Summary
Поддерживаемые липидных бислоев и природные частицы мембран являются удобными системы, которые можно аппроксимировать свойства клеточных мембран и быть включены в различных аналитических стратегий. Здесь мы показываем, способ получения микрочипов, состоящие из поддерживаемых липидных двухслойных покрытием SiO 2 бусины, фосфолипидов пузырьков или природных частицы оболочки.
Abstract
Липидного бислоя мембраны образуют плазменные мембраны клеток и определить границы субклеточных органелл. В природе эти мембраны гетерогенные смеси многих видов липидов, содержат мембраной белков и оформлены с углеводами. В некоторых экспериментах, желательно, чтобы отделить биофизических или биохимические свойства липидный бислой от тех природного мембраны. Такие случаи требуют использования модельных систем, таких как гигантские пузырьки, липосомы или поддерживаемых липидного бислоя (SLBS). Массивы SLBS особенно привлекательны для зондирования и подражая межклеточные взаимодействия. Здесь мы опишем новый способ формирования массивов SLB. Субмикронного диаметра SiO 2 гранулы сначала покрывают липидных бислоев с образованием сферических SLBS (SSLBs). Затем гранулы хранение в массив микролунок субмикронного диаметра микро-сфабрикованы. Методика подготовки использует "швабру" для очистки поверхности подложки, в то время оставляешьг за SSLBs, которые поселились в лунки. Этот метод не требует химической модификации микропланшетным субстрата, ни особых таргетинга лигандов на SSLB. Микролунки занимают отдельных шариков, поскольку диаметр хорошо настроен, чтобы быть просто больше, чем диаметр шарика. Как правило, более 75% скважин заняты, а остальные остаются пустыми. В буфере массивы SSLB отображения долгосрочную стабильность больше, чем за одну неделю. Несколько типов SSLBs могут быть размещены в одном массиве по последовательным осаждением, и массивы могут быть использованы для зондирования, который мы показали, характеризуя взаимодействие холерного токсина с ганглиозидов GM1. Показано также, что фосфолипидов пузырьки без бортов опор и биомембран от клеточных источников может быть облечена с тем же методом и клеточно-специфические липиды мембран могут быть идентифицированы.
Introduction
Липидов двухслойные мембраны являются важными структуры в природе. Сотовый плазменные мембраны и органелл мембраны состоят из липидного бислоя, которые включают ряд молекул, которые необходимы для жизни. Многие процессы поддержания жизни происходить на поверхности клеток или опосредованы молекул, ассоциированных с липид-двухслойных мембран. В самом деле, многие фармацевтические препараты целевые процессы или молекулы находятся на или в мембранах 1,2. Поэтому необходимо, чтобы аналитически исследовать процессы, такие, как химические реакции или нековалентными обязательных событий, которые происходят на поверхности мембраны. Потому что природные мембраны может быть трудно изолировать и / или интерфейс с датчиками, многие исследователи используют упрощенные модели мембраны проводить аналитические исследования. Ряд модельных мембранных систем описаны в литературе, начиная от гигантских везикул, которые могут быть от десятков до сотен микрон в диаметре до липосом с наноразмерными размеры 3,4. Alternнительно, плоский бислоев, нанесенные на твердых подложках, то есть поддерживается бислоев (SLBS), может быть сформирован на нескольких различных поверхностей и были широко использованы в биофизических, биохимических и аналитических приложений 5. Соединительная SLBS с электрическими или оптическими материалов позволяет исследовать мембранной биохимии и биофизики с использованием различных аналитических методик. Флуоресцентная микроскопия 6, электрохимии 7, оптическая спектроскопия 8, сканирующей зондовой микроскопии 9, поверхностного плазмонного резонанса 10, и масс-спектрометрии 11 все были использованы для изучения структуры и свойств SLBS.
Массивы SLB обеспечивают дополнительную гибкость при проектировании датчиков для мультиплексов анализов 12,13. Другие приложения используют массивы SLB, чтобы имитировать переход, который формирует между иммунными клетками 14. Методы обработки для массивов SLB менялись от microfluIDic подходы 15 тем, которые используют физические барьеры между соседними пятнами SLB. 16 Другие группы использовали методы печати 17, фотохимический рисунка 18 и различные наноинженерии приближается 19 для создания массивов SLB.
В данной работе и сопровождающей видео мы продемонстрируем способ формирования массивов SLB путем сдачи на хранение SLB-покрытием SiO 2 шарики в упорядоченных массивов лунок 20. Мы ссылаемся на SLB-покрытых SiO 2 шариков в виде сферических поддерживаемых липидного бислоя (SSLBs). Этот метод является расширением предыдущей работы, который создал массивы фосфолипидных везикул и биомембран, полученных из природных источников 21, из которого мы также показывают примеры результатов. Другие способы выстроив частицы биомембрана или везикулы полагались на моделях конкретных, ориентированных на лигандов на поверхности, которые связывают с дополнительными лигандами, содержащихся на поверхности пузырьков. Примеры включают биотин-авидин ассоциация 22,23 и гибридизации ДНК схемы 24. Наш подход требует только массив микролуночные без каких-либо таргетинга или распознавания фрагментов, необходимых. Размер SSLBs определяется диаметром SiO 2 бортовых опор, которые имеют низкую поли-дисперсность. Настраивая диаметр микролуночные просто больше, чем диаметр SSLB, только один SSLB оседает в каждую микролунку. Поли (диметилсилоксан) (PDMS) скребок затем удаляет с поверхности все SSLBs, которые не иммобилизованных в лунках. Микролунки и полученные массивы SSLB имеют высокую плотность (~ 10 5 SSLBs / мм 2) с 3 мкм от центра до центра расстояние и гексагональной периодичности. По серийно нанесения SSLBs с различными составами липидов, можно создать многокомпонентных массивов с случайно расположенных SSLBs. Чтобы продемонстрировать зондирования возможности массивов SSLB, мы использовали взаимодействие холерного токсина (CTX) с ганглиозида (GM1) включенного в SSLBs. Сприродные частицы мембран, мы смогли обнаружить клеточные специфические липиды в многокомпонентных массивов, содержащих мембранный материал из двух различных типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Микротехнологий из Microwell подложки матрицы
- Начните с 4 дюйма кремниевой пластины с 100 нм термически выращенного оксида.
- Спин SPR-955 0,7 фоторезиста на пластине при 4000 оборотах в минуту в течение 30 сек.
- Выпекать на электрической плитке при 115 ° С в течение 90 сек.
- Expose фоторезиста.
- Используйте маску, которая будет создавать 1 мкм отверстия, расположенные в гексагональной решетки с периодом 3 мкм, где массив охватывает 2 мм х 2 мм площадь.
- Expose пластины в я-линии степпер, используя размер шага 6 мм и экспозиции 200 мДж / см 2.
- Выпекать на электрической плитке при 115 ° С в течение 90 сек.
- Разработка с использованием спиновой проявитель для нанесения 2 лужи CD-26 на пластине в течение всего времени развития 90 сек.
- Тщательно промойте сверхчистой дистиллированной воды и сухой с N 2.
- Протравите оксид в реактивно-ионного гравер в течение 6 мин с 50 кубических сантиметров в минуту аргона, 25 кубических сантиметров в минуту из CF 4 и 50 кубических сантиметров в минуту швейцарских франков 3 флокрыло при давлении 75 мТорр.
- Протравите кремний в ПМС глубокой траншеи реактивный-ионной офортист в течение 2 мин с 63 SCCM С 4 F 8, 27 SCCM в SF 6, 40 SCCM аргона и 10 станд из O 2, протекающий при давлении 14 мТорр.
- Полоскание в ацетон, метанол и изопропанол, чтобы удалить сопротивляться.
- Место в ванну с H 2 SO 4: H 2 O 2 1:01 в течение 10 мин для очистки поверхности.
- Тщательно промойте сверхчистой дистиллированной воды и сухой с N 2.
- Депозит 1080 А Al 2 O 3 путем осаждения атомных слоев при температуре 250 ° С.
2. Получение поли (диметилсилоксан) Ракель
- Если это возможно, работать в чистом помещении. В противном случае работать в чистейшей возможной среде.
- Получить пластиковую чашку Петри (или другой чистый одноразовый контейнер) с ≥ 13 мм сторон.
- В этом блюде, вылить 5 г PDMS отвердитель, затем 50 г PDMS барельефэ агент (или что-нибудь с соотношением 1:10, который будет в основном заполнить чашку Петри). Тщательно перемешать с одноразовой пластиковой пипетки или стержня.
- Удалить пузырьки путем размещения смешанные PDMS в камере с вакуумной линии, применяя вакуум до пузырьков выйти из смеси (примерно 30 мин).
- Если не уже в чашке Петри, залить PDMS в чашки Петри, избегая создания воздушных пузырьков.
- Лечение ночь на электрической плитке в> 50 ° C (выше тепла в течение меньшего времени также работает).
- С новым / чистым лезвием бритвы, аккуратно вырезать прямоугольный кусок примерно 2,5 х 2,5 см, сохраняя верхнюю поверхность как можно более чистым. Пил с чистого пинцета. Аккуратный от одного края (вплоть до 1,5 см), нажав на лезвие бритвы одним движением, чтобы сделать верхний край острый, как возможно (это будет край используется в швабры процесса).
- Чистый с ацетон, метанол, изопропиловый спирт, и сверхчистой деионизированной воды, а затем сушить с чистой газообразного азота. Храните в чистом чашке Петри.
3. Подготовка пузырьков
- Сбор липидов исходные растворы 25 мг / мл яичного фосфатидилхолина (PC) и 1 мг / мл 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N - (lissamine родамина B сульфонил) соль аммония (Ро-DPPE) в хлороформе и 0,5 мг / мл стоковый раствор monosialoganglioside GM1 в смеси хлороформ / метанол (2:1 объем / объем).
- В небольшой стеклянный флакон сделать смесь, что приводит к 97% мол ПК, 2 моль% GM1 и 1 моль% Rho-DPPE добавлением 18,9 мкл 25 мг / мл ПК, 39,6 мкл 0,5 мг / мл GM1 и 7,9 мкл 1 мг / мл Rho-DPPE с использованием стеклянных шприцев.
- Примечание:. Дополнительный материал для Наир и др. 25 содержит превосходный настраиваемый Excel таблицу для расчета количества липидов, необходимые для создания пузырьков любой желаемой композиции.
- Поместите флакон в вакуумном эксикаторе и удалить растворитель, оставив флакон под вакуумом в течение 6 часов.
- Сделать водный раствор 0,1М NaCl. Добавить 0,5 мл 0,1 М раствора NaCl во флакон, содержащий высушенный липидной пленки.
- Разрешить водный липидов смесь на отдых в течение ночи.
- Кратко вихрь смеси для создания суспензии везикул, а затем разрушать ультразвуком в течение 20 мин в ванне для обработки ультразвуком при комнатной температуре.
- Экструдируйте суспензии везикул через поликарбонатную мембрану с 100 нм размера пор. Передайте суспензии везикул через фильтрующий 17x.
- Храните экструдированных пузырьки в стеклянном флаконе при 4 ° С.
4. Формирование сферических поддерживаемых липидного бислоя
- Соберите 700 нм в диаметре SiO 2 бусинки. Шарики поставляются в дистиллированной воде с концентрацией фондовом 1,4 х 10 11 бусин / мл.
- В 1,5 мл пробирку Эппендорфа подготовить 1 мл шарик суспензии с концентрацией 1,5 х 10 10 бисер / мл добавлением 107 мкл исходного раствора шарик в 893 мкл 0,1 М NaCl.
- Vortex подвеску, чтобы убедиться, что он хорошо мильнеподвижной.
- Центрифугируют суспензию с 1700 мкг в течение 20 минут, затем отбросить супернатант. Ресуспендируют бусины в 1 мл 0,1 М NaCl. Повторите этот шаг еще дважды тщательно мыть шарики.
- Для формирования SSLBs, в 1,5 мл пробирку Эппендорфа добавить 25 мкл SiO 2 шарик суспензии в 200 мкл 1 мг / мл суспензии везикул. Vortex смесь и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре. На этой стадии концентрация SSLB должно быть 1,7 × 10 9 / мл SSLBs.
- Центрифуга при 1700 мкг в течение 20 мин для осаждения SSLBs. Осадок должен появиться розовый из-за разрыва пузырьков с Ро-DPPE на бусы.
- Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют в 225 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), рН 7,4. Повторите шаги 4.6-4.7 два более раз, чтобы удалить любые неразорвавшихся пузырьки из суспензии SSLB.
5. Ассамблея SSLB массива
- Клив пластины из микролуночных массивов в результате на прямоугольные куски с 4-6 микрофономRowell массивы за штуку.
- Vortex смешать подвеска SSLB, затем поместите 10 мкл SSLB подвески на каждом массиве микропланшетным. Дабы остальные в течение 1 часа, чтобы позволить SSLBs оседают на поверхности.
- Осторожно промыть чип микролуночный массива с PBS из бутылки мыть, то погружаться в ванну PBS, подготовленный в неглубокую посуду.
- В то время как под водой, осторожно положите PDMS швабры флеш на чипе микролуночный массива и аккуратно сдвиньте ее вдоль поверхности 5x удалить SSLBs, которые не иммобилизованных в лунках.
- Возьмитесь за чип микролуночный массив с помощью пинцета и осторожно встряхните в ванне PBS, чтобы удалить лишнюю SSLBs.
- Быстро удалить обломок от швабры бане и не размещать в свежем PBS бане до дальнейшего использования. Убедитесь, что верхняя поверхность чипа остается влажной, чтобы сохранить SSLBs.
Примечание: Метод сборки описано выше, могут быть использованы для создания массивов природных частицы оболочки, как миелиновых частиц, выделенных из мозга мыши, или фотоновspholipid пузырьки без SiO 2 бортовых опор. Эта работа подробно описана в Виттенбергского соавт. 21 и репрезентативные результаты приведены ниже.
6. Холерного токсина Анализ Binding
- Подготовка 2 мг / мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
- Готовят раствор с требуемой концентрации Alexa 488-конъюгированного холерного токсина B-субъединицы в ЗФР с 2 мг / мл BSA.
- Извлеките чип массива SSLB из ванны PBS и фитиль наиболее раствора PBS далеко с использованием лабораторной салфеткой. Оставьте достаточно PBS на чипе сохранить массив SSLB увлажненной.
- Для предотвращения неспецифического связывания, добавьте 200 мкл 2 мг / мл BSA решение чипа массива SSLB. Пусть остальное в течение 1 часа в увлажненной коробки.
- С помощью микропипетки, удалить 200 мкл раствора из верхней части чипа массива SSLB.
- Добавить 200 мкл раствора токсина холеры на чип массива SSLB и оставьте в течение 1 часа в увлажненной коробки.
- Осторожно промыть чип массива SSLB с PBS из бутылки мытья для удаления несвязанного холерный токсин.
- Вика от избытка PBS с использованием лабораторного протрите. Перед визуализации чип крышку с скольжения 24 мм х 40 мм крышкой.
- Массивы Изображение с прямой микроскоп с помощью фильтра устанавливает подходит для флуорофоров интересов.
- Анализ интенсивности флуоресценции отдельных SSLBs в массиве с использованием автоматизированного анализа частиц функцию программного обеспечения ImageJ.
- Компиляция средние интенсивности флуоресценции от отдельных SSLBs в гистограмм, которые обобщают интенсивности SSLBs найденные на данном массиве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда SiO 2 гранулы смешивают с раствором везикул, состоящих из фосфолипидов, флуоресцентные липидов и других липидов, таких как ганглиозиды, пузырьки разрыву на SiO 2 бортовых поверхности, чтобы сформировать SSLBs, как схематически показано на фиг.1а. После промывки SSLBs, капли раствора SSLB помещают на массив микропланшета, и гранулы дают осесть на поверхность. (Рис. 1B1) Это также может быть сделано с суспензией фосфолипидных везикул или стихийных частицы оболочки, которые показаны на рис 1B2. Флуоресценции изображение фосфолипидных везикул, адсорбированных на микролуночном подложки матрицы показана на фиг 1B3. Тогда скребок PDMS производится скользить мягко по всей поверхности, чтобы удалить любые SSLBs (рис. 1c1), везикулы или природные частицы оболочки (рис. 1c2), что не обосноваться в лунки. Это приводит к массиву SSLB, в котором каждыймикролуночный содержит не более одного SSLB (рис. 1d1) или массив, где несколько пузырьки или природные частицы мембранные в каждую микролунку (Рисунок 1D2). Изображение микрочипов, состоящего из флуоресцентной помечены пузырьков показан на рисунке 1d3.
.. Рисунок 1 Формирование SSLBs и SSLB сборки массива (а) Иллюстрация SSLB, состоящей из 3-х видов липидов на SiO 2 шарика: яйцо ПК (черный), Ро-DPPE (красные) и GM1 (синий). (B1-d1) технологическую для сборки массива SSLB показывая SSLBs разбросанные на массиве микропланшетным (b1), использование ракеля PDMS, чтобы очистить поверхность SSLBs не поселился в лунки (C1), а окончательный массив SSLB (d1 ). (B2-d2 (B3) флуоресценции изображение фосфолипидных везикул, адсорбированных на микролуночном подложки, соответствующей иллюстрации в (В2). (D3) флуоресценции образ микрочипов состоит из фосфолипидов пузырьков, соответствующих иллюстрации в (D2). Взято из ссылок 20 и 21 и используются с разрешения Американского химического общества.
Индивидуальные SiO 2 бусины опоры для SSLBs в лунки были обследованы с сканирующей электронной микроскопии (SEM) с обеих угловой топ-зрения и поперечного сечения точек зрения. Вид сверху области примерно на 15 мкм х 15 мкм показано на фиг.2а, а на рисунке 2b показан вид в поперечном разрезе одного шарика, иммобилизованного вмикролуночный. Чем светлее слой покрытия микролуночные составляет 100 нм из Al 2 O 3, сданный на хранение осаждения атомных слоев, чтобы настроиться диаметр хорошо так, что скважины способны вместить только отдельные бусины.
Рисунок 2. Сканирующей электронной микроскопии изображения массивов SSLB. (А) Электронно-микроскопический снимок 15 мм районе х 15 мм с указанием SSLB шарик опоры иммобилизованные в микротитровальных массивов. (Б) один диаметр 700 нм SSLB в микролунку. Микролуночный покрытие Al 2 O 3, который осаждается сокращаться Микролуночные так, что только отдельные шарики могут поместиться внутри. Взято из ссылки 20 и используются с разрешения Американского химического общества.
После того, как массивы SSLB готовы, они могут быть отображены с помощью флуоресцентной микроскопии.
Последовательное осаждение различных типов SSLBs был использован для создания массива с более чем одним типом SSLB, где идентичность отдельных SSLBs была определена отсутствие или в присутствии рецептора токсина (GM1) и его связывание холерного токсина (CTX). Процесс сборки такой же, как для одного типа SSLB но было проведено во второй раз с другим именем SSLB. Начиная концентрация SSLBs был 10x ниже, чтобы уменьшить загруженность первого типа SSLB и позволить больше вакансий, которые смогут занять второго типа SSLB. В рисунках 3с-3е, массив SSLB с двумя типами SSLBs показано. Альл из SSLBs содержать красный флуоресцентный Rho-DPPE (фиг.3С), но только некоторые из SSLBs содержать GM1, ганглиозид, который является рецептором для B-субъединицы CTx. При воздействии на зеленый флуоресцентный Alexa 488-сопряженного CTx, только SSLBs содержащие GM1 светиться в зеленом канале (рис. 3d). Когда красные и зеленые их объединении, то можно определить, какие SSLBs содержат GM1 (желтый) и которые не (красный) (рис. 3e).
Рисунок 3. Флуоресценции визуализации массивов SSLB. (А) площадь мкм 100 мкм х 100, содержащий 936 Ро-DPPE меченные SSLBs яйцо ПК. (Б) светлое и флуоресценции наложения показывая SSLB с 76% лунок оккупированных. (CE) Массив SSLB содержащий SSLBs, содержащие Rho-DPPE(С), часть которых также содержать GM1, которая связана Alexa-488-конъюгированного CTx (г). (Е) Слияние красного и зеленого каналов, где локализуется флуоресценции указывает на наличие GM1 на SSLB. Синие круги указывают SSLBs что только флуоресцируют красным, то есть не хватает GM1. Взято из ссылки 20 и используются с разрешения Американского химического общества.
Флуоресценции данные из массивов SSLB анализировали путем измерения интенсивности отдельных SSLBs в изображении. Интенсивность данных SSLB из массивов были собраны в гистограмм. Рисунке 4а показаны один такой гистограмму из анализа Ро-DPPE флуоресценции от массива SSLB состоящей исключительно из SSLBs содержащих яйца ПК и 1% мол Ро-DPPE. Данные в рисунке 4a были приобретены анализа изображения на рисунке 3а. Мы обнаружили, что массивы SSLB быть надежными и стабильными в течение не менее одной недели, когда в холодильникей погружен в буфере. Массивы не теряли интенсивность флуоресценции, и не размещение массивов изменить в течение одной недели (Рисунок 4б).
Рисунок 4. (А) Гистограмма, показывающая распределение интенсивности флуоресценции для массива SSLB показано на рисунке 3а. Средняя интенсивность для каждого SSLB в массиве был использован для компиляции гистограмму. Сплошная линия является гауссовским нужным данным. (Б) Среднее размещение массива (черные кружки) и интенсивность флуоресценции (красные квадраты) для массива SSLB контролируемой в течение одной недели. Взято из ссылки 20 и используются с разрешения Американского химического общества.
Мы сделали массивы, состоящие из SSLBs с различными концентрациями GM1 (0, 0,5, 1й 2 моль%) и подвергает их фиксированной концентрации CTx, а также массивов с SSLBs с концентрацией GM1 и подвергает их различных концентраций CTx. Позже эксперимент был использован для определения равновесного константу диссоциации (KD) для связывания GM1/CTx. Массивы SSLB с меняющейся концентрацией GM1 подвергались 50 нМ Alexa-488 с надписью CTx в течение 1 часа, затем промывали и отображаемого. Интенсивность гистограммы для SSLB массивов с 0,5 - 2 моль% GM1 подвергающихся 50 нМ Alexa 488-сопряженных CTX можно увидеть на рисунке 5а 5б показывает линейную зависимость средней интенсивности флуоресценции от концентрации GM1.. Когда концентрация GM1 в SSLBs фиксируется на 2% мол и массивы SSLB подвергаются CTx от 16 пМ до 158 нМ, связывание ответ следующим образом сигмоидальных кривых, как показано на фиг.5С. Кривые подходят для этих данных основаны на двух различных связующих моделей: изотерма Ленгмюра (уравнение 1), и режим Hill-Waudл (уравнение 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
(1)
(2)
Где F является интенсивность флуоресценции при данной концентрации CTX, F макс является интенсивность флуоресценции при связывании насыщен, [СТх] является концентрация СТх, Уб и К Н являются константы диссоциации от Ленгмюра и Hill-Waud подходит, соответственно и п коэффициент кооперативности в модели Хилл-Waud. Коэффициент кооперативности (п) оценивает величину мультивалентный связывания, где п больше, чемодин показывает, что каждая молекула СТх связывает более одного GM1. Концентрация CTx на уровне 0,5 х F макс является Уб или K H для взаимодействия GM1/CTx. В наших экспериментах мы рассчитали K D 1,6 ± 0,2 нМ и К Н 1,4 ± 0,2 нМ с п стоимости 1,3, что указывает кооперативного связывания. Константы диссоциации для взаимодействия GM1/CTx варьироваться в широких пределах в литературе, начиная более 5 порядков от 4:05 вечера до 370 нМ 26,27.
Рисунок 5. CTx/GM1 анализов связывания на массивах SSLB. (А) Гистограммы интенсивности флуоресценции индивидуальных SSLBs в массивах SSLB. Массивы содержится SSLBs 0,5, 1 или 2% мол GM1 и подвергали воздействию 50 нМ Alexa 488-конъюгированного CTX.Сплошные линии Гаусса подходит. (Б) Участок распределения означает из (а) в зависимости от концентрации GM1. (В) кривые связывания, показывающие распределение средств из массивов, содержащих SSLBs с 2 моль% GM1 после воздействия Alexa-488-сопряженного CTx колеблется от 16 часов до 158 нМ. Линии подходит к изотермы Ленгмюра (красный) и Hill-Waud (синий) обязательные моделей. Столбики ошибок в (BC) представляют стандартные отклонения распределений интенсивности флуоресценции, соответствующих каждой точки данных. Взято из ссылки 20 и используются с разрешения Американского химического общества.
Как упоминалось ранее, это также можно формировать массивы с биомембраны материала, полученного из природных источников 21. Массивы получены таким же образом, путем диспергирования частицы оболочки на микролуночном подложке, а затем очистка верхней поверхности с ракеля оставить мембранных частиц в микрофонrowells. Рисунок 6 показывает примеры миелина и нейронных липидов плот микрочипов. На фиг.6А, миелиновые частицы метили липофильным флуорофора FM1-43. Липидного плоты, как известно, обогащенный содержанием холестерина и ганглиозиды, таких как GM1; Таким образом, в Alexa 488-сопряженных СТх прочно связывается с липидных плот микрочипов, как показано на рисунке 6b, в то время как флуоресцентно меченных стрептавидин (SAPE) не связывается с массива. (Рис. 6, в) Мы также создали полосой массивов, обеспечивая миелина и липидный плот частиц в микропланшетным подложке с микрофлюидный чип с 250 мкм широкими каналами. После родов частиц, микрофлюидных чип был отделен от микропланшетным подложки и швабры процесс осуществляется в обычном режиме. Полосовые массивы были затем подвергается воздействию флуоресцентного анти-олигодендроцитов IgM антитела (IgM O4), который связывает sulfatide найти в миелина. (Рис. 7) миелина и липидный плот полоса микрочиповс в рисунке 7 показаны при возрастающих уровнях увеличения, и на самом высоком уровне увеличения, это очевидно, что IgM О4 связывается только с миелиновых микрочипов потому sulfatide отсутствует липидных плотах.
Рисунок 6. Миелин частиц и нейронные липидов массивы плот частиц. (А) микрочипов миелина частиц, где частицы миелина оказываются флуоресцентные по липофильном флуорофором FM1-43. Пунктирная линия показывает границу области массива. (Б) липидов плот микрочипов показывая СТх связывания с частицами липидов плоту. (С) липидов плот микрочипов воздействию флуоресцентного стрептавидин-фикоэритрином (SAPE), показывая мало ни неспецифическое связывание. Взято из ссылки 21 и используются с разрешения Американского химического Society.
Рисунок 7. Многокомпонентные массивы формируется микрофлюидных доставки миелина и нейронных плот мембран. (А) флуоресценции изображение после миелина и плотах были депонированы через микроканалов на микрочипов подложки. Левые и правые полосы содержат миелин и средняя полоса содержит нейронные мембраны плоту. Мембраны окрашивали FM1-43, который маркирует все липидного материала. Масштабная линейка 250 мкм. (Б) флуоресценции образ тех же трех полос после применения швабру PDMS и инкубации с IgM О4. Масштабная линейка 250 мкм. (CE) Увеличенные изображения из трех полос, показывающих, что IgM О4 связывается только с миелиновых микрочипов: (с) оставил полоса и (е) право полосой. Масштабные бары в рanels се являются 30 мкм. Взято из ссылки 21 и используются с разрешения Американского химического общества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе показано, что монодисперсные SiO 2 шариков, покрытых поддерживаемых липидных бислоев могут быть выстроены в микротитровальных массивов без необходимости ориентации лигандов на липидных бислоев или поверхности подложки, и массивы могут быть использованы для определения характеристик токсин-липидных взаимодействий. Константа диссоциации были рассчитаны для связывания CTx/GM1 выгодно, учитывая широкий несоответствие значений в литературе, с предыдущим доклада Winter и соавт., Где был использован коллоидный узел липидных покрытием шариков рассчитать константу диссоциации около 30 нМ. Установив данные в модели связывания Хилл-Waud, мы определили, что взаимодействие CTx/GM1 вероятно мультивалентный, что согласуется с предыдущими докладами 28. B (связывания ганглиозидов) субъединица CTx существует в виде пентамера, с каждой из пяти единиц, способных связывать молекулы GM1 29; Таким образом, это не удивительно, что более одной субъединицы могут быть связаны с учетом Разницаusive подвижность GM1 в SLBS 30.
Массивы химически функционализированных шариков были использованы в других аналитических исследований 31. В этих типах опытов, бисер, как правило, иммобилизованные в лунках, созданных в конце протравленных оптических волокон. Multiplex флуоресцентные анализы можно проводить в этой конфигурации путем смешивания субпопуляций шариков и иммобилизации их одновременно на конце оптического волокна 32. В нашем мультиплекса анализа (рис. 3в-3e), мы иммобилизованных оптически закодированные SSLBs последовательно, поскольку липиды на SSLBs свободных в растворе могут быть переданы от одного типа SSLB другому 33. Хотя это добавляет дополнительные шаги в подготовке массивов SSLB, это не слишком много времени и является наиболее эффективным подходом для липидных функциональными бисером. Мы также пространственно кодированные массивы путем нанесения различных популяций SSLB в соседних массивов микролуночных, и там не наблюдается КИОс помеха между массивами 20. Чтобы сократить время пробоподготовки, массивы SSLB можно приготовить заранее и используется, когда это необходимо. Мы протестировали стабильность массивов в течение одной недели и не обнаружили существенных деградации массивов с точки зрения интенсивности флуоресценции, что свидетельствует, что количество липидного материала на SSLBs не меняется со временем. Кроме того, размещение массив не изменяется с течением времени, что позволяет предположить, что как только SSLBs обездвижены, они не отрываются от лунки (рис. 4б).
В дополнение к шариков, покрытых синтетических липидных бислоев, мы также использовали этот метод для создания массивов естественных частицы оболочки 21. В этой работе, мы иммобилизованных частиц миелина, полученные из мозга мыши, а также нейрональных мембран частиц, таких как липид-плота фракции. Мы смогли использовать массивы для выявления клеток конкретных молекул поверхности мембраны антителом биндиNG (6 и 7). Кроме того, когда размер лунки была снижена на наноуровне и верхней поверхностью массива была покрыта золотом, мы смогли использовать поверхностного плазмонного резонанса контролировать связывание антител к частицам миелиновых мембран без использования флуоресцентных меток. Основное различие между использованием SSLB и пузырьки или природные частицы оболочки с образованием массива является то, что в случае SSLBs точное количество материала мембраны в каждую микролунку, как известно, потому что только один шарик может поместиться в каждую лунку. С пузырьков или природных частицы оболочки, нет никакого способа контролировать количество материала в каждую микролунку, кроме регулировать исходной концентрации пузырьков или частиц. Однако вариабельность обеспеченных скважины из числа везикул не очень велика по сравнению с распределением диаметров пузырьков 21.
Наконец, этот метод может иметь DIVERSE будущих приложений. Junesch и его коллеги использовали резиновую швабру для удаления наночастиц во коллоидной литографии нанофабрикации 34. Мембранные массивы могут быть сформированы, чтобы имитировать межклеточные контакты исследовать клеточный фокусное адгезию 35 или изучить связывание мембранных кривизны зондирования белков 36. Кроме того, использование пористых гранул будет способствовать включению трансмембранных белков в липидных бислоев 37 или местной доставки грузов в хранимой клеток, культивируемых на биомембрана подложки матрицы. Микролуночный платформа изготовлена с помощью фотолитографии, что позволяет гибкость конструкции. Здесь наши массивы были гексагональной геометрии, но площадь, линейные, или другие геометрии может быть создан с переменным массива периодичности и микролуночные размеры исследовать пространственные эффекты фокальной адгезии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами шо от Национальных Институтов Здоровья (R01 GM092993), Национальный научный фонд (NSF КАРЬЕРА премии и DBI 0964216), Управление военно-морских исследований (ОНР) для молодых следователь Программа и премии Миннесота Партнерство для биотехнологии и медицинские геномики. Изготовление устройства была выполнена в университет Миннесоты Nanofabrication центра (NFC), которая получает поддержку от NSF через инфраструктурной сети Национальный Nanotechnology. Эта работа также была поддержана грантами в MR от Национальных Институтов Здоровья (NS048357, R21 NS073684), Национального общества рассеянного склероза (CA1060A11), Эпплбаум, Hilton, Петерсон и Sanford фондов и семьи McNeilus. Авторы хотели бы поблагодарить Hyungsoon Im для помощи с иллюстрациями и Shailabh Кумар об оказании помощи сканирующей электронной микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
