Summary
Lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. Tuttavia, alcuni neuroni spinali-proiezione sono buoni recuperatori e altri non lo sono. Questo documento illustra le tecniche per la lampreda di mare abitazioni larve (e adulti recentemente trasformati), producendo completi transezioni midollo spinale e la preparazione di cervelli wholemount e midolli spinali per l'ibridazione in situ.
Abstract
Dopo una lesione completa del midollo spinale, lamprede di mare in un primo momento sono paralizzate sotto il livello di resezione. Tuttavia, essi recuperano locomozione dopo diverse settimane, e questo è accompagnato da rigenerazione breve distanza (pochi mm) degli assoni propriospinali e degli assoni spinali-proiezione dal tronco encefalico. Tra i 36 grandi neuroni spinali-proiezione identificabili, alcuni sono buoni recuperatori e gli altri sono cattivi rigeneratori. Questi neuroni possono essere più facilmente identificate nelle preparazioni SNC wholemount. Al fine di comprendere i meccanismi dei neuroni-intrinseca che favoriscono o inibiscono la rigenerazione degli assoni dopo una lesione nei vertebrati del SNC, si determina differenze di espressione genica tra i rigeneratori buoni e cattivi, e come l'espressione è influenzata dalla resezione del midollo spinale. Questo documento illustra le tecniche per l'edilizia abitativa larvale e recentemente trasformato lamprede di mare per adulti in serbatoi d'acqua dolce, producendo completi transezioni midollo spinale sotto visione microscopica, e preparare brain e wholemounts midollo spinale per ibridazione in situ. In breve, gli animali sono mantenuti a 16 ° C e anestetizzato in 1% benzocaina in lampreda Ringer. Il midollo spinale è sezionato con iridectomia forbici attraverso un approccio dorsale e l'animale è permesso di recuperare in serbatoi d'acqua dolce a 23 ° C. Per ibridazione in situ, gli animali sono reanesthetized e il cervello e il cavo rimosso tramite un approccio dorsale.
Introduction
Nei mammiferi lesioni del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che porta alla perdita permanente della funzione al di sotto del sito di lesione, perché assoni feriti non si rigenerano attraverso la zona di trauma e ricollegare ai loro obiettivi adeguati. A differenza dei mammiferi, lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. 1 È interessante notare che, lamprede hanno una serie di 36 midollo spinale proiettando neuroni che sono singolarmente identificabili in tutto il montaggio preparati cervello a causa delle loro grandi dimensioni 2,3 (Figura 1) . Tutti questi neuroni spinali-proiezione sono axotomized da un alto livello completa resezione del midollo spinale. Precedenti studi del nostro gruppo e altri hanno dimostrato che anche in presenza di recupero funzionale dopo SCI alcuni di questi neuroni mostrano una bassissima capacità rigenerativa (sono considerati "cattivi rigeneratori"), mentre altri di solito si rigenerano il loro assone attraverso il sito di lesione (sono considerati "grigeneratori OOD "). 2,3 Questa caratteristica rende lamprede un modello vertebrato interessante studiare le differenze nell'espressione genica tra il bene e il male rigeneratori neuroni spinali-proiezione, che a sua volta porterà alle differenze nella capacità rigenerativa intrinseca dei neuroni che cercano di rigenerare i loro assoni nello stesso ambiente estrinseca. 1
Usando questo modello che abbiamo precedentemente dimostrato che il midollo-proiezione neuroni con scarsa capacità rigenerativa spettacolo espressione di recettori guida assonale molecola come UNC5 4,5 e neogenin, 6 che mediano rispettivamente, l'azione inibitoria di netrina e RGM. Inoltre, con questo metodo il nostro gruppo ha anche dimostrato che solo le buone rigeneratori mostrano un recupero dell'espressione di neurofilamenti dopo la lesione e durante il processo di rigenerazione. Recentemente, Busch e Morgan 7 hanno dimostrato mediante immunofluorescenza che i cattivi rigeneratori mostrano un Incremed espressione di sinucleina dopo l'infortunio, che è stato riferito da autori al fatto che i "cattivi" rigeneratori neuroni spinali-proiezione lentamente muoiono dopo una completa del midollo spinale recisione 5,7,8. Così, il modello lampreda di una lesione completa del midollo spinale è emerso come un modello molto utile per capire che cosa rende un cordone sporgente neurone spinale un "cattivo rigeneratore" dopo assotomia.
Per condurre i nostri studi si sta eseguendo un protocollo di intervento chirurgico completo midollo spinale resezione e una dissezione del cervello posteriore in corrispondenza dei punti di tempo desiderato dopo l'infortunio di eseguire wholemount ibridazione in situ. Nell'articolo metodologica presente vi presentiamo un protocollo dettagliato per la corretta esecuzione di un intervento chirurgico completo lesioni del midollo spinale in lamprede larvale, la successiva manutenzione degli animali e la dissezione del cervello finale e preparazione del cervello per un wholemount ibridazione in situ. Un protocollo dettagliato per perform il wholemount ibridazione in situ nel cervello di lamprede larvale è stato riportato in precedenza. 9 Inoltre, questo protocollo per le lesioni del midollo spinale e la dissezione del cervello può essere utilizzato anche per poi elaborare i cervelli per immunoistochimica o altri metodi istologici.
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Protocol
Vedere la Tabella 1 per tutti i materiali usati in questo protocollo.
Gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale alla Temple University.
1. Gli animali
- Ottenere tipo selvatico lamprede di mare larvali (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm di lunghezza (4-7 anni) da ruscelli che alimentano il lago Michigan, da affluenti del fiume Delaware (Pennsylvania) o corsi d'acqua nel Maine.
- In laboratorio, mantenere le larve in gruppi di 50 - 100 animali in vasche d'acqua dolce 50 litri a 16 ° C. Linea i serbatoi con un centimetro di ghiaia per le larve di tana in, e l'acqua viene filtrata carbone e condizionato con pietre d'aria per almeno 48 ore per rimuovere il cloro e altre impurità prima di mettere le lamprede in loro. Non vi è alcuna necessità di alimentare gli animali, che riciclano loro detriti, fino al giorno di utilizzo.
2 Complete SpinalCord Transection
- Prima della chirurgia spinale preparare una soluzione di Ringer lamprey con la seguente composizione: 110 mM NaCl, 2.1 mM KCl, 2.6 mM CaCl 2, 1.8 mM MgCl 2 e 10 mM tampone Tris; pH 7,4.
- Per eseguire la resezione del midollo spinale, posizionare le larve in un piccolo contenitore per essere anestetizzati con 1% tricaine methanesulfonate in soluzione di Ringer ghiacciata.
- Una volta posto anestetizzato gli animali in una capsula di Petri mezzo pieno di Sylgard (silicone) e utilizzano 4 perni di insetti (0,15 millimetri di diametro) per tenere gli animali in posizione per l'intervento chirurgico (uno è posto al muso dell'animale, uno alla coda e due al livello del 5 ° branchie). Riempire la capsula di Petri quasi fino alla cima con soluzione di Ringer. Mettere il piatto con la larva sul ghiaccio durante l'esecuzione dell'intervento con lo stereomicroscopio.
- Per eseguire la recisione del midollo spinale dorsale, mediana, fare una incisione longitudinale con un bisturi (# 11) al livello del 5 °branchia per visualizzare il midollo spinale. Inizialmente la pelle è aperta inserendo la punta della lama bisturi rivolto verso l'alto e quindi il tessuto muscolare viene intercettato molto delicatamente fino al midollo spinale può essere visto da sopra. Moda due ganci dei perni di insetti e li usa per tenere le pareti del corpo aperte durante l'esecuzione della resezione del midollo spinale.
- Completamente transezione del midollo spinale a livello del 5 ° gill utilizzando un paio di forbici (Castroviejo # 8), inserire le forbici perpendicolarmente al midollo spinale. Il midollo spinale deve essere completamente sezionato con un taglio netto. Visualizza il midollo spinale estremità tagliate con lo stereomicroscopio per confermare che il midollo spinale è stata completamente sezionato. Poi, riallineare le estremità tagliate del midollo spinale dopo la resezione utilizzando un paio di pinze (# 5).
- Dopo aver eseguito la resezione del midollo spinale chiudere la ferita nella parete dorsale del corpo con un paio di pinze sottili e mettere le larve in ghiaccio per 1 ora per permettere alla ferita to asciugare. Mettete un pezzo di carta da filtro tra i ghiacci e le larve e immergerlo con soluzione di Ringer lampreda. La bassa temperatura mantiene gli animali vivi allo stesso tempo che permette la ferita di aria secca e quindi contribuire a prevenire le infezioni.
- Poi il trasferimento le larve di piccoli serbatoi (1 larva per ogni serbatoio) con ghiaccio acqua fredda per 24 ore.
- Esaminare il leso larve 1 giorno dopo la sezione spinale per confermare comportamentale che non c'è movimento caudale al sito di lesione. Una recisione del midollo spinale è considerato completo se la larva può muovere solo la testa rostrale al sito di lesione (al livello del 5 ° branchia). Se questo è il caso, le larve possono ora essere trasferito ai serbatoi (1 larva per serbatoio) con acqua dolce a temperatura ambiente (23 ° C) per consentire loro di recuperare i punti di tempo scelto.
- Durante il periodo di recupero cambiare l'acqua ogni 2 o 3 giorni.
3 Cervello dissezione e preparazione diil cervello di ibridazione in situ
- Ai punti di tempo desiderato dopo l'infortunio ri-anestetizzare le lamprede di mare larvali e luogo e li pin nella capsula di Petri con una soluzione di Ringer per eseguire la dissezione del cervello come sopra.
- Per sezionare il cervello, in primo luogo fare una incisione trasversale con il bisturi tra la narice e l'organo pineale. Da qui iniziano a tagliare il tessuto circostante il cervello utilizzando un paio di forbici Castroviejo tenendolo con un paio di pinze.
- Una volta che il cervello è esposto, rimuovere il plesso coroideo, utilizzando un paio di pinze e usare i ganci per diffondere la testa dell'animale ed esporre i nervi cranici. Quindi, tagliare trasversalmente il midollo spinale con le forbici Castroviejo. Tenere il midollo spinale con un paio di pinze durante l'utilizzo di un altro paio di pinze per tagliare i nervi cranici per sezionare il cervello fuori.
- Dopo la dissezione, mettere il cervello su un piccolo pezzo di silicone e tenerlo in posizione inserendo 2 insect perni in bulbi olfattivi e 1 nel midollo spinale. Quindi, tagliare il posteriore e commissure cerebrotectal del cervello lungo la linea mediana dorsale con le forbici e deviare le piastre alare lateralmente e pin li piatta al silicone con 4 pin di insetti (Figura 2).
- Trasferire il pezzo di silicone con il cervello di un tubo contenente paraformaldeide al 4% in tampone fosfato (pH 7.4) viene fissato camera temparature per 3 ore su un rotatore.
- Dopo la fissazione utilizzare il cervello per wholemount ibridazione in situ come descritto precedentemente (Swain et al., 1994). Brains di controllo o sham operati animali devono essere eseguiti sempre in parallelo con i cervelli di animali feriti. Il cervello larvale wholemounted può essere studiato mediante ibridazione in situ per la sua forma piatta e sottile e anche per l'assenza di mielina 10, che rende il cervello piuttosto traslucido.
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Representative Results
Come esempio dei risultati che si possono ottenere quando si utilizza questo metodo, le immagini rappresentative del cervello wholemounted che mostrano l'espressione dei trascritti neogenin in neuroni spinali identificabili spinale proiezione di controllo e 2 settimane dopo lesione larvali lamprede di mare sono mostrati nella Figura 2. I lettori si riferiscono a un precedente studio 6 segnalato il rapporto tra l'espressione di neogenin dopo una resezione completa del midollo spinale e la capacità rigenerativa del midollo spinale identificabile proiettando neuroni della lampreda di mare per tutti i dettagli. In breve, i risultati hanno dimostrato che dopo l'infortunio ci sono cambiamenti nell'espressione del recettore neogenin identificabili in neuroni spinali-proiezione. Due settimane dopo una resezione completa del midollo spinale il recettore neogenin è preferenzialmente espresso in cattive rigeneratori, come la M1, I1, I2, I4, o neuroni Mth (vedi Figura 2B) Questi risultati dimostrano l'esitodel protocollo e suggeriscono che il recettore neogenin potrebbe essere coinvolto nel fallimento della rigenerazione di queste cellule.
Figura 1: Schema di una vista dorsale del cervello lampreda di mare mostra la località dei neuroni reticulospinal identificabili. Tratto da Barreiro-Iglesias e Shifman. 5 Per le abbreviazioni, vedi elenco qui sotto.
Figura 2 Microfotografie di vedute dorsali del cervello maturo larvale lampreda di mare che mostrano l'espressione del trascritto neogenin di controllo (A) e 2 settimane dopo l'infortunio (b) animali. Si noti in B che dopo l'infortunio del neogenin trascrizione è preferenzialmente espresso nei neuroni notoriamente rigeneratori cattive (ad esempio, M1, I1, I2, I4 e neuroni mth). Inoltre, nota la presenza dei fori lasciati dai perni utilizzati per contenere il cervello (frecce). I lettori sono riferiti al precedente studio da Shifman e collaboratori. 6 Per le abbreviazioni, vedi elenco qui sotto.
ABBREVIAZIONI
| B (B1-B6) | Cellule Müller della regione bulbare (mezzo rhombencephalic reticolare nucleo) |
| hab.-ped. tr. | tratto habenulopeduncular |
| I1-I6 | Cellule Müller della regione istmica |
| IoX | glossofaringeo nucleo motore |
| inf. | infundibulum |
| ISTH. Retic. | formazione reticolare istmica |
| M1-M4 | Cellule Müller da 1 a 4 |
| Mth | Cellula di Mauthner |
| mese ' | cellula di Mauthner ausiliario |
| smi | medianus solco inferiore |
| Vm | trigemino nucleo motore |
| X | vagale nucleo motore |
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Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire una resezione completa del midollo spinale e posteriore dissezione del cervello in lamprede di mare larvali. Questa procedura permette di analizzare le differenze nell'espressione genica tra identificabile midollo spinale sporgenti neuroni dopo la lesione del midollo spinale per mezzo di un cervello intero-mount ibridazione in situ. Il passaggio fondamentale nella procedura è la corretta esecuzione di una resezione completa del midollo spinale, che può essere controllato osservando le estremità tagliate del midollo spinale sotto la stereomicrocope e confermato 24 ore più tardi toccando delicatamente il muso della larva con un paio di pinze per vedere se non c'è movimento caudale al sito di lesione. E 'anche importante per il recupero dell'animale che le forbici utilizzate per la chirurgia non sono affilate e che una singola e pulito taglio viene fatto per la transezione completamente il midollo spinale.
La sopravvivenza degli animali dopo la lesione è molto migliorata mantenendo il Animals su ghiaccio durante l'intervento chirurgico e durante l'ora utilizzato per consentire alla ferita di aria secca e poi in acqua ghiacciata per la prima 24 ore. Dopo questo periodo la ferita è chiusa e gli animali possono già essere trasferito in serbatoi con acqua dolce a temperatura ambiente.
Lamprede larvali possono recuperare a temperatura ambiente e non a loro abituale freddo perché una grande maggioranza degli animali recuperare funzione comportamentale pieno locomotoria dopo la lesione a temperature più elevate. 11 Il recupero di un normale pattern di locomozione si osserva 8 a 10 settimane dopo la completa resezione del midollo spinale.
Dopo aver eseguito la resezione completa del midollo spinale e la dissezione del cervello nei punti di tempo scelto i cervelli larvali possono essere trattati non solo per eseguire un intero montaggio ibridazione in situ, come mostrato qui (Figura 2), ma anche per altri metodi istologici come la immunoistochimica ( ad esempio 7 (ad esempio 8) o il rilevamento di caspasi attivate utilizzando fluorocromi etichettato inibitori della caspasi. 5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
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