Summary
Lampreys gjenopprette bevegelse etter en komplett ryggmargsskade. Men noen spinal-projisere nevroner er gode regenerators og andre ikke. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger havet lamprett larver (og nylig forvandlet voksne), som produserer komplette ryggmargs transections og forbereder wholemount hjerne og ryggmargen for in situ hybridisering.
Abstract
Etter en komplett ryggmargsskade, er havet lampreys på første lammet under nivået for tran. Men gjenopprette de locomotion etter flere uker, og dette er ledsaget av kort avstand regenerering (noen mm) av propriospinal axoner og spinal-projisere axoner fra hjernestammen. Blant de 36 store identifiserbare spinal-projisere nevroner, noen er gode regenerators og andre er dårlige regenerators. Disse nevronene lettest kan identifiseres i wholemount CNS forberedelser. For å forstå nervecellen-iboende mekanismer som favoriserer eller hemme axon regenerering etter skade i virveldyr CNS, avgjør vi forskjeller i genuttrykk mellom de gode og dårlige regenerators, og hvordan uttrykket påvirkes av ryggmargen tran. Denne artikkelen illustrerer teknikker for boliger larve og voksen nylig forvandlet sjøen lampreys i ferskvannstanker, som produserer komplette ryggmargs transections henhold mikroskopisk syn, og forbereder brain og ryggmargs wholemounts for in situ hybridisering. Kort, blir dyrene holdt ved 16 ° C og bedøvet i 1% Benzokain i niøye Ringer. Ryggmargen er transektert med iridectomy saks via en rygg tilnærming og dyret er lov til å komme i ferskvannstanker ved 23 ° C. For in situ hybridisering, blir dyrene reanesthetized og hjernen og ledningen fjernes via en dorsal tilnærming.
Introduction
Hos pattedyr ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende tilstand som fører til permanent tap av funksjon under skadestedet fordi skadde axoner ikke regenerere gjennom traumer sonen og koble til sine respektive mål. I motsetning til pattedyr, lampreys gjenopprette bevegelse etter en fullstendig ryggmargsskade. Ett Interessant lampreys har et sett av 36 ryggmargen som rager nevroner som er enkeltvis identifiserbare i hel-montere hjerne preparater på grunn av deres store størrelse 2,3 (figur 1) . Alle disse spinal-neuroner blir utragende axotomized ved et høyt nivå komplett ryggmargstranseksjon. Tidligere studier av vår gruppe, og andre har vist at selv i nærvær av funksjonell restitusjon etter SCI noen av disse neuroner viser en svært lav evne til reproduksjon (de anses som "dårlig regeneratorer"), mens andre vanligvis regenerere deres axon gjennom skadestedet (de regnes som "good regenerators "). 2,3 Denne egenskapen gjør lampreys en interessant virveldyr modell for å studere forskjeller i genuttrykk mellom gode og dårlige regenerator spinal-projisere nevroner som i sin tur vil føre til forskjeller i den iboende regenererende evne nevroner som forsøker å regenerering av aksoner i den samme ytre miljø. ett
Ved hjelp av denne modellen vi har tidligere vist at spinal-projisere nevroner med lav regenerativ evne vis uttrykk for aksonale veiledning molekyl reseptorer som UNC5 4,5 og neogenin, 6 som medierer den hemmende virkningen av netrin og RGM hhv. I tillegg, ved å bruke denne metoden vår gruppe har også vist at bare de gode regeneratorer viser en gjenvinning av ekspresjonen av neurofilaments etter skaden, og i løpet av regenereringen. Nylig, Busch og Morgan 7 har vist ved immunfluorescens at de dårlige regenerators viser en increased ekspresjon av synuclein etter skade, som har vært knyttet av forfatterne til det faktum at den "dårlige" regenerator spinal-neuroner som rager langsomt dø etter en fullstendig ryggmargstran 5,7,8. Så har niøyemodell av et komplett ryggmargsskade dukket opp som en svært nyttig modell for å forstå hva som gjør en ryggmarg projisere nevron en "dårlig regenerator" etter axotomy.
For å gjennomføre våre studier vi utfører en komplett ryggmargstran kirurgi protokoll og en posterior hjernen disseksjon på de ønskede tidspunkter etter skade til å utføre wholemount in situ hybridisering. I den foreliggende metodiske artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for en forsvarlig saksbehandling i en komplett ryggmargsskade kirurgi i larve lampreys, den påfølgende vedlikehold av dyrene og den endelige hjernen disseksjon og forberedelse av hjernen for en wholemount in situ hybridisering. En detaljert protokoll til PErform den wholemount in situ hybridisering i hjernen av larver lampreys tidligere er blitt rapportert. 9. I tillegg har denne protokoll for ryggmargsskade og hjerne disseksjon kan også brukes til å behandle deretter hjernene for immunohistokjemi eller andre histologiske metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se tabell 1 for alle materialer som brukes i denne protokollen.
Forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Temple University.
1. Dyr
- Skaff villtype larve sjøen lampreys (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm i lengde (4 - 7 år) fra bekker fôring Lake Michigan, fra sideelver til Delaware River (Pennsylvania) eller bekker i Maine.
- I laboratoriet opprett larver i grupper på 50 - 100 dyr i 50 gallon ferskvannstanker ved 16 ° C. Linje tankene med en tomme av grus for larvene å hule i, og vannet er kullfilter, og rom med luft steiner i minst 48 timer for å fjerne klor og andre urenheter før du plasserer lampreys i dem. Det er ikke nødvendig å mate dyr, som gjenvinner sin egen detritus, inntil bruksdagen.
2. Komplett SpinalCord tran
- Før ryggmarg kirurgi forberede en lamprett Ringer-løsning med følgende sammensetning: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1.8 mM MgCl2, og 10 mM Tris-buffer; pH 7,4.
- For å utføre ryggmargen tran, plasser larver i en liten beholder som skal bedøves med 1% Tricaine methanesulfonate i iskald Ringer løsning.
- Når bedøvet sted dyrene i en petriskål halvveis fylt med Sylgard (silikon) og bruke 4 insektnålene (0,15 mm diameter) for å holde dyrene i posisjon for operasjonen (en er plassert på snuten på dyret, en på halen og to på nivået av den 5. gjelle). Fyll petriskål nesten opp til toppen med Ringer-løsning. Sett fatet med larven på is mens du utfører operasjonen under stereomikroskop.
- For å utføre ryggmargen tran en dorsal, midtlinje, lage en langsgående snitt med en skalpell (# 11) på nivået av den 5.gill å visualisere ryggmargen. Utgangspunktet huden er åpen ved å sette inn spissen av skalpellblad vendt oppover og deretter muskelvev er skåret meget forsiktig til ryggmargen kan sees ovenfra. Mote to kroker fra insekt pinnene og bruke dem til å holde kroppen vegger åpen mens du utfører ryggmargen tran.
- Helt tversgående ryggmargen på nivå med de 5 th gill ved å bruke en saks (Castroviejo # 8), setter saksen vinkelrett på ryggmargen. Ryggmargen må være helt transektert med et rent kutt. Visualisere ryggmargen kuttet endene under stereomikroskop for å bekrefte at ryggmargen har blitt fullstendig transektert. Deretter omstille de kappede ender av ryggmargen etter transeksjon ved hjelp av en pinsett (# 5).
- Etter å ha utført ryggmarg tran lukke såret i dorsal kroppsveggen med et par av fine pinsetter og sette larvene på is i 1 time for å tillate at såret to tørke. Legg et stykke filterpapir mellom isen og larver og suge den med niøye Ringer løsning. Den lave temperaturen holder dyrene i live samtidig som det tillater at såret for å lufttørke, og derfor hjelper til å forebygge infeksjoner.
- Deretter overfører larvene til små akvarier (1 larve per tank) med iskaldt vann i 24 timer.
- Undersøk lesioned larver 1 dag etter ryggtran til atferdsmessig bekrefte at det ikke er noen bevegelse caudal til skadestedet. En ryggmargen tran anses som fullført dersom larven kan bevege seg bare dens hode rostral til skadestedet (på nivået av den 5. gjelle). Hvis dette er tilfelle larvene kan nå overføres til tanker (1 larve per tank) med ferskvann ved romtemperatur (23 ° C) for å tillate dem å komme seg for de valgte tidspunkter.
- Under utvinning perioden endre vann hver 2 til 3 dager.
3. Brain Dissection og klargjøring avBrain for in situ hybridisering
- Ved de ønskede tidspunkter etter skaden re-bedøve larve sjøen lampreys og sted, og feste dem i petriskålen med Ringer-løsning for å utføre hjernen disseksjon som ovenfor.
- Å dissekere hjernen ut, først gjøre en tverrgående snitt med skalpellen mellom nesebor og pineal organ. Herfra begynner å skjære vev som omgir hjernen ved hjelp av et par av Castroviejo saks ved å holde det med en pinsett.
- Når hjernen er eksponert, fjerne de choroid plexus ved hjelp av en pinsett og bruke kroker å spre hodet av dyret og eksponere de hjernenerver. Deretter kuttet ryggmargen på tvers med Castroviejo saks. Hold ryggmargen med en pinsett mens du bruker en annen pinsett til å kutte de hjernenerver å dissekere hjernen ut.
- Etter disseksjon, sette hjernen på en liten del av silikon og holde det på plass ved å sette inn to insect pins i lukte pærer og en i ryggmargen. Deretter kuttet posterior og cerebrotectal commissures av hjernen langs rygglinjen med saksen og avlede Alare plater sidelengs og pin dem flatt mot silikon med fire insekt pins (figur 2).
- Overfør stykke silikon med hjernen til et rør inneholdende 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (pH 7,4) til å være fast ved romtemperatur i 3 timer på et rotasjonsledd.
- Etter fiksering bruke hjerne wholemount for in situ hybridisering, som beskrevet tidligere (Swain et al., 1994). Hjerner fra kontroll eller simulert opererte dyr som skal kjøres alltid parallelt med hjerner fra skadde dyr. Den wholemounted larve hjernen kan bli studert ved in situ hybridisering på grunn av sin flate og tynn form og også på grunn av fravær av myelin 10, som gjør hjernen relativt gjennomskinnelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på hvilke resultater som kan oppnås ved bruk av denne metoden, representative bilder av wholemounted hjerner viser uttrykk for neogenin transkripsjoner i identifiserbare ryggmargs-projisere nevroner av kontroll og 2 uker etter lesjon larve sjøen lampreys er vist i figur 2. De leserne blir henvist til en tidligere studie 6 rapporterer forholdet mellom ekspresjonen av neogenin etter en fullstendig ryggmargstranseksjon og den regenererende evne til identifiserbare ryggmargs rager nevroner i havet lamprett for detaljer. Kort fortalt har resultatene vist at etter skaden det er endringer i ekspresjon av reseptoren i neogenin identifiserbare spinal-neuroner som rager. To uker etter en komplett ryggmargstran den neogenin reseptoren er fortrinnsvis uttrykt i dårlige regenerators, som M1, I1, I2, I4, eller MTH nevroner (se figur 2B) Disse resultatene viser utfalletav protokollen, og tyder på at neogenin reseptoren kan være involvert i svikt i regenereringen av disse cellene.
Figur 1: Skjematisk tegning av en rygg utsikt over havet lamprett hjernen som viser plasseringen av identifiserbare reticulospinal nevroner. Gjengitt fra Barreiro-Iglesias og Shifman. 5 For forkortelser, se liste nedenfor.
Figur 2. Mikrofotografier av rygg utsikt over den modne larve havet lamprett hjernen som viser uttrykk for neogenin transkripsjon kontroll (A) og 2 uker etter skade (B) dyr. Legg merke til at i B etter skaden neogenin transkripsjon er fortrinnsvis uttrykt i nevroner kjent for å være dårlige regenerators (f.eks M1, I1, I2, I4 og MTH nevroner). Legg også merke til at tilstedeværelsen av hullene igjen av stiftene brukes til å holde hjernen (piler). Leserne blir henvist til forrige studie av Shifman og kollegaer. 6 For forkortelser, se liste nedenfor.
FORKORTELSER
| B (B1-B6) | Müller cellene i slagflaten regionen (Midt rhombencephalic retikulære nucleus) |
| hab.-ped. tr. | habenulopeduncular kanalen |
| I1-I6 | Müller cellene i isthmus regionen |
| JegX | glossopharyngeal motor nucleus |
| inf. | infundibulum |
| isth. Retic. | isthmus retikulære dannelsen |
| M1-M4 | Müller celler 1 til 4 |
| Mnd | Mauthner celle |
| mnd ' | hjelpe Mauthner celle |
| smi | sulcus medianus mindreverdig |
| Vm | trigeminal motor nucleus |
| X | vagal motor nucleus |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å utføre en komplett ryggmargstran og posterior hjernen disseksjon i larve sjøen lampreys. Denne prosedyren kan analysere forskjeller i genuttrykk mellom identifiserbare ryggmargsutstikk nevroner etter ryggmargsskade ved hjelp av en hel-mount hjernen in situ hybridisering. Det kritiske trinnet i fremgangsmåten er den riktige utførelse av en komplett ryggmargstranseksjon, som kan styres ved å observere de kappede ender av ryggmargen under stereomicrocope og bekreftet 24 timer senere ved forsiktig berøring snuten av larven med et par tang for å se om det er noen bevegelse caudal til skadestedet. Det er også viktig for utvinning av dyret at saksen brukes for operasjonen ikke er butt, og at en enkelt og rent kutt er gjort for å fullstendig skjære over ryggmargen.
Overlevelsen av dyrene etter at skaden er sterkt forbedret ved å holde animals på is i løpet av operasjonen, og i løpet av timen brukes til å tillate såret for å lufttørke og deretter i is-kaldt vann for den første 24 timer. Etter denne perioden såret er lukket og dyrene allerede kan overføres til tanker med ferskvann ved romtemperatur.
Larve lampreys er tillatt å gjenvinne romtemperatur, og ikke i deres vanlige kald temperatur, fordi en større fleste dyrene gjenopprette fullt lokomotorisk atferds funksjon etter skaden ved høyere temperaturer. For 11 utvinning av et normalt mønster av bevegelse observeres 8 til 10 uker etter at hele ryggmargen tran.
Etter å ha utført den komplette ryggmargstranseksjon og hjernen disseksjon på valgte tidspunkter larve hjerner kan bearbeides, ikke bare for å utføre en hel-montering in situ hybridisering, som vist her (figur 2), men også for andre histologiske metoder som immunhistokjemi ( f.eks 7 (f.eks 8) eller påvisning av aktiverte caspaser ved hjelp fluorokromkonjugerte merket kaspase-inhibitorer. fem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
