Summary
Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.
Abstract
Na een complete dwarslaesie, zijn zee lampreys eerst onder het niveau van doorsnijding verlamd. Echter, ze herstellen locomotie na enkele weken en dit gepaard met korte afstand regeneratie (enkele mm) van propriospinal axonen en spinale-projecterende axons van de hersenstam. Onder de 36 grote identificeerbare spinale-projecteren van neuronen, sommige zijn goed regenerators en anderen zijn slecht regenerators. Deze neuronen kunnen het gemakkelijkst worden geïdentificeerd wholemount CNS preparaten. Om de neuron-intrinsieke mechanismen bevorderen begrijpen of remmen axon regeneratie na verwonding in de gewervelde CZS, bepalen we de verschillen in genexpressie tussen de goede en slechte regeneratoren en hoe de expressie beïnvloed door ruggenmerg doorsnijding. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting larvale en onlangs omgebouwd volwassen zee prikken in zoet water tanks, de fabricage van volledig ruggenmerg doorsnijdingen onder microscopische visie, en het voorbereiden van brain en het ruggenmerg wholemounts voor in situ hybridisatie. In het kort worden gehouden dieren 16 ° C en verdoofd in 1% benzocaïne in lamprei Ringer. Het ruggenmerg wordt doorsneden met iridectomiescharen via een dorsale benadering en het dier kan herstellen in zoet water tanks bij 23 ° C. Voor in situ hybridisatie, worden de dieren reanesthetized en de hersenen en koord verwijderd via een dorsale benadering.
Introduction
Bij zoogdieren ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende aandoening die leidt tot permanent verlies van de functie onder de plaats van het letsel, omdat gewonde axonen niet regenereren door het trauma zone en opnieuw te verbinden met hun geschikte doelwitten. In tegenstelling tot zoogdieren, lampreys herstellen voortbeweging na volledig ruggenmergletsel. 1 Interessant lampreys een set van 36 ruggenmerg projecteren neuronen die afzonderlijk identificeerbare geheel-mount brain preparaten wegens hun grote omvang 2,3 (figuur 1) . Al deze spinale-projecterende neuronen axotomized door een hoog-niveau volledig ruggenmerg doorsnijding. Eerdere studies van onze groep en anderen hebben aangetoond dat zelfs bij aanwezigheid van functioneel herstel na SCI, sommige neuronen vertonen een zeer lage regeneratieve capaciteit (ze worden beschouwd als "slecht regeneratoren"), terwijl andere gewoonlijk vernieuwt axon door de plaats van letsel (ze worden beschouwd als "good regeneratoren "). 2,3 Deze eigenschap maakt lampreys interessant vertebrate modellen om de verschillen in genexpressie tussen goed en slecht regenerator spinale-projecterende neuronen die op hun beurt leiden tot verschillen in de intrinsieke regeneratieve vermogen van neuronen die proberen te bestuderen regenereren hun axonen in dezelfde extrinsieke milieu. 1
Met behulp van dit model dat we hebben eerder aangetoond dat spinale-projecteren neuronen met lage regeneratieve vermogen tonen uitdrukking van axonale begeleiding molecuul receptoren zoals UNC5 4,5 en neogenin, 6, die de remmende werking van netrine en RGM respectievelijk bemiddelen. Bovendien met deze methode onze fractie is ook gebleken dat alleen de goede regeneratoren tonen een herstel van de expressie van neurofilamenten na het letsel en tijdens het regeneratieproces. Onlangs, Busch en Morgan 7 hebben aangetoond door immunofluorescentie dat de slechte regenerators tonen een Increased expressie van synucleïne na beschadiging, die is verbonden door de auteurs dat de "slechte regenerator" spinal-projecterende neuronen langzaam sterven na volledig ruggenmerg doorsnijding 5,7,8. Dus, de lamprei model van een complete dwarslaesie heeft ontpopt als een zeer bruikbaar model om te begrijpen wat maakt een ruggemerg projecteren neuron een "slechte regenerator" na axotomy.
Om onze studies voeren we volledig ruggenmerg doorsnijding chirurgie protocol en een achterste hersenen dissectie op de gewenste tijdstippen na letsel wholemount voeren in situ hybridisatie. In de huidige methodologische artikel stellen we een gedetailleerd protocol voor de goede uitvoering van een complete dwarslaesie chirurgie in larvale prikken, het verdere onderhoud van de dieren en de uiteindelijke hersenen dissectie en de voorbereiding van de hersenen voor een wholemount in situ hybridisatie. Een gedetailleerd protocol te perform de wholemount in situ hybridisatie in de hersenen van larven prikken is eerder gemeld. 9 Daarnaast heeft dit protocol voor ruggenmergletsel en hersenen dissectie kunnen ook gebruikt dan verwerken de hersenen voor immunohistochemie of andere histologische methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zie tabel 1 voor alle in dit protocol gebruikte materialen.
Experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Temple University.
1 Dieren
- Verkrijgen wildkleur larvale zee prikvissen (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm lang (4-7 jaar oud) uit beken voeden van Lake Michigan, van zijrivieren van de Delaware River (Pennsylvania) of stromen in Maine.
- In het laboratorium handhaven larven in groepen van 50 - 100 dieren in 50 gallon zoetwater tanks bij 16 ° C. Lijn de tanks met een centimeter van grind voor de larven te graven in, en het water wordt houtskool gefilterd en geconditioneerd met lucht stenen voor ten minste 48 uur aan chloor en andere onzuiverheden te verwijderen voordat u het prikken in hen. Het is niet nodig de dieren die hun afval recyclen tot de dag van gebruik voeden.
2 Compleet SpinalKoord doorsnijding
- Voor het ruggenmerg operatie stelt een lamprey Ringer oplossing met de volgende samenstelling: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCI, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM MgCl2 en 10 mM Tris-buffer; pH 7.4.
- Om het ruggenmerg doorsnijding voeren, plaatst de larven in een kleine houder zal worden verdoofd met 1% tricaïne methaansulfonaat in ijskoude Ringer oplossing.
- Zodra verdoofde plaats de dieren in een petrischaal half gevuld met Sylgard (silicone) en gebruik 4 insecten kunnen (0,15 mm diameter) om de dieren in stand te houden voor de operatie (een is geplaatst op de snuit van het dier, een aan de staart en twee ter hoogte van de 5e gill). Vul de petrischaal bijna tot aan de top met Ringer-oplossing. Zet de schaal met de larve op het ijs tijdens het uitvoeren van de operatie onder de stereomicroscoop.
- Om het ruggenmerg doorsnijding uitvoeren van een dorsale, middellijn, maak een longitudinale incisie met een scalpel (# 11) ter hoogte van de 5egill het ruggenmerg visualiseren. Aanvankelijk skin is geopend door de tip van de scalpel naar boven en het spierweefsel wordt gesneden zeer zacht tot ruggenmerg kan worden gezien van boven. Fashion twee haken van het insect pinnen en gebruik ze om te houden van het lichaam muren geopend tijdens het uitvoeren van het ruggenmerg doorsnijding.
- Volledig doorsnijden van het ruggenmerg op het niveau van de 5 e kieuw met behulp van een schaar (Castroviejo 8 #), steek de schaar loodrecht op het ruggenmerg. Het ruggenmerg moet volledig worden doorsneden met een schone snede. Visualiseer het ruggenmerg gesneden uiteinden onder de stereomicroscoop om te bevestigen dat het ruggenmerg volledig is doorgesneden. Daarna lijnt de afgesneden einden van het ruggenmerg na de doorsnijding met een pincet (# 5).
- Na het uitvoeren van het ruggenmerg doorsnijding sluit de wond in de dorsale lichaamswand met een paar fijne pincet en zet de larven op ijs gedurende 1 uur tot de wond t toestaano drogen. Leg een stukje filtreerpapier tussen het ijs en de larven en laat deze met lamprei Ringer-oplossing. De lage temperatuur blijft de dieren in leven tegelijkertijd dat het de wond aan de lucht drogen en kunnen bijdragen tot infecties.
- Overdragen dan de larven van kleine tanks (1 larve per tank) met ijskoud water gedurende 24 uur.
- Onderzoek de laesie larven 1 dag na de spinale doorsnijding te gedragsmatig bevestigen dat er geen beweging caudaal van de plaats van letsel. Een ruggenmerg doorsnijding als voltooid wanneer de larve alleen de kop rostraal kan naar de plaats van letsel (ter hoogte van de 5e gill). Als dit het geval larven kan nu worden overgebracht naar tanks (1 larve per tank) met kraanwater bij kamertemperatuur (23 ° C) zodat zij terug voor de gekozen tijdstippen.
- Tijdens de herstelperiode ververs het water om de 2 tot 3 dagen.
3 Brain Dissection en voorbereiding vanBrain in situ hybridisatie
- Op de gewenste tijdstippen na de blessure opnieuw verdoven het larvale zee prikvissen en plaats en zet ze in de petrischaal met Ringer-oplossing naar de hersenen dissectie als hierboven uit.
- Naar de hersenen ontleden, eerst een dwarse insnijding met de scalpel tussen het neusgat en de pijnappelklier orgel. Hier begint het weefsel rond de hersenen afgesneden door een paar Castroviejo schaar terwijl het met een pincet.
- Zodra de hersenen blootgesteld, verwijdert de choroid plexus met een pincet en gebruik de haken aan het hoofd van het dier verspreiden en bloot de craniale zenuwen. Snij vervolgens het ruggenmerg dwars met de Castroviejo schaar. Houd het ruggenmerg met een pincet terwijl u een ander paar pincetten om de craniale zenuwen gesneden om de hersenen ontleden.
- Na dissectie, zet de hersenen op een klein stukje van siliconen en houd deze vast door het invoegen van 2 insect pinnen in de olfactorische bollen en 1 in het ruggenmerg. Snij vervolgens de achterste en cerebrotectal commissuren van de hersenen langs de dorsale middellijn met de schaar en afbuigen de alar platen lateraal en speld ze plat op de silicone met 4 insect pinnen (figuur 2).
- Breng het stuk silicone met de hersenen om een buis met 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) bij kamertemperatuur temparature worden vastgesteld gedurende 3 uur op een rotator.
- Na fixatie gebruik de hersenen wholemount voor in situ hybridisatie zoals eerder beschreven (Swain et al., 1994). Brains uit controle of sham geopereerde dieren moeten altijd parallel lopen met de hersenen van gewonde dieren. De wholemounted larvale hersenen kunnen worden onderzocht door in situ hybridisatie vanwege de platte en dunne vorm en ook door de afwezigheid van myeline 10, die in de hersenen relatief doorschijnend maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als voorbeeld van de resultaten die kunnen worden verkregen bij gebruik van deze methode, representatieve beelden van wholemounted hersenen die de expressie van de neogenin transcripten in identificeerbare ruggenmerg neuronen uitstekende controle en 2 weken na lesie larvale zee lampreys zijn getoond in figuur 2. De lezers worden verwezen naar een eerdere studie 6 rapportage van de relatie tussen de expressie van neogenin na een complete ruggenmerg doorsnijding en het regeneratieve vermogen van de identificeerbare ruggemerg projecteren neuronen van de zeeprik voor volledige details. Kort gezegd, hebben de resultaten aangetoond dat na de blessure zijn er veranderingen in de expressie van de receptor in neogenin identificeerbare spinale-projecteren neuronen. Twee weken na volledig ruggenmerg doorsnijding de neogenin receptor preferentieel tot expressie in slechte regeneratoren, zoals M1, I1, I2, I4 of Mth neuronen (zie figuur 2B) Deze resultaten tonen het resultaatvan het protocol en suggereren dat de neogenin receptor betrokken kunnen worden bij het falen van de regeneratie van deze cellen.
Figuur 1: Schematische tekening van een dorsaal aanzicht van de zeeprik hersenen die de plaats van de identificeerbare reticulospinal neuronen. Overgenomen uit Barreiro-Iglesias en Shifman. 5 Voor afkortingen, zie onderstaande lijst.
Figuur 2 Microfoto van dorsale uitzicht op de volgroeide larven zeeprik hersenen die de uitdrukking van de neogenin transcript in de controle (A) en 2 weken na het letsel (B) dieren. Mee in B, dat na de blessure van de neogenin transcript wordt bij voorkeur uitgedrukt in neuronen bekend om slechte regenerators (bijvoorbeeld, M1, I1, I2, I4 en Mth neuronen). Let ook op de aanwezigheid van de gaten die door de pennen gebruikt om de hersenen (pijlen) vasthouden. De lezers worden verwezen naar de eerdere studie door Shifman en collega's. 6 Voor afkortingen, zie onderstaande lijst.
AFKORTINGEN
| B (B1-B6) | Müller cellen van de bulbaire regio (midden rhombencephalic reticulaire nucleus) |
| hab.-ped. tr. | habenulopeduncular darmkanaal |
| I1-I6 | Müllercellen van het isthmische regio |
| IX | glossopharyngeal motor nucleus |
| inf. | infundibulum |
| ISTH. Retic. | isthmische reticulaire formatie |
| M1-M4 | Müllercellen 1 tot 4 |
| MTH | Mauthner cel |
| MTH ' | extra Mauthner cel |
| smi | sulcus medianus inferieure |
| Vm | trigeminus motor nucleus |
| X | vagale motor nucleus |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om een complete ruggenmerg doorsnijding en posterieure hersenen dissectie in larvale zee prikvissen voeren. Deze procedure maakt analyse verschillen in genexpressie tussen identificeerbare ruggenmerg neuronen projecteren ruggenmergschade door geheel-mount in situ hybridisatie brain. De kritische stap in de procedure is het correct uitvoeren van een volledige doorsnijding ruggenmerg, die 24 uur later worden bestuurd door het observeren van de afgesneden einden van het ruggenmerg onder stereomicrocope en bevestigd door voorzichtig aanraken van de snuit van de larve met een paar forceps of er geen beweging caudaal van de plaats van letsel. Het is ook belangrijk voor het herstel van het dier dat de schaar voor de operatie niet stomp en die een scherp gesneden gebeurt volledig doorsnijden het ruggenmerg.
Het voortbestaan van de dieren na het letsel is sterk verbeterd door het houden van de animALS op ijs tijdens de operatie en gedurende de uren gebruikt om de wond aan de lucht drogen en vervolgens in ijskoud water gedurende de eerste 24 uur. Na deze periode de wond gesloten en de dieren reeds overgedragen aan tanks met kraanwater bij kamertemperatuur.
Larven lampreys mogen herstellen bij kamertemperatuur en niet hun gebruikelijke lage temperatuur omdat grotere meerderheid van de dieren herstellen volledige motorische gedragsfuncties na het letsel bij hogere temperaturen. 11 Het herstel van een normaal patroon van beweging wordt waargenomen 8 tot 10 weken na de volledige ruggenmerg doorsnijding.
Na het uitvoeren van een totale doorsnijding ruggenmerg en hersenen dissectie op de gekozen tijdstippen de larvale hersenen kan niet alleen worden verwerkt tot een geheel uitvoeren-mount in situ hybridisatie zoals hier getoond (figuur 2), maar ook voor andere histologische methoden zoals immunohistochemische ( bijvoorbeeld 7 (8) of de detectie van geactiveerde caspases met fluorochroom gemerkte caspase remmers. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
