Summary
Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.
Abstract
לאחר פגיעה בחוט השדרה שלמה, lampreys הים בראשון משותק מתחת לרמה של חיתוך רוחב. עם זאת, הם להתאושש תנועה לאחר מספר שבועות, וזה מלווה בהתחדשות מרחק קצר (כמה מ"מ) של האקסונים propriospinal ואקסונים מקרינים שדרה מגזע המוח. בין 36 הנוירונים מקרין שדרת זיהוי גדול, חלקם regenerators טוב ואחרים הם regenerators רע. יכולים בקלות להיות מזוהים ביותר נוירונים אלה בהכנות למערכת עצבים המרכזיות wholemount. על מנת להבין את מנגנוני נוירון הפנימי שמעדיפים או לעכב התחדשות האקסון לאחר פציעה בחוליות במערכת העצבים המרכזית, אנו קובעים הבדלים בביטוי הגנים בין regenerators הטוב ורע, וכיצד ביטוי מושפע מחיתוך רוחב חוט השדרה. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחל דיור וlampreys ים הבוגר הפך לאחרונה במיכלי מים טרי, הפקת transections חוט השדרה שלמה תחת חזון מיקרוסקופי, והכנת brעין וwholemounts חוט השדרה לכלאה באתר. בקצרה, מוחזקי בעלים חיים ביום 16 ב ° C ומורדם ב1% benzocaine ברינגר צמד ים. חוט השדרה הוא transected עם המספריים iridectomy באמצעות גישת גב ובעלי החיים מותר להתאושש במיכלי מים טרי ב23 ° C. לכלאה באתר, בעלי החיים reanesthetized והמוח וחוט שהוסרו באמצעות גישת גב.
Introduction
ביונקי פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שמוביל לאובדן קבוע של תפקוד מתחת לאתר של פציעה כי האקסונים נפצעו לא להתחדש דרך אזור הטראומה ולהתחבר מחדש למטרות המתאימות. בניגוד ליונקים, lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. 1 מעניין, יש לי lampreys סט של 36 חוט השדרה מקרין נוירונים כי הם אישי מזהים בכל הר הכנות מוח בגללם גודל גדול 2,3 (איור 1) . כל הנוירונים מקרין שדרה אלה axotomized על ידי חיתוך רוחב חוט השדרה מלא ברמה גבוהה. המחקרים קודמים של הקבוצה ואחרים שלנו הראו כי אפילו בנוכחות של החלמה תפקודית לאחר SCI חלק מהנוירונים האלה להראות יכולת התחדשות נמוכה מאוד (הם נחשבים "regenerators הרע"), בעוד שאחרים בדרך כלל להתחדש האקסון שלהם דרך האתר של פציעה (הם נחשבים גרם "regenerators ood "). 2,3 מאפיין זה הופך את lampreys מודל חוליות מעניין ללמוד את ההבדלים בביטוי הגנים בין תאי עצב מקרין שדרת regenerator הטוב והרע, כי בתורו יובילו להבדלים ביכולת ההתחדשות הפנימית של תאי עצב המנסה להתחדש האקסונים שלהם באותה הסביבה חיצונית. 1
שימוש במודל זה יש לנו הראה בעבר כי תאי עצב עם ביטוי מופע יכולת משובי נמוך של קולטני מולקולת הדרכת axonal כמו UNC5 4,5 וneogenin, 6 אשר מתווכים את הפעולה המעכבת של netrin וRGM בהתאמה מקרינה שדרה. בנוסף, על ידי שימוש בשיטה זו הקבוצה שלנו הראתה גם כי רק regenerators הטוב להראות התאוששות של הביטוי של neurofilaments לאחר הפציעה ובמהלך תהליך ההתחדשות. לאחרונה, בוש ו7 מורגן הראו על ידי immunofluorescence שregenerators הרע להראות increasביטוי עורך של סינוקלאין לאחר פציעה, שספר על ידי המחברים לעובדה שתאי העצב מקרין השדרה "regenerator הרע" למות לאט לאחר 5,7,8 חיתוך רוחב חוט השדרה מלא. אז, מודל צמד ים של פגיעה בחוט השדרה שלמה התפתח כמודל שימושי מאוד להבין מה גורם נוירון כבל מקרין השדרה "regenerator רע" לאחר axotomy.
לבצע המחקרים שלנו אנו מבצעים פרוטוקול מלא בעמוד השדרה חיתוך רוחב כבל ניתוח ונתיחת מוח אחורי בנקודות הזמן הרצויות לאחר פציעה לבצע wholemount הכלאה באתר. במאמר המתודולוגי הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע התקין של ניתוח פגיעה בחוט השדרה מלא בlampreys הזחל, התחזוקה הבאה של בעלי החיים ונתיחה הסופית המוח והכנת המוח לwholemount הכלאה באתר. פרוטוקול מפורט לperform wholemount הכלאה באתר במוח של lampreys זחל כבר דווח בעבר. 9 בנוסף, פרוטוקול זה לפגיעה בחוט השדרה ומוח לנתיחה יכול לשמש גם לאחר מכן לעבד את המוח לאימונוהיסטוכימיה או שיטות היסטולוגית אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ראה לוח 1 לכל חומרים המשמשים בפרוטוקול זה.
ניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טמפל.
.1 בעלי חיים
- להשיג lampreys ים זחל wildtype (Petromyzon מרינוס ל '), 10 - 14 סנטימטר באורך (4 - 7 שנים) מזרמי האכלת האגם מישיגן, מיובליו לנהר דלאוור (פנסילבניה) או הזרמים במיין.
- במעבדה, לשמור על זחלים בקבוצות של 50 - 100 בעלי חיים בטנקי מים מתוקים 50 ליטר ביום 16 במעלות צלזיוס. קו טנקים עם סנטימטר של חצץ לזחלים להתחפר ב, והמים מסונן בפחם וממוזג עם אבני אוויר לפחות 48 שעות כדי להסיר כלור וזיהומים אחרים לפני הצבת lampreys בהם. אין צורך להאכיל את בעלי החיים, שממחזרים שאריות שלהם, עד ליום של שימוש.
.2 בעמוד השדרה מלאהחיתוך רוחב כבל
- לפני הניתוח בעמוד השדרה להכין פתרון רינגר צמד ים עם ההרכב הבא: 110 mM NaCl, 2.1 מ"מ KCl, 2.6 מ"מ CaCl 2, 1.8 מ"מ MgCl 2 ו10 חיץ מ"מ טריס; pH 7.4.
- כדי לבצע חיתוך רוחב חוט השדרה, למקם את הזחלים במכל קטן שהרדים עם 1% methanesulfonate tricaine בפתרון רינגר הקר כקרח.
- ברגע שהמקום בהרדמה בעלי החיים בצלחת פטרי המלא למחצה בSylgard (סיליקון) ולהשתמש 4 סיכות חרקים (בקוטר מ"מ 0.15) כדי להחזיק את בעלי החיים בעמדה לניתוח (אחד ממוקם בחוטם של החיה, אחד בזנב ושתיים ברמה של הזימים 5 th). מלא את צלחת פטרי כמעט עד לקצה עם פתרון Ringer. שים את הצלחת עם הזחל על קרח בעת ביצוע הניתוחים במסגרת סטראו.
- כדי לבצע חיתוך רוחב חוט השדרה הגבי, קו האמצע, לעשות חתך אורכי עם אזמל (# 11) ברמה של ה 5זימים לדמיין את חוט השדרה. בתחילה העור פתוח על ידי החדרת הקצה של להב סכין המנתחים פונה כלפי מעלה ולאחר מכן רקמת השריר היא לחתוך בעדינות רבה עד חוט השדרה ניתן לראות מלמעלה. אופנה שני ווים מסיכות חרקים ולהשתמש בם כדי להחזיק את גוף הקירות פתוחים בעת ביצוע חיתוך רוחב חוט השדרה.
- לגמרי תחצה את חוט השדרה ברמה של הזימים 5 th באמצעות זוג מספריים (# 8 Castroviejo), להכניס את המספריים בניצב לחוט השדרה. חוט השדרה יש transected לחלוטין עם חתך אחד נקי. דמיינו את הקצוות לחתוך חוט השדרה מתחת לסטראו כדי לאשר שבחוט השדרה נחתך לחלוטין. לאחר מכן, ליישר מחדש את קצות החתך של חוט השדרה לאחר חיתוך רוחב באמצעות זוג המלקחיים (מס '5).
- לאחר ביצוע חיתוך רוחב חוט השדרה לסגור את הפצע בקיר גוף גב עם זוג מלקחיים בסדר ולשים את הזחלים על קרח עבור שעה 1 כדי לאפשר t הפצעo להתייבש. שים פיסת נייר סינון בין הקרח והזחלים ולספוג את זה עם פתרון Ringer צמד ים. הטמפרטורה הנמוכה שומרת על בעלי החיים בחיים באותו הזמן שהיא מאפשרת את הפצע לאוויר יבש ולכן עוזר למנוע זיהומים.
- לאחר מכן להעביר את הזחלים לטנקים קטנים (זחל 1 לכל טנק) במים קרים כקרח ל24 שעות.
- בדוק את יום זחלי 1 הפצוע לאחר חיתוך רוחב השדרה כדי לאשר התנהגותית שאין זנב תנועה לאתר של פציעה. חיתוך רוחב חוט השדרה נחשב שלם אם הזחל יכול להזיז רק את ראשו מקורי לאתר של פציעה (ברמה של הזימים 5 th). אם זה המקרה הזחלים יכולים כעת יועברו לטנקים (זחל 1 לכל טנק) עם מים מתוקים בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס) כדי לאפשר להם להתאושש במשך נקודות הזמן שנבחרו.
- במהלך תקופת ההחלמה להחליף את המים כל 2 עד 3 ימים.
.3 המוח Dissection והכנתהמוח לכלאה באתר
- בנקודות הזמן הרצויות לאחר הפציעה מחדש להרדים lampreys ים הזחל והמקום ולהצמיד אותם בצלחת פטרי עם פתרון Ringer לבצע נתיחת המוח כאמור לעיל.
- לנתח את המוח, להפוך ראשון חתך רוחבי עם האזמל בין הנחיר ואיבר האצטרובל. מכאן יתחיל לחתוך את הרקמה המקיפה את המוח על ידי שימוש בזוג מספריים Castroviejo בעוד מחזיק אותו עם זוג המלקחיים.
- ברגע שהמוח חשוף, להסיר את מקלעת דמית העין באמצעות זוג המלקחיים ולהשתמש בקרסים כדי להפיץ את ראשו של בעל החיים ולחשוף את עצבי הגולגולת. לאחר מכן, חותך את transversally חוט השדרה עם המספריים Castroviejo. החזק את חוט השדרה עם זוג המלקחיים תוך שימוש בזוג נוסף של מלקחיים לחתוך את עצבי הגולגולת לנתח את המוח.
- לאחר נתיחה, לשים את המוח על חתיכה קטנה של סיליקון ולהחזיק אותו בעמדה על ידי הוספת 2 תוספותect סיכות בנורות חוש הריח ו1 בחוט השדרה. לאחר מכן, לחתוך האחורי וcommissures cerebrotectal של המוח לאורך קו האמצע הגב עם המספריים ולהסיט את צלחות עלאר רוחבית ולהצמיד אותם שטוח לסיליקון עם 4 סיכות חרקים (איור 2).
- העבר את פיסת סיליקון עם המוח לצינור המכיל 4 paraformaldehyde% בנאגרו מלוח פוספט (pH 7.4) להיות קבועים בtemparature החדר למשך 3 שעות על הכתף.
- לאחר קיבוע להשתמש במוח לwholemount הכלאה באתר כפי שתואר לעיל (סוויין et al., 1994). מוחות מבעלי החיים שליטה או אחיזת עיניים פעלו יש תמיד לרוץ במקביל למוח מבעלי חיים שנפגעו. מוח זחל wholemounted ניתן ללמוד על ידי הכלאה באתר בגלל הצורה שטוחה ודקה שלה וגם בשל היעדר המיאלין 10, מה שהופך את המוח די שקוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמא לתוצאות שניתן להשיג בעת השימוש בשיטה זו, תמונות מייצגות של מוח wholemounted מראים את הביטוי של תעתיקי neogenin בתאי עצב הניתן לזיהוי בעמוד השדרה מקרין-כבל שליטה ו2 שבועות לפרסם lampreys ים זחל נגע מוצגים באיור 2. הקוראים מופנים למחקר קודם 6 דיווח הקשר בין הביטוי של neogenin לאחר חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה ואת יכולת ההתחדשות של חוט השדרה לזיהוי מקרינה הנוירונים של צמד ים הים לקבלת פרטים מלאים. בקצרה, תוצאות הראו כי לאחר הפציעה יש שינויים בביטוי של הקולטן neogenin בתאי עצב מקרין שדרה לזיהוי. שבועיים לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה מלא קולט neogenin באו לידי ביטוי באופן מועדף בregenerators הרע, כמו M1, I1, I2, I4, או נוירונים Mth (ראה איור 2) תוצאות אלו מראות את התוצאהשל הפרוטוקול ומצביע על כך שהקולטן neogenin יכול להיות מעורב בכישלון של ההתחדשות של תאים אלה.
איור 1: ציור סכמטי של נוף הגבי של מוח צמד ים ים המראה את מיקומם של הנוירונים reticulospinal לזיהוי. לשכפל מBarreiro-איגלסיאס ושיפמן. 5 לקיצורים, ראה רשימה בהמשך.
איור 2 Photomicrographs דעות הגבי של מוח צמד ים ים הזחל הבוגר מראים את הביטוי של תעתיק neogenin בשליטה (א) ו 2 שבועות לאחר פציעת בעלי חיים (ב '). שים לב בB שלאחר פציעת nתמליל eogenin בא לידי הביטוי באופן מועדף בתאי העצב הידועים להיות regenerators הרע (למשל, M1, I1, I2, I4 ונוירונים Mth). כמו כן, שים לב לנוכחותם של החורים שהותירו הסיכות משמשות להחזיק את המוח (חיצים). הקוראים מופנים למחקר הקודם על ידי שיפמן ועמיתים לעבודה. 6 לקיצורים, ראו רשימה בהמשך.
קיצורים
| B (B1-B6) | תאי מולר מהאזור של המוח המאורך (גרעין רשתי rhombencephalic באמצע) |
| hab.-ped. TR. | מערכת habenulopeduncular |
| I1-I6 | תאי מולר מאזור isthmic |
| אניX | גרעין מוטורי של לשון או לוע |
| inf. | אינפונדיבולה |
| isth. retic. | מבנה הרשתי isthmic |
| M1-M4 | תאי מולר 1 עד 4 |
| Mth | תא מאוטנר |
| mth ' | תא מאוטנר עזר |
| smi | medianus מענית נחותה |
| Vm | גרעין מוטורי trigeminal |
| X | גרעין מוטורי מחנק |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה ומוח אחורי לנתיחה בlampreys ים זחל. הליך זה מאפשר הבדלי ניתוח בביטוי גנים בין חוט השדרה לזיהוי תאי עצב מקרינים לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות מוח כל ההר בכלאה באתר. השלב הקריטי בהליך הוא הביצוע הנכון של חיתוך רוחב חוט השדרה שלם, אשר יכול להיות נשלט על ידי התבוננות קצות החתך של חוט השדרה מתחת לstereomicrocope ואישר 24 שעות מאוחר יותר על ידי בעדינות נוגע בחוטמו של הזחל עם זוג מלקחיים כדי לראות אם אין זנב תנועה לאתר של פציעה. כמו כן, חשוב להתאוששות של בעלי החיים שהמספריים המשמשים לניתוח הם לא בוטים ושחתך אחד ונקי נעשה ויחצה את חוט השדרה לחלוטין.
ההישרדות של בעלי החיים לאחר הפציעה הוא השתפרה מאוד על ידי שמירה על עניםals על קרח במהלך הניתוח ובמהלך השעה משמשת כדי לאפשר את הפצע לאוויר יבש ולאחר מכן במים קרים כקרח לשעה 24 הראשונה. לאחר תקופה זו הוא הפצע סגור ויכולים להיות כבר העביר את בעלי החיים לטנקים עם מים מתוקים בטמפרטורת חדר.
lampreys הזחל מותר להתאושש בטמפרטורת חדר ולא בטמפרטורה הקרה הרגילה שלהם, כי רוב גדול יותר של בעלי החיים לשחזר תפקוד ההתנהגותי של תנועה מלאה לאחר הפציעה בטמפרטורות גבוהות יותר. 11 ההתאוששות של דפוס נורמלי של תנועה הוא ציין 8 עד 10 שבועות לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה המלא.
לאחר ביצוע חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה והמוח לנתיחה בנקודות הזמן שנבחרו יכול להיות מעובד במוחם הזחל לא רק לבצע כל הר בכלאה באתר כפי שמוצג כאן (איור 2), אלא גם לשיטות היסטולוגית אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה ( למשל 7 (למשל 8) או זיהוי של caspases מופעל באמצעות מעכבי caspase fluorochrome שכותרת. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
