Summary
Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. Jedoch einige Rücken ragenden Neuronen sind gut Regeneratoren sind und andere nicht. Dieses Papier zeigt die Techniken für den Wohnungsbau Meerneunauge Larven (und vor kurzem umgewandelt Erwachsene), Herstellung vollständiger Rückenmarksquerschnitten erhalten und Vorbereitung wholemount Gehirn und Rückenmark für die in situ-Hybridisierung.
Abstract
Nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen, werden Meerneunaugen auf den ersten unter dem Niveau der Durchtrennung gelähmt. Bewegungs jedoch erholen sie nach mehreren Wochen, und dies wird durch kurzes Stück Regeneration (einige mm) von propriospinale Axonen und Rücken ragenden Axone aus dem Hirnstamm begleitet. Unter den 36 großen erkennbaren Rücken ragenden Neuronen, sind einige gute Regeneratoren und andere sind schlecht Regeneratoren. Diese Neuronen können am einfachsten in wholemount CNS Vorbereitungen identifiziert werden. Um die Neuron-intrinsische Mechanismen, begünstigen oder hemmen verstehen Axon Regeneration nach Verletzung im ZNS der Wirbeltiere, bestimmen wir Unterschiede in der Genexpression zwischen den guten und schlechten Regeneratoren und wie Expression durch Rückenmarksdurchtrennung beeinflusst. Dieses Papier zeigt die Techniken für die Larvengehäuse und vor kurzem umgewandelt Erwachsenen Seeneunaugen in Frischwassertanks, produziert komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten unter mikroskopischer Sicht, und die Vorbereitung brAin und Rückenmark wholemounts für in situ-Hybridisierung. Kurz gesagt, werden die Tiere bei 16 gehalten ° C und in 1% Benzocain in Neunauge Ringer betäubt. Das Rückenmark ist mit Iridektomie Schere über einen dorsalen Zugang durchtrennt und das Tier darf in Frischwassertanks bei 23 ° C erholen. Für in-situ-Hybridisierung werden die Tiere reanästhesiert und die Gehirn und Rückenmark über einen dorsalen Zugang entfernt.
Introduction
Bei Säugetieren Rückenmarksverletzungen (SCI) ist eine verheerende Erkrankung, die zu dauerhaften Verlust der Funktion unterhalb der Verletzungsstelle führt, weil verletzt Axone nicht durch das Trauma Zone zu regenerieren und wieder in die entsprechenden Ziele. Im Gegensatz zu Säugetieren, Neunaugen erholen Fortbewegung nach einer kompletten Rückenmarksverletzungen. 1 Interessanterweise Neunaugen haben einen Satz von 36 Rückenmark hervorstehenden Neuronen, die in individuell identifizierbar sind ganze Gehirn-Mount-Präparate wegen ihrer großen Größe 2,3 (Abbildung 1) . Alle diese Rücken ragenden Neuronen werden von einer hochrangigen komplette Durchtrennung des Rückenmarks axotomisierten. Frühere Studien unserer Gruppe und andere haben gezeigt, dass auch in der Gegenwart die funktionelle Erholung nach einer Rückenmarks einige dieser Neuronen zeigen eine sehr geringe Regenerationsfähigkeit (sie werden als "schlecht Regeneratoren"), während andere in der Regel regenerieren ihre Axon durch den Ort der Verletzung (sie werden als "gOOD Regeneratoren "). 2,3 Diese Eigenschaft macht Neunaugen eine interessante Wirbeltiermodell, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen guten und schlechten Regenerator Rücken ragenden Neuronen, die wiederum auf die Unterschiede in der intrinsischen Regenerationsfähigkeit von Neuronen, die versuchen Leitstudie regenerieren ihre Axone in der gleichen äußeren Umgebung. 1
Mit diesem Modell haben wir bereits gezeigt, dass Rücken ragenden Neuronen mit niedrigen Regenerationsfähigkeit zeigen Ausdruck der axonalen Führung Molekül Rezeptoren wie UNC5 4,5 und Neogenin, 6, die die hemmende Wirkung von Netrin und RGM bzw. zu vermitteln. Darüber hinaus kann durch diese Methode unserer Gruppe hat auch gezeigt, dass nur die guten Regeneratoren zeigen eine Erholung der Ausdruck von Neurofilamenten nach der Verletzung und während des Regenerationsprozesses. Kürzlich, Busch und Morgan 7 wurden durch Immunfluoreszenz gezeigt, dass die schlechten Regeneratoren zeigen eine zunehed Expression Synuclein nach der Verletzung, die von den Autoren der Tatsache, dass die "schlechte Regenerator" spinal ragenden Neuronen langsam nach einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks 5,7,8 sterben bezogen wurde. So hat sich die Neunaugen Modell eines kompletten Rückenmarksverletzung als ein sehr nützliches Modell zu verstehen, was eine Rückenmark hervorstehenden Neuron eine "schlechte Regenerator" nach Axotomie entstanden.
Unseren Untersuchungen führen wir führen eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks-Chirurgie-Protokoll und eine hintere Gehirn Dissektion bei den gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung von wholemount in-situ-Hybridisierung durchzuführen. In der vorliegenden methodischen Artikel stellen wir ein ausführliches Protokoll für die ordnungsgemäße Durchführung eines kompletten Rückenmarksverletzungen Chirurgie in Larvenneunaugen, die anschließende Pflege der Tiere und die letzte Gehirn Präparation und Vorbereitung des Gehirns für eine wholemount in-situ-Hybridisierung. Ein detailliertes Protokoll perform die Wholemount in situ-Hybridisierung im Gehirn von Larven Neunaugen wurde bereits berichtet. 9 Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Verletzung des Rückenmarks und des Gehirns Präparation auch verwendet werden, um dann verarbeitet das Gehirn für die Immunhistochemie oder anderen histologischen Methoden werden.
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Protocol
Siehe Tabelle 1 für alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien.
Die Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Temple University zugelassen.
1. Tiere
- Erhalten Wildtyp-Larven Meerneunaugen (Petromyzon marinus L.), von 10 - 14 cm in der Länge (4 - 7 Jahre alt) aus Bächen Fütterung Lake Michigan, von Nebenflüssen auf dem Delaware River (Pennsylvania) oder Streams in Maine.
- Im Labor halten Larven in Gruppen von 50 bis 100 Tiere in 50 Gallonen Frischwasserbehälter bei 16 ° C aufweist. Leitung die Tanks mit einem Zoll von Kies für die Larven zu graben, und das Wasser wird Kohle filtriert und mit Klimaanlage Steine für mindestens 48 h zu Chlor und andere Verunreinigungen vor dem Einlegen in die Neunaugen zu entfernen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Tiere, die ihre eigenen Schutt recyceln, bis zum Tag der Verwendung zuzuführen.
2. Vollständige SpinalKabel Trennung
- Vor dem Rückenmark Chirurgie bereiten ein Neunauge Ringer-Lösung mit folgender Zusammensetzung: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl 2, 1,8 mM MgCl 2 und 10 mM Tris-Puffer; pH-Wert 7,4.
- Um die Rückenmarksdurchtrennung durchführen, legen die Larven in einem kleinen Behälter mit 1% Tricaine Methansulfonat- in eiskaltem Ringer-Lösung betäubt werden.
- Sobald narkotisierten Ort die Tiere in einer Petrischale zur Hälfte mit Sylgard (Silikon) gefüllt und mit 4 Insektenstifte (0,15 mm Durchmesser), um die Tiere in der Position für die Operation zu halten (man ist an der Schnauze des Tieres am Heck platziert, eine und zwei auf der Höhe des 5. Gill). Füllen Sie die Petrischale fast bis an die Spitze mit Ringerlösung. Setzen Sie die Schale mit der Larve auf Eis, während der Durchführung der Operation unter dem Stereomikroskop.
- Auf das Rückenmark durchtrennt eine dorsale durchzuführen, Mittellinie, einen Längsschnitt mit einem Skalpell (# 11) auf der Ebene des 5.Kiemen des Rückenmarks zu visualisieren. Zunächst ist die Haut, indem Sie die Spitze des Skalpellklinge nach oben und dann das Muskelgewebe sehr schonend geschnitten, bis das Rückenmark von oben gesehen werden geöffnet. Mode zwei Haken von den Insektenstifte und nutzen sie, um zu halten die Körperwände offen, während der Durchführung der Durchtrennung des Rückenmarks.
- Komplett durchschneiden das Rückenmark auf Höhe des 5. Kiemen mit Hilfe einer Schere (Castroviejo # 8), legen Sie die Schere senkrecht zum Rückenmark. Das Rückenmark ist vollständig mit einem sauberen Schnitt durchtrennt werden. Visualisieren die Rückenmarksschnittenden unter dem Stereomikroskop, um zu bestätigen, dass das Rückenmark durchtrennt wurde komplett ist. Dann richten Sie die Schnittenden des Rückenmarks nach der Durchtrennung mit Hilfe einer Pinzette (# 5).
- Nach der Durchführung der Durchtrennung des Rückenmarks die Wunde in der dorsalen Körperwand mit einer feinen Pinzette und setzen die Larven auf Eis für 1 Stunde, um die Wunde t erlaubeno trocknen. Setzen Sie ein Stück Filterpapier zwischen dem Eis und der Larven und genießen Sie es mit Neunauge Ringer-Lösung. Die niedrige Temperatur hält die Tiere am Leben in der gleichen Zeit, die es ermöglicht, die Wunde an der Luft trocknen und damit hilft, Infektionen zu verhindern.
- Übertragen Sie anschließend die Larven zu kleinen Tanks (1 Larve pro Tank) mit eiskaltem Wasser für 24 Stunden.
- Untersuchen Sie die lädierten Larven 1 Tag nach der Durchtrennung des Rücken zu verhaltens bestätigen, dass es keine Bewegung Schwanz an den Ort der Verletzung. Eine Rückenmarksdurchtrennung gilt als abgeschlossen, wenn die Larve kann nur den Kopf rostral der Stelle der Verletzung zu bewegen (auf der Ebene des 5. Kiemen). Wenn dies der Fall ist kann nun die Larven, Panzer (1 Larve pro Tank) mit Frischwasser bei Raumtemperatur (23 übertragen werden ° C), damit sie für den gewählten Zeitpunkten zu erholen.
- Während der Erholungsphase das Wasser wechseln alle 2 bis 3 Tage.
3. Gehirn Dissection und Vorbereitung derdas Gehirn für in-situ-Hybridisierung
- Bei der gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung wieder zu betäuben die Larvenmeerneunaugen und Ort und hänge sie in der Petrischale mit Ringer-Lösung, um das Gehirn Dissektion wie oben durchzuführen.
- Um das Gehirn zu sezieren, zuerst eine Querschnitt mit dem Skalpell zwischen dem Nasenloch und der Zirbeldrüse Orgel. Von hier aus beginnen, die rund um das Gehirngewebe, indem ein Paar von Castroviejo Schere, während es mit einer Pinzette halten geschnitten.
- Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, entfernen Sie die Adergeflecht mit Hilfe einer Pinzette und verwenden Sie die Haken, um den Kopf des Tieres zu verbreiten und setzen die Hirnnerven. Dann schneiden Sie das Rückenmark quer mit den Castroviejo Schere. Halten Sie das Rückenmark mit einer Pinzette, während mit einer anderen Pinzette, um die Hirnnerven geschnitten, um das Gehirn zu sezieren.
- Nach der Sektion, legte das Gehirn auf einem kleinen Stück aus Silikon und halten sie in Position, indem Sie 2 insect Stifte im Riechkolben und 1 im Rückenmark. Dann schneiden Sie den hinteren und cerebrotectal Kommissuren des Gehirns entlang der dorsalen Mittellinie mit der Schere und lenken die Flügelplatte seitlich und stecken Sie sie flach auf den Silikon mit 4 Insektenstifte (Abbildung 2).
- Übertragen des Stücks aus Silikon mit dem Gehirn in ein Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4) bei Raum temparature 3 h auf einem Rotator befestigt werden.
- Nach der Fixierung mit dem Gehirn für Wholemount in situ Hybridisierung, wie zuvor beschrieben (Swain et al., 1994). Gehirne von Kontrolle oder scheinoperierten Tiere sollten immer parallel mit den Gehirnen von verletzten Tieren ausgeführt werden. Die wholemounted Larven Gehirn durch in situ Hybridisierung wegen seiner flachen und dünnen Form und auch wegen der Abwesenheit von Myelin 10, die das Gehirn relativ scheinend macht sucht werden.
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Representative Results
Als Beispiel für die Ergebnisse, die bei der Verwendung dieser Methode erhalten werden können, repräsentative Bilder von wholemounted Gehirn, die die Expression der Transkripte in Neogenin identifizierbaren Rückenmark-Nervenzellen des vorstehenden Steuer und 2 Wochen nach der Läsion Larvenmeerneunaugen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Leser werden auf einer früheren Studie 6 die Berichterstattung über die Beziehung zwischen der Expression von Neogenin nach einer kompletten Durchtrennung des Rückenmarks und die Regenerationsfähigkeit des Rückenmarks hervorstehenden identifizierbaren Neuronen des Meerneunauge für weitere Informationen bezeichnet. Kurz gesagt Ergebnisse haben gezeigt, dass nach der Verletzung gibt es Änderungen in der Expression des Rezeptors Neogenin identifizierbaren Rücken ragenden Neuronen. Zwei Wochen nach einer kompletten Durchtrennung des Rückenmarks die Neogenin-Rezeptor wird bevorzugt in schlecht Regeneratoren ausgedrückt, wie die M1, I1, I2, I4, oder M-ten Neuronen (siehe Abbildung 2B) Diese Ergebnisse zeigen die Ergebnissedes Protokolls und schlagen vor, dass die Neogenin-Rezeptor könnte der Ausfall der Regeneration dieser Zellen beteiligt sein.
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer Rückenansicht des Meerneunauge Gehirn zeigt den Standort der identifizierbaren retikulospinale Neuronen. Von Barreiro-Iglesias und Shifman. 5 wiedergegeben Für Abkürzungen siehe Liste unten.
Abbildung 2. Mikroaufnahmen von Rückenansichten der reifen Larven Meerneunauge Gehirn, die die Expression des Transkripts in Neogenin Kontrolle (A) und 2 Wochen nach der Verletzung (B) Tieren. Hinweis in B, dass nach der Verletzung die neogenin Transkript bevorzugt in Nervenzellen bekannt, schlecht sein Regeneratoren ausgedrückt (zB M1, I1, I2, I4 und Mon Neuronen). Beachten Sie auch, das Vorhandensein der Löcher durch die verwendet werden, um die Gehirn (Pfeile) halten Stifte links. Die Leser werden an die früheren Studie von Shifman und Mitarbeiter. 6 Für Abkürzungen bezeichnet, siehe Liste unten.
Abkürzungen
| B (B1-B6) | Müller Zellen des bulbären Bereich (Mitte rhombencephalic Nucleus reticularis) |
| hab.-ped. tr. | habenulopeduncular-Darm-Trakt |
| I1-I6 | Müllerzellen der sich verengenden Region |
| IchX | glossopharyngeus motorischen Kern |
| inf. | Infundibulum |
| ISTH. retic. | isthmisch Retikularformation |
| M1-M4 | Müller-Zellen 1 bis 4 |
| Mth | Mauthner-Zelle |
| mth ' | Hilfs Mauthner-Zelle |
| smi | Sulcus medianus inferior |
| Vm | Trigeminus-motorischen Kern |
| X | vagalen motorischen Kern |
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Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll, um eine komplette Durchtrennung des Rückenmarks und hinteren Hirn Dissektion in Larvenmeerneunaugen durchzuführen. Dieses Verfahren ermöglicht die Analyse Unterschiede in der Genexpression zwischen den identifizierbaren Rückenmark vorst Neuronen nach einer Rückenmarksverletzung durch eine ganze Montage Gehirn in situ Hybridisierung. Der kritische Schritt in dem Verfahren ist die korrekte Ausführung einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, die durch die Beobachtung der Schnittenden des Rückenmarks unter stereomicrocope 24 h später durch leichtes Berühren der Schnauze der Larven mit einem Paar von gesteuerten und bestätigt werden kann, Zange zu sehen, ob es keine Bewegung kaudal der Stelle der Verletzung. Es ist auch wichtig für die Wiederherstellung des Tieres, dass die für die Operation verwendet Scheren sind nicht stumpf und dass eine einzige und sauberer Schnitt wird getan, um völlig durchschneiden das Rückenmark.
Das Überleben der Tiere nach der Verletzung ist sehr zu, indem sie die anim verbessertALS auf Eis während der Operation und während der verwendet wird, um die Wunde an der Luft trocknen und dann in eiskaltem Wasser für die ersten 24 Stunden ermöglichen Stunde. Nach dieser Zeit wird die Wunde verschlossen und die Tiere bereits auf Tanks mit Frischwasser bei Raumtemperatur übertragen werden.
Larvenneunaugen sind bei Raumtemperatur und nicht an ihrem üblichen kalten Temperaturen, da eine größere Mehrheit der Tiere erholen volle Bewegungsverhaltens Funktion nach der Verletzung bei höheren Temperaturen zu erholen. 11. Die Wiederherstellung eines normalen Muster der Fortbewegung wird beobachtet, 8 bis 10 Wochen nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks.
Nach der Durchführung der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks und des Gehirns Dissektion bei den gewählten Zeitpunkten die Larven Gehirn kann nicht nur verarbeitet werden, um eine durchführen ganze-mount in situ Hybridisierung, wie hier dargestellt (Abbildung 2), sondern auch für andere histologische Methoden wie Immunhistochemie ( zB 7 (beispielsweise 8) oder der Nachweis von aktivierten Caspasen durch Verwendung Fluorochrom markierten Caspase-Inhibitoren. 5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
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- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
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