Summary
Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.
Abstract
Después de una lesión completa de la médula espinal, las lampreas de mar en primera están paralizados por debajo del nivel de corte transversal. Sin embargo, se recuperan locomoción después de varias semanas, y esto se acompaña de la regeneración corta distancia (unos pocos mm) de los axones propioespinal y axones-espinales que se proyecta desde el tronco cerebral. Entre los 36 grandes neuronas espinales proyectar identificables, algunos son buenos y otros son regeneradores malas regeneradores. Estas neuronas pueden ser más fáciles de identificar en las preparaciones del SNC wholemount. Con el fin de comprender los mecanismos de las neuronas intrínsecas que favorecen o inhiben la regeneración de axones después de la lesión del SNC en los vertebrados, determinamos diferencias en la expresión génica entre los regeneradores buenas y malas, y cómo la expresión es influenciada por transección de la médula espinal. Este documento ilustra las técnicas de larvas vivienda y recientemente transformado lampreas marinas adultas en depósitos de agua potable, la producción de transección medular completa bajo visión microscópica, y la preparación brain y wholemounts médula espinal para la hibridación in situ. En pocas palabras, los animales se mantienen a 16 ° C y anestesiado en el 1% de benzocaína en Ringer lamprea. La médula espinal se secciona con tijeras de iridectomía a través de un enfoque dorsal y se permite que el animal pueda recuperarse en depósitos de agua potable a 23 ° C. Para la hibridación in situ, los animales se reanesthetized y el cerebro y el cordón removidos a través de un enfoque dorsal.
Introduction
En los mamíferos lesión de la médula espinal (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a la pérdida permanente de la función por debajo del sitio de la lesión, porque los axones lesionados no se regeneran a través de la zona de trauma y se vuelven a conectar a sus objetivos adecuados. En contraste con los mamíferos, lampreas recuperar la locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. 1 Curiosamente, lampreas tienen un conjunto de 36 neuronas de la médula espinal que se proyecta que son individualmente identificable en todo el montaje preparaciones cerebrales debido a su gran tamaño 2,3 (Figura 1) . Todas estas neuronas espinales están proyectando axotomizadas por transección de la médula espinal completa de alto nivel. Estudios anteriores de nuestro grupo y otros han demostrado que, incluso en la presencia de la recuperación funcional después de SCI algunas de estas neuronas muestran una capacidad regenerativa muy bajo (se consideran "malos regeneradores"), mientras que otros por lo general se regeneran su axón a través del sitio de la lesión (se consideran "gregeneradores ood "). 2,3 Esta característica hace que las lampreas un modelo vertebrado interesante estudiar las diferencias en la expresión génica entre el bien y el mal regenerador neuronas espinales que se proyecta que a su vez dará lugar a las diferencias en la capacidad regenerativa intrínseca de las neuronas que intentan regenerar sus axones en el mismo entorno extrínseca. 1
El uso de este modelo que hemos demostrado anteriormente que-espinal proyectando las neuronas con baja capacidad regenerativa muestran la expresión de los receptores de moléculas guía axonal como UNC5 4,5 y neogenin, 6 que median la acción inhibitoria de netrina y RGM respectivamente. Además, mediante el uso de este método nuestro grupo ha demostrado también que sólo las buenas regeneradores muestran una recuperación de la expresión de neurofilamentos después de la lesión y durante el proceso de regeneración. Recientemente, Busch y Morgan 7 han demostrado por inmunofluorescencia que los malos regeneradores muestran un increasexpresión ed de sinucleína después de la lesión, que se ha relacionado por los autores sobre el hecho de que las "malas regenerador" neuronas espinales proyectar mueren lentamente después de una médula espinal transección completa 5,7,8. Así, el modelo de la lamprea de una lesión completa de la médula espinal se ha convertido en un modelo muy útil para entender lo que hace que un cable de la proyección de las neuronas de la médula de un "mal regenerador" después de axotomía.
Para llevar a cabo nuestros estudios estamos llevando a cabo un protocolo completo de la médula espinal y cirugía transección una disección del cerebro posterior en los momentos deseados después de la lesión para realizar wholemount hibridación in situ. En el presente artículo metodológico se presenta un protocolo detallado para el correcto cumplimiento de la cirugía de lesión medular completa en las lampreas de larvas, el mantenimiento posterior de los animales y la disección del cerebro final y preparación del cerebro para una wholemount hibridación in situ. Un protocolo detallado a performa la wholemount hibridación in situ en el cerebro de las lampreas de larvas ha sido informado previamente. 9 Además, este protocolo para la lesión de la médula espinal y la disección del cerebro puede también ser utilizado entonces para procesar los cerebros de inmunohistoquímica u otros métodos histológicos.
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Protocol
Ver Tabla 1 para todos los materiales utilizados en este protocolo.
Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Temple.
1. Animales
- Obtener wildtype lampreas marinas larvales (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de largo (4-7 años) de los arroyos que alimentan el lago Michigan, a partir de afluentes del río Delaware (Pennsylvania) o arroyos en Maine.
- En el laboratorio, las larvas de mantener en grupos de 50 a 100 animales en tanques de agua dulce de 50 galones a 16 ° C. Línea de los tanques con una pulgada de grava para que las larvas madriguera en, y el agua se filtra el carbón y se acondicionó con piedras de aire durante al menos 48 horas para eliminar el cloro y otras impurezas antes de colocar las lampreas en ellos. No hay necesidad de alimentar a los animales, que reciclan su propio detritus, hasta el día de uso.
2. completa EspinalLa transección del cable
- Antes de la cirugía de la médula espinal preparar una solución de Ringer lamprea con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 2,1 mM, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM de MgCl 2 y 10 mM de tampón Tris; pH 7,4.
- Para realizar la transección de la médula espinal, colocar las larvas en un pequeño recipiente que se anestesiaron con metanosulfonato de tricaína 1% en solución de Ringer enfriada con hielo.
- Una vez anestesiado el lugar de los animales en una placa de Petri llena hasta la mitad con Sylgard (de silicona) y utilizan 4 pins de insectos (0,15 mm de diámetro) para mantener a los animales en posición durante la cirugía (uno se coloca en el hocico del animal, uno en la cola y dos en el nivel de la 5 ª agallas). Llene la caja de Petri casi hasta la parte superior con una solución de Ringer. Coloque el plato con la larva en el hielo mientras se realiza la cirugía bajo el microscopio estereoscópico.
- Para realizar la transección de la médula espinal dorsal, la línea media, hacer una incisión longitudinal con un escalpelo (# 11) a nivel de la 5 ªGill para visualizar la médula espinal. Inicialmente la piel está abierta mediante la inserción de la punta de la cuchilla de escalpelo hacia arriba y entonces el tejido muscular se corta muy suavemente hasta la médula espinal puede ser visto desde arriba. Moda dos ganchos de los pasadores de insectos y los utilizan para sostener las paredes del cuerpo abierto mientras se realiza la transección de la médula espinal.
- Completamente seccionar la médula espinal a nivel de la 5 ª agallas mediante el uso de un par de tijeras (Castroviejo 8 #), insertar las tijeras perpendicularmente a la médula espinal. La médula espinal tiene que ser completamente seccionado con un corte limpio. Visualice los extremos cortados de la médula espinal en el microscopio estereoscópico para confirmar que la médula espinal ha sido completamente seccionado. Entonces, realinear los extremos cortados de la médula espinal después de la transección mediante el uso de un par de pinzas (# 5).
- Después de realizar la transección de la médula espinal a cerrar la herida en la pared dorsal del cuerpo con un par de pinzas finas y poner las larvas en hielo durante 1 hora para permitir que la herida to secar. Ponga un pedazo de papel de filtro entre el hielo y las larvas y remojarlo con solución de Ringer lamprea. La baja temperatura mantiene los animales vivos, al mismo tiempo que permite que la herida se seque al aire y por lo tanto ayudando a prevenir infecciones.
- A continuación, traslado a las larvas de los tanques pequeños (1 larva por tanque) con agua helada durante 24 horas.
- Examine el lesionado larvas de 1 día después de la transección espinal para conductualmente confirmar que no hay movimiento caudal al sitio de la lesión. Un transección de la médula espinal se considera completa si la larva puede moverse sólo su cabeza rostral al sitio de la lesión (en el nivel de la 5 ª agallas). Si este es el caso de las larvas ahora puede ser transferido a los tanques (1 larva por tanque) con agua dulce a temperatura ambiente (23 ° C) para permitir que se recuperen de los puntos de tiempo seleccionados.
- Durante el período de recuperación de cambiar el agua cada 2 o 3 días.
3. Cerebro disección y preparación deCerebro de hibridación in situ
- En los puntos de tiempo deseados después de la lesión volver a anestesiar las lampreas de mar de larvas y el lugar y el pin en la placa de Petri con solución de Ringer para llevar a cabo la disección del cerebro como anteriormente.
- Para diseccionar el cerebro, en primer lugar hacer una incisión transversal con el bisturí entre la fosa nasal y el órgano pineal. Desde aquí comenzar a cortar el tejido que rodea el cerebro mediante el uso de un par de tijeras Castroviejo mientras la mantiene con un par de fórceps.
- Una vez que el cerebro está expuesto, retire el plexo coroideo mediante el uso de un par de fórceps y el uso de los ganchos para difundir la cabeza del animal y exponer los nervios craneales. Luego, cortar transversalmente la médula espinal con las tijeras de Castroviejo. Mantenga la médula espinal con un par de fórceps durante el uso de otro par de pinzas para cortar los nervios craneales para diseccionar el cerebro fuera.
- Después de la disección, poner el cerebro en un pequeño trozo de silicona y mantenerlo en su posición insertando 2 insect alfileres en los bulbos olfatorios y 1 en la médula espinal. Luego, cortar la parte posterior y comisuras cerebrotectal del cerebro a lo largo de la línea media dorsal con las tijeras y desviar las placas alares lateralmente y el pin plano para la silicona con 4 pins de insectos (Figura 2).
- Transferir la pieza de silicona con el cerebro a un tubo que contiene un 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino (pH 7,4) que se fije en Temparature ambiente durante 3 h en un rotador.
- Después de la fijación utilizar el cerebro para wholemount hibridación in situ como se describe anteriormente (Swain et al., 1994). Los cerebros de los animales de control con operación simulada o se debe ejecutar siempre en paralelo con los cerebros de los animales heridos. El cerebro de larvas wholemounted puede ser estudiada mediante hibridación in situ debido a su forma plana y delgada y también debido a la ausencia de mielina 10, que hace que el cerebro bastante translúcido.
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Representative Results
Como ejemplo de los resultados que se pueden obtener cuando se utiliza este método, las imágenes representativas de cerebros wholemounted que muestran la expresión de las transcripciones neogenin en neuronas de la médula espinal identificables de proyección del control y 2 semanas después de la lesión de larvas lampreas de mar se muestran en la Figura 2. Los lectores pueden consultar a un estudio previo 6 informar de la relación entre la expresión de neogenin después de una transección completa de la médula espinal y la capacidad de regeneración de la médula espinal que puede ser identificada proyectando las neuronas de la lamprea de mar para obtener detalles completos. Brevemente, los resultados han demostrado que después de la lesión hay cambios en la expresión del receptor de neogenin en las neuronas espinales-proyectar identificables. Dos semanas después de una transección completa de la médula espinal el receptor neogenin se expresa preferentemente en los malos regeneradores, como la M1, I1, I2, I4, o neuronas Mth (ver Figura 2B) Estos resultados demuestran el resultadodel protocolo y sugieren que el receptor neogenin podría estar implicado en el fracaso de la regeneración de estas células.
Figura 1: Esquema de una vista dorsal del cerebro lamprea de mar que muestra la ubicación de las neuronas reticulospinal identificables. Reproducido de Barreiro-Iglesias y. Shifman 5 Para las abreviaturas, véase la lista más abajo.
Figura 2. fotomicrografías de vistas dorsales de la madurez de las larvas cerebro lamprea marina que muestran la expresión del transcrito de neogenin en el control (A) y 2 semanas después de la lesión (b) Los animales. Nota en B que después de la lesión del neogenin transcripción se expresa preferentemente en las neuronas se sabe que son malas regeneradores (por ejemplo, M1, I1, I2, I4 y neuronas Mth). Además, tenga en cuenta la presencia de los agujeros dejados por las alfiler para mantener el cerebro (flechas). Los lectores pueden consultar el estudio previo de Shifman y compañeros de trabajo. 6 Para las abreviaturas, véase la lista más abajo.
ABREVIATURAS
| B (B1-B6) | Las células de Müller de la región bulbar (media núcleo reticular rhombencephalic) |
| hab.-ped. tr. | tracto habenulopeduncular |
| I1-I6 | Las células de Müller de la región ístmica |
| YoX | núcleo motor glosofaríngeo |
| inf. | infundíbulo |
| ISTH. retic. | formación reticular ístmica |
| M1-M4 | Las células de Müller 1 a 4 |
| Mes | Celular Mauthner |
| mth ' | celular Mauthner auxiliar |
| smi | medianus surco inferior |
| Vm | núcleo motor del trigémino |
| X | núcleo motor vagal |
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Discussion
Aquí presentamos un protocolo detallado para realizar un corte transversal de la médula espinal completa y la disección del cerebro posterior en las lampreas marinas larvales. Este procedimiento permite analizar las diferencias en la expresión génica entre identificable de la médula espinal que se proyectan neuronas después de la lesión de la médula espinal por medio de un cerebro todo el montaje hibridación in situ. El paso crítico en el procedimiento es el correcto funcionamiento de una transección completa de la médula espinal, que puede ser controlada mediante la observación de los extremos cortados de la médula espinal bajo la stereomicrocope y confirmó 24 horas más tarde tocando suavemente el hocico de la larva con un par de fórceps para ver si no hay movimiento caudal al sitio de la lesión. También es importante para la recuperación del animal que las tijeras utilizadas para la cirugía no son romas y que una sola y limpio corte se hace para seccionar completamente la médula espinal.
La supervivencia de los animales después de la lesión está muy mejorado, manteniendo la animals en el hielo durante la cirugía y durante la hora utilizada para permitir que la herida se seque al aire y luego en agua helada durante las primeras 24 horas. Después de este período, la herida se cierra y los animales ya puede ser transferido a los tanques con agua dulce a temperatura ambiente.
Lampreas de larvas se dejaron recuperar a temperatura ambiente y no a su temperatura fría usual porque una gran mayoría de los animales recuperar la función completa del comportamiento locomotor después de la lesión a temperaturas más altas. 11 La recuperación de un patrón normal de locomoción se observa 8 a 10 semanas después de la transección completa de la médula espinal.
Después de realizar la transección de la médula espinal completa y la disección del cerebro en los puntos de tiempo seleccionados los cerebros de larvas se pueden procesar no sólo para llevar a cabo un todo el montaje hibridación in situ tal como se muestra (Figura 2), sino también para otros métodos histológicos (como inmunohistoquímica por ejemplo 7 (por ejemplo 8) o la detección de las caspasas activadas mediante el uso de inhibidores de caspasa marcado con fluorocromo. 5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
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