Summary
Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d'autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l'hybridation in situ.
Abstract
Après une lésion complète de la moelle épinière, la lamproie marine dans un premier temps sont paralysés en dessous du niveau de sectionnement. Cependant, ils récupèrent locomotion après plusieurs semaines, ce qui est accompagné par régénération à courte distance (quelques mm) des axones et des axones spinaux propriospinaux saillie du tronc cérébral. Parmi les 36 grands neurones spinaux saillie identifiables, certains sont bons régénérateurs et d'autres sont mauvaises régénérateurs. Ces neurones peuvent le plus facilement être identifiés dans les préparations wholemount SNC. Afin de comprendre les mécanismes neuronaux intrinsèques qui favorisent ou inhibent la régénération axonale après une lésion du système nerveux central chez les vertébrés, nous déterminons les différences d'expression génique entre les bons et les mauvais régénérateurs, et comment l'expression est influencée par la moelle sectionnement de la moelle. Cet article illustre les techniques pour le logement des larves et des adultes lamproies récemment transformées en réservoirs d'eau, la production de sections transversales de la moelle épinière complets sous vision microscopique, et la préparation de brain échantillons entiers et de la moelle épinière pour l'hybridation in situ. En bref, les animaux sont maintenus à 16 ° C et anesthésiés dans 1% de benzocaïne dans lamproie Ringer. La moelle épinière est sectionnée avec iridectomie ciseaux par une approche dorsale et l'animal est autorisé à récupérer dans les réservoirs d'eau douce à 23 ° C. Par hybridation in situ, les animaux sont reanesthetized et le cerveau et la moelle éliminés par un abord dorsal.
Introduction
Chez les mammifères lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une perte permanente de la fonction ci-dessous le site de la lésion, car axones lésés ne se régénèrent pas dans la zone de traumatisme et se reconnecter à leurs cibles. Contrairement aux mammifères, les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. 1 Fait intéressant, les lamproies ont un ensemble de 36 moelle épinière projection neurones qui sont identifiables individuellement dans l'ensemble du montage des préparations du cerveau en raison de leur grande taille 2,3 (Figure 1) . Tous ces neurones spinaux sont en saillie par un axotomisés complète transection de la moelle épinière de haut niveau. Des études antérieures de notre groupe et d'autres ont montré que, même en présence de la récupération fonctionnelle après un traumatisme médullaire certains de ces neurones présentent une très faible capacité de régénération (ils sont considérés comme «mauvais régénérateurs»), tandis que d'autres se régénèrent généralement leur axone à travers le site de la lésion (ils sont considérés comme «grégénérateurs ood »). 2,3 Cette caractéristique rend les lamproies un modèle vertébré intéressant d'étudier les différences d'expression génique entre le bien et le mal régénérateur neurones spinaux saillie qui à son tour conduire à des différences dans la capacité de régénération intrinsèque des neurones qui tentent de régénérer leurs axones dans le même environnement extrinsèque. 1
En utilisant ce modèle, nous avons précédemment montré que les neurones de projection de la colonne vertébrale avec une faible capacité de régénération axonale de montrer l'expression des récepteurs de molécules de guidage comme UNC5 néogénine 4,5 et 6, qui assurent la médiation de l'action inhibitrice de la nétrine et RGM respectivement. En outre, en utilisant cette méthode notre groupe a également montré que seules les bonnes régénérateurs montrent une récupération de l'expression des neurofilaments après la lésion et au cours du processus de régénération. Récemment, Busch et Morgan 7 ont montré par immunofluorescence que les mauvaises régénérateurs montrent un increasexpression ée de synucléine après une blessure, qui a été rapporté par les auteurs sur le fait que les "mauvais" régénérateur neurones spinaux saillie meurent lentement après un sectionnement de la moelle épinière 5,7,8 complète. Ainsi, le modèle de la lamproie d'une lésion complète de la moelle épinière a émergé comme un modèle très utile pour comprendre ce qui rend un cordon en saillie neurone spinal une «mauvaise régénérateur" après axotomie.
Pour mener nos études, nous effectuons un sectionnement de la moelle épinière protocole de chirurgie complète et une dissection postérieure du cerveau au niveau des points de temps souhaités après une blessure à effectuer wholemount hybridation in situ. Dans l'article méthodologique actuelle, nous présentons un protocole détaillé pour la bonne exécution d'une opération complète de lésions de la moelle épinière chez les lamproies larvaires, l'entretien ultérieur des animaux et la dissection du cerveau finale et la préparation du cerveau pour une wholemount hybridation in situ. Un protocole détaillé de perform la wholemount hybridation in situ dans le cerveau des lamproies larvaires a été indiqué précédemment. 9 En outre, ce protocole en cas de blessure de la moelle épinière et le cerveau dissection peut être également utilisé pour traiter ensuite les cerveaux pour l'immunohistochimie ou d'autres méthodes histologiques.
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Protocol
Voir le tableau 1 pour tous les matériaux utilisés dans ce protocole.
Des expériences ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université Temple.
1. Animaux
- Obtenir type sauvage larves de lamproie de mer (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de longueur (4 - 7 ans) des cours d'eau qui alimentent le lac Michigan, des affluents de la rivière Delaware (Pennsylvanie) ou les cours d'eau, dans le Maine.
- Dans le laboratoire, maintenir les larves dans des groupes de 50 - 100 animaux dans les réservoirs d'eau de 50 gallons à 16 ° C. Ligne des réservoirs avec un pouce de gravier pour les larves de terrier, et l'eau est filtrée et conditionnée charbon de bois avec des pierres de l'air pendant au moins 48 heures pour éliminer le chlore et d'autres impuretés avant de placer les lamproies en eux. Il n'est pas nécessaire de nourrir les animaux, qui recyclent leur propre détritus, jusqu'à la journée d'utilisation.
2. complète épinièreCordon Transection
- Avant la chirurgie de la moelle épinière préparer une solution de Ringer lamproie avec la composition suivante: NaCl 110 mM, KCl 2,1 mM, 2,6 mM de CaCl2, 1,8 mM MgCl 2 et du tampon Tris 10 mM; pH 7,4.
- Pour effectuer la transection de la moelle épinière, les larves placer dans un petit récipient à anesthésiés avec 1% de méthanesulfonate de tricaïne dans une solution de Ringer à froid de glace.
- Une fois lieu anesthésié les animaux dans une boîte de Pétri à moitié rempli d'Sylgard (silicone) et utilisent 4 broches d'insectes (0,15 mm de diamètre) pour maintenir les animaux en position pour la chirurgie (on est placé au museau de l'animal, l'un à la queue et deux au niveau de la 5 ème branchies). Remplissez la boîte de Pétri près au sommet avec une solution de Ringer. Mettez le plat avec la larve sur la glace pendant la chirurgie sous la loupe binoculaire.
- Pour effectuer la transection de la moelle épinière dorsale, la ligne médiane, une incision longitudinale avec un scalpel (n ° 11) au niveau de la 5 èmebranchies de visualiser la moelle épinière. Initialement, la peau est ouverte par l'insertion de la pointe de la lame de scalpel et ensuite vers le haut le tissu musculaire est coupé très doucement jusqu'à ce que la moelle épinière peut être vu d'en haut. Mode deux crochets des broches insectes et les utiliser pour maintenir les parois de la caisse ouverte tout en effectuant le sectionnement de la moelle épinière.
- Complètement transect de la moelle épinière au niveau de la 5 ème branchies en utilisant une paire de ciseaux (Castroviejo n ° 8), insérer les ciseaux perpendiculairement à la moelle épinière. La moelle épinière doit être complètement sectionnée par une coupe franche. Visualisez les extrémités de la moelle épinière de coupe sous la loupe binoculaire pour confirmer que la moelle épinière a été complètement sectionné. Ensuite, aligner les extrémités de la moelle épinière après la coupe de sectionnement à l'aide d'une paire de pinces (5).
- Après avoir effectué la transection de la moelle épinière fermer la plaie dans la paroi dorsale du corps avec une paire de pinces fines et met les larves sur de la glace pendant 1 heure pour permettre à la plaie de to sécher. Placer un morceau de papier-filtre entre la glace et les larves et les faire tremper avec une solution de Ringer lamproie. La basse température permet de maintenir les animaux vivants, en même temps qu'il permet à la plaie de l'air sec et donc aider à prévenir les infections.
- Transférez ensuite les larves de petits réservoirs (1 larve par réservoir) avec de l'eau glacée pendant 24 heures.
- Examinez la lésion larves 1 jour après le sectionnement de la moelle pour confirmer comportemental qu'il n'y a pas de mouvement caudal au site de la lésion. Un sectionnement de la moelle épinière est considérée comme complète si la larve peut se déplacer que son rostre de la tête à l'endroit de la blessure (au niveau de la 5 ème branchies). Si c'est le cas, les larves peut maintenant être transféré dans des réservoirs (1 larve par réservoir) avec l'eau douce à température ambiante (23 ° C) pour leur permettre de récupérer des points de temps choisis.
- Au cours de la période de récupération de changer l'eau tous les 2 à 3 jours.
3. dissection du cerveau et la préparation dele cerveau pour l'hybridation in situ
- Aux points de temps souhaités après la blessure ré-anesthésier les lamproies larvaires et le lieu et les épingler dans la boîte de Pétri avec une solution de Ringer pour effectuer la dissection du cerveau comme ci-dessus.
- Pour disséquer le cerveau, tout d'abord faire une incision transversale avec le scalpel entre la narine et la glande pinéale. De là, commencer à couper le tissu entourant le cerveau en utilisant une paire de ciseaux Castroviejo en la tenant avec une paire de forceps.
- Une fois que le cerveau est exposé, retirez le plexus choroïde en utilisant une paire de pinces et d'utiliser les crochets pour répandre la tête de l'animal et d'exposer les nerfs crâniens. Ensuite, coupez la transversale de la moelle épinière avec des ciseaux de Castroviejo. Maintenir la moelle épinière avec une paire de pinces tout en utilisant une autre paire de pinces pour couper les nerfs crâniens pour disséquer le cerveau destination.
- Après dissection, mettre le cerveau sur un petit morceau de silicone et le maintenir en position en insérant deux insect broches dans le bulbe olfactif et le 1 dans la moelle épinière. Ensuite, coupez la partie postérieure et commissures cerebrotectal du cerveau le long de la ligne médiane dorsale avec les ciseaux et dévier les plaques alaires latéralement et épinglez-les à plat sur le silicone avec 4 broches d'insectes (figure 2).
- Transférer la pièce de silicone avec le cerveau dans un tube contenant 4% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate salin (pH 7,4) d'être fixé à la chambre temparature pendant 3 heures sur un agitateur.
- Après fixation utiliser le cerveau pour wholemount hybridation in situ comme décrit précédemment (Swain et al., 1994). Brains des animaux de contrôle ou subi une opération fictive doivent être exécutés toujours en parallèle avec les cerveaux des animaux blessés. Le cerveau larvaire wholemounted peut être étudiée par hybridation in situ en raison de sa forme plate et mince et également en raison de l'absence de 10 la myéline, ce qui rend le cerveau plutôt translucide.
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Representative Results
Comme un exemple des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant cette méthode, des images représentatives de cerveaux wholemounted montrant l'expression des transcrits néogénine dans les neurones identifiables de la moelle épinière saillie de contrôle et 2 semaines après la lésion larves de lamproie de mer sont présentés dans la figure 2. Les lecteurs sont invités à une étude précédente 6 rapports de la relation entre l'expression de la néogénine après un sectionnement de la moelle épinière complète et la capacité de régénération de la moelle épinière identifiable projection des neurones de la lamproie de mer pour plus de détails. En bref, les résultats ont montré que, après la blessure, il ya des changements dans l'expression du récepteur dans néogénine neurones spinaux saillie identifiables. Deux semaines après une section complète de la moelle épinière du récepteur néogénine est préférentiellement exprimé dans de mauvaises régénérateurs, comme les, I1, I2, I4, ou neurones Mth M1 (voir Figure 2B) Ces résultats démontrent le résultatdu protocole et suggèrent que le récepteur néogénine pourrait être impliqué dans l'échec de la régénération de ces cellules.
Figure 1: Schéma d'une vue dorsale du cerveau de la lamproie marine montrant l'emplacement des neurones réticulo-identifiables. Reproduit de Barreiro Iglesias et. Shifman 5 Pour les abréviations, voir la liste ci-dessous.
Figure 2 Microphotographies de vues dorsales de la larve de la lamproie marine cerveau mature montrant l'expression de la transcription néogénine contrôle (A) et 2 semaines après la lésion (b) des animaux. Remarque B, que après la blessure du neogenin transcription est préférentiellement exprimée dans les neurones connus pour être de mauvais régénérateurs (par exemple, M1, I1, I2, I4 et les neurones MTH). En outre, notez la présence des trous laissés par les broches utilisés pour maintenir le cerveau (flèches). Les lecteurs sont invités à l'étude précédente par Shifman et collègues. 6 Pour les abréviations, voir la liste ci-dessous.
ABRÉVIATIONS
| B (B1-B6) | Les cellules de Müller de la région bulbaire (milieu rhombencéphalique noyau réticulaire) |
| hab.-ped. tr. | voies habenulopeduncular |
| I1-I6 | Les cellules de Müller de la région de l'isthme |
| JeX | glossopharyngien noyau moteur |
| inf. | infundibulum |
| ISTH. retic. | formation réticulée isthmique |
| M1-M4 | Les cellules de Müller 1 à 4, |
| Mth | Cellule Mauthner |
| mth ' | cellule Mauthner auxiliaire |
| smi | medianus sillon inférieur |
| Vm | noyau moteur du trijumeau |
| X | vagal noyau moteur |
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Discussion
Nous présentons ici un protocole détaillé pour effectuer un sectionnement de la moelle épinière complète et postérieure dissection du cerveau en larves de lamproie de mer. Cette procédure permet d'analyser les différences dans l'expression génique entre les neurones de la moelle épinière en saillie identifiables après une lésion de la moelle épinière par l'intermédiaire d'un cerveau entier de montage en hybridation in situ. L'étape critique dans la procédure est la performance correcte de l'une section complète de la moelle épinière, qui peut être commandé par l'observation des extrémités de la moelle épinière de coupe sous la stereomicrocope et confirmé 24 heures plus tard en touchant doucement le museau de la larve d'une paire de Pince pour voir s'il n'y a pas de mouvement caudale au site de la lésion. Il est également important pour la récupération de l'animal que les ciseaux utilisés pour la chirurgie n'est pas brusque et que seule une coupe propre et est fait pour permettre le croisement complètement la moelle épinière.
La survie des animaux après la lésion est fortement améliorée par le maintien animals sur la glace au cours de la chirurgie et pendant l'heure utilisée pour permettre à la plaie sécher à l'air puis dans l'eau glacée pour les 24 premières heures. Après cette période, la plaie est refermée et les animaux peut déjà être transféré dans des réservoirs à eau douce à température ambiante.
Lamproies larvaires sont autorisés à récupérer à la température ambiante et non à leur température froide d'habitude car une grande majorité des animaux récupérer plein locomoteur fonction du comportement après l'accident à des températures plus élevées. 11 La reprise d'un modèle normal de locomotion est observé 8 à 10 semaines après la section complète de la moelle épinière.
Après avoir effectué la transection de la moelle épinière complète et la dissection du cerveau à des points de temps choisis les cerveaux des larves peuvent être traités non seulement pour effectuer un ensemble de montage en hybridation in situ, comme indiqué ici (figure 2), mais également pour d'autres méthodes histologiques comme l'immunohistochimie ( par exemple 7 (par exemple 8) ou la détection de caspases activées à l'aide d'inhibiteurs de caspases marqué fluorochrome. 5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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