação alvo removido (Figura 7) quando os parâmetros de lavagem tais como a velocidade de distribuição, os volumes de lavagem e o número de lavagens são optimizados. Seguinteo uso de uma máquina de lavar prato automatizada com soluções de fagos, protocolos de descontaminação eficazes são necessárias para garantir a ausência de contaminação cruzada de sucessivas rodadas de seleções ou diferentes processos de selecção e um guia / interpretação solução de problemas é fornecida na Tabela 3.
Figura 1. Visão geral -. Produção de antígeno de alta capacidade e gasoduto seleção anticorpo Esta visão geral mostra uma visualização passo-a-passo de um gasoduto representante geração antígeno e seleção de anticorpos. A identificação in silico de limites de domínio antigénio permite síntese de genes, a expressão e selecção sobre domínios para proteínas que podem ser fracamente caracterizadas. Domínios de antigénios expressos são imobilizadas e utilizadas para isolar conjuntos de clones de anticorpo de alta afinidade específicos a partir de um combinatorial biblioteca de anticorpos exibidos sobre a superfície de fagos filamentosos. Piscinas de anticorpo-fago a partir de eluídos e amplificados antigénios individuais pode então ser utilizada para monitorizar o enriquecimento redonda-redonda para os clones de ligação específicos em ensaios baseados em ELISA comparando alvo imobilizado contra proteína de controlo negativo antes do isolamento de clones de ligação individuais para caracterização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. visualização de SDS-PAGE dos antigénios etiquetados por afinidade. Um representante de SDS-PAGE de expressas e purificadas 6X-HIS-GST marcado com domínios de antigénios (5-10 domínio kDa + 26 kDa GST), originalmente identificado por análise in silico de antigénio limites do domínio. Os domínios proteicos expressos e isolado por afipurificação nidade são caracterizados por SDS-PAGE antes de seleções para garantir a identidade baseada no tamanho, rendimentos adequados e pureza para permitir a utilização em seleções de anticorpos fago. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A visualização dos títulos de saída fago. Os fagos títulos de saída são determinadas por plaqueamento de células infectadas com o fago através de uma série de diluições de 10 vezes em meio de ágar complementado com vários antibióticos (tetraciclina, canamicina e carbenicilina) para determinar a menor diluição na qual colónias pode ser observado e estimar o número de fagos obrigado a direcionar antígeno e fluido. Por favor, clique aqui para ver um grandeversão r desta figura.
Figura 4. Relação de Binding of alvo a proteína de controlo negativo por ELISA reunidas. O progresso do enriquecimento pode ser avaliada seguintes rodadas de seleção pela triagem eluentes amplificados individuais contra ambos os objectivos específicos e proteínas de controlo negativo e / ou isolado afinidade tag. Mostrado na trama são as relações de enriquecimento para a ligação de 96 piscinas de anticorpos fago individuais contra seus respectivos 96 antígenos contra proteína de controlo negativo em paralelo. Cada valor da relação é derivada de duas medidas de absorbância que quantificam a ligação do conjunto de fagos para qualquer destino ou proteína de controlo negativo utilizando um anticorpo HRP-fundido específico para M13 proteína de revestimento do fago. Um limiar proporção de 2 ou superior (normalmente na gama 2-10 ou mais, conforme ilustrado no vermelho) é usado como uma indicação do enriquecimentoe a provável presença de clones específicos de ligação. Rácios de Menores pode significar falha ou questões específicas com a seleção que poderão necessitar de uma otimização do protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. directa clonal Fab-fagos Fab de ligação ou ELISA. A ligação de clones individuais (em se Fab-fagos de Fab ou formato) pode ser avaliada pelo ensaio baseado em ELISA contra proteína imobilizada em placas de 384 poços. A ligação é detectada usando um anticorpo HRP-condensado secundária contra a proteína de revestimento de M13 em Fab-fago ou um marcador de afinidade na Fab. Os valores de absorção-primas para a ligação de clonal Fab-fago alvo antígeno, proteína de controlo negativo e marca de afinidade antígeno (GST) são retratados ilustrando bi específicaNDErs (A01, A04, A06), e as pastas pegajosas (A05).
Figura 6. Avaliação dos volumes distribuídos por unidade de manuseamento de líquidos automatizado. Entrega consistente e precisa dos volumes pretendidos pelos sistemas de pipetagem de 96 poços robóticas ou manuais podem ser avaliadas utilizando soluções tingidos e um leitor de placas. Neste exemplo, 10 ul de uma solução contendo azul de bromofenol é pipetado sequencialmente a todos os poços de duas placas de 96 poços utilizando uma única caixa de ponta. Cada poço contém 90 jil / poço de dH2O, análoga à adição do fago auxiliar para E. infectados coli. absorvâncias de cada placa a 590 nm são lidos em triplicado, e os volumes são interpoladas a partir de uma curva padrão preparada usando uma pipeta calibrada de canal único. Os volumes entregues a uma única linha na primeira e segunda placa são mostrados. Note-se que nos abetost placa, bem E04 recebe nenhuma solução tingido, e na segunda placa, ele recebe um volume duplo. Isto indica que o toque de ponta não é suficiente para a entrega consistente, e requer uma maior optimização. Intervalos de confiança de 95% para as medições de absorvância estão apresentados triplicado.
Figura 7. Avaliação da placa de lavagem automatizada. A remoção eficaz de fagos não ligados podem ser avaliadas utilizando um ensaio ELISA para medir a ligação de Fab-fago positivo para imobilizado (o anticorpo anti-FLAG) e proteínas (BSA) de controlo negativo, enquanto variando as condições de lavagem. Neste exemplo, o fago de entrada análogo a biblioteca ingénua (10 13 ufc / ml em PBT) é removida utilizando oito ou dezasseis lavagens, à mão ou com o robot. Ligação a BSA fago Residual é o mesmo em todas as condições, como é a ligação específica ao anticorpo anti-FLAG imobilizada, indicAting que com este caudal baixo, ambos os métodos são equivalentes e suficientemente rigorosas. Intervalos de confiança de 95% dos poços duplicados são mostrados.
| SOLUTIONS | |||
| Media 2YT - Adicionar água para 1 L, ajustar o pH para 7,0, e autoclave. | extracto de levedura | 10 g | |
| triptona | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| Meios NZY (1 L) | NZ Amina | 10 g | |
| extracto de levedura | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 ml | ||
| Estoque 20 sal | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 estoque de açúcar (1 L) | glicose | 25 g | |
| lactose | 100 g | ||
| glicerina | 250 ml | ||
| Estoque sal 20x (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH4Cl | 1 H | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbenicilina (Carb): | 100 mg / ml em água. Filtro-esterilizar. | ||
| Canamicina (Kan): | 25 mg / ml em água. Filtro-esterilizar. | ||
| Tetraciclina (Tet): | 10 mg / ml em água. Esterilizar por filtração. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2,5 M | ||
| 1x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCl | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mm | ||
| KH 2 PO 4 | 1,5 mM | ||
| 1X KCM | KCl | 500 mM | |
| CaCl2 | 150 mM | ||
| MgCl2 | 250 mM | ||
| SOC Mídia | extracto de levedura | 5 g / L | |
| triptona | 20 g / L | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCl | 2,5 mM | ||
| MgSO4 | 20 mM | ||
| Glicose | 20 mM | ||
| O tampão de bloqueio | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tampão PBT | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| Tampão PT | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| O ácido fosfórico | H 3 P0 4 | 1 H | |
Tabela 1. Mídia e Soluções.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Componente | ul por reacção | ||
| Água | 19.45 | ||
| Tampão 10x Taq | 2,5 | ||
| dNTPs (10 mM) | 0,675 | ||
| DMSO | 0,75 | ||
| Enzima Taq | 0,125 | ||
| Atacante Primer (100 estoque UM) | 0,25 | ||
| Primer reverso (100 estoque UM) | 0,25 | ||
| Os iniciadores de sequenciação da cadeia pesada | |||
| M13 Atacante cartilha | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| Iniciador M13 reverso | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Iniciadores de sequenciação de cadeia leve | |||
| M13 Atacante cartilha | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| Iniciador M13 reverso | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| AJUSTES PCR | |||
| Passo 1. | 94 ° C durante 3:00 min | ||
| Passo 2. | 94 ° C durante 0:30 min | ||
| Passo 3. | 55 ° C durante 0:30 min | ||
| Passo 4. | 72 ° C durante 1:00 min | ||
| Volte para a Etapa 2 e repita 24x | pule para o passo 2 | ||
| Passo 5. | 72 ° C durante 7:00 min | ||
| Passo 6. | |||
Tabela 2. PCR Master Mix and Settings.
| Interpretação dos resultados de descontaminação | |||
| Chapa | Esperado título carbenicilina | Se não? | |
| Controle Pré-infecção | 0 | As células foram pré-infecção; nada se pode concluir a partir da experiência. | |
| Controle de contaminação | gramado | Contaminação insuficiente para ser capaz de avaliar a eficácia da descontaminação subsequente; Considere submergindo colector em vez de solução de fagos a aspiração. | |
| Teste de descontaminação | 0 | Descontaminação não concluir; aumentar o tempo de imersão, a Concentra lixíviação ou tentar SDS e lavagens de EtOH vez. | |
Tabela 3. Avaliação da anilha de descontaminação. Para determinar a eficácia da descontaminação, é necessário mostrar que a máquina de lavar foi contaminado com fagos, e que o protocolo de descontaminação eliminado com sucesso que a contaminação. Usando fago que conferem resistência carbenicilina, os resultados esperados a partir de um tal teste são listados, juntamente com sugestões deve o verdadeiro resultado difere do resultado esperado.
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Discussion
Ao conduzir em selecções de anticorpos in vitro, os dois principais determinantes do sucesso selecção são 1) o isolamento de alvos antigénicos bem dobradas para a selecção em cima e 2) a disponibilidade de uma biblioteca de anticorpos de alta diversidade funcional. Em muitos casos, a disponibilidade de quantidades suficientes de bem-dobradas, proteína de comprimento completo pode ser limitante. Uma abordagem para superar esta limitação é a utilização de domínios identificados a partir da análise de bioinformática 22 e sintetizados para inserção num vector de expressão bacteriano com uma marca de afinidade adequada.
Há uma variedade de marcas que são usadas em aplicações de biotecnologia para aumentar a solubilidade, facilitar a purificação e para estabilizar domínios instáveis. 11 A capacidade de sintetizar virtualmente qualquer sequência desejada, é possível inserir uma plataforma altamente versátil geração antigénio. Embora o formato de tag-GST é comum, os resultados bem-sucedidos foram previamenteobtido utilizando hexa-histidina, Fc, halo, proteína de ligação a maltose e as etiquetas de biotinilação específica do local, e acredita-se que inúmeras outras marcas de afinidade pode ser optimizado para a utilização de uma plataforma semelhante. No entanto, os marcadores de afinidade pode ter conseqüências negativas tanto benéficos e não intencionais em aplicações a jusante 11 e devem ser cuidadosamente investigadas antes de estabelecer um gasoduto com base em um formato particular.
Muitas vezes, os novos usuários vão colocar a questão de como avaliar a qualidade de uma biblioteca de anticorpos e, embora não há uma resposta simples, deve-se tentar avaliar vários recursos importantes (seja natural ou sintética), incluindo a diversidade global, os níveis de exposição relativos, a natureza da e extensão da randomização (isto é, criação de biblioteca contra o conteúdo da biblioteca determinada por sequenciação) e as propriedades físico-químicas do anticorpo versus aplicação pretendida. Embora fora do âmbito deste protocolo, a treatme mais detalhadant esses recursos e como elas podem afetar a seleção de anticorpos pode ser encontrada aqui 2,23. O conhecimento da diversidade da biblioteca é, em particular, importante para assegurar a cobertura adequada da diversidade durante as selecções. Tipicamente, uma concentração de fagos que fornece 100-1.000 cópias de cada clone de fago na biblioteca é desejável e deve garantir que quaisquer verdadeiros ligantes positivos presentes na biblioteca pode ser recuperado. No entanto, a ligação não específica de fagos para microplacas superfícies aumenta dramaticamente acima 10 13 fagos / mL, e de muito diversas bibliotecas, mais do que um único poço por antigénio podem ser necessários para assegurar uma cobertura suficiente. Por outro lado, se a biblioteca de entrada for demasiado diluída, a concentração absoluta de verdadeiros positivos ligantes será medida abaixo da KD (tipicamente nM) que não vai ser recuperado. Tendo em conta estes constrangimentos, bibliotecas de fagos geralmente deve ser novamente suspensas para outubro 12-13 fago / ml para a primeira rodada de seleções.0; A esta concentração, uma aliquota de 100 L de fago representa uma cobertura 1,000-100 dobra de uma biblioteca de diversidade 10 9 -10 10 e rotineiramente pode produzir clones de ligação a antigénios diferentes. A concentrações inferiores, ou o aumento das diversidades, pode ser necessário aumentar o número de poços de antigénio seleccionadas contra na primeira fase (ver Secção 2.9). Após a Round 1, no entanto, a maior parte da diversidade não vinculativo da biblioteca foi removido; excesso de cobertura do round 1 saída diversidade é na maioria das vezes facilmente realizável através de um único bem. Em casos de seleções paralelas em placas de 96 poços, isso pode reduzir o número de placas de selecção antigénio necessária para apenas um, subseqüentes ao primeiro round.
Durante seleções reais, titulação fago pode oferecer medidas objetivas de caracterizar e monitorar o progresso, enquanto ajuda a identificar áreas de interesse particular nas primeiras rodadas de seleção onde o enriquecimento não é suficiente paraser detectado. Isto pode ser particularmente útil durante a escala de seleções para determinar o desempenho do protocolo. Em geral, os títulos de fagos de entrada (ou seja, biblioteca ingênuo ou pós-amplificação de fagos eluídos) devem permanecer relativamente constante (10 12 -10 13 fago / ml) entre as rodadas, com baixo crescimento celular / títulos baixos fagos indicando potencial de contaminação e / ou pobre saída da ronda anterior. Embora titulos de fagos saída devem aumentar durante o enriquecimento em rodadas de selecção, é esperado um intervalo de 10 3 -10 5 ufc / mL nas duas primeiras rondas. Desvio relativamente a este intervalo pode indicar possíveis problemas com a seleção, como contaminação ou excesso de lavagem rigorosa. Nas etapas posteriores de selecção (ou seja, arredonda 3 e 4), o enriquecimento de clones que se ligam especificamente ao antigénio alvo pode ser avaliada por meio de ELISA que medem a ligação reunidas do conjunto de fagos contra ambos antigénio alvo e negativoproteína de controlo (ver secção 4).
Depois de 3-4 etapas de selecção (ou uma vez enriquecimento em proteína alvo atingiu um antigénio alvo: controlo negativo relação sinal de proteína de 2: 1 ou superior em comparação com a proteína de fundo), as células bacterianas infectadas são plaqueadas para isolar colónias individuais de fagemídeo para sequenciação , caracterização e clonagem inicial, se necessário. Neste momento, é altamente recomendável para converter Fab-fago para libertar Fab antes caracterização adicional. Apesar de Fab-fago pode ser utilizado para a caracterização inicial diluindo 10 ul de sobrenadante de fagos (descrito na Secção 5.1) em 20 ul de tampão PBT e detecção com anticorpos anti-M13-HRP (descrito nos Passos 4,4-4,5), na nossa experiência, propriedades de ligação pode mudar substancialmente em qualquer lugar de 5-20% de clones após a libertação da partícula de fago e conversão precoce pode evitar problemas com falsos positivos. A metodologia utilizada para a conversão específica dependerá da unique arquitetura da phagemid e, portanto, não será tratada explicitamente aqui. No entanto, nos vectores mais vulgarmente utilizados, isto pode geralmente ser conseguido por 1) transformação de fagemideo purificado (ou piscina fagemídeo) para um não supressor competentes E. estirpe de E. coli HB2151 tal como 55244 ou se uma paragem âmbar (TAG) intervém codão da proteína Fab e pIII, 2) inserção de um codão de terminação âmbar entre as proteínas Fab e pIII para permitir a expressão de fragmentos de anticorpo solúveis numa estirpe não supressora ou 3) através da clonagem de genes de imunoglobulinas (de fagemídeo indivíduo ou piscina fagemídeo) para um vector de expressão adequado. Para simplificar ainda mais a seleção e caracterização, métodos de clonagem combinadas podem oferecer meios efetivos para a conversão de clones de ligação en masse para construções de expressão, tanto eliminando o potencial de ligação de falso-positivo de partículas Fab-fagos e onde expressão lisados são utilizados para a caracterização precoce, mesmo o custo e esforço de purificaçãoinicialmente pode ser evitada.
Para clones isolados directamente a partir da biblioteca de F (descrito em 24), domínios variáveis de anticorpos podem ser sequenciados utilizando 1-2 ul de sobrenadante de fagos como molde para amplificar por PCR as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (Ver Tabela 2 para os iniciadores de Materiais Biblioteca F dirigidos ). Utilizando estes iniciadores, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve irá produzir produtos de ~ 700 e ~ 500 pb, respectivamente, que abrange todos os três CDRs. Primers incluir sites de recozimento para primers M13 de tal modo que os produtos podem ser sequenciadas após limpeza (conforme descrito na Seção 5.4.5) usando primers padrão disponíveis na maioria dos serviços centrais de seqüenciamento. Alternativamente, para piscinas Fab-fagos que foram clonados num vector de expressão e transformadas directamente em que E. coli para expressão, as colónias individuais podem ser isolados e ressuspendidos em 15 ul de 2YT e 1-2 ul da suspensão de células utilizadas directamente como molde para um único colony PCR utilizando iniciadores apropriados.
Automatização de seleções exigirá otimização e validação de várias funções robóticas chave. Em geral, manipulação de líquidos à base de pipeta devem ser precisas e consistentes em todos os 96 canais a lavagem deve remover os fagos não ligados de forma eficiente sem descascar antígeno adsorvido ou ligado Fab-fago a partir da placa de seleção. Descontaminação eficaz da placa máquina de lavar também é necessário entre os rounds para permitir o enriquecimento e contra-seleção efetivos, e entre seleções subseqüentes para evitar a contaminação cruzada. Para ajudar a optimizar o processo de selecção de alto rendimento, métodos simples para a avaliação destas funções têm sido usados anteriormente e são descritos abaixo e detalhados no protocolo.
Para avaliar a consistência dos volumes entregues por todos os canais de um grupo de distribuição / aspiração de líquido, uma solução colorida é pipetado para uma placa de 96 poços de fundo plano eo absorbance em cada poço medida num leitor de placas. Um cromóforo, tal como o azul de bromofenol é útil para soluções de tingimento idênticas às utilizadas para a selecção de reais para avaliar os efeitos de diferentes propriedades de tensão superficial e de coesão sobre os volumes entregues. Após se confirmar que todos os canais são dispensar volumes consistentes, a precisão do volume total administrada pode ser determinada pela medição da massa de líquido transferido para cada placa.
Automação de lavagem para remover placa clones não ligados requer primeiramente a optimização do ritmo a que tampão de lavagem é para ser dispensado e o número de lavagens para ser empregue. Um método razoável de se avaliar este parâmetro emprega controlos positivos (clones específicos de ligação de Fab-fago) para avaliar os efeitos da variação da taxa e / ou o número de lavagens de distribuição para determinar se 1) adsorvido antigénio ou fago ligado é removido por lavagem excessivamente rigorosas ou 2) uma ligação não específica de proteínas não é excessivo d cognatosue a condições de lavagem que não são suficientemente rigorosas. Residual / fago ligado pode ser detectado e quantificado por infecção em bactérias e placas para contagem de colónias individuais, ou por ELISA utilizando anticorpos secundários específicos para os marcadores de afinidade de anticorpos ou proteínas de revestimento do fago. Os controlos negativos são usados para avaliar os níveis residuais de não-ligação de Fab-fago a proteínas alvo ou a ligação de Fab-fago específico para as proteínas não cognatos / fundo, que podem ser elevados se a lavagem não é suficientemente rigoroso. Neste caso utilizou-se a BSA imobilizada como um controlo para a ligação não específica e um anticorpo anti-FLAG, que reconhece um epitopo marcador FLAG no Fab-fago como um controlo positivo. Foram comparados oito e dezesseis ciclos de lavagem utilizando o robô contra a lavagem à mão, com um caudal médio, para mostrar que essas técnicas foram equivalentes. Como alternativa, a medição de entrada e saída de títulos de fagos (ver capítulo 7) durante seleções em curso também pode ajudar a fazer ajustes finos nos parâmetros de lavagem. Finalmente, a descontaminação dos lavadores de placas usadas para as seleções devem ser eficazes, a fim de eliminar carry-over de fago de seleções anteriores. Em nossa experiência, recém-diluída de hipoclorito de sódio a 0,5% é rápido, eficaz e barato. Detergentes tais como o SDS são eficazes, mas também necessitam de muito mais extensa lavagem para remover do sistema. Verifique a compatibilidade de reagentes para o sistema antes de qualquer teste. Para avaliar a descontaminação, que testar a presença de fagos residual em soluções tratadas pelo sistema de fluidos e interpretar os resultados de acordo com a Tabela 3.
Em resumo, este protocolo proporciona um método para isolar escalável Fabs de bibliotecas combinatórias pelo paralelo em selecções in vitro contra domínios proteicos e oferece técnicas para a validação de um sistema de selecção de fagos automatizado. Barreiras de custo e de infra-estrutura que extensas instalações de animais podem representar são mitigados uma vez que este método não rely mediante a imunização de animais. Além disso, por meio da integração com a seleção geração antígeno-anticorpo fago, fatores de qualidade que afetam o sucesso de seleção são mais facilmente monitorado e ajustado. Quando o período de tempo a partir da expressão de antigénio para a selecção e caracterização inicial é da ordem de 6-8 semanas, uma maior capacidade de resposta do sistema de produção pode ser realizado. Os anticorpos isolados a partir de selecções in vitro são também ambos facilmente modificado (devido ao genótipo-fenótipo ligação) e renovável, exigindo apenas o ADN armazenado de a construção de expressão para repetidamente e de forma reprodutível voltar a gerar anticorpos. Finalmente, mostrando que este protocolo pode ser realizado utilizando uma abordagem quasi-manual ou totalmente automatizado, que emprega um sistema de seleção robótico de design personalizado, o rendimento pode ser escalável e acessível a pequenos laboratórios acadêmicos e industriais igualmente.
Usando os métodos de alto rendimento descritos acima e a biblioteca de F biblioteca de anticorpos sintética 24 tanto in vitro - e em proteínas in situ -expressed. Embora as taxas de sucesso para qualquer dado selecção irá depender tanto sobre a qualidade (pureza, foldedness, mono-dispersividade etc.) dos alvos de antigénio, bem como a qualidade e a diversidade da biblioteca de anticorpo, observou-se que em qualquer lugar 25-80 % de antigénios irá produzir ligantes para uma selecção de alto rendimento. Importante, é importante notar que os clones com a capacidade de modular a função de destino também pode muitas vezes ser selecionado. Esta biblioteca é construída usando uma estrutura totalmente humano, o que torna estes anticorpos passíveis de potencial aplicação terapêutica 25, reforçando, assim, a importância deste oleoduto como uma abordagem alternativa para a produção de reagentes de afinidade com base amplavalor.
Em resumo, a robustez e versatilidade da abordagem apresentada neste protocolo continuará a ajudar na otimização, industrialização e uso generalizado final desta tecnologia como um meio viável de atingir a meta de longo prazo de geração de reagentes de afinidade para praticamente todos os membros da proteoma humano.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o Fundo Comum do NIH - Protein Programa de reagentes de captura para financiar o desenvolvimento da seleção anticorpo recombinante e caracterização gasoduto Antibody Rede e da Fundação Canadense para Inovação para a compra financiamento da plataforma seleção robótico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
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