Summary
Lampretter genvinde bevægelse efter en komplet rygmarvsskade. Men nogle spinale ragende neuroner er gode regeneratorer og andre er ikke. Dette papir illustrerer de teknikker til boliger havlampret larver (og for nylig transformerede voksne), der producerer komplette rygmarv transections og forberede whole- mount hjerner og rygmarv til in situ hybridisering.
Abstract
Efter en komplet rygmarvsskade er havet lampretter i første lammet under niveauet for overskæring. Men de genvinde bevægelse efter flere uger, og dette er ledsaget af kort afstand regenerering (få mm) propriospinal axoner og spinal ragende axoner fra hjernestammen. Blandt de 36 store identificerbare spinal-fremspringende neuroner, nogle er gode regeneratorer og andre er dårlige regeneratorer. Disse neuroner kan lettest identificeret i whole- mount CNS præparater. For at forstå de neuron-iboende mekanismer, der fremmer eller hæmmer Axon regenerering efter skade i hvirveldyr CNS, vi bestemme forskelle i genekspression mellem de gode og dårlige forstærkerkrav og hvordan udtryk påvirkes af rygmarv transection. Dette papir illustrerer de teknikker til boliger larvestadiet og nyligt transformerede voksne havet lampretter i ferskvand tanke, der producerer komplette rygmarv transections under mikroskopisk syn, og forbereder brAin og rygmarv wholemounts til in situ hybridisering. Kort fortalt er dyr, der holdes ved 16 ° C og bedøvet i 1% benzocain i lampret Ringer. Rygmarven transected med iridectomy saks via en dorsal tilgang og dyret får lov til at komme sig i ferskvand tanke ved 23 ° C. Til in situ-hybridisering dyrene reanesthetized og hjernen og ledningen fjernes via en dorsal tilgang.
Introduction
Hos pattedyr rygmarvsskade (SCI) er en ødelæggende tilstand, der fører til permanent tab af funktionen nedenfor skadestedet fordi tilskadekomne axoner ikke regenerere gennem traumet zone og genoprette forbindelsen til deres passende mål. I modsætning til pattedyr, lampretter genvinde bevægelse efter en komplet rygmarvsskade. 1. Interessant lampretter har et sæt af 36 rygmarv fremspringende neuroner, der kan identificeres individuelt i hele-mount hjernen præparater på grund af deres store størrelse 2,3 (figur 1) . Alle disse spinal-fremspringende neuroner er axotomized af et højt niveau komplet rygmarv transection. Tidligere studier i vores gruppe og andre har vist, at selv i nærværelse af funktionelle bedring efter SCI nogle af disse neuroner viser et meget lavt regenerationsevne (de betragtes som "dårlige regeneratorer"), mens andre sædvanligvis regenerere deres axon gennem læsionsstedet (de betragtes som "gOOD regeneratorerne "). 2,3 Denne egenskab gør lampretter en interessant hvirveldyr model til at undersøge forskellene i genekspression mellem god og dårlig regeneratorlejer spinal-fremspringende neuroner, der igen vil føre til forskelle i den iboende regenerativ evne neuroner, der forsøger at regenerere deres axoner i den samme ydre miljø. 1.
Ved hjælp af denne model har vi tidligere vist, at spinal ragende neuroner med lav regenerativ evne viser ekspression af axonale vejledning molekyle receptorer som UNC5 4,5 og neogenin 6, som medierer den hæmmende virkning af netrin og RGM hhv. Hertil kommer, at ved at bruge denne metode i vores gruppe har også vist, at kun de gode regeneratorer viser et opsving af ekspressionen af neurofilamenter efter skaden og under regenerering. For nylig Busch og Morgan 7 har vist ved immunofluorescens at de dårlige regeneratorer viser en i stigendeed udtryk for synuclein efter skade, som er blevet fortalt af forfatterne til det faktum, at de "dårlige regeneratorlejer" spinal-fremspringende neuroner langsomt dø efter en komplet rygmarv transection 5,7,8. Så har Lamprenen model af en komplet rygmarvsskade dukket op som en meget nyttig model til at forstå, hvad der gør en rygmarv fremspringende neuron en "dårlig regenerator" efter axotomi.
At gennemføre vores undersøgelser, vi udfører en komplet rygmarv transection kirurgi protokol og en bageste hjerne dissektion ved de ønskede tidspunkter efter skade udføre whole- mount in situ hybridisering. I den nuværende metodiske artikel præsenterer vi en detaljeret protokol for den korrekte udførelse af en komplet rygmarvsskade kirurgi i larvernes lampretter, den efterfølgende vedligeholdelse af dyrene og den endelige hjerne dissektion og forberedelse af hjernen for en whole- mount in situ hybridisering. En detaljeret protokol til perform den whole- mount in situ hybridisering i hjernen på larvestadiet lampretter er tidligere blevet rapporteret. 9. Desuden er denne protokol for rygmarvsskade og hjerne dissektion kan også bruges til så behandle hjerner for immunhistokemisk eller andre histologiske metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se tabel 1 for alle i denne protokol materialer.
Eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Temple University.
1. Dyr
- Opnå vildtype larval hav lampretter (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm i længden (4 - 7 år) fra vandløb fodring Lake Michigan, fra bifloder til Delaware-floden (Pennsylvania) eller vandløb i Maine.
- I laboratoriet, vedligeholde larver i grupper på 50 til 100 dyr i 50 gallon ferskvandstanke ved 16 ° C. Linje tankene med en tomme af grus for larverne at grave sig ned i, og vandet er trækul filtreret og condition med luft sten i mindst 48 timer for at fjerne klor og andre urenheder før placere lampretter i dem. Der er ingen grund til at fodre dyrene, som recirkulerer deres egen efterladenskaber, indtil den dag brug.
2. Komplet SpinalCord transection
- Før rygmarven kirurgi forberede en lamprey Ringer-opløsning med følgende sammensætning: 110 mM NaCI, 2,1 mM KCI, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM MgCl2 og 10 mM Tris-buffer; pH 7,4.
- For at udføre rygmarven transektion placere larver i en lille beholder, der skal bedøves med 1% tricaine methanesulfonate i iskold Ringer-opløsning.
- Når bedøvede sted dyrene i en petriskål halvt fyldt med Sylgard (silikone), og brug 4 insekt stifter (diameter 0,15 mm) til at holde dyrene i position til kirurgi (den ene er placeret ved snuden af dyret, en på halen og to på niveau 5. gælle). Fyld petriskål næsten op til toppen med Ringer-opløsning. Sæt fadet med larve på is, mens de udfører operationen under stereomikroskop.
- For at udføre rygmarven transektion en dorsal, midterlinjen gøre et langsgående snit med en skalpel (# 11) på niveau 5.gælle at visualisere rygmarven. Oprindeligt huden er åben ved at sætte spidsen af skalpelbladets opad og derefter muskelvæv skæres meget forsigtigt, indtil rygmarven kan ses fra oven. Fashion to kroge fra insekt stifter og bruge dem til at holde kroppen vægge åbne, mens de udfører rygmarven transection.
- Helt transektere rygmarven på niveau med det 5. gælle ved hjælp af en saks (Castroviejo # 8), indsætte saks vinkelret på rygmarven. Rygmarven skal helt gennemskåret med et rent snit. Visualiser rygmarven afskårne ender under stereomikroskop at bekræfte, at rygmarven er blevet fuldstændig transected. Derefter justere de afskårne ender af rygmarven efter overskæring ved hjælp af en tang (# 5).
- Efter udførelse af rygmarven overskæring lukke såret i den dorsale kropsvæggen med et par fine tænger og sætte larverne på is i 1 time for at give såret to tørre. Læg et stykke filterpapir mellem isen og larver og suge det med lampret Ringer-opløsning. Den lave temperatur holder dyrene i live på samme tid, at det tillader såret at lufttørre og derfor bidrage til at forebygge infektioner.
- Derefter overføres larverne til små tanke (1 larve pr tank) med iskoldt vand i 24 timer.
- Undersøg læderede larver 1 dag efter spinal transection til adfærdsmæssigt bekræfte, at der ikke er nogen bevægelse caudale til stedet for skade. En rygmarv transection betragtes som fuldstændig, hvis larve kan bevæge kun dens hoved rostralt til stedet for skade (på niveau med det 5. gælle). Hvis dette er tilfældet, larver kan nu overføres til tanke (1 larve per beholder) med ferskvand ved stuetemperatur (23 ° C) for at give dem mulighed for at restituere sig i de valgte tidspunkter.
- I løbet af tilbagebetalingsperioden skifte vand hver 2 til 3 dage.
3. Brain Dissektion og Udarbejdelse afHjerne for in situ hybridisering
- På de ønskede tidspunkter efter skaden re-bedøver de larvestadiet havet lampretter og sted og fastgøre dem i petriskålen med Ringer-opløsning til at udføre hjernen dissektion som ovenfor.
- At dissekere hjernen ud, først lave en tværgående snit med skalpellen mellem næsebor og pineal orgel. Herfra begynder at skære vævet, der omgiver hjernen ved hjælp af et par Castroviejo saks samtidig holder den med en pincet.
- Når hjernen er udsat for, fjerne plexus chorioideus ved hjælp af en pincet og bruge krogene til at sprede hovedet af dyret og udsættes kranienervelidelser. Derefter skæres rygmarven tværs med Castroviejo saks. Hold rygmarven med en pincet, mens du bruger en anden tang til at skære kranienervelidelser at dissekere hjernen ud.
- Efter dissektion, sætte hjernen på et lille stykke af silikone, og hold den på plads ved at indsætte 2 insect stifter i olfaktoriske pærer og 1 i rygmarven. Derefter skæres den bageste og cerebrotectal commissures af hjernen langs ryggens midtlinie med saksen og afbøjer Alar plader sideværts og pin dem fladt på silicone med 4 insekt ben (Figur 2).
- Overfør stykke af silikone med hjernen til et rør indeholdende 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning (pH 7,4), der skal fastsættes på plads temparature i 3 timer på en rotator.
- Efter fiksering bruge hjernen til whole- mount in situ hybridisering som tidligere beskrevet (Swain et al., 1994). Hjerner fra kontrol eller skinopererede dyr bør køres altid parallelt med hjerner fra tilskadekomne dyr. Den wholemounted larve hjerne kan undersøges ved in situ-hybridisering på grund af sin flade og tynde form og også på grund af fraværet af myelin 10, som gør hjernen temmelig gennemskinnelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på de resultater, der kan opnås, når du bruger denne metode, repræsentative billeder af wholemounted hjerner viser ekspressionen af neogenin transkripter i identificerbare rygmarv ragende neuroner i kontrol og 2 uger efter læsion larvestadium hav lampretter er vist i figur 2. Læserne henvises til en tidligere undersøgelse 6 rapportering forholdet mellem udtryk for neogenin efter en komplet rygmarv transection og den regenerative evne identificerbare rygmarven fremspringende neuroner i havlampret for detaljer. Kort fortalt har resultater vist, at efter den skade, der er ændringer i ekspressionen af neogenin receptor i identificerbare spinal-fremspringende neuroner. To uger efter en komplet rygmarv overskæring den neogenin receptoren fortrinsvis udtrykkes i dårlige regeneratorer, ligesom M1, I1, I2, I4 eller mth neuroner (se figur 2B) Disse resultater viser resultatetaf protokollen og foreslå, at neogenin receptoren kan inddrages i svigt i regenerering af disse celler.
Figur 1: Skematisk tegning af en dorsal udsigt over havlampret hjerne viser placeringen af identificerbare reticulospinal neuroner. Gengivet fra Barreiro-Iglesias og Shifman. 5 For forkortelserne, se listen nedenfor.
Figur 2. Fotomikrografier af dorsale udsigt over den modne larve havlampret hjerne viser ekspressionen af neogenin udskrift i kontrol (a) og 2 uger efter skade (b) dyr. Bemærk i B, efter skaden neogenin udskrift fortrinsvis udtrykkes i neuroner kendt for at være dårlige regeneratorer (f.eks M1, I1, I2, I4 og MTH neuroner). Bemærk også, at tilstedeværelsen af hullerne efterladt af de pinde, der anvendes til at holde hjernen (pile). Læserne henvises til den tidligere undersøgelse af Shifman og kolleger. 6 For forkortelser, se listen nedenfor.
FORKORTELSER
| B (B1-B6) | Müller celler i bulbar-regionen (midten rhombencephalic retikulære nucleus) |
| hab.-ped. tr. | habenulopeduncular tarmkanalen |
| I1-I6 | Müller celler i isthmus region |
| JegX | glossopharyngeal motoriske kerne |
| inf. | infundibulum |
| isth. Retic. | isthmus retikulære formation |
| M1-M4 | Müller celler 1 til 4 |
| Mth | Mauthner celle |
| mth ' | medhjælper Mauthner celle |
| smi | sulcus medianus ringere |
| Vm | trigeminus motoriske kerne |
| X | vagus motoriske kerne |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for at udføre en komplet rygmarv transection og bageste hjerne dissektion i larvestadiet hav lampretter. Denne procedure gør det muligt at analysere forskellene i genekspression mellem identificerbare rygmarv fremspringende neuroner efter rygmarvsskade ved hjælp af en hel-mount hjernen in situ-hybridisering. Det kritiske trin i proceduren er den korrekte udførelse af en komplet rygmarv transektion, som kan kontrolleres ved at observere de afskårne ender af rygmarv under stereomicrocope og bekræftet 24 timer senere ved forsigtigt at røre snude larve med et par pincet til at se, om der er nogen bevægelse caudale til læsionsstedet. Det er også vigtigt for inddrivelse af det dyr, der saksen anvendes til kirurgi er ikke sløv, og at en enkelt og rent snit er gjort til fuldstændigt transektere rygmarven.
Overlevelsen af dyrene efter skaden er stærkt forbedret ved at holde animals på is under kirurgi og under time anvendes til at give såret lufttørre og derefter i iskoldt vand for de første 24 timer. Efter denne periode såret er lukket, og dyrene kan allerede nu overføres til tanke med ferskvand ved stuetemperatur.
Larval lampretter får lov til at komme sig ved stuetemperatur og ikke på deres sædvanlige kold temperatur, fordi et større flertal af dyrene genvinde fuld locomotor adfærdsmæssige funktion efter skaden ved højere temperaturer. 11 igen får et normalt mønster af bevægelse observeres 8 til 10 uger efter at hele rygmarven overskæring.
Efter udførelse af den komplette rygmarv overskæring og hjernen dissektion ved de valgte tidspunkter larvestadiet hjerner kan behandles ikke kun at udføre en hel-mount in situ hybridisering som vist her (figur 2), men også for andre histologiske metoder som immunhistokemi ( fx 7 (f.eks 8) eller påvisning af aktiverede caspaser ved hjælp fluorochrom mærket caspaseinhibitorer. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
