Summary
Миноги восстановить двигательную после полной травмы спинного мозга. Тем не менее, некоторые спинальные-проектирование нейроны являются хорошими регенераторов, а другие нет. Эта статья иллюстрирует методы для жилья морская минога личинок (и недавно преобразованных взрослых), производить полные transections спинного мозга и подготовке Wholemount мозги и спинного мозга для гибридизация.
Abstract
После полного повреждения спинного мозга, морские миноги сначала парализованы ниже уровня перерезки. Тем не менее, они выздоравливают передвижение через несколько недель, и это сопровождается короткие расстояния регенерации (несколько мм) проприоцептивных аксонов и спинного-проектирование аксонов от мозга. Среди 36 крупных идентифицируемых спинного-проектирование нейронов, некоторые из них хорошие регенераторов и другие плохие регенераторов. Эти нейроны могут быть наиболее легко идентифицировать в Wholemount препаратов ЦНС. Для того, чтобы понять нейронные-внутренняя механизмы, способствующие или ингибировать регенерацию аксонов после травмы у позвоночных ЦНС, мы определить различия в экспрессии генов между хорошими и плохими регенераторов, и как выражение под влиянием перерезки спинного мозга. Эта статья иллюстрирует методы для жилищного личинок и недавно преобразованные взрослых на море миноги в резервуарах пресной воды, производя полную позвоночника transections кабель под микроскопического зрения, и подготовка брайн и спинного wholemounts шнур для гибридизация. Вкратце, животных содержат в 16 ° C и под наркозом в 1% Benzocaine в миноги Ringer. Спинной мозг пересекается с иридэктомия ножницами через спинной подхода и животное разрешено восстановить в цистернах пресной воды при 23 ° С. Для гибридизация, животные reanesthetized и мозг и шнур удаляют через спинной подхода.
Introduction
У млекопитающих повреждение спинного мозга (SCI) является разрушительным условии, что приводит к постоянной потере функции ниже места повреждения, потому что поврежденные аксоны не восстанавливаются через зону травмы и снова в соответствующие целям. В отличие от млекопитающих, миноги восстановить двигательную после полного повреждения спинного мозга. 1 Интересно, миноги есть набор 36 спинного мозга проектирование нейроны, которые по отдельности идентифицировать в целом монтажа препараты мозга за их большой размер 2,3 (рис 1) . Все эти спинного-проектирование нейронов аксотомизированных путем полного рассечения спинного мозга на высоком уровне. Предыдущие исследования нашей группы и других показали, что даже в присутствии функционального восстановления после ТСМ некоторые из этих нейронов показать очень низкую способность к регенерации (они считаются "плохими регенераторов"), в то время как другие, как правило, восстановить их аксоны через сайт травмы (они считаются "гOOD регенераторов "). 2,3 Эта характеристика делает миног интересную модель позвоночных изучить различия в экспрессии генов между хорошим и плохим регенератора спинного-проектирование нейронов, что, в свою очередь приведет к различиям в собственной регенеративной способности нейронов, которые пытаются регенерировать свои аксоны в той же внешней среды. 1
Используя эту модель мы уже показали, что спинного проектирование нейроны с низкой регенеративной способности шоу выражения аксональных рецепторов молекул руководство как UNC5 4,5 и neogenin, 6, которые опосредуют тормозящее действие Netrin и агр соответственно. Кроме того, с помощью этого метода наша группа также показано, что только хорошие регенераторы показывают восстановление экспрессии нейрофиламентов после травмы и в процессе регенерации. Недавно Буш и Morgan 7 показали иммунофлуоресценцией что плохие регенераторов показать повыред выражение синуклеина после травмы, которая была связана авторами с тем, что "плохо" регенератора спинного выступающие нейроны медленно умирать после полной рассечение спинного мозга 5,7,8. Так, минога модель полной травмы спинного мозга возник как очень полезную модель, чтобы понять, что делает спинного мозга проектирование нейрон "плохо регенератор" после аксотомии.
Для проведения наших исследований мы выполняем полный спинной протокол хирургии шнур рассечение и рассечение задней мозговой в нужных точках времени после травмы для выполнения Wholemount в гибридизация. В данной методической статье мы представляем подробный протокол для надлежащего исполнения полного повреждения спинного мозга хирургии в личиночной миног, последующее техническое обслуживание животных и окончательный рассечение мозга и подготовка мозга для Wholemount в гибридизация. Подробный протокол до реrform на Wholemount в гибридизация в мозге личинок миноги уже сообщалось ранее. 9 Кроме того, этот протокол для травмы спинного и головного мозга вскрытия может быть также использован для затем обработать мозги для иммуногистохимии или других гистологических методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В таблице 1 для всех материалов, используемых в данном протоколе.
Эксперименты были утверждены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Университете Темпл на.
1. Животные
- Получить дикого типа личинок морских миног (Petromyzon Маринус L.), 10 - 14 см в длину (4 - 7 лет) из потоков, питающих озеро Мичиган, из притоков реки Делавэр (штат Пенсильвания) или потоков в штате Мэн.
- В лаборатории, поддерживать личинок в группах 50 - 100 животных в 50 галлонов пресноводных аквариумах при 16 ° С. Линия танки с дюйма гравия для личинки зарываются в, и вода уголь отфильтровывают и кондиционером с воздушным камней, по крайней мере 48 часов для удаления хлора и других примесей до размещения миноги в них. Там нет необходимости, чтобы накормить животных, которые перерабатывают собственную детрит, до дня использования.
2 Полный SpinalШнур Перерезка
- Перед спинного мозга хирургии подготовить минога звонка раствора следующего состава: 110 мМ NaCl, 2,1 мМ KCl, 2,6 мМ CaCl 2, 1,8 мМ MgCl 2 и 10 мМ Трис-буфер; рН 7,4.
- Для выполнения перерезки спинного мозга, разместить личинок в небольшой контейнер, чтобы быть под наркозом с 1% Tricaine метансульфоната в ледяной холодный раствор Рингера.
- После того, как под наркозом месте животные в чашке Петри, наполовину заполненный Sylgard (силиконового) и использовать 4 насекомых булавками (0,15 мм в диаметре), чтобы держать животных в положении для хирургии (один находится на морде животного, один в хвосте и два на уровне 5-го жаберных). Заполните Петри почти до вершины с раствором Рингера. Поставьте блюдо с личинки на льду при выполнении операции под стереомикроскопом.
- Для выполнения перерезки спинного шнур в спинной, средней линии, сделать продольный разрез скальпелем (# 11) на уровне 5-гожаберных визуализировать спинной мозг. Сначала кожа открыта, вставив кончик скальпелем вверх, а затем мышечная ткань режут очень осторожно до тех пор, спинной мозг не видно сверху. Мода два крючка от насекомых булавками и использовать их, чтобы держать стены тела открыты при выполнении перерезки спинного мозга.
- Полностью секут спинной мозг на уровне 5-го жаберных с помощью ножниц (Castroviejo # 8), вставить ножницы перпендикулярно спинного мозга. Спинной мозг должен быть полностью перерезана одним чистый срез. Визуализация позвоночника концы вырезать кабель под стереомикроскопом подтвердить, что спинной мозг был полностью перерезана. Затем, перестроить разрезанные концы спинного мозга после рассечения с помощью пары щипцов (# 5).
- После выполнения спинного мозга рассечение закрыть рану в спинной стенке тела с парой тонких щипцов и поставить личинок на льду в течение 1 часа, чтобы позволить раны то высохнуть. Положите кусочек фильтровальной бумаги между льдом и личинок и замочить его с минога Ringer решения. Низкая температура продолжает живых животных в то же время, что она позволяет рану высохнуть на воздухе и, следовательно, помогает предотвратить инфекции.
- Затем перенесите личинки малого танков (1 личинка на баке) с ледяной водой в течение 24 часов.
- Изучите пораженное личинки 1 день после перерезки спинного чтобы поведенчески подтвердить, что нет никакого движения каудальнее месте повреждения. Перерезки спинного мозга считается полным, если личинка может двигаться только головной рострально к месту повреждения (на уровне 5-го жаберных). Если это так, личинки теперь могут быть переданы в цистернах (1 личинка на резервуаре) с пресной водой при комнатной температуре (23 ° C), чтобы разрешить им восстановить для выбранных временных точках.
- В период восстановления менять воду каждые 2 до 3 дней.
3 Мозг Вскрытие и подготовкаМозг для гибридизация
- В желаемых временных точках после травмы повторно Обезболить личинок морских миног и место и закрепить их в чашку Петри с раствором Рингера для выполнения рассечение мозга, как описано выше.
- Чтобы вскрыть мозг из, сначала сделать поперечный надрез скальпелем между ноздрю и шишковидной органа. Отсюда начинают разрезать ткани, окружающие мозга с помощью пары Castroviejo ножницами, удерживая его с парой щипцов.
- Как только мозг подвергается, удалить сосудистое сплетение, используя пару щипцов и использовать крючки распространять голову животного и разоблачить черепно-мозговых нервов. Тогда, сократить спинного мозга трансверсально с ножницами Castroviejo. Держите спинной мозг с парой щипцов, используя другую пару щипцов, чтобы сократить черепные нервы препарировать мозг из.
- После вскрытия, положить мозг на небольшой кусок силикона и удерживайте его в этом положении, вставив 2 модулиЭСТ булавки в обонятельной луковицы и 1 в спинном мозге. Тогда, вырезать задний и cerebrotectal спайки мозга вдоль средней линии спины с ножницами и отвлечь Алар пластины с боков и приколоть их квартиру силикона с 4 штифтами насекомых (рисунок 2).
- Передача кусок силикона с мозгом в пробирку, содержащую 4% параформальдегида в фосфатном буферном растворе (рН 7,4), чтобы быть закреплены при комнатной температуре в течение 3 часов на ротатора.
- После фиксации использовать мозг для Wholemount в гибридизация, как описано ранее (Swain и соавт., 1994). Головной мозг контроля или ложнооперированных животных должна быть запущена всегда параллельно с мозгами из раненых животных. Wholemounted личиночной мозга могут быть изучены в гибридизация за его плоской и тонкой формы, а также в связи с отсутствием миелина 10, что делает мозг довольно прозрачный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера результатов, которые можно получить при использовании этого метода, представительные образы wholemounted мозги, показывающие экспрессию neogenin транскриптов в идентифицируемых спинного мозга-проектирование нейронов контроля и 2 недель после поражения личинок морских миног показаны на рисунке 2. Читатели называют предыдущем исследовании 6 отчетном взаимосвязь между экспрессией neogenin после полной перерезки спинного мозга и регенеративной способности идентифицируемых спинного мозга выступающей нейроны моря миноги для подробной информации. Вкратце, результаты показали, что после травмы происходят изменения в экспрессии neogenin рецептора в идентифицируемых спинного-проектирование нейронов. Две недели после полной перерезки спинного мозга neogenin рецептор преимущественно выраженные в плохих регенераторов, как М1, I1, I2, I4, или MTH нейронов (рис 2В) Эти результаты показывают результатыпротокола и предполагают, что neogenin рецептора могут быть вовлечены в провале регенерации этих клеток.
Рисунок 1: Схематическое изображение спинной части морская минога мозга с указанием местоположения идентифицируемых ретикулоспинальных нейронов. Воспроизводится по Barreiro-Иглесиас и Шифман. 5 Для сокращений, увидеть список ниже.
Рисунок 2 Микрофотографии видом спинных зрелого личинок морская минога мозга, показывающих экспрессию neogenin стенограммы в контрольной (а) и 2 недели после травмы (B) животных. Примечание в B, что после травмы нeogenin транскрипт преимущественно экспрессируется в нейронах, как известно, плохие регенераторы (например, М1, I1, I2, I4 и Mth нейроны). Кроме того, обратите внимание на наличие отверстий, оставленных штифтов, используемых для хранения мозга (стрелки). Читатели могут обратиться к предыдущему исследованию Шифман и коллегами. 6 Для сокращений, увидеть список ниже.
СОКРАЩЕНИЯ
| В (В1-В6) | Мюллер клетки регионе бульбарной (средний rhombencephalic ретикулярного ядра) |
| hab.-пед. тр. | habenulopeduncular тракта |
| I1-I6 | Мюллер клетки истмико регионе |
| ЯX | языкоглоточный ядро двигателя |
| инф. | воронка |
| ISTH. Мейснера. | истмико ретикулярной формации |
| M1-M4 | Müller клетки от 1 до 4 |
| Mth | Маутнер клеток |
| мес ' | вспомогательный Маутнер клеток |
| сми | борозды medianus уступает |
| Vm | тройничного ядро двигателя |
| X | блуждающего ядро двигателя |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем подробный протокол для выполнения полного перерезки спинного мозга и заднюю рассечение мозга в личиночной морских миног. Эта процедура позволяет анализировать различия в экспрессии генов между идентифицировать спинного мозга, выступающих нейронов после травмы спинного мозга с помощью мозга целом монтажа в гибридизация. Решающим шагом в процедуре является правильное выполнение полного перерезки спинного мозга, которые можно контролировать, наблюдая нарезанные концы спинного мозга под stereomicrocope и подтвердил 24 часа спустя, осторожно касаясь мордой личинки с парой щипцы, чтобы увидеть, если нет движения каудальнее месте повреждения. Кроме того, важно для восстановления животного, что ножницы, используемые для операции не являются тупыми и что одна и чистый срез делается полностью секут спинной мозг.
Выживание животных после травмы значительно улучшена, сохраняя Анимлов на льду во время операции и в течение часа, используемой, чтобы рану на сухой, а затем в ледяную воду воздухом в течение первых 24 часов. После этого периода рану закрывают, и животные уже могут быть переданы в резервуарах с пресной водой при комнатной температуре.
Личинки миноги разрешено восстановление при комнатной температуре, а не при их обычной холодной температуре, потому что больше большинство животных восстановить полный двигательную функцию поведенческий после травмы при более высоких температурах. 11 Восстановление нормальной схеме передвижения наблюдается от 8 до 10 недель после полного спинного мозга рассечения.
После выполнения полного перерезки спинного мозга и рассечение мозга при выбранных временных точках личиночные мозги могут быть обработаны не только выполнять целом монтажа в гибридизация, как показано здесь (Рисунок 2), но и для других гистологических методов, таких как иммуногистохимии ( например, 7 (например, 8) или обнаружение активированных каспаз путем использования Флуорохром помечены ингибиторы каспаз. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
