Summary
ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。
Abstract
完全な脊髄損傷後、最初は海のヤツメウナギは離断のレベル以下に麻痺している。しかし、これらは数週間後に歩行をリカバリし、これを脊髄固有の軸索および脳幹から脊髄に突出する軸索の短い距離再生（数mm）を伴う。 36大の識別可能脊髄投射ニューロンの中には、優れた再生器であり、他は悪い再生器である。これらのニューロンは、最も容易にホールマウントCNS調製物中で同定することができる。有利ニューロン固有のメカニズムを理解または脊椎動物CNSにおける損傷後の軸索再生を阻害するためには、良い、悪い再生器との間の遺伝子発現の相違を決定する方法、および発現は、脊髄切断によって影響される。本稿では、顕微鏡のビジョンの下で、完全な脊髄離断を生産、住宅幼虫のための技術と新鮮な水タンク内の最近変換された大人の海のヤツメウナギを示しており、BRの準備AINおよびin situハイブリダイゼーションのための脊髄wholemounts。簡単に述べると、動物を16に維持される C°、ヤツメウナギリンガーで1％ベンゾカインで麻酔し。脊髄は背側アプローチを介して、虹彩切除鋏で切開され、動物は23℃の真水タンクに回復させる。 in situハイブリダイゼーションのために、動物を再麻酔され、脳と脊髄は背側アプローチを介して除去。
Introduction
哺乳動物では、脊髄損傷（SCI）は、負傷した軸索がトラウマゾーンを通って再生し、それらの適切なターゲットに再接続していないため、損傷部位以下の機能の永久的な損失につながる壊滅的な条件である。哺乳類とは対照的に、ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復。1興味深いことに、ヤツメウナギは、それらの大きなサイズのホールマウント脳調製物において個別に識別可能なニューロンを投影する36脊髄のセットを持っている2,3（ 図1） 。これらの脊髄投射ニューロンのすべてが高レベルの完全な脊髄離断により軸索切断されている。私たちのグループとその他の以前の研究では、他の人は通常、損傷部位を通じて軸索を再生しながらでも、これらのニューロンのいくつかは非常に低い再生能力を示し、SCI後の機能回復の存在下で、（彼らは "悪い再生器を」と考えられている）ことを示している（それらが考慮される「グラムOOD再生器」）。2,3この特性は、ヤツメウナギ面白い脊椎動物モデルは今度にしようとする神経細胞の本質的な再生能力の違いにつながる良い面と悪い蓄冷脊髄投射ニューロン間の遺伝子発現の違いを研究することができます同じ外因環境での軸索を再生。1
このモデルを用いて、私たちは、以前にそれぞれネトリンとRGMの阻害作用を媒介しUNC5 4,5及びネオゲニンなどの軸索ガイダンス分子レセプターの低い再生能力を示して発現とその脊髄投射ニューロン、6を示している。また、この方法を使用することによってわれわれのグループはまた、唯一の良い再生器は、損傷後、再生プロセス中にニューロフィラメントの発現の回復を示すことが示されている。最近では、ブッシュとモーガン7が悪い再生器がincreasを示すことが免疫蛍光によって示されている「悪い再生器「脊髄投射ニューロンはゆっくりと完全な脊髄離断5,7,8の後に死亡するという事実に著者によって関係している傷害後シヌクレインのエド式。だから、完全な脊髄損傷のヤツメウナギモデルは、脊髄に突出ニューロン軸索切断後に「悪い再生器 "を作るかを理解するために非常に有用なモデルとして登場しました。
私たちの研究を実施するために、本 発明者らは、in situハイブリダイゼーションホールマウントを実行するために、損傷した後、所望の時点で完全な脊髄離断手術プロトコルと後方脳の解剖を行っている。現在の方法論的な記事では、幼虫ヤツメウナギにおける完全な脊髄損傷の手術の適正なパフォーマンスのために詳細なプロトコルを提示し、動物のその後のメンテナンスやin situハイブリダイゼーションホールマウントのための最終的な脳の解剖と脳の準備。 PEに詳細なプロトコル幼虫ヤツメウナギの脳においてin situハイブリダイゼーションホールマウントをrformは、以前に報告されている。9はまた、脊髄損傷および脳の解剖のためのこのプロトコルは、その後、免疫組織化学または他の組織学的方法のために脳を処理するために使用することができる。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべての材料については、表1を参照してください。
実験は、テンプル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
1。動物
- 野生型幼虫の海ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス L.）を取得し、10 -メイン州のデラウェア川（ペンシルベニア州）またはストリームへの支流から、ミシガン湖の供給流れから- （7歳4）長さが14センチ。
- 16℃で50ガロンの淡水タンク内の100の動物 - 研究室では、50のグループで幼虫を維持する。ライン砂利のインチでタンク幼虫が中に穴を掘るためにのために、水を炭濾過し、その中にヤツメウナギを置く前に、塩素や他の不純物を除去するために、少なくとも48時間、エアストーンで調整されている。使用する日まで、自らの残骸をリサイクル動物を供給する必要はありません。
2コンプリート脊髄コード離断
- 脊髄手術の前に以下の組成を有するヤツメウナギリンゲル液の準備：110のNaCl、2.1のKCl、2.6のCaCl 2、1.8mMのMgCl 2および10mMのトリス緩衝液を; pHは7.4。
- 脊髄切断を行うために、小さな容器に幼虫を置き氷冷リンゲル液中の1％トリカインメタンスルホネートで麻酔する。
- 麻酔された場所にペトリ皿の動物の半分シルガード（シリコーン）で満たし、一動物の鼻に配置される（手術のための位置に尾少なくとも一つを、動物を保持するために4昆虫ピン（0.15ミリメートルの直径）を使用して一度そして2つの5 番目の鰓のレベルで）。ほとんどリンゲル液でトップまでのペトリ皿を埋める。実体顕微鏡下で手術を行いながら、氷上で幼虫をシャーレを入れてください。
- 脊髄離断に背を実行するには、正中線、5 番目のレベルで外科用メス（＃11）と長手方向に切開する脊髄を可視化する鰓。最初に皮膚を上に向けて外科用メスの刃の先端を挿入し、脊髄を上から見ることができるまで、筋肉組織が非常に緩やかに切断されることによって開放されている。ファッション2昆虫ピンからフックと脊髄離断を行いながら、身体の壁が開いて保持するためにそれらを使用しています。
- 完全にハサミを使用して、5 番目の鰓（カストロ＃8）のレベルで脊髄を横断する、脊髄に垂直にはさみを挿入します。脊髄は完全に1きれいにカットを横切する必要があります。脊髄を完全に離断されたことを確認する実体顕微鏡下で脊髄切断端を可視。そして、一対の鉗子（＃5）を用いて、横切開後に脊髄の切断端を再調整。
- 脊髄切断を行った後、微細ピンセットを背体壁に傷を閉じ、創傷tを可能にするために1時間氷上に幼虫を入れO乾燥させます。氷と幼虫の間のフィルタ·一枚の紙を入れて、ヤツメウナギのリンゲル液でそれを浸します。低温は、傷が空気乾燥することができますので、感染を予防するのに役立つと同時に、生きている動物を保持します。
- その後、24時間氷冷水小さな水槽（タンクあたり1幼虫）の幼虫を移す。
- 行動的に損傷部位への移動、尾がないことを確認するために、脊髄離断後に病変幼虫1日を調べます。幼虫（5 番目の鰓のレベルで）損傷部位にのみ、その頭の吻側を動かすことができれば、脊髄離断が完了したと見なされる。この場合、幼虫は現在、室温で淡水と戦車（タンクあたり1幼虫）に転送することができます（23 それらは、選択された時点で回復することを可能にする°C）。
- 回復期間中は2〜3日ごとに水の交換。
3。脳解剖との調製in situハイブリダイゼーションのための脳
- 損傷後の希望の時点で幼虫の海ヤツメウナギと場所を再度麻酔し、上記のように、脳の解剖を行うためにリンゲル溶液とペトリ皿でそれらをピン。
- 脳を解剖するには、最初の鼻孔および松果体臓器の間にメスで横切開を行います。ここからピンセットでそれを保持しながら、カストロのハサミを使用して、脳の周囲の組織を切断し始める。
- 脳が露出された後、ピンセットを使って、脈絡叢を除去し、動物の頭部を広げ、脳神経を露出するためのフックを使用しています。その後、カストロのはさみで脊髄横断を切った。脳を切開する脳神経を切断するために鉗子の別のペアを使用しながら、ピンセットで脊髄を持ちます。
- 2プラグを挿入することで解剖した後、シリコンの小片に脳を入れて、位置に保持脊髄の嗅球と1電気ショック療法のピン。その後、はさみで背側正中線に沿って後方と脳のcerebrotectal交連をカットし、横方向に翼状プレートを偏向し、4昆虫ピン（ 図2）を有するシリコーンフラットそれらをピン。
- 回転装置上で3時間室温温度に固定されるリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに脳シリコーン片を移す。
- 前述のように定着後のin situハイブリダイゼーションホールマウント用に脳を使用して（スウェインら 、1994）。コントロールまたは偽手術動物からの脳を負傷した動物からの脳と並行して、常に実行する必要があります。 wholemounted幼虫の脳は、そのフラットで薄型のin situハイブリダイゼーションにより研究し、また、脳はかなり半透明になりミエリン10の欠如に起因することができます。
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Representative Results
この方法を使用するときに得られる結果は、識別可能な脊髄突出におけるネオゲニン転写物の発現を示すwholemounted脳の代表画像の一例として、制御のニューロンおよび2週間後の病変幼虫海ヤツメウナギは、 図2に示されている。読者は、完全な脊髄離断および完全な詳細については、海のヤツメウナギの神経細胞を投影する識別可能な脊髄の再生能力の後ネオゲニンの発現との関係を報告して、以前の研究6と呼ばれている。簡単に述べると、結果は、損傷後に識別脊髄投射ニューロンにおけるネオゲニン受容体の発現に変化があることを示している。二週間M1、I1、I2、I4、またはM番目のニューロン様ネオゲニン受容体を優先的に悪い再生器中で発現される完全な脊髄離断後（ 図2Bを参照）これらの結果は、結果を実証プロトコル及びネオゲニン受容体がこれらの細胞の再生の障害に関与し得ることを示唆している。
図1：識別可能な網様体ニューロンの位置を示す海ヤツメウナギの脳の背側のビューの概略図 。略語についてバレイロ-イグレシアスとShifman。5からの再生は、以下のリストを参照してください。
背側制御（A）におけるネオゲニン転写物の発現を示す成熟した幼虫の海ヤツメウナギの脳の景色と、損傷後（B）の動物を2週間の図2の顕微鏡写真。傷害nの後は、Bに注意してくださいeogenin転写物を優先的に悪い再生器であることが知られているニューロンにおいて発現される（ 例えば 、M1、I1、I2、I4およびM番目のニューロン）。また、脳（矢印）を保持するために使用されるピンによって残された穴の存在に注意してください。読者はShifmanおよび共同研究者による以前の研究と呼ばれている。略語については6、以下のリストを参照してください。
略語
| B（B1-B6） | 延髄領域のミュラー細胞（中rhombencephalic網様核） |
| hab.-PED。 TR。 | habenulopeduncular道 |
| I1〜I6 | 峡部地域のミュラー細胞 |
| 私はX | 舌咽運動核 |
| infファイル。 | 漏斗 |
| ISTH。網状赤血球。 | 峡部網様体 |
| M1-M4 | ミュラー細胞1から4 |
| 第M | マウスナー細胞 |
| 第m ' | 補助マウスナーセル |
| SMI | 溝正中の劣る |
| Vmは | 三叉神経運動核 |
| X | 迷走運動核 |
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Discussion
ここでは、幼虫の海のヤツメウナギで完全な脊髄離断および後脳の解剖を実行するために詳細なプロトコルを提示する。この手順では、in situハイブリダイゼーションホールマウント脳による脊髄損傷後のニューロンを投影する識別可能な脊髄の間の遺伝子発現の差を分析することができる。手順における重要なステップはstereomicrocope下、脊髄の切断端を観察することによって制御され、穏やかに一対の幼虫の鼻に触れることにより24時間後に確認することができる完全な脊髄切断の正確な性能である鉗子損傷部位への移動、尾がないかどうかを確認します。また、手術のために使用されるハサミは鈍ではない、動物の回復のための重要かつシングルとクリーンカットが完全に脊髄を横断するために行われていることである。
損傷後の動物の生存は非常なアニメーションを維持することによって改善され手術中の最初の24時間空気乾燥した後、氷冷水中に傷を可能にするために使用時間中に氷上でALS。この期間の後、創傷を閉じ、動物が既に室温で淡水をタンクに移すことができる。
動物のより大部分は、より高い温度で損傷後の完全な自発行動機能を回復するため、幼虫ヤツメウナギは室温ではなく、それらの通常の低温で回復させる。11歩行の正常なパターンの回復は、8〜10週間観察され、完全な脊髄切断後。
完全な脊髄離断及び幼虫の脳はここに示されているようにin situハイブリダイゼーションホールマウント実行するだけでなく、処理することができる選択された時点での脳の解剖（ 図2）を実行した後だけでなく、免疫組織化学のような他の組織学的方法のために（ 例：7 例えば 、8）または蛍光標識されたカスパーゼ阻害剤を使用することにより、活性化カスパーゼの検出。5
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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