Summary
Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.
Abstract
La demanda de los anticuerpos que se satisfagan las necesidades de las aplicaciones básicas y clínicas de investigación es alta y se incrementará dramáticamente en el futuro. Sin embargo, es evidente que las tecnologías tradicionales no son monoclonales solo hasta esta tarea. Esto ha llevado al desarrollo de métodos alternativos para satisfacer la demanda de alta calidad y reactivos de afinidad renovables a todos los elementos accesibles del proteoma. Con este fin, métodos de alto rendimiento para la realización de selecciones de bibliotecas de anticuerpos en fagos sintéticos se han diseñado para aplicaciones que implican diversos antígenos y optimizado para un rendimiento rápido y el éxito. En la presente memoria, un protocolo se describe en detalle que ilustra con la demostración de vídeo la selección paralela de clones Fab fagos a partir de bibliotecas de alta diversidad contra cientos de objetivos usando un manipulador de líquidos 96 manual de canales o el sistema de robótica automatizada. El uso de este protocolo, un solo usuario puede generar cientos de antígenos,seleccionar anticuerpos a ellos en paralelo y validar la unión de anticuerpos dentro de 6-8 semanas. Se destacan: i) un formato antígeno viable, ii) caracterización del antígeno preselección, iii) los pasos críticos que influyen en la selección de clones específicos y de alta afinidad, y iv) las formas de efectividad selección monitoreo y etapa temprana caracterización anticuerpo clon. Con este enfoque, hemos obtenido fragmentos de anticuerpos sintéticos (FABS) a muchas clases de objetivos, incluyendo los receptores de un solo paso de membrana, hormonas de proteínas secretadas y proteínas intracelulares multi-dominio. Estos fragmentos se convierten fácilmente a los anticuerpos de longitud completa y se han validado para exhibir una alta afinidad y especificidad. Además, se han demostrado para ser funcionales en una variedad de inmunoensayos estándar, incluyendo transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia celular, inmunoprecipitación y ensayos relacionados. Esta metodología se acelerará el descubrimiento de anticuerpos y en última instancia, nos acercan a la realización del objetivo of generación de anticuerpos de alta calidad, renovables a la proteoma.
Introduction
Con el inicio de la era post-genómica, la disponibilidad de reactivos de unión de alta calidad para caracterizar y modular proteínas es esencial para abrir nuevas investigaciones y vías terapéuticas. Los anticuerpos siguen siendo fundamentales para los investigadores académicos e industriales como la investigación básica y las herramientas de diagnóstico y terapéuticos potenciales. No en vano, se ha registrado un impresionante crecimiento de las empresas de desarrollo de anticuerpos contrato, la mayoría de los cuales se basan en tecnologías de hibridoma convencionales para generar anticuerpos personalizados. Sin embargo, la selección in vitro usando bibliotecas de anticuerpos en fagos se está convirtiendo en una tecnología poderosa alternativa que puede ofrecer ventajas únicas y éxito donde las tecnologías convencionales pueden enfrentar limitaciones 1, 2.
A la luz de la considerable demanda de anticuerpos de alta calidad como herramientas de investigación, dos retos principales para la generación de anticuerpos renovables son 1) el rendimiento de la selección y 2) av antígenodimensiones pueden ser. Un número de grupos han descrito en las tuberías de selección in vitro destinadas a aumentar el rendimiento y la tasa de identificación de anticuerpos. Estas descripciones detalle una variedad de enfoques viables que incluyen la selección a ya sea de longitud completa se dirige a 3,4, o dominios 5,6,7 estructuralmente relacionado, utilizando ya sea 6,8 o placa de base 3,4 esquemas de inmovilización del antígeno basado en perlas. Además, la creciente adopción de las tecnologías de síntesis de genes 9 ha hecho la generación de antígeno sistemática, en particular de dominios aislados, razonablemente rentable y puede potencialmente aliviar la dificultad en la obtención de cantidades suficientes de antígeno purificado, de longitud completa. Mediante el uso de las dos tecnologías en tándem, un oleoducto autónomo y generación antígeno escalable y selección de anticuerpos se ideó que permita el aislamiento paralelo de anticuerpos para grandes conjuntos de dominios de antígenos expresados y facilitar el desarrollo de reactivos para characterizing clases enteras de proteínas estructuralmente o funcionalmente relacionados.
Con este objetivo, un gasoducto integrado que las parejas en la identificación in silico de dominios antígeno expresables, síntesis de genes, expresión bacteriana de alto rendimiento de antígenos y escalables fagos selecciones de anticuerpos se ha desarrollado. Este gasoducto requiere sólo la infraestructura básica disponible para la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida (incluidas las bibliotecas de anticuerpos que son cada vez más accesibles a través de un acuerdo de licencia o de transferencia de material), pero también es susceptible de automatización para el uso a escala industrial. El uso de este protocolo, es posible generar cientos de dominios antigénicos de afinidad de etiquetado, y aislar fragmentos de anticuerpos rutinariamente altamente específicos para muchos de estos antígenos.
La tecnología de presentación en fagos ha demostrado demostrado la compatibilidad con una amplia variedad de formatos de reactivo de afinidad recombinantes incluyendo Fab, scFv, Fv y los dominios autónomos y unacreciente variedad de pequeños "marcos alternativos" (proteínas ankyrin repetir diseñados (DARPins), fibronectina (FN), dominios de lipocalina y más 10). Discusión se limita en este ejemplo para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos Fab, aunque se presume que estos métodos pueden adaptarse a otros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnología, los Fab con baja afinidad nanomolar a pequeña, etiquetados dominios de la proteína incluyendo dominios del factor de transcripción, dominios SH2, proteínas y otros ARN vinculante se han seleccionado con éxito, muchos de los que se unen para pedir una proteína y son funcionales en inmunoensayos, como la inmunofluorescencia , inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Es importante destacar que los clones de unión recombinantes son totalmente renovable y se puede volver a generar a partir de construcciones de expresión a través de la producción bacteriana oferta mayor coherencia, la reproducibilidad y la rentabilidad, lo que justifica el gasto de validación clon riguroso.
En este protocol y video que lo acompaña, se demuestran los métodos básicos para la selección de anticuerpos de bibliotecas de fagos utilizando dominios de antígenos inmovilizados. Este método particular emplea dominios de la proteína marcada con GST inmovilizado por adsorción pasiva en placas de micropocillos, aunque otras etiquetas 11,12,13 y formatos de selección 13,14,2 también se han utilizado con éxito. Consideraciones críticas para la configuración y el comportamiento de las selecciones con control paralelo de parámetros de selección destinados a identificar y aislar anticuerpos monoclonales específicamente enriquecidos para la validación se detallan.
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Protocol
1. Antígeno Generación
NOTA: los dominios antígeno puede ser sintetizado y clonado por una variedad de vendedores comerciales en un constructo de expresión inducible por IPTG apropiado.
- Transformar los constructos de expresión en, T1-fago resistente químicamente competente, BL21 E. células de E. coli por mezcla de 10 ng de ADN que codifica en 20 l de 1X KCM en el hielo en una placa de PCR de 96 seguido de la adición de 20 L de las células químicamente competentes.
- Incubar la mezcla de células / ADN en hielo durante 20 min, a temperatura ambiente durante 10 min y luego en hielo de nuevo durante 2 min antes de salvamento con 100 l de caldo de súper óptima pre-calentado con glucosa (SOC) medios de comunicación, cubriendo con una junta de la placa transpirable y agitación a 37 ° C durante 1 hora a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm.
- Placa de 5 l de células transformadas a Luria-Bertani (LB) placas / agar suplementado con carbenicilina (100 g / ml) y crecer O / N para obtener colonias individuales utilizados paragenerar stocks de glicerol.
- Inocular 1 ml de 2YT media / carbohidratos con 5 l de glicerol y crecer durante 12 horas a 37 ° C en un bloque de 96 pocillos de pozo profundo con agitación a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm.
- Inocular NZY media15 (suplementado con 0,05% de glucosa, 2% de lactosa y 100 g / ml de carbenicilina) con una dilución 01:40 de este cultivo, a continuación, se agita durante 6-8 horas a 30 ° C y 200 rpm en un orbital 2,5 cm coctelera.
- Bacterias de pellets y purifican proteínas antigénicas en alto rendimiento en una placa de filtro de 96 pocillos que contenía 100 l de resina Ni-NTA como por protocols16,17 publicado previamente.
- Determinar la concentración de proteínas purificadas por Bradford assay18 de fijación de colorante y caracterizar para el tamaño y la pureza de la separación y visualización de 10-50 g con tinción de Coomassie en un gel de SDS-PAGE (Ver Figura 2).
NOTA: En esta etapa proteínas puede caracterizarse adicionalmente por métodos que evalúan la agregación de proteínas 19 20 dependiendo de la naturaleza del antígeno y los requisitos de la tubería de selección.
2. Preparación y titulación de la biblioteca de fagos
- Elija una sola colonia de T1 fago resistentes E. coli células en 1 ml de medio 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina.
- Una vez que el crecimiento celular se establece visualmente, diluir el cultivo en un volumen mayor de 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina para asegurar un volumen suficiente de células para la infección (generalmente 45 l por dilución biblioteca, ver a continuación.).
- Preparar la biblioteca para su uso por precipitar el fago de tampón de almacenamiento con 1 / quinto volumen de autoclave 20% de PEG-8000, M NaCl 2.5 (PEG-NaCl) incubar en hielo durante 30 min y la granulación precipitó el fago por centrifugación a 12.000 x g.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado de fago en un volumen apropiado de 1x PBS pH 7,4, 0,2% de BSA y 0,05% de Tween (PBT), ajustando to una concentración de fago apropiado para selecciones (si es necesario) para garantizar la cobertura de la biblioteca adecuada. Consulte el paso 2.9 y Discusión.
- Diluir una alícuota del fago 5 l en 45 l de 1x PBS pH 7.4 en una placa multi-pocillo estéril, mezclar y crear una serie de diluciones de 10 veces en el mismo tampón.
- Añadir 5 l de cada dilución de fago a 45 l de fago T1 resistentes E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 600 = 0,4 a 0,8) en otra placa de múltiples pocillos, cubren con un sello transpirable e incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 30 minutos en un agitador orbital 2,5 cm.
- Placa de 5 l de células infectadas de cada uno de los pozos en una placa de agar pre-calentado suplementado con 100 g / ml de carbenicilina y crecer O / N a 37 ° C hasta que las colonias son visibles.
- Calcular el total de fagos / ml como sigue:
Los fagos / ml = número de colonias en una placa carbenicilina en el diluir la muestra x 200 x 10 i (con i = el num más máximoBER de diluciones en el que las colonias son evidentes). - Para determinar el número de pocillos recubiertos de antígeno para asegurar la cobertura de la diversidad de la biblioteca, calcular como sigue:
Número de pozos recubiertos de antígeno requerida =
Cobertura pliegue deseado * diversidad de la biblioteca
Nº de fagos por 100 l
3. Anticuerpo Selección de bibliotecas de fagos
3.1) Inmovilización de antígeno
- Para evitar los ciclos de congelación-descongelación que pueden afectar a la calidad del antígeno y para facilitar diluciones, preparar un plato proteína antigénica de almacenamiento normalizado a 100x concentraciones de trabajo (por ejemplo, 500 g / ml) y alícuotas a placas de 96 pocillos no vinculante.
- Preparar placas recubiertas de antígeno a partir de soluciones de stock de proteína un día antes de cada ronda de selecciones mediante la dilución de placas stock con PBS.
- Escudo placas de 96 pocillos de poliestireno de unión a proteínas de alto con 100 l de proteína antigénica GST-etiquetados o control negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a 5 mg / ml en PBS. Agitar a 250 rpm 4 ° CO / N en un agitador de microplacas.
- Eliminar la solución de proteína de la recubierto microplacas, bloquear las placas recubiertas de antígeno y la selección negativa con 200 l de tampón de bloqueo (0,2% de BSA en PBS 1x pH 7,4) y agitar a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
- Después del bloqueo, lavar las placas recubierto de proteína bloqueadas cuatro veces con 200 l de 1x PBS pH 7,4 con 0,05% de Tween (PT) de tampón ya sea manualmente o usando un lavador de microplacas automático.
3.2) Biblioteca Pre-liquidación y Antigen-fago Incubación
- Agotan la biblioteca de no (o TAG) clones específicos de unión de fagos de fragmentos de anticuerpos a través de la transferencia de 100 l (10 12) de fago de biblioteca de fagos preparado en tampón de PBT a una serie de pocillos recubiertos con proteína de control negativo o etiqueta de afinidad libre proteína (por ejemplo, GST) equivalente al número de objetivos e incubar fagoen pocillos durante 1-2 horas a RT con agitación a 250 rpm.
NOTA: Como una alternativa o medios adicionales de selección negativa, la incubación puede también llevarse a cabo en presencia de un exceso (5-25 mM) etiqueta de afinidad de proteína soluble (por ejemplo, GST) para eliminar adicionalmente los clones de unión de etiquetas y mejorar la recuperación de la diana específica clones de unión. - Transferencia de fago sobrenadante de selección negativa a las placas recubiertas con antígeno y se incuba durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación a 250 rpm para la captura de los clones de unión específicos.
- Retire fago no unido y se lavan los pocillos de la microplaca 8-15 veces con tampón PT ya sea manualmente o utilizando un lavador de microplacas. Retire el exceso de tampón de lavado justo antes de la elución.
3.3) elución, Infección y Fago amplificación
- Temprano en el día de elecciones, elegir una sola colonia de T1 fago resistentes E. coli células en 1 ml de medio 2YT suplementado con 50 mg / ml de tetraciclina y crecer a 37 ° C wiº agitación a 200 rpm en un agitador orbital 2,5 cm o equivalente.
- Una vez que se estableció el crecimiento celular y puede ser visto por el ojo, aumentar el volumen de los medios de comunicación con 2YT suplementado con 50 ug / ml de tetraciclina para asegurar un volumen suficiente de células para la infección (generalmente 100 l por selección bien).
- Cultivar las células hasta una DO 600 de 0,4-0,8 se alcanza (aproximadamente 5-7 horas), a continuación, para eluir el fago unido añadir 100 l de células a la placa de antígeno se lavó y agitar a 37 ° C durante 30 min.
- Añadir fago auxiliar M13K07 a una concentración final de 1 x 10 10 ufc / ml y se incuba a 37 ° C durante 45 min con agitación a 200 rpm.
- La transferencia de células a 1,2 ml de 2YT suplementado con 150 mg / ml de carbenicilina y 75 mg / ml de kanamicina en un bloque de 96 pocillos de pozo profundo con fondo en V y crecer O / N a 37 ° C con agitación a 200 rpm en un 2,5 cm agitador orbital.
3.4) Preparación Fago y repetidas rondas de Selección
- Bacterias de pellets por centrifugación a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Mezclar volúmenes iguales de sobrenadantes de fagos de placas replicadas en un mini-tubo de 96 pocillos caja azul de microplacas estériles, neutralizar con 1/10 volumen de 10X PBT y mezclar. Repetir las rondas de selección (a partir del paso 3.1.1) por 3-4 rondas o hasta que se observa el enriquecimiento (Vea las Secciones 4. y 7.) en comparación con la proteína de control negativo.
NOTA: En las primeras rondas de selección cuando no se espera un importante enriquecimiento / detectable (es decir, las rondas 1 y 2), la cuantificación de los títulos de entrada y salida de fagos (descritos en la Sección 7 y resultados representativos se muestra en la Figura 3) puede ser útil para asegurar concentraciones mínimas de fagos para selecciones exitosas (descritos en discusión) y son más apropiados que los ELISA agrupados.
4. Caracterización por Pooled ELISA
- 96 pocillos Escudo de alto valor proteico-binding placas de poliestireno con 100 l de GST-etiquetados proteína antígeno o proteína de control negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 mg / ml según la Sección 3.1 y agitar a 4 ° CO / N.
- Eliminar el exceso de antígeno, bloquear la placa con 200 l de tampón de bloqueo con agitación durante 1-2 horas a RT a 250 rpm en un agitador de microplacas y se lava cuatro veces con tampón PT 200 l, ya sea a mano o por lavador de placas automatizado.
- Aplicar 100 l de sobrenadante de fago (diluido 1: 10-1: 20 en tampón PBT), agitar a 250 rpm durante 15 min a TA, y se lava la placa ocho veces con tampón PT 200 l.
- Añadir 100 l de anti-M13-HRP (1: 5000 en tampón PBT). Agitar a 200 rpm durante 30 min a RT, a continuación, lavar la placa seis veces con tampón PT 200 l y dos veces con 200 l de PBS.
- Aplicar 100 l de 1: 1 de sustrato TMB y desarrollar durante 5-15 min (o hasta que el color sustancial ha desarrollado), y luego se detiene la reacción por adición de 100 l de 1 MH 3 4 y leer la placa a 450 nm.
- En general, el enriquecimiento en grupos de fagos se puede observar en las rondas 3-4 como una relación de la unión específica frente a la unión no específica de> 2 (véase la Figura 4)
NOTA: Es informativo observar que gran señal de unión absoluta de la proteína marcador de afinidad indica enriquecimiento de carpetas-etiqueta específica (en lugar de carpetas de destino), y que la señal de unión absoluta en lo alto de la proteína de control negativo indica enriquecimiento de no específica o " aglutinantes pegajosas ".
5. Clone Selección, secuenciación y caracterización
5.1) El aislamiento de clones individuales Fab-fago
- Para aislar clones individuales para la secuenciación y caracterización, infectar 1/10 volumen de la piscina de fago amplificado en al fago T1 resistentes a E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 600 = 0,4-0,8) en una placa de microtitulación de fondo redondo, cubrir con un Breathajunta de la placa ble e incubar con agitación a 200 rpm durante 30 min a 37 ° C.
- Preparar 10 veces diluciones seriadas en medios 2YT y placa sobre placas de agar separadas suplementadas con 100 g / ml de carbenicilina.
- Recoger colonias individuales en 450 l de medio 2YT / carb suplementado con 1 x 10 9 M13K07 fagos / ml y crecer O / N en un mini-tubo 96 caja azul de microplacas pocillo estéril de incubar a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- Bacterias de pellets por centrifugación a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Sobrenadante de fago clonal se puede utilizar para la secuenciación de clones Fab fagos (como se describe en la Sección 5.4), o para clonal-ELISA de unión directo para determinar la especificidad contra antígenos inmovilizados (como se describe en las Secciones 5.3 y 21) para los que los resultados representativos se muestran en la figura 5.
5.2) La expresión de los clones Fab para la caracterización
- Después de la clonación en un apropiado evector xpression (ver Discusión), recoger sola E. coli colonias transformadas con construcciones de expresión a 1 ml de 2YT media / carbohidratos en un 96 y placa de pozo profundo con un palillo o punta de la pipeta estéril y crecer durante 12-16 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Esto se puede hacer ya sea manualmente o con un selector automático de colonias.
- Transferencia de 40 l de cultivo en crecimiento de 1,5 ml de medio NZY suplementado con glucosa / lactosa / glicerol en un bloque bien para pozos profundos 96 según la metodología de Studier et al. 15
NOTA: Como alternativa, las células se pueden cultivar durante 3-4 hr (OD 0,8-1,0) en la expresión no suplementada y la proteína inducida por la adición de 1 mM IPTG. - Cubrir el bloque de cultivo (s) con un sello transpirable y expresar clones de Fab durante 6-8 horas a 30 ° C con agitación a 200 rpm. Placas giran a 4000 xg durante 15 min para sedimentar las células bacterianas, separar el sobrenadante, placas de recubrimiento con un sello de papel de aluminio y se congelan bolitas a -20 ° C hasta que la lisis.
- Liberar los Fab expresados a partir de gránulos recogidos con 100 l de tampón de lisis (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% Triton X-100 de pH 8,0 con 1 mg / ml de lisozima y 10 inhibidores de benzonasa / ml de cultivo y de la proteasa u) y agitación durante 2 horas a 4 ° C.
- Eliminar los restos celulares por centrifugación a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C y se recoge el sobrenadante lisado crudo para su uso en la caracterización inicial de la especificidad por placas de ELISA (véase la Sección 5.3).
5.3) Caracterización Clon por la unión directa Clonal Fab ELISA
- Inmovilizar antígenos como se describe en la Sección 3.1 en lugar aliquotting 30 l de 2 mg / ml de antígeno en PBS a los pocillos de una placa de 384 pocillos. Diseños de antígeno basados en Quad en la placa pueden facilitar la transferencia de reactivos cuando se usa 96 cabezales de distribución basadas en canal. Lave y bloquear las placas de ELISA según la Sección 3.1.
- Lisados aclarados recogidos de Sección 5.2 se puede aplicar directamente al antígeno inmovilizado para evaluación de la unión. Incubar 30 l de lisado por pocillo durante 15 min a TA con agitación a 200 rpm.
NOTA: proteína purificada clon Fab alternativamente se puede utilizar mediante la dilución de 10 g / ml en tampón de PBT y la aplicación de 30 l de cada clon a los pocillos bloqueados que contienen antígeno o proteína de control negativo (GST, BSA etc.) y el desarrollo de la misma manera descrita a continuación. Alternativamente, Fab-fago también se puede utilizar mediante la dilución de 10 l de sobrenadante de fago (que se describe en la Sección 5.1) en 20 l de tampón PBT (1: 3) y la detección con anticuerpos anti-M13-HRP (que se describe en los pasos 4.4 a 4.5) - Retire el exceso de lisado y lavar los pozos ya sea manualmente o utilizando una placa automatizado lava 8x con 100 l de tampón PT y eliminar el exceso de buffer.
- Incubar 30 l de una dilución 1: 5000 de anticuerpo anti-FLAG secundaria en tampón PBT durante 30 min a RT con agitación a 200 rpm.
- Lave, desarrollar y cuantificar indicados en los puntos 4.3 a 4.5.
NOTA: Los resultados representativosque ilustran clones de unión tanto específicas como no específicas se muestran en la Figura 5.
5.4) Secuenciación Clone
- Prepare una mezcla maestra de PCR como se indica en la Tabla 2.
- Añadir 2 l de la plantilla de PCR apropiado (ya sea fago sobrenadante o re-suspendido sola colonia bacteriana que contiene fagémido-) a 20 l de mezcla maestra de PCR preparados con los cebadores apropiados en los pocillos de una placa de PCR.
NOTA: se requieren mezclas de reacción separadas para la secuenciación de ambos los genes de las cadenas pesadas y ligeras. - Ejecutar la reacción de PCR usando los parámetros enumerados en la Tabla 2 - Configuración de la PCR.
- Verificar el éxito de la reacción de PCR mediante la mezcla de 5 l de la reacción completada con colorante de carga en un gel de agarosa al 1% suplementado con tinción de ADN y la visualización de imágenes en un transiluminador de 300 nm.
- Añadir 2 l de producto de PCR a 10 l de agua estéril que contiene 0,2; L cada uno de exonucleasa y la fosfatasa alcalina de camarón y se incuba a 37 ° C durante 20 min seguido de la inactivación de la enzima a 80 ° C durante 10 min para eliminar el exceso de cebadores en la preparación para la secuenciación.
6. Escala de Selección Automatizado
6.1) de manejo de líquidos a base de pipeta
- Preparar un 1% (w / v) de azul de bromofenol en agua y eliminar las partículas insolubles usando un filtro de 0,45 ml.
- Para determinar el rango lineal de la absorbancia en el lector de placa, preparar una dilución 1: 1.000 de la solución de azul de bromofenol 1% en agua, y continuar con dos veces diluciones en serie (diluciones 16 en total).
- Transfiera 100 l de cada dilución a una placa de fondo plano de 96 y leer la absorbancia a 590 nm. Terreno absorbancia absoluta frente factor de dilución y elegir una dilución en el medio a alto final del rango lineal para pruebas posteriores.
- Añadir azul de bromofenol al agua o a la solución realque se pipetearon en base a la dilución escogida en el paso anterior en un volumen suficiente para el pipeteado para tres placas de 96 pocillos, más el volumen muerto en el depósito.
- Calibrar una pipeta de un solo canal para entregar el volumen de ensayo pipeteando agua sobre una balanza analítica (100 l de agua pesa 100 mg a TA.)
- Usando la pipeta calibrada, transferir el volumen de ensayo de la solución de teñido para al menos tres pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano y leer sus absorbancias a 590 nm, por triplicado.
- Pesar tres pocillos vacíos de fondo plano de 96 en una balanza analítica y registrar sus masas.
- Volumen de ensayo de pipetas de depósito para cada uno de tres placas de 96 pocillos y medir sus absorbancias a 590 nm, por triplicado.
- Pesar cada placa y calcular la diferencia de masa.
- En primer lugar, evaluar si las absorbancias de cada bien son uniformes dentro del rango de tolerancia (por ejemplo., +/- 5%) y de su coherencia con la famie absorbancias obtenidas por mano de pipeteado con el Pipetman calibrado. Si los canales particulares son consistentemente más o de menos la entrega (por ejemplo, véase la Figura 6), siga los procedimientos de reparación y repita el procedimiento de evaluación hasta que todos los canales ofrecen volúmenes uniformes.
- En segundo lugar, una vez que todos los canales se confirman la entrega de volúmenes uniformes, comprobar la exactitud de ese volumen mediante el cálculo de la diferencia de masa promedio por pozo. Por ejemplo, un conjunto manipulador de líquidos perfectamente calibrado para 100 l entregará 9,60 g de agua por placa, o 0,10 g de agua por pocillo. Si el volumen real de entrega es consistentemente sobre o bajo el volumen deseado, a continuación, un factor de corrección se puede aplicar, es decir, la programación de 110 l con el fin de entregar en realidad 100 l.
NOTA: Para pequeños volúmenes, por ejemplo, 10 l, utilice diez veces más azul de bromofenol en la solución de teñido, y pre-alícuota de 90 l de agua a las placas de 96 pocillos a mano, para asegurar que el absorbances son medibles y la caída en el rango lineal.
6.2) Lavado automatizado Plate
- Inmovilizar objetivo positivo y proteínas de control negativos en pocillos separados de microplacas de 96 pocillos (dos placas para cada condición a ensayar) como se describe en la Sección 3.1.
- Bloquear los sitios de unión no específica mediante incubación con solución de bloqueo durante una hora a RT.
- Añadir idénticas alícuotas de 100 l de una ufc 10 13 / ml objetivo vinculante solución de Fab-fago en PBT a todos los pocillos en todas las placas y se incuba con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 hr.
- Lávese las dos placas de acuerdo a cada estado, una placa para la infección y la titulación y una placa de ELISA.
- Evaluar la eficacia del lavado por la infección directa en bacterias y titulación (como se describe en la Sección 3.3 (sin M13K07 adición) y 7.2.1) o desarrollo con anti-anticuerpo M13 HRP y sustrato colorimétrico (como se describe en la Sección 4).
- Valoraciones de fagos from clones específicos a menudo producirán en el intervalo de 10 5 -10 7 fagos / ml de una proteína inmovilizada contra el cual se une específicamente el clon. Algunos unión residual de proteína de control negativo (por ejemplo, BSA) es de esperar y, en general 10 2 -10 5 fagos / ml se observan, sin embargo los títulos muy bajos (es decir., <10 1) puede tener señal de lavar excesivamente estrictas, lo que puede poner en peligro una selección.
- Para fago unión determinada por ELISA, comparar las señales absolutas vinculantes para las proteínas de control positivo y negativo para determinar si el lavado robótico es equivalente al establecido causa de lavado de manos (Figura 7).
6.3) La descontaminación Lavavajillas Placa
- Para comenzar, ejecutar el protocolo de descontaminación para ser probado.
NOTA: Recomendamos el uso de al menos el doble del volumen total de la línea, y el primer y tomar la cabeza lavadora durante 5 minutos en el 0,5% de hipoclorito de sodio, fr recién diluidolejía comercial om (típicamente 6% de hipoclorito de sodio). - Primer y tomar la cabeza lavadora durante 5 min en (autoclave) de agua estéril y, por último, cebe el sistema hasta que las líneas están llenas de aire.
- Primer de las líneas con agua estéril o tampón de lavado.
- Lavar una microplaca de 96 pocillos estériles una vez, retire de la lavadora y el sello con junta de la placa estéril. Esta es la placa de control previo a la contaminación.
- Alícuota de 100 l de O / N amplifican la cultura fago sobrenadante a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos.
- Lave la placa que contiene el fago-una vez, a continuación, retire de la lavadora y sellar con un sello de plástico o papel de aluminio placa. Esta es la placa de control de la contaminación.
- Llevar a cabo el protocolo de descontaminación está probando. En este ejemplo, repita los pasos 6.3.1 y 6.3.2.
- Lávese las microplacas estériles una vez, a continuación, retire de la lavadora y el sello. Esta es la placa de ensayo de descontaminación.
- Placa de 50 l de la fase de registro E. coli a las placas de titulación; este es el pre-infecciónplaca de control de la.
- Quitar el sello pre-contaminación, la contaminación y las placas de 96 pocillos de descontaminación y añadir 100 l de E. coli en la etapa de crecimiento en fase logarítmica a todos los pocillos, utilizando nuevos consejos para cada pozo.
- Sellar y se incuba a 37 ° C durante 30 min a 200 rpm.
- Placa de 50 l de células infectadas de tres pozos al azar de cada placa de 96 pocillos a placas 2YT / carb 10 cm y se incuba a 37 ° CO / N.
- Transferencia de 50 l de células infectadas de todos los pocillos de cada placa a placas de pocillos profundos que contienen 1 ml de 2YT más 100 g / ml de carbenicilina por pocillo y crecer O / N a 37 ° C.
- Repita el protocolo de descontaminación y dejar la lavadora líneas sequen.
NOTA: No O crecimiento / N en placas o en un medio líquido debe ser observado en las placas de control previas a la infección, el control previo a la contaminación o las pruebas de descontaminación. Muchas colonias y el crecimiento deben ser observados en la placa de control de la contaminación; si no, no hay conclusiones sobre la eficacia de laprotocolo de descontaminación se puede hacer. Idealmente, las placas de descontaminación producirán colonias y no hay ningún crecimiento O / N en cualquiera de los pocillos en las placas de O / N. La rigurosidad del protocolo de descontaminación se puede aumentar con concentraciones más altas de blanqueo, ya remojo tiempos y ciclos adicionales.
7. Entrada / Salida de titulaciones
7.1) Las titulaciones de fagos de entrada
- Diluir una alícuota de 5 l de fago a 50 l con PBS estéril filtrada y mezclar.
- Preparar serie de dilución de 10 veces en PBS filtrada de forma estéril a 10 10 con una pipeta multicanal o una pipeta de 96 canales.
- Inocular 5 l de fago diluido en 45 l de fago T1 resistentes a E. coli células en fase logarítmica de crecimiento (OD 0,6-0,8) e incubar cubierto con un sello respirable durante 30 minutos a 37 ° C.
- Placa de 5 l de células infectadas en un / placa de agar LB suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba O / N at 37 ° C.
- La concentración de fago puede estimarse a partir de la muestra más diluida en la que aparecen colonias de acuerdo con los cálculos detallados en la Sección 2.8.
7.2) Salida de Fago Pitrations
- Después de la elución de fago unido a la placa mediante la adición de E. coli células, diluir una alícuota de 5 l de células infectadas con fago a 50 l con medio 2YT en autoclave
- Preparar serie de dilución de 10 veces en medio 2YT autoclave a 10 6 usando una pipeta multicanal o pipeta de 96 canales.
- Placa de 5 l de células infectadas en que una placa de agar suplementado con 100 mg / ml de carbenicilina y se incuba O / N a 37 ° C.
- La concentración de fago puede estimarse a partir de la muestra más diluida en la que aparecen colonias de acuerdo con los cálculos detallados en la Sección 2.8.
NOTA: En ambos casos (es decir, los títulos de entrada y salida de fago, la comparación con el número de colonias en tanto tetraciclina (cel total del número) y kanamicina (fago auxiliar título) también pueden ser de carácter informativo.
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Representative Results
El protocolo descrito en el presente documento se ha utilizado para aislar fragmentos de anticuerpos a una variedad de ambos dominios de antígenos estructuralmente y funcionalmente relacionados con bibliotecas combinatorias de Fab presentados en fagos en paralelo. Cuestiones relacionadas con la disponibilidad de antígeno pueden eludirse, en muchos casos, por la identificación in silico de dominios antígeno expresables que son adecuados para la selección de anticuerpos 23. Mediante el acoplamiento de la expresión del antígeno a la selección de anticuerpos dentro del mismo laboratorio (Figura 1) se hace factible la construcción de un gasoducto integrado, en el que los parámetros de antígenos críticos a la selección se pueden controlar más fácilmente. En la mayoría de los casos, con cuidado de determinación de los límites de dominio permite la expresión y el aislamiento de cantidades adecuadas de antígeno suficientemente puro de la expresión de alto rendimiento en 96 o 24 placas de pocillos para pozos profundos (Figura 2) para su uso exitoso en selecciones de anticuerpos. Durante las sucesivasrondas del proceso de selección, las concentraciones de fagos eluidos y enriquecimiento de fagos que se unen específicamente al antígeno pueden ser monitoreados por cualquiera de titulación del fago (Figura 3) o con grupos de fagos en un ensayo ELISA (Figura 4). Una relación de unión (> 2) generalmente indica la presencia de clones de unión específicos. A la inversa, una proporción baja (<2) puede ayudar a determinar la causa de un fallo de selección. Por ejemplo, una relación de <2 con alta OD no específica puede indicar insuficiente eliminación de clones no específicos (o aglutinantes pegajosos) y puede justificar una mayor optimización del protocolo de selección. Sin embargo, una vez que se detecta el enriquecimiento, los clones de alta afinidad individuales se pueden aislar para la secuenciación y caracterización. Clone unión se puede caracterizar en un inmunoensayo colorimétrico y permite la comparación de la unión del Fab-fago o Fab a antígeno inmovilizado frente a la proteína de control negativo, produciendo una medida de enriquecimiento (relación de unión a target frente a la proteína de control negativo o proteína marcador de afinidad) (Figura 5).
Durante la ampliación y automatización de este método, la evaluación de las funciones clave de la unidad de tratamiento de líquidos puede ser útil para garantizar un funcionamiento correcto y preciso con soluciones similares a los utilizados durante las selecciones reales. El uso de cromóforos que absorben en soluciones puede ayudar a detectar cuando los canales específicos de los fluidos (aspiración o dispensación) están bien tapados o han perdido el sello resultante en la prestación de volumen parcial, como se ilustra en la Figura 6. Unidades de lavado automático también puede ser una fuente de variabilidad y pueden requerir atención. El uso de clones de unión conocida permite la comparación de la unión entre la proteína de control objetivo para asegurar que se mantiene diana de unión, mientras que la unión de fondo eliminado (Figura 7) cuando se están optimizando los parámetros de lavado tales como la velocidad de dispensación, los volúmenes de lavado y el número de lavados. Siguienteel uso de un lavador de placas automatizado con soluciones de fagos, los protocolos de descontaminación eficaces que sean necesarias para asegurar la ausencia de contaminación cruzada de las sucesivas rondas de selecciones o diferentes procedimientos de selección y una guía / interpretación de solución de problemas se proporciona en la Tabla 3.
Figura 1. Visión general -. La producción de antígenos de alto rendimiento y la tubería de selección de anticuerpos Este resumen muestra una visualización paso a paso de un oleoducto generación antígeno y anticuerpo selección representativa. La identificación in silico de los límites de dominio de antígeno permite la síntesis de genes, expresión y selección en los dominios de las proteínas que pueden ser pobremente caracterizados. Dominios antígeno expresado se inmovilizan y se utilizan para aislar grupos de clones específicos de anticuerpos de alta afinidad de un compañerobiblioteca de anticuerpos mbinatorial muestra en la superficie del fago filamentoso. Piscinas de anticuerpos de fagos eluidos y amplificados a partir de antígenos individuales se pueden utilizar para controlar el enriquecimiento de ida y de vuelta de clones de unión específicos en ensayos basados en ELISA comparando diana inmovilizada en comparación con la proteína de control negativo antes del aislamiento de clones de unión individuales para la caracterización. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. SDS-PAGE visualización de antígenos por afinidad etiquetado. Un representante de SDS-PAGE de 6X-His-GST-etiquetados dominios antígenos expresados y purificados (5-10 kDa dominio + 26 kDa GST) identificado originalmente por análisis in silico de antígeno los límites de dominio. Dominios de proteína expresada y aislados por Affipurificación nidad se caracterizan por SDS-PAGE antes de selecciones para asegurarse de tamaño basada en la identidad, los rendimientos adecuados y pureza para permitir el uso de selecciones de fagos de anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Visualización de los títulos de fago de salida. Títulos de fagos de salida se determinan en placas las células infectadas con el fago sobre una serie de diluciones de 10 veces en medio de agar suplementado con diversos antibióticos (tetraciclina, carbenicilina y kanamicina) para determinar la dilución más baja en la que colonias se puede observar y estimar el número de fagos unidos al antígeno diana y se eluyó. Haga clic aquí para ver una granr Versión de esta figura.
Figura 4. Relación de unión de diana a la proteína de control negativo por agrupada ELISA. El progreso de enriquecimiento se puede evaluar siguientes rondas de selección por selección de eluyentes amplificadas individuales tanto contra los objetivos específicos y las proteínas de control negativo y / o aislado etiqueta de afinidad. Se muestra en la trama son los coeficientes de enriquecimiento para la unión de 96 piscinas de fagos de anticuerpos individuales en contra de sus 96 respectivos antígenos frente a la proteína de control negativo en paralelo. Cada valor de la relación se deriva de dos mediciones de absorbancia que cuantifican la unión del fago a la piscina ya sea objetivo o proteína de control negativo utilizando un anticuerpo fusionado-HRP específico para la proteína de la cubierta del fago M13. Un umbral de relación de 2 o mayor (a menudo que van desde 2 hasta 10 o más como se muestra en rojo) se utiliza como una indicación de enriquecimientoy la probable presencia de clones de unión específicos. Proporciones menores pueden significar el fracaso de o temas específicos con la selección que puede justificar una mayor optimización del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. clonal Fab-fago de unión directa o Fab ELISA. La unión de clones individuales (ya sea en formato Fab Fab-fago o) se puede evaluar por ensayo basado en ELISA frente a la proteína inmovilizada en placas de 384 pocillos. La unión se detecta usando un anticuerpo fusionado-HRP secundaria contra la proteína de cubierta de M13 en Fab-fago o una etiqueta de afinidad en la Fab. Valores de absorbancia primas para la unión de clonal Fab-fago para apuntar antígeno, proteína de control negativo y marcador de afinidad antígeno (GST) se representan ilustrando bi específicauna ECM (A01, A04, A06), y aglutinantes pegajosas (A05).
Figura 6. Evaluación de los volúmenes dispensados por unidad automatizado de manipulación de líquidos. Entrega consistente y precisa de los volúmenes destinados por los sistemas de pipeteo de 96 pocillos robóticos o manuales puede ser evaluada utilizando soluciones de teñido y un lector de placas. En este ejemplo, 10 l de una solución que contiene azul de bromofenol es secuencialmente con una pipeta a todos los pocillos de dos placas de 96 pocillos utilizando una caja de punta única. Cada pocillo contiene 90 l / pocillo dH 2 O, análoga a la adición de fago ayudante para E. infectados coli. absorbancias de cada placa a 590 nm se leyó por triplicado, y los volúmenes se interpolan a partir de una curva estándar preparada con Pipetman de un solo canal calibrado. Se muestran los volúmenes entregados a una sola fila en la primera y segunda placa. Tenga en cuenta que en los abetost placa, así E04 no recibe ninguna solución de teñido, y en la segunda placa, que recibe un volumen doble. Esto indica que la punta de contacto no es suficiente para la entrega constante, y requiere una mayor optimización. Se muestran los intervalos de confianza del 95% para las mediciones de absorbancia por triplicado.
Figura 7. Evaluación de lavado de placas automatizado. La eliminación eficaz de los fagos no unidos se puede evaluar usando un ELISA para medir Fab-fago de unión a positivo inmovilizado (el anticuerpo anti-FLAG) y proteínas de control (BSA) negativos, mientras que la variación de las condiciones de lavado. En este ejemplo, el fago de entrada análoga a la biblioteca naïve (10 13 ufc / ml en PBT) se elimina con ocho o dieciséis lavados, a mano o con el robot. Fago residual unión a BSA es el mismo en todas las condiciones, como es la unión específica a un anticuerpo anti-FLAG inmovilizado, indicAting que a este ritmo de flujo bajo, ambos métodos son equivalentes y suficientemente rigurosas. Se muestran 95% intervalos de confianza de los pocillos duplicados.
| SOLUCIONES | |||
| Medios 2YT - Añadir agua a 1 l, ajustar el pH a 7,0, y autoclave. | extracto de levadura | 10 g | |
| triptona | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| Medios NZY (1 L) | NZ Amina | 10 g | |
| extracto de levadura | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 ml | ||
| 20 de la sal Stock | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 azúcar stock (1 L) | glucosa | 25 g | |
| lactosa | 100 g | ||
| glicerol | 250 ml | ||
| 20x sal de valores (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH 4 Cl | 1 M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbenicilina (carbohidratos): | 100 mg / ml en agua. Filtros de esterilizar. | ||
| Kanamicina (Kan): | 25 mg / ml en agua. Filtros de esterilizar. | ||
| Tetraciclina (Tet): | 10 mg / ml en agua. Se esteriliza con filtro. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2,5 M | ||
| 1x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCl | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1,5 mM | ||
| 1X KCM | KCl | 500 mM | |
| CaCl 2 | 150 mM | ||
| MgCl 2 | 250 mM | ||
| SOC Medios | extracto de levadura | 5 g / L | |
| triptona | 20 g / L | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCl | 2,5 mM | ||
| MgSO 4 | 20 mM | ||
| Glucosa | 20 mM | ||
| Tampón de bloqueo | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tampón PBT | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| Búfer PT | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| El ácido fosfórico | H 3 P0 4 | 1 M | |
Tabla 1. Medios y Soluciones.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Componente | l por reacción de | ||
| Agua | 19.45 | ||
| Tampón 10X Taq | 2.5 | ||
| dNTPs (madre 10 mM) | 0,675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| Enzima Taq | 0,125 | ||
| Cebador (100 uM de valores) | 0.25 | ||
| Cebador inverso (100 uM de valores) | 0.25 | ||
| Cebadores de secuenciación de la cadena pesada | |||
| Cebador directo M13 | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| Cebador M13 Reverse | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Los cebadores de secuenciación de cadena ligera | |||
| Cebador directo M13 | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| Cebador M13 Reverse | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| AJUSTES PCR | |||
| Paso 1. | 94 ° C durante 3:00 min | ||
| Paso 2. | 94 ° C durante doce y treinta min | ||
| Paso 3. | 55 ° C durante doce y treinta min | ||
| Paso 4. | 72 ° C durante 1:00 min | ||
| Vuelva al paso 2 y repita 24x | saltar al paso 2 | ||
| Paso 5. | 72 ° C durante 7:00 min | ||
| Paso 6. | |||
Tabla 2. PCR Master Mix y Configuración.
| Interpretación de los resultados de descontaminación | |||
| Placa | Esperado título de carbenicilina | Si no? | |
| Control Pre-infección | 0 | Fueron pre-las células infectadas; nada se puede concluir a partir de la experiencia. | |
| Control de la contaminación | césped | Contaminación insuficiente para poder evaluar la eficacia de la posterior descontaminación; considerar sumergiendo colector en solución de fagos en lugar de aspiración de la misma. | |
| Prueba de Descontaminación | 0 | Descontaminación no completa; aumentar el tiempo de inmersión, concentración de lejíación o intentar SDS y lavados EtOH lugar. | |
Tabla 3. Evaluación de la descontaminación de la lavadora. Para determinar la eficacia de la descontaminación, es necesario demostrar que la arandela se contaminó con el fago, y que el protocolo de descontaminación eliminado con éxito que la contaminación. El uso de fagos que confieren resistencia a la carbenicilina, los resultados que se esperan de un test se enumeran, junto con sugerencias si el verdadero resultado diferente del resultado esperado.
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Discussion
Al llevar a cabo en la selección de anticuerpos in vitro, los dos determinantes principales de éxito selección son 1) el aislamiento de dianas antigénicas bien plegadas para seleccionar sobre y 2) la disponibilidad de una biblioteca de anticuerpos de alta diversidad funcional. En muchos casos, la disponibilidad de cantidades suficientes de bien plegada, proteína de longitud completa puede ser limitante. Un enfoque para superar esta limitación es el uso de dominios identificados a partir del análisis bioinformático 22 y sintetizados para la inserción en un vector de expresión bacteriano con un marcador de afinidad apropiado.
Hay una variedad de etiquetas que se utilizan en aplicaciones de biotecnología para aumentar la solubilidad, facilitar la purificación y para estabilizar dominios inestables. 11 La capacidad de sintetizar prácticamente cualquier secuencia de inserto deseado permite una plataforma de generación de antígeno altamente versátil. Aunque el formato de GST-etiquetados es común, los resultados exitosos han sido previamenteobtuvo utilizando hexahistidina, Fc, Halo, la proteína de unión a maltosa y las etiquetas de biotinilación de sitio específico y se cree que miríada de otras etiquetas de afinidad se pueden optimizar para su uso en una plataforma similar. Sin embargo, las etiquetas de afinidad pueden tener consecuencias negativas no intencionales y beneficiosos en las aplicaciones posteriores 11 y deben ser investigadas a fondo antes de establecer una tubería basado en un formato particular.
A menudo, los nuevos usuarios planteará la cuestión de la forma de evaluar la calidad de una biblioteca de anticuerpos y, aunque no hay una respuesta clara, uno debe tratar de evaluar varias características clave (ya sea natural o sintético), incluyendo la diversidad en general, niveles de visualización relativos, la naturaleza de y el alcance de la aleatorización (es decir, diseño de la biblioteca frente al contenido de la biblioteca determinada por secuenciación) y las propiedades fisicoquímicas del anticuerpo frente a la aplicación prevista. Aunque más allá del alcance de este protocolo, un limp más detalladant de estas características y cómo pueden afectar a la selección de anticuerpos se pueden encontrar aquí 2,23. El conocimiento de la diversidad de la biblioteca es, en particular, es importante para asegurar una cobertura adecuada de la diversidad en las selecciones. Por lo general, una concentración de fagos que ofrece 100-1.000 copias de cada clon de fago en la biblioteca es deseable y debe asegurarse de que cualquier verdaderos positivos aglutinantes presentes en la biblioteca se pueden recuperar. Sin embargo, la unión no específica del fago a la microplaca superficies aumenta drásticamente por encima de 10 13 fagos / ml, y por muy diversas bibliotecas, más de un solo pozo por antígeno puede ser necesario para garantizar una cobertura suficiente. Por otro lado, si la biblioteca de entrada está demasiado diluida, la concentración absoluta de verdaderos positivos aglutinantes será tan por debajo de la KD (típicamente nM) que no se pueden recuperar. Dadas estas restricciones, las bibliotecas de fagos general deben resuspendieron a octubre 12 al 13 de fagos / ml para la primera ronda de selección.0; A esta concentración, una alícuota de 100 L de fago representa una cobertura de 1,000-100 pliegue de una biblioteca de diversidad 10 9 -10 10 y se puede producir de forma rutinaria clones de unión a diversos antígenos. A concentraciones menores, o el aumento de las diversidades, puede ser necesario aumentar el número de pozos de antígenos seleccionados en contra en la primera ronda (ver sección 2.9). Con posterioridad a la ronda 1, sin embargo, la mayor parte de la diversidad no vinculante de la biblioteca ha sido eliminado; el exceso de cobertura de la diversidad de salida ronda 1 es lo más a menudo fácilmente alcanzable usando un solo pozo. En los casos de selecciones paralelas en placas de 96 pocillos, esto puede reducir el número de placas de selección de antígenos necesarios para una sola, con posterioridad a la primera ronda.
Durante selecciones reales, titulación fago puede ofrecer medidas objetivas para caracterizar y monitorear el progreso, mientras que ayuda a identificar áreas de interés particular en las primeras rondas de selección, donde el enriquecimiento no es suficiente paraser detectado. Esto puede ser particularmente útil durante el raspado de selecciones para determinar el rendimiento de protocolo. En general, las valoraciones de fagos de entrada (es decir, la biblioteca ingenuo o post-amplificación del fago eluido) deben permanecer relativamente constante (10 12 -10 13 fagos / ml) entre las rondas, con crecimiento celular pobres / títulos bajos de fagos que indica la posible contaminación y / o mala salida de la ronda anterior. Aunque se espera que los títulos de fagos producción aumentará durante el enriquecimiento en las rondas posteriores de la selección, se espera un rango de 10 3 -10 5 ufc / ml en las primeras dos rondas. La desviación de este rango puede indicar posibles problemas con la selección, como la contaminación o el exceso de rigurosidad de lavado. En las rondas posteriores de selección (es decir, las rondas 3 y 4), el enriquecimiento de clones que se unen específicamente al antígeno diana puede evaluarse mediante ELISA combinados que miden la unión del grupo de fagos contra ambos antígeno diana y negativaproteína de control (véase la sección 4).
Después de 3-4 rondas de selección (o una vez que el enriquecimiento en la proteína diana ha llegado a un antígeno diana: relación señal proteína de control negativo de 2: 1 o superior en comparación con la proteína de fondo), células bacterianas infectadas se colocan en placas para aislar las colonias de fagómidos individuales para la secuenciación , caracterización inicial y la clonación si es necesario. En este momento, es altamente recomendable para convertir Fab-fago para liberar Fab antes de la caracterización adicional. Aunque Fab-fago se puede utilizar para la caracterización inicial mediante la dilución de 10 l de sobrenadante de fago (que se describe en la Sección 5.1) en tampón PBT 20 l y la detección con anticuerpos anti-M13-HRP (que se describe en los pasos 4.4 hasta 4.5), en nuestra experiencia, propiedades de unión pueden cambiar sustancialmente en cualquier lugar de 5-20% de los clones en la liberación de la partícula de fago y la conversión a tiempo puede evitar problemas con los falsos positivos. La metodología específica utilizada para la conversión dependerá de la unique arquitectura del fagémido y por lo tanto no serán tratados aquí de forma explícita. Sin embargo, en los vectores más utilizados, esto puede llevarse a cabo generalmente por 1) la transformación de fagémido purificado (o la piscina fagémido) a un no-supresor competente E. cepa de E. coli HB2151 tal como 55.244 o si una parada ámbar (TAG) codón interviene la proteína Fab y pIII, 2) la inserción de un codón de parada ámbar entre las proteínas Fab y pIII para permitir la expresión de fragmentos de anticuerpos solubles en una cepa no supresora o 3) mediante la clonación de genes de inmunoglobulina (de fagémido individuo o la piscina fagémido) en un vector de expresión adecuado. Para simplificar aún más la selección y caracterización, métodos de clonación mancomunados pueden ofrecer medios eficaces para la conversión de clones de unión en masa a las construcciones de expresión, tanto eliminando la posibilidad de falsos positivos de unión de las partículas Fab-fago y donde se utilizan lisados de expresión para la caracterización temprana, incluso el coste y el esfuerzo de purificaciónse puede evitar inicialmente.
Para los clones aislados directamente de Biblioteca F (descrito en 24), los dominios variables de anticuerpos pueden ser secuenciados utilizando 1-2 l de sobrenadante de fago como molde para amplificar por PCR regiones determinantes de complementariedad (CDRs) (Ver Tabla 2 de Materiales para cebadores dirigidos-F Biblioteca ). Usando estos cebadores, las regiones variables de cadena pesada y ligera producirán productos de ~ 700 y ~ 500 pb, que abarca respectivamente los tres CDRs. Los cebadores incluyen sitios de hibridación para iniciadores de M13 de tal manera que los productos pueden ser secuenciados después de la limpieza (como se describe en la Sección 5.4.5) utilizando cebadores estándar disponibles en la mayoría de las instalaciones centrales de secuenciación. Alternativamente, para las piscinas Fab fagos que han sido clonados en un vector de expresión y se transforma directamente en E. coli para la expresión, las colonias individuales se puede aislar y se resuspendió en 15 l de 2YT y 1-2 l de la suspensión de células utilizadas directamente como molde para la sola colony PCR usando cebadores apropiados.
Selecciones Automatización requerirán optimización y validación de varias funciones robóticas clave. En general, el manejo de líquidos a base de pipeta debe ser precisa y consistente a través de los 96 canales, de lavado de placas debe eliminar los fagos no unidos de manera eficiente y sin pelar antígeno adsorbido o unido Fab-fago de la placa de selección. Descontaminación efectiva del lavador de placas también es necesario entre rondas para permitir el enriquecimiento y contra-selección eficaz, y entre las selecciones posteriores para evitar la contaminación cruzada. Para ayudar a optimizar el procedimiento de selección de alto rendimiento, los enfoques simples para la evaluación de estas funciones se han utilizado anteriormente y se describe a continuación y detallado en el protocolo.
Para evaluar la consistencia de los volúmenes suministrados por todos los canales de un cabezal de distribución / aspiración de líquido, una solución de color se pipetearon a una placa de pocillos de fondo plano 96 y la absorbance en cada pocillo midió en un lector de placas. Un cromóforo como el azul de bromofenol es útil para soluciones de teñido similares a los utilizados para las selecciones reales para evaluar los efectos de diferentes propiedades de tensión superficial y de cohesión sobre los volúmenes suministrados. Después de confirmar que todos los canales están dispensando volúmenes coherentes, la precisión del volumen total entregado se puede determinar mediante la medición de la masa de líquido transferido a cada placa.
Automatización de lavado de placas para eliminar clones no unidos requiere principalmente la optimización de la velocidad a la que el tampón de lavado se va a dispensar y el número de lavados para ser empleado. Un método razonable de evaluar este parámetro emplea controles positivos (Fab-fago específico clones de unión) para evaluar los efectos de variar la tasa y / o el número de lavados de dispensación para determinar si 1) adsorbido antígeno o fago unido se está eliminado por lavado excesivamente estrictas o 2) la unión no específica a las proteínas no afines es excesivo due para lavar condiciones que no son lo suficientemente estrictas. Residual fago / unido puede detectarse y cuantificarse, ya sea por infección en bacterias y enchapado para el recuento de colonias individuales, o por ELISA utilizando anticuerpos secundarios específicos para las etiquetas de afinidad de anticuerpos o proteínas de la cubierta del fago. Controles negativos se utilizan para evaluar los niveles residuales de no vinculante Fab-fago a proteínas diana o Fab-fago de unión específica a las proteínas no afines / fondo, que pueden ser elevados si el lavado no es suficientemente estricta. En este caso, hemos utilizado inmovilizados BSA como control para la unión no específica y un anticuerpo anti-FLAG que reconoce un epítopo etiqueta FLAG en el Fab-fago como control positivo. Comparamos ocho y dieciséis ciclos de lavado utilizando el robot contra el lavado a mano, con un caudal medio, para demostrar que estas técnicas eran equivalentes. Alternativamente, la medición de entrada y valoraciones de fagos de salida (ver sección 7) durante selecciones en curso también puede ayudar a hacer ajustes finos en los parámetros de lavado. Por último, la descontaminación de los lavadores de placas utilizado para las selecciones debe ser eficaz para eliminar el arrastre de fago de las selecciones anteriores. En nuestra experiencia, recién diluida de hipoclorito de sodio al 0,5% es rápido, eficaz y barato. Detergentes tales como SDS también son eficaces, pero requieren mucho más extensa de lavado para eliminar del sistema. Comprobar la compatibilidad reactivo para el sistema antes de cualquier prueba. Para evaluar la descontaminación, ponemos a prueba la presencia de fagos residual en soluciones que maneja el sistema de líquidos e interpretar los resultados de acuerdo con la Tabla 3.
En resumen, este protocolo proporciona un método escalable para el aislamiento de los Fab de bibliotecas combinatorias por paralelo en selecciones in vitro contra los dominios de proteínas y ofrece técnicas para la validación de un sistema de selección de fagos automatizado. Costo y de infraestructura barreras que amplias instalaciones con animales pueden plantear son mitigados ya que este método no vuelveLy en la inmunización de animales. Además, mediante la integración de la generación de antígeno con la selección de anticuerpos de fagos, los factores de calidad que afectan el éxito de selección se controlan y se ajustan más fácilmente. Cuando el marco de tiempo de la expresión del antígeno para la selección y caracterización inicial es del orden de 6-8 semanas, un sistema más sensible de la producción se puede realizar. Los anticuerpos aislados a partir de selecciones in vitro son también tanto modificar fácilmente (debido a la vinculación genotipo-fenotipo) y renovable, requiriendo sólo el ADN almacenado de la construcción de expresión repetidamente y reproducible volver a generar anticuerpos. Finalmente, demostrando que este protocolo se puede realizar utilizando un enfoque cuasi-manual o totalmente automatizada que emplea un sistema de selección robótico de diseño personalizado, el rendimiento puede ser escalable y accesible para los pequeños laboratorios académicos e industriales por igual.
Utilizando los métodos de alto rendimiento descritos anteriormente y la Biblioteca F biblioteca de anticuerpos sintéticos 24 tanto in vitro - in situ y en las proteínas -expresada. Aunque las tasas de éxito para cualquier selección dada dependerán tanto de la calidad (pureza, foldedness, mono-dispersidad etc.) de los objetivos de antígeno, así como la calidad y la diversidad de la biblioteca de anticuerpos, se ha observado que en cualquier lugar desde 25 hasta 80 % de antígenos producirá aglutinantes para una selección de alto rendimiento. Es importante destacar que, vale la pena señalar que los clones con la capacidad para modular la función objetivo a menudo pueden también ser seleccionados. Esta biblioteca se construye utilizando un marco completamente humano, lo que hace que estos anticuerpos susceptibles de aplicación terapéutica potencial 25, subrayando así la importancia de esta tubería como un enfoque alternativo para la generación de reactivos de afinidad con base ampliavalor.
En resumen, la robustez y versatilidad del enfoque presentado en este protocolo se seguirán para ayudar en la optimización, la industrialización y el uso generalizado último de esta tecnología como un medio viable para lograr el objetivo a largo plazo de la generación de reactivos de afinidad a prácticamente todos los miembros de el proteoma humano.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer el Fondo Común NIH - Proteína Programa de reactivos de captura para financiar el desarrollo de la selección y caracterización de anticuerpos tubería recombinante de anticuerpos de red y de la Fundación Canadiense para la Innovación para la compra de financiación de la plataforma de selección robótica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
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