Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Dannelse av biomembranen Mikromatriser med en nal-basert Assembly Method

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Støttede lipid bilayers og naturlige membran partikler er praktiske systemer som kan tilnærme egenskapene til cellemembraner og bli innlemmet i en rekke analytiske strategier. Her viser vi en metode for å forberede mikromatriser sammensatt av støttede lipid dobbeltlag-belagt SiO 2 perler, fosfolipid blemmer eller naturlige membran partikler.

Abstract

Lipide dobbeltlagsmembraner danne plasmamembranen av celler, og definerer grensene for subcellulære organeller. I naturen er disse membraner er heterogene blandinger av mange typer av lipider, inneholde membranbundne proteiner og er dekorert med karbohydrater. I noen eksperimenter, er det ønskelig å kople de biofysiske og biokjemiske egenskaper til lipid-dobbeltlag fra de av naturlig membran. Slike tilfeller krever bruk av modellsystemer slik som store vesikler, liposomer eller støttet lipid dobbeltlag (SLBs). Matriser av SLBs er spesielt attraktive for sensing applikasjoner og hermet celle-celle interaksjoner. Her beskriver vi en ny metode for å danne SLB arrays. Submicron diameter SiO 2 perler er først belagt med lipid bilayers å danne sfæriske SLBs (SSLBs). Perlene ble deretter satt inn på en matrise av mikro-fabrikerte submikron-diameter mikrobrønner. Fremstillingen teknikken bruker en "nal" for å rense substratoverflaten, mens leaving bak SSLBs som har slått seg ned i mikrobrønner. Denne metoden krever ingen kjemisk endring av mikro underlaget, og heller ikke noen spesielle rettet ligander på SSLB. Mikro er opptatt av enkelt perler fordi brønnen diameter er innstilt til å være akkurat større enn diameteren perle. Vanligvis er mer 75% av brønnene er opptatt, mens resten forblir tom. I buffer SSLB matriser viser langsiktig stabilitet på mer enn en uke. Flere typer av SSLBs kan plasseres i en enkelt rekke ved serie avsetning, og de matriser kan benyttes for avføling, som demonstrerer vi ved å karakterisere interaksjonen mellom koleratoksin med gangliosid GM1. Vi viser også at fosfolipid-vesikler uten bead støtter og biomembraner fra cellulære kilder kan være sammenstilt med den samme metode og celle-spesifikke membranlipider kan identifiseres.

Introduction

Lipid-dobbeltlag-membraner er viktige strukturer i naturen. Cellular plasmamembraner og organelle membraner er sammensatt av lipid dobbeltlag som inneholder en rekke molekyler som er nødvendig for liv. Mange livsnødvendige prosesser forekommer på overflaten av celler eller mediert av molekyler assosiert med lipid-dobbeltlag-membraner. Faktisk er mange legemidler mål-prosesser eller molekyler funnet på eller i membraner 1,2. Det er derfor nødvendig å analytisk undersøke prosesser, for eksempel kjemiske reaksjoner eller kovalente bindende hendelser som oppstår på membran flater. Fordi naturlige membraner kan være vanskelig å isolere og / eller grensesnitt med sensorer, benytter mange forskere forenklet modell membraner for å utføre analytiske studier. En rekke modellmembransystemer er beskrevet i litteraturen, som strekker seg fra store vesikler som kan være flere titalls til flere hundre mikron i diameter til liposomer med nanoskala dimensjoner 3,4. Alternatively, planar lipid bilayers avsatt på fast underlag, dvs. støttet lipid dobbeltlag (SLBs), kan være dannet på en rekke ulike overflater, og har vært mye brukt i biofysiske, biokjemiske og analytiske applikasjoner fem. Kopling SLBs med elektriske eller optiske materialer muliggjør undersøkelse av membran biokjemi og biofysikken ved bruk av forskjellige analytiske teknikker. Fluorescens mikroskopi 6, elektrokjemi 7, optisk spektroskopi 8, scanning probe mikros 9, overflate plasmonresonans 10, og massespektrometri 11 har alle blitt ansatt for å studere struktur og egenskaper av SLBs.

SLB arrays gir ekstra allsidighet i utformingen av sensorer for multiplex analyser 12,13. Andre programmer bruker SLB arrays for å etterligne krysset som utgjør mellom immunceller 14. Tilberedningsmetoder for SLB arrays har variert fra microfluidic nærmer 15 til de som benytter fysiske barrierer mellom tilstøtende SLB patcher. 16 Andre grupper har brukt trykkmetoder 17, fotokjemisk mønster 18 og ulike nanoengineering nærmer 19 å opprette SLB arrays.

I denne utredningen og medfølgende video viser vi en metode for forming SLB arrays ved å deponere SLB-belagte SiO 2 perler inn bestilte matriser av mikro 20. Vi viser til SLB-belagte SiO 2 perler som sfæriske støttede lipid dobbeltlag (SSLBs). Denne teknikken er en forlengelse av tidligere arbeid som er laget matriser av fosfolipid-vesikler og biomembraner avledet fra naturlige kilder 21, hvorfra vi viser også eksempelresultater. Andre metoder for arraying biomembrane partikler eller blemmer har stolt på mønstre av spesifikke målgruppe ligander på overflater som assosierer med utfyllende ligander som finnes på vesikkel overflaten. Eksempler inkluderer biotin-avidin foreningen 22,23 og DNA hybridisering ordninger 24. Vår tilnærming krever bare et mikromatrise uten målretting eller anerkjennelse moieties nødvendige. Størrelsen på SSLBs defineres av diameteren av SiO to kulestøttene, som har lav poly-dispersitet. Ved å justere diameteren mikro å bare større enn diameteren SSLB, legger seg bare en enkelt SSLB inn i hver mikrobrønn. Et poly (dimetylsiloksan) (PDMS) nalen deretter fjernes fra overflaten alle SSLBs som ikke er immobilisert i mikrobrønner. De mikrobrønner og resulterende SSLB matriser har høy tetthet (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 mikrometer senter-til senteravstanden, og heksagonale periodisitet. Ved serie deponering SSLBs med forskjellig lipid sammensetning, er det mulig å lage flerkomponent matriser med tilfeldig plasserte SSLBs. For å demonstrere sensing evnen til SSLB arrays, brukte vi et samspill av kolera toksin (CTx) med en ganglioside (GM1) innarbeidet i SSLBs. Mednaturlige membran-partikler var vi i stand til å oppdage cellespesifikke lipider i multikomponent matriser inneholdende membranmaterialet fra to forskjellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Microfabrication av mikro Array Underlag

  1. Start med en 4 tommers silisiumskive med 100 nm av termisk vokst oksid.
  2. Spin SPR-955 0,7 fotoresist på silikonskiven ved 4000 opm i 30 sek.
  3. Bake på en varmeplate ved 115 ° C i 90 sek.
  4. Expose fotoresist.
    1. Bruk en maske som vil skape en mikrometer hull anordnet i et sekskantet oppstilling med et 3 mikrometer periode hvor matrisen omfatter et 2 mm x 2 mm-området.
    2. Eksponer skive i en i-linje stepper ved hjelp av en trinnstørrelse på 6 mm, og en eksponering på 200 mJ / cm 2.
  5. Bake på en varmeplate ved 115 ° C i 90 sek.
  6. Utvikle bruke en spin-utvikler å sette to pytter av CD-26 på wafer for en samlet utbygging tid på 90 sek.
  7. Skyll grundig med ultrarent DI vann og tørk med N 2.
  8. Etse oksid i en reaktiv-ion etcher for 6 min med 50 SCCM av Ar, 25 SCCM av CF 4, og 50 SCCM av CHF 3 flovingen ved et trykk på 75 mTorr.
  9. Ets silisium i en ICP dyp grøft-reaktiv-ione etcher i 2 min med 63 SCCM for C 4 F 8, 27 SCCM for SF 6, 40 SCCM for Ar, og 10 SCCM av O to strømmer ved et trykk på 14 mTorr.
  10. Skylling i aceton, metanol og isopropanol for å fjerne motstå.
  11. Sted i et bad av H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 for 10 min å rengjøre overflaten.
  12. Skyll grundig med ultrarent DI vann og tørk med N 2.
  13. Innskudd 1080 Å av Al 2 O 3 ved atom lag deponering ved 250 ° C.

2. Utarbeidelse av Poly (dimethylsiloxane) Nal

  1. Hvis det er mulig, arbeide i et renrom. Ellers jobber i den reneste miljøet mulig.
  2. Skaff en plast petriskål (eller en annen ren engangs beholder) med ≥ 13 mm sider.
  3. I denne parabolen, helle ut 5 g PDMS herder, etterfulgt av 50 g PDMS base middel (eller noe med et 01:10-forhold som for det meste vil fylle petriskål). Bland godt med en engangs plast pipette eller stang.
  4. Fjern bobler ved å plassere de blandede PDMS i et kammer med en vakuumledning, påføring av vakuum inntil boblene kommer ut av blandingen (ca. 30 min).
  5. Hvis det ikke allerede i petriskål, hell PDMS i petriskål, unngå etablering av luftbobler.
  6. Herde over natten på en varmeplate ved> 50 ° C (høyere varme for kortere tid fungerer også).
  7. Med ny / ren barberblad, kuttet nøye et rektangulært stykke ca 2,5 x 2,5 cm, holde toppen overflaten så ren som mulig. Skrell ut med en ren pinsett. Skjær av en kant (ned til 1,5 cm) ved å trykke ned på barberblad i én bevegelse, for å gjøre den øverste kanten så skarpe som mulig (dette vil være den kanten brukes i nal prosess).
  8. Rent med aceton, metanol, isopropylalkohol og ultrarent DI-vann, og deretter blåse tørt med ren nitrogengass. Oppbevar i en ren petriskål.

Tre. Utarbeidelse av Blemmer

  1. Samle lipid stamløsninger på 25 mg / ml, egg fosfatidylcholin (PC) og 1 mg / ml 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (lissamin rodamin B sulfonyl) ammoniumsalt (Rho-DPPE) in kloroform og en 0,5 mg / ml stamløsning av monosialoganglioside GM1 i kloroform / metanol (2:1 v / v).
  2. I en liten glassampulle lage en blanding som fører til 97 mol% PC, 2 mol% GM1 og 1 mol% Rho-DPPE ved tilsetning av 18,9 ul av 25 mg / ml PC, 39,6 mL av 0,5 mg / ml GM1 og 7,9 pl av 1 mg / ml Rho-DPPE ved hjelp av glassprøyter.
  3. Merk:. Den supplerende materiale for Nair et al 25 inneholder en utmerket passelig Excel regneark for beregning av mengder av lipider som kreves for å skape blemmer av noe ønsket komposisjon.
  4. Plasser beholderen i en vakuum-eksikator, og fjerne løsningsmidlet ved å forlate ampullen under vakuum i 6 timer.
  5. Lag en vandig oppløsning av 0.1M NaCl. Tilsett 0,5 ml av 0,1 M NaCl-løsning til en ampulle som inneholder den tørkede lipidfilmen.
  6. Tillat den vandige lipid-blandingen til å hvile over natten.
  7. Kort vortex blanding for å lage en vesikkelsuspensjon, deretter sonicate i 20 min i et bad sonicator ved romtemperatur.
  8. Ekstrudere vesikkelsuspensjon gjennom en polykarbonat membran med 100 nm pore størrelse. Før vesikkelsuspensjon gjennom filter 17x.
  9. Oppbevar ekstruderte vesikler i et hetteglass ved 4 ° C.

4. Dannelse av Kule Støttede lipid bilayers

  1. Samle 700 nm diameter SiO 2 perler. Perlene blir levert i destillert vann med et lager-konsentrasjon på 1,4 x 10 11 perler / ml.
  2. I en 1,5 ml Eppendorf-rør forbereder en 1 ml perlesuspensjon med en konsentrasjon på 1,5 x 10 10 perler / ml ved å tilsette 107 ul av vulsten stamløsning til 893 pl av 0.1 M NaCl.
  3. Vortex suspensjon for å sikre at det er vel miXED.
  4. Sentrifuger suspensjonen ved 1700 xg i 20 min og deretter kaste supernatanten. Resuspender perlene i 1 ml av 0,1 M NaCl. Gjenta dette to ganger mer grundig vasking av perlene.
  5. For å danne de SSLBs, i et 1,5 ml Eppendorf-rør legger til 25 pl av den SiO 2 perlesuspensjon til 200 ul av 1 mg / ml vesikkelsuspensjon. Vortex blandingen og la det stå i en time ved romtemperatur. På dette stadiet SSLB konsentrasjonen skal være 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
  6. Sentrifuger ved 1700 x g i 20 minutter for å pelletere SSLBs. Pelleten skal vises rosa grunn av brudd av vesikler med Rho-DPPE på perlene.
  7. Kast supernatanten og resuspender i 225 ul fosfatbufret saltvann (PBS), pH = 7,4. Gjenta trinn 04.06 til 04.07 to flere ganger for å fjerne eventuelle unruptured vesikler fra SSLB suspensjon.

5. Montering av SSLB Array

  1. Cleave wafer av mikro arrays resulterer i rektangulære stykker med 4-6 micRowell arrays per stykke.
  2. Vortex blande SSLB suspensjon, deretter plassere 10 mL av SSLB suspensjon på hver mikro array. Lest resten i 1 time for å tillate SSLBs å slå seg til overflaten.
  3. Forsiktig vaske mikromatrise chip med PBS fra en vaskeflaske, så senk i en PBS bad utarbeidet i et grunt fat.
  4. Mens neddykket, påfør PDMS nal flush på mikromatrise chip og forsiktig gli langs overflaten 5x å fjerne SSLBs som ikke er immobilisert i mikrobrønner.
  5. Grip den mikromatrise chip med pinsett og rist i PBS bad for å fjerne eventuelle overskytende SSLBs.
  6. Raskt fjerne brikken fra skrapen bad og plasser i en frisk PBS bad før videre bruk. Kontroller at toppen overflaten av brikken er fortsatt våt å bevare SSLBs.

Merk: Monteringsmetoden som er beskrevet ovenfor kan brukes til å lage sammensetninger av naturlige membran-partikler som, i likhet med myelin partikler isolert fra musehjerne, eller phospholipid vesikler uten de SiO 2 perle støtter. Dette arbeidet er beskrevet i detalj i Wittenberg et al. 21. og representative resultater er vist nedenfor.

6. Kolera toksinbindende analysen

  1. Tilbered en 2 mg / ml oppløsning av bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
  2. Forbered en løsning med ønsket konsentrasjon av Alexa 488-konjugert koleratoksin B-subenhet i PBS med 2 mg / ml BSA.
  3. Fjern SSLB rekke chip fra PBS bad og transportere bort det meste av PBS løsning ved hjelp av et laboratorium tørk. La akkurat nok PBS på brikken for å holde SSLB rekke hydrert.
  4. For å forhindre ikke-spesifikk binding, tilsett 200 ul av 2 mg / ml BSA-løsning til SSLB matrise chip. La resten i 1 time i en fuktet boks.
  5. Med en mikropipette, fjerne 200 pl av oppløsningen fra toppen av SSLB matrisen chip.
  6. Tilsett 200 ul av koleratoksin løsning på SSLB matrise-brikken, og la resten i 1 time i en fuktet boks.
  7. Forsiktig vaske SSLB rekke chip med PBS fra en vaskeflaske for å fjerne ubundet kolera toksin.
  8. Wick bort overflødig PBS ved hjelp av et laboratorium tørk. Før bildebehandling dekke chip med en 24 mm x 40 mm dekkglass.
  9. Bilde arrays med en oppreist mikroskop bruker filter setter hensiktsmessig for fluoroforene av interesse.
  10. Analyser fluorescensintensiteten av individuelle SSLBs i en matrise ved hjelp av den automatiske partikkelanalysefunksjonen ImageJ programvare.
  11. Kompilere gjennomsnitts fluorescensintensiteter fra individuelle SSLBs inn histogrammer som oppsummerer de intensiteter av SSLBs funnet på et gitt utvalg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når SiO to perler blandes med en løsning av vesikler som består av fosfolipider, fluorescerende lipider og andre lipider slik som gangliosider, vesikler briste på kuleflater SiO 2 for å danne SSLBs, som vist skjematisk i figur 1a. Etter vasking av SSLBs, blir en dråpe SSLB løsningen plassert på en mikrorekke og kulene får lov til å slå seg ned til overflaten. (Fig. 1B1) Dette kan også gjøres med en suspensjon av fosfolipid-vesikler eller naturlige membran-partikler som er vist på figur 1B2. En fluorescens bilde av fosfolipid-vesikler adsorbert til en mikromatrise substrat er vist i figur 1B3. Da PDMS nal er laget for å gli forsiktig over overflaten for å fjerne eventuelle SSLBs (figur 1C1), blemmer eller naturlig membran partikler (Figur 1c2) som ikke bosette seg i mikrobrønner. Dette resulterer i en SSLB matrise hvor hvermikro inneholder høyst ett SSLB (figur 1D1) eller en matrise der flere blemmer eller naturlige membran-partikler er i hvert mikro (figur 1d2). Et bilde av en microarray sammensatt av fluorescensmerkede vesikler er vist i figur 1d3.

Figur 1
.. Figur 1 Dannelse av SSLBs og SSLB rekke enheten (a) Illustrasjon av en SSLB består av tre typer lipider på en SiO 2 perle: egg PC (sort), Rho-DPPE (rød) og GM1 (blå). (B1-d1) prosessflyt for montering av en SSLB matrise som viser SSLBs spredt på en mikro array (b1), bruk av PDMS nal for å fjerne overflaten av SSLBs ikke avgjort i mikro (C1), og den endelige SSLB array (d1 ). (B2-d2 (B3) A fluorescens bilde av fosfolipid-vesikler adsorbert på en mikro substrat tilsvarende illustrasjonen i (b2). (D3) En fluorescens-bilde av en mikromatrise sammensatt av fosfolipid-vesikler som tilsvarer illustrasjonen i (d2). Tilpasset fra referanser 20 og 21, og brukes med tillatelse av American Chemical Society.

Individuelle SiO 2 perler støtter for SSLBs i mikro ble fotografert med scanning elektronmikroskopi (SEM) fra både vinklet top-view og tverrsnitts perspektiver. Et toppriss av et område omtrent 15 um x 15 um er vist i figur 2a, mens figur 2b viser et tverrsnitt av en enkelt perle immobilisert i enmikro. Den lettere lag belegg på mikro er 100 nm av Al 2 O 3 avsatt av atom-lag deponering å tune den godt diameter slik at brønnene er i stand til accomodating bare enkelt perler.

Fig. 2
Figur 2. Scanning elektronmikroskopi bilder av SSLB arrays. (A) Et elektronmikroskop av en 15 mm x 15 mm område viser SSLB perle støtter immobilisert i mikro arrays. (B) En enkelt 700 nm diameter SSLB i en mikro. Den mikro belegget er Al 2 O 3, som er avsatt for å krympe mikrobrønn, slik at bare enkelte perler kan passe inn. Tilpasset fra referanse 20 og brukes med tillatelse fra American Chemical Society.

Når SSLB matriser blir fremstilt, kan de bli avbildet ved fluorescens mikroskopi. Figur 3b viser et område med 550 mikrobrønner og 416 SSLBs for en beleggsprosent på 76%.

Sekvensiell avsetning av forskjellige typer SSLBs ble brukt til å lage matriser med mer enn en type SSLB, hvor identiteten til individuelle SSLBs ble bestemt ved fravær eller tilstedeværelse av et toksin-reseptoren (GM1) og dens binding av koleratoksin (CTx). Monteringsprosessen var den samme som for en enkelt SSLB type, men man har utført en andre gang med en annen SSLB identitet. Den starter konsentrasjon av SSLBs var 10x lavere for å redusere belegg av den første typen SSLB og å tillate flere ledige stillinger å være okkupert av den andre typen SSLB. I Tall 3c-3e, er en SSLB array med to typer SSLBs vist. All av de SSLBs inneholder røde fluorescerende Rho-DPPE (figur 3c), men bare noen av de SSLBs inneholder GM1, et gangliosid som er reseptoren for B-subenheten av CTx. Når de utsettes for grønn fluorescerende Alexa 488-konjugert CTx, bare de SSLBs inneholder GM1 fluoresce i den grønne kanalen (figur 3d). Når de røde og grønne bilder blir slått sammen, er det mulig å bestemme hvilke SSLBs inneholder GM1 (gul) og som ikke (rødt) (fig. 3e).

Figur 3
Fluorescens avbildning av SSLB arrays Figur 3... (A) En 100 pm x 100 pm-område inneholdende 936 Rho-DPPE-merkede egg PC SSLBs. (B) En lysfelt og fluorescens overlegg viser en SSLB med 76% av de mikro okkupert. (Ce) En SSLB array som inneholder SSLBs som inneholder Rho-DPPE(C), en fraksjon av dem inneholder også GM1, som er bundet med Alexa-488-konjugert CTx (d). (E) Fusjon av røde og grønne kanaler hvor colocalized fluorescens indikerer tilstedeværelse av GM1 på SSLB. De blå sirklene indikerer SSLBs som bare fluoresce rød, dvs. mangler GM1. Tilpasset fra referanse 20 og brukes med tillatelse fra American Chemical Society.

Fluorescens data fra SSLB matriser ble analysert ved å måle intensiteten av de enkelte SSLBs i et bilde. Den SSLB intensitetsdata fra matriser ble kompilert inn histogrammer. Figur 4a viser et slikt histogram fra analysen av Rho-DPPE fluorescens fra en SSLB matrise bestående utelukkende av SSLBs inneholdende egg-PC og en mol% Rho-DPPE. Dataene i figur 4a ble ervervet ved å analysere bildet i figur 3a. Vi fant SSLB arrays for å være robust og stabilt i minst én uke når nedkjølt ennd nedsenket i buffer. Arrays ikke mister noen fluorescens intensitet, heller ikke belegg av arrays endres i løpet av en uke (Figur 4b).

Figur 4
Figur 4 (a) histogram som viser fordelingen av fluorescensintensiteter for SSLB matrisen vist i figur 3a.. Den midlere intensitet for hver SSLB i rekken ble brukt til å kompilere histogrammet. Den heltrukne linjen er en Gaussisk tilpasning til dataene. (B) Mean rekke belegg (svarte sirkler) og fluorescens intensitet (røde firkanter) for en SSLB matrise overvåket i løpet av én uke. Tilpasset fra referanse 20 og brukes med tillatelse fra American Chemical Society.

Vi har gjort matriser bestående av SSLBs med varierende konsentrasjoner av GM1 (0, 0,5, 1 and 2 mol%) og utsatte dem for en fast konsentrasjon av CTx samt matriser med SSLBs med konsentrasjoner av GM1 og utsatte dem for varierende konsentrasjoner av CTx. Den senere forsøk ble benyttet for å bestemme likevekts-dissosiasjons-konstant (Kd) for GM1/CTx binding. De SSLB matriser med varierende konsentrasjon GM1 ble utsatt for 50 nM Alexa-488 merket CTx i 1 time og deretter vasket og fotografert. Intensiteten histogrammer for SSLB matriser med 0,5 til 2 mol% GM1 utsatt for 50 nM Alexa 488-konjugert CTx kan sees i figur 5a Figur 5b viser den lineære avhengighet av midlere fluorescensintensitet ved GM1-konsentrasjon.. Når konsentrasjonen av GM1 i SSLBs er fastsatt til 2 mol%, og de ​​SSLB matriser blir utsatt for CTx som strekker seg fra 16 pM til 158 nM, følger den bindende reaksjon sigmoidal kurver som vist på figur 5c. Kurvene passer til disse dataene er basert på to forskjellige bindingsmodeller: Langmuir isotermen (Eq. 1) og Hill-Waud modusl (Eq. 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ligning 1 (1)

Ligning 2 (2)

Hvor F er fluorescensintensiteten ved en gitt CTx konsentrasjon, er F max fluorescensintensiteten når bindingen er mettet, [CTx] er den konsentrasjon CTx, K D og K H er de dissosiasjonskonstanter fra Langmuir og Hill-Waud passer hhv , og n er cooperativity koeffisient i Hill-Waud modell. Den cooperativity koeffisient (n) anslår mengden av flerverdig binding, hvor et n er større ennen indikerer at hver CTx molekyl binder seg mer enn en GM1. Konsentrasjonen av CTx 0.5 x F max er den K D eller K H for GM1/CTx interaksjon. I våre forsøk beregnet vi en K D på 1,6 ± 0,2 nM og K H på 1,4 ± 0,2 nM med en n-verdi på 1,3, noe som indikerer kooperativ binding. De dissosiasjonskonstanter for GM1/CTx samhandling varierer mye i litteraturen, som strekker seg over 5 størrelsesordener fra 04:05 til 370 nM 26,27.

Figur 5
Figur 5. CTx/GM1 bindende analyser på SSLB arrays. (A) Histogrammer av fluorescensintensiteten av individuelle SSLBs innenfor SSLB matriser. De matriser inneholdt SSLBs med 0,5, 1 eller 2 mol% GM1, og ble utsatt for 50 nM Alexa 488-konjugert CTx. Denheltrukne linjer er Gaussisk passer. (B) Plot av fordelingsinnretningen fra (a) som en funksjon av GM1-konsentrasjon. (C) Bindende kurver som viser fordelingen betyr fra matriser inneholder SSLBs med 2 mol% GM1 etter eksponering til Alexa-488-konjugert CTx varierende fra 16 pm til 158 nM. Linjene er passer til Langmuir isotermen (rød) og Hill-Waud (blå) bindende modeller. De feilfelt i (bc) representerer standardavvik av fordelinger av fluorescens intensitet som tilsvarer hvert datapunkt. Tilpasset fra referanse 20 og brukes med tillatelse fra American Chemical Society.

Som nevnt tidligere, er det også mulig å danne matriser med biomembrane materiale avledet fra naturlige kilder 21. De matriser er dannet på samme måte, ved å dispergere membran-partikler på en mikrobrønn-substrat, og deretter å rense den øvre overflate med nalen for å etterlate membranpartikler i micRowells. Figur 6 viser eksempler på myelin og nevronale lipid flåte mikromatriser. I figur 6a, blir myelin partikler merket med den lipofile fluoroforen FM1-43. Lipid flåter er kjent for å bli anriket på cholesterol og gangliosider som GM1; Således binder Alexa 488-konjugert CTx sterkt til lipid Flåte mikromatriser, som vist i figur 6b, mens fluorescensmerkede streptavidin (SAPE) ikke binder til matrisen. (Figur 6c) Vi har også opprettet stripe arrays ved å levere myelin og lipid flåte partikler til mikro underlaget med en microfluidic chip med 250 mikrometer brede kanaler. Etter partikkel levering, ble microfluidic chip løsrevet fra mikro underlaget og nal prosess utført som vanlig. Den stripe matriser ble deretter eksponert for en fluorescerende anti-oligodendrocyte IgM-antistoff (IgM O4), som binder sulfatidantistoffer funnet i myelin. (Figur 7) Den myelin og lipid flåte stripe microarrays i figur 7 er vist ved økende nivåer av forstørrelsen, og at det høyeste nivå av forstørrelse, er det innlysende at IgM O4 bare bindes til de myelin mikromatriser fordi sulfatidantistoffer er fraværende fra lipid flåter.

Figur 6
Figur 6. Myelin partikkel og nevronale lipid flåten partikkel arrays. (A) En myelin partikkelmicroarray hvor myelin partiklene er gjengitt fluorescerende av den lipofile fluoroforen FM1-43. Den stiplede linjen viser kanten av matriseområdet. (B) Lipid flåte microarray viser CTx binding til lipid flåten partikler. (C) Lipid flåte microarray utsatt for fluorescerende streptavidin-fysoerytrin (SAPE) viser liten eller ingen spesifikk binding. Tilpasset fra referanse 21 og brukes med tillatelse av American Chemical Societyiety.

Figur 7
Figur 7. Multikomponent arrays dannet av microfluidic levering av myelin og nerve flåte membraner. (A) Fluorescens bilde etter myelin og flåter ble avsatt via microfluidic kanaler på microarray underlaget. Venstre og høyre striper inneholder myelin og midt stripe inneholder nevronale flåte membraner. Membranene er farget med FM1-43, hvilke etiketter all lipid materiale. Målestokk er 250 mikrometer. (B) fluorescens bilde av de samme tre striper etter påføring av PDMS nalen og ruger med IgM O4. Målestokk er 250 mikrometer. (CE) Forstørrede bilder fra de tre stripene som viser at IgM O4 bare binder seg til myelin mikromatriser: (c) venstre stripen og (e) skudd med høyre stripe. Skalaen barer i panels ce er 30 mikrometer. Tilpasset fra referanse 21 og brukes med tillatelse fra American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet viser vi at monodisperse SiO to kuler belagt med støttede lipid dobbeltlag kan være sammenstilt i mikro arrays uten behov for målretting ligander på lipid-dobbeltlag, eller substratets overflate, og de ​​matriser kan anvendes for å karakterisere toksin-lipid interaksjonene. Den dissosiasjonskonstant beregnet vi for CTx/GM1 binding sammenligner gunstig, gitt stor spredning av verdiene i litteraturen, med en tidligere rapport av Winter et al. Hvor kolloidal sammenstilling av lipid-belagte perler ble brukt til å beregne en dissosiasjonskonstant på omtrent 30 nM. Ved å tilpasse dataene til Hill-Waud bindingsmodell, har vi fastslått at CTx/GM1 interaksjonen sannsynligvis multivalent, som stemmer overens med tidligere rapporter 28. Den B (gangliosid binding) subenheten av CTx eksisterer som en pentamer, med hver av de fem enheter som er i stand til å binde en GM1-molekyl 29; således, er det ikke overraskende at mer enn en underenhet kan være bundet gitt diffusive mobilitet av GM1 i SLBs 30.

Tabeller med kjemisk functionalized perler har blitt brukt i andre analytiske studier 31. I disse typer av eksperimenter, blir perlene vanligvis immobilisert i mikrobrønner laget i enden av etsede optiske fibre. Multiplex fluorescens-analyser kan utføres i denne konfigurasjonen ved å blande subpopulasjoner av perler og immobilisering av dem samtidig på enden av den optiske fiberen 32.. I vår multiplex-analysen (figur 3c-3e), vi immobilisert optisk kodede SSLBs sekvensielt fordi lipider på SSLBs gratis i løsningen kunne overføres fra én type SSLB til en annen 33. Selv om dette gir ekstra trinn i fremstillingen av SSLB matriser, er det ikke altfor tidskrevende og er den mest effektive metode for lipid-funksjonalisert perler. Vi har også romlig kodet matriser ved å sette forskjellige SSLB populasjoner i tilliggende mikro matriser, og det er ikke noe observerbart cross-talk mellom arrays 20. For å redusere sample-forberedelse ganger, kan SSLB arrays være forberedt på forhånd og brukes når det er ønskelig. Vi testet for stabiliteten av matriser i løpet av en uke, og fant ingen signifikant nedbrytning av matriser i form av fluorescens-intensitet, noe som indikerer at mengden av fettmateriale på SSLBs ikke endrer seg med tiden. Også gjør matrisen belegg ikke endres over tid, noe som tyder på at når SSLBs er immobilisert, har de ikke løsner fra mikrobrønnene (Figur 4b).

I tillegg til perler belagt med syntetiske lipid bilayers, har vi også brukt denne metoden for å lage matriser av naturlige membranpartikler 21. I dette arbeidet har vi immobilisert myelin partikler avledet fra musehjerne, samt neuronale membranpartikler, som for eksempel lipid-flåten fraksjon. Vi var i stand til å bruke matriser for å identifisere cellespesifikk membranoverflatemolekyler ved antistoff binding (fig. 6 og 7). Videre, når størrelsen på mikrobrønnene ble redusert til nanoskala, og den øvre overflate av matrisen ble belagt med gull, var vi i stand til å bruke overflate-plasmonresonans å overvåke bindingen av antistoffer mot myelin-membran-partikler uten bruk av fluorescerende markører. Den store forskjellen mellom hjelp SSLB og vesikler eller naturlige membran-partikler for å danne matriser er at i tilfelle av SSLBs den nøyaktige mengden av membranmateriale i hver mikrobrønn er kjent fordi bare en enkelt perle kan passe inn i hver brønn. Med vesikler eller naturlige membran-partikler, er det ingen måte å kontrollere mengden av materiale i hver mikrobrønn, annet enn for å justere startkonsentrasjonen av vesikler eller partikler. Imidlertid er det godt-til-brønn variasjon av antallet blemmer ikke er meget stor, sammenlignet med fordelingen av vesikkel diametre 21.

Til slutt, kan denne metoden har diverse fremtidige søknader. Junesch og kollegaer har ansatt en nal for å fjerne nanopartikler under kolloidalt litografi nanofabrication 34. Membran arrays kunne bli dannet for å etterligne celle-celle kontakter for å undersøke mobilnettet brennvidde heft 35 eller undersøke binding av membran kurvatur-sensing proteiner 36. I tillegg ville bruken av porøse kuler lette inkludering av transmembrane proteiner til lipid dobbeltlag 37 eller lokal levering av lagret gods til celler dyrket på en biomembrane matrise substrat. Den mikro plattformen er fabrikkert av fotolitografi, som gir mulighet for fleksibilitet i design. Her er våre arrays hadde sekskantede geometri, men firkantet, lineær, eller andre geometrier kan lages med varierende utvalg periodisitet og mikro dimensjoner for å undersøke romlige effekter av fokal vedheft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til SHO fra National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIERE Award og DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program og Minnesota Partnership Award for bioteknologi og Medisinsk Genomics. Device fabrikasjon ble utført ved University of Minnesota Nanofabrication Center (NFC), som mottar støtte fra NSF gjennom National Nanoteknologi Infrastructure Network. Dette arbeidet ble også støttet med tilskudd til MR fra National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Foundations og MCNEILUS familien. Forfatterne ønsker å takke Hyungsoon Im for å få hjelp med illustrasjoner og Shailabh Kumar for hjelp med scanning elektronmikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
  2. Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
  3. Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
  5. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
  6. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  7. Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
  8. Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
  9. Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
  10. Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
  11. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
  12. Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
  13. Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
  14. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
  15. Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
  16. Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
  17. Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
  18. Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
  19. Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
  20. Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
  21. Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
  22. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
  23. Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
  24. Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
  25. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
  26. Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
  27. Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
  28. Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
  29. Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
  30. Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
  31. Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
  32. Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
  33. Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
  34. Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
  35. Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
  36. Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
  37. Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).

Tags

Bioteknologi støttet lipidbilag perler microarray fluorescens microfabrication nanofabrication atom lag deponering myelin lipid flåter
Dannelse av biomembranen Mikromatriser med en nal-basert Assembly Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W.,… More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter