Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501

Summary

طبقات ثنائية الدهون بدعم والجزيئات الغشاء الطبيعية هي أنظمة مريحة التي يمكن تقريب خصائص أغشية الخلايا وإدراجها في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات التحليلية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لإعداد ميكروأرس تتكون من أيد الدهون المغلفة طبقة ثنائية شافي 2 حبات، حويصلات فوسفورية أو جزيئات الغشاء الطبيعية.

Abstract

الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية تشكل أغشية البلازما من الخلايا وتحديد العضيات التحت خلوية حدود. في الطبيعة، وهذه الأغشية هي مزيج غير متجانس من العديد من أنواع الدهون، وتحتوي على بروتينات غشاء محدد وزينت مع الكربوهيدرات. في بعض التجارب، فمن المستحسن أن فصل الخصائص الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية أو من طبقة ثنائية المادة الدهنية من تلك الغشاء الطبيعية. مثل هذه الحالات تدعو إلى استخدام نظم نموذج مثل حويصلات العملاقة، الجسيمات الشحمية أو طبقات ثنائية الدهون المدعومة (SLBs). صفائف SLBs جذابة بشكل خاص للتطبيقات الاستشعار عن بعد ومحاكاة التفاعلات خلية خلية. نحن هنا تصف طريقة جديدة لتشكيل المصفوفات SLB. والمغلفة Submicron قطرها شافي 2 حبات الأولى مع طبقات ثنائية الدهون لتشكيل SLBs كروية (SSLBs). ثم تترسب حبات في مجموعة من microwells submicron ذات القطر الصغير التجهيز. يستخدم تقنية التحضير ل"ممسحة" لتنظيف سطح الركيزة، في حين اغادرز وراء SSLBs التي استقرت في microwells. يتطلب هذا الأسلوب أي تعديل الكيميائية الركيزة microwell، ولا أي بروابط تستهدف بشكل خاص على SSLB. ويشغل Microwells بواسطة الخرز واحد لأن يتم ضبطها قطر جيدا أن مجرد أكبر من قطر حبة. عادة، يتم المحتلة أكثر من 75٪ من الآبار، في حين أن بقية تبقى فارغة. في المخزن عرض صفائف SSLB الاستقرار على المدى الطويل من الاسبوع أكبر من واحد. أنواع متعددة من SSLBs يمكن وضعها في مجموعة واحدة عن طريق ترسب المسلسل، وصفائف يمكن استخدامها للاستشعار، والتي علينا أن نظهر من خلال تميز تفاعل بكتيريا الكوليرا مع غانغليوزيد GM1. وتبين لنا أيضا أن الحويصلات فوسفورية دون الدعم حبة وbiomembranes من مصادر الخلوية يمكن المحتشدة مع نفس الأسلوب ويمكن تحديد نسبة الدهون في غشاء الخلية محددة.

Introduction

الأغشية الدهنية طبقة ثنائية هي هياكل الأساسية في الطبيعة. وتتكون الأغشية الخلوية والأغشية البلازما عضية من طبقات ثنائية الدهون التي تضم عددا من الجزيئات التي هي ضرورية للحياة. تحدث العديد من العمليات إدامة الحياة على سطح الخلايا أو بوساطة الجزيئات المرتبطة الأغشية الدهنية، طبقة ثنائية. في الواقع، تم العثور على العديد من الأدوية العمليات المستهدفة أو الجزيئات أو في الأغشية 1،2. وبالتالي فإنه من الضروري التحقيق في العمليات التحليلية، مثل التفاعلات الكيميائية أو الأحداث ملزمة noncovalent التي تحدث على أسطح الأغشية. لأن الأغشية الطبيعية يمكن أن يكون من الصعب عزل و / أو التفاعل مع أجهزة الاستشعار، والعديد من الباحثين استخدام الأغشية نموذج مبسط لإجراء دراسات تحليلية. ووصف عدد من أنظمة غشاء نموذج في الأدب، بدءا من حويصلات العملاقة التي يمكن أن يكون عشرات ومئات من ميكرون في القطر إلى الجسيمات الشحمية ذات أبعاد النانو 3،4. Alternatively، طبقات ثنائية مستو الدهون تترسب على الدعم الصلبة، أي بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs)، يمكن تشكيلها على عدد من الأسطح المختلفة، واستخدمت على نطاق واسع في التطبيقات الفيزيائية الحيوية، والكيمياء الحيوية، والتحليلية 5. اقتران SLBs مع المواد الكهربائية أو الضوئية يمكن التحقيق في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الغشاء من خلال استخدام التقنيات التحليلية المختلفة. مضان المجهري 6، 7 الكيمياء الكهربائية، التحليل الطيفي الضوئي 8، 9 المجهر التحقيق، مأكل سطح الرنين 10، وقياس الطيف الكتلي 11 كلها قد استخدمت لدراسة بنية وخصائص SLBs.

صفائف SLB تقدم براعة إضافية في تصميم أجهزة استشعار لفحوصات متعددة 12،13. تطبيقات أخرى استخدام صفائف SLB لتقليد مفترق التي تشكل بين الخلايا المناعية 14. وقد اختلفت أساليب إعداد للصفائف SLB من microfluنهج idic 15 إلى تلك التي توظف الحواجز المادية بين بقع SLB المجاورة. استخدمت 16 مجموعات أخرى أساليب الطباعة 17، الزخرفة الضوئية 18 ومختلف النهج nanoengineering 19 إلى إنشاء صفائف SLB.

في هذه الورقة والفيديو المرفقة ونحن لشرح طريقة لتشكيل المصفوفات SLB عن طريق إيداع SLB المغلفة شافي 2 حبات في صفائف أمر من microwells 20. نشير إلى SLB المغلفة شافي 2 حبات كروية طبقات ثنائية الدهون كما دعمت (SSLBs). هذه التقنية هو امتداد لعمل سابق أن خلق صفائف الحويصلات فوسفورية وbiomembranes المستمدة من مصادر طبيعية 21، التي تبين لنا أيضا نتائج سبيل المثال. وقد اعتمدت أساليب أخرى لarraying جزيئات غشاء حيوي أو حويصلات على أنماط بروابط استهداف محددة على الأسطح التي اقترانه بروابط التكميلية الواردة على سطح الحويصلة. وتشمل الأمثلة البيوتين-جمعية أفيدين 22،23 ومخططات تهجين الحمض النووي 24. نهجنا يتطلب سوى مجموعة microwell مع أي استهداف أو الاعتراف الأنصاف اللازمة. ويعرف حجم SSLBs من قبل قطر تدعم حبة شافي والتي تعاني من انخفاض بولي التبعثر. عن طريق ضبط قطر microwell للتو أكبر من قطر SSLB، سوى SSLB واحدة يستقر في كل microwell. A بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) ممسحة ثم يزيل من على سطح الأرض كل SSLBs التي لا يجمد في microwells. وmicrowells والمصفوفات SSLB الناتجة لديها كثافة عالية (~ 10 5 SSLBs / مم 2) مع 3 ميكرون مركز إلى مركز تباعد وتيرة سداسية. عن طريق إيداع متسلسل SSLBs مع التراكيب الدهون مختلفة، فمن الممكن لإنشاء صفائف متعدد المكونات مع SSLBs وضعه بشكل عشوائي. للتدليل على قدرة الاستشعار صفائف SSLB، استخدمنا تفاعل بكتيريا الكوليرا (CTX) مع غانغليوزيد (GM1) دمجها في SSLBs. معجزيئات الغشاء الطبيعي، تمكنا من الكشف عن نسبة الدهون في خلايا محددة في المصفوفات المتعددة المكونات التي تحتوي على مادة غشاء من اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التصنيع الدقيق من Microwell صفيف الركيزة

  1. تبدأ مع رقاقة السيليكون 4 بوصة مع 100 نيوتن متر من أكسيد نمت حراريا.
  2. تدور SPR-955 0.7 مقاوم الضوء على الرقاقة عند 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  3. خبز على موقد في 115 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
  4. فضح مقاومة للضوء.
    1. استخدام قناع التي من شأنها خلق 1 ميكرومتر الثقوب وترتيبها في مجموعة سداسية مع فترة 3 ميكرون حيث تغطي مجموعة 2 مم × 2 مم المجال.
    2. فضح رقاقة السائر في خط ط باستخدام حجم خطوة من 6 مم وتعرض 200 ميغا جول / سم 2.
  5. خبز على موقد في 115 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
  6. تطوير استخدام مطور تدور لإيداع 2 برك من CD-26 على الرقاقة لفترة تطوير مجموعه 90 ثانية.
  7. شطف جيدا مع الماء عالى النقاء والجافة مع DI N 2.
  8. حفر أكسيد مطبوع في رد الفعل ايون لمدة 6 دقائق مع 50 من سورة SCCM، 25 SCCM من CF و 50 SCCM من CHF 3 فلوالجناح عند ضغط 75 mTorr.
  9. حفر السيليكون في برنامج المقارنات الدولية في أعماق خندق رد الفعل ايون مطبوع لمدة 2 دقيقة مع 63 SCCM من C 4 F 27 SCCM من SF 40 من سورة SCCM، و 10 SCCM من O 2 تتدفق عند ضغط 14 mTorr.
  10. شطف في الأسيتون، والميثانول، والأيزوبروبانول لإزالة مقاومة.
  11. المكان في حمام من H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 لمدة 10 دقيقة لتنظيف السطح.
  12. شطف جيدا مع الماء عالى النقاء والجافة مع DI N 2.
  13. إيداع 1،080 Å من آل 2 O 3 بواسطة ترسب طبقة الذرية في 250 درجة مئوية.

2. تحضير بولي (dimethylsiloxane) الممسحة

  1. إذا كان ذلك ممكنا، والعمل في غرف الأبحاث. العمل على خلاف ذلك في بيئة أنظف ممكن.
  2. الحصول على طبق بتري البلاستيكية (أو غيرها من الحاويات المتاح نظيفة) مع الجانبين ≥ 13 مم.
  3. في هذا الطبق، من اجل الخروج 5 ز كيل PDMS علاج، تليها 50 ز PDMS وباوكيل البريد (أو أي شيء مع نسبة 01:10 من شأنها أن تملأ معظمها طبق بيتري). تخلط جيدا مع ماصة البلاستيك القابل للتصرف أو قضيب.
  4. إزالة الفقاعات من خلال وضع PDMS مختلطة في غرفة مع خط فراغ، وتطبيق فراغ حتى يخرج فقاعات من الخليط (حوالي 30 دقيقة).
  5. إن لم يكن بالفعل في طبق بيتري، صب PDMS في طبق بيتري، وتجنب خلق فقاعات الهواء.
  6. علاج بين عشية وضحاها على موقد في> (يعمل أيضا ارتفاع الحرارة لوقت أقل) 50 درجة مئوية.
  7. مع الجديد / شفرة حلاقة نظيفة، وقطع بعناية قطعة مستطيلة حوالي 2.5 × 2.5 سم، وحفظ السطح العلوي نظيفة قدر الإمكان. قشر خارجا مع ملقط نظيفة. تقليم قبالة حافة واحدة (وصولا الى 1.5 سم) عن طريق الضغط باستمرار على شفرة حلاقة في اقتراح واحد، لجعل أعلى الحافة الحادة قدر الإمكان (وهذا سوف يكون على حافة المستخدمة في عملية ممسحة).
  8. نظيفة مع الأسيتون، والميثانول، ايزوبروبيل، وعالى النقاء المياه DI، ثم ضربة الجافة مع غاز النيتروجين نظيفة. تخزين في طبق بتري نظيفة.

3. إعداد الحويصلات

  1. جمع الدهون الحلول الأسهم من فسفاتيديل 25 ملغ / مل البيض (PC) و 1 ملغ / مل 1،2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (lissamine رودامين B السلفونيل) ملح الأمونيوم (رو DPPE) في الكلوروفورم و0.5 ملغ / مل من محلول المخزون monosialoganglioside GM1 في الكلوروفورم / الميثانول (2:1 ت / ت).
  2. في قارورة زجاجية صغيرة جعل المزيج الذي ينتج 97٪ PC مول، مول 2٪ GM1 و 1٪ مول رو DPPE بإضافة 18.9 ميكرولتر من 25 ملغ / مل PC، 39.6 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل GM1 و 7.9 ميكرولتر من 1 ملغ / مل رو DPPE استخدام المحاقن الزجاجية.
  3. ملاحظة: المواد التكميلية لناير وآخرون 25 يحتوي على تخصيص جداول البيانات إكسل ممتازة لحساب كميات من الدهون المطلوبة لإنشاء الحويصلات من أي تكوين المطلوب.
  4. وضع القارورة في مجفف الفراغ وإزالة المذيب من خلال ترك القارورة تحت فراغ لمدة 6 ساعة.
  5. جعل محلول مائي من 0.1M كلوريد الصوديوم. إضافة 0.5 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M الحل لالقارورة التي تحتوي على الدهون فيلم المجففة.
  6. السماح للخليط الدهن المائي للراحة بين عشية وضحاها.
  7. باختصار مزيج دوامة لإنشاء تعليق الحويصلة، ثم يصوتن لمدة 20 دقيقة في حمام sonicator في درجة حرارة الغرفة.
  8. بثق تعليق الحويصلة عبر غشاء البولي مع 100 نانومتر حجم المسام. تمرير تعليق الحويصلة من خلال 17X التصفية.
  9. تخزين الحويصلات مقذوف في قارورة زجاجية في 4 درجات مئوية.

4. تشكيل كروية المدعومة الدهون طبقات ثنائية

  1. جمع 700 نانومتر قطر شافي 2 الخرز. يتم توفير حبات في الماء المقطر مع تركيز الأسهم من 1.4 × 10 11 حبات / مل.
  2. في أنبوب 1.5 مل إيبندورف إعداد حبة التعليق 1 مل بتركيز 1.5 × 10 10 حبات / مل بإضافة 107 ميكرولتر من محلول المخزون حبة إلى 893 ميكرولتر من 0.1 M كلوريد الصوديوم.
  3. دوامة تعليق لضمان أنها كذلك ميلxed.
  4. الطرد المركزي تعليق على 1،700 x ج لمدة 20 دقيقة ثم تجاهل طاف. resuspend والخرز في 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر ليغسل جيدا الخرز.
  5. لتشكيل SSLBs، في أنبوب 1.5 مل إيبندورف إضافة 25 ميكرولتر من تعليق حبة شافي 2 إلى 200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حويصلة التعليق. دوامة الخليط واسمحوا الوقوف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في هذه المرحلة يجب أن يكون تركيز SSLB 1.7 × 10 9 SSLBs / مل.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 20 دقيقة لتكوير SSLBs. يجب أن تظهر بيليه الوردي بسبب تمزق الحويصلات مع رو DPPE على الخرز.
  7. تجاهل طاف و resuspend في 225 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة = 7.4. كرر الخطوات من 4،6-4،7 مرتين أكثر لإزالة أي الحويصلات unruptured عن تعليق SSLB.

5. جمعية SSLB صفيف

  1. رقاقة يلتصق صفائف microwell مما أدى إلى قطع مستطيلة مع هيئة التصنيع العسكري 4-6صفائف رويل للقطعة الواحدة.
  2. دوامة خلط تعليق SSLB، ثم ضع 10 ميكرولتر من SSLB التعليق على كل مجموعة microwell. لئلا تبقى لمدة 1 ساعة للسماح SSLBs ليستقر على السطح.
  3. بلطف غسل رقاقة مجموعة microwell مع برنامج تلفزيوني من زجاجة غسل، ثم يغرق في حمام PBS أعدت في طبق ضحل.
  4. بينما المغمورة، ضع برفق PDMS دافق ممسحة على رقاقة مجموعة microwell وحرك برفق على طول سطح 5X لإزالة SSLBs التي لا يجمد في microwells.
  5. قبضة رقاقة مجموعة microwell مع ملاقط وبلطف يهز في الحمام لإزالة أي برنامج تلفزيوني SSLBs الزائدة.
  6. بسرعة إزالة رقاقة من الحمام ممسحة ووضع في حمام برنامج تلفزيوني جديد حتى استخدامها مرة أخرى. تأكد من أن السطح العلوي للرقاقة لا يزال الرطب للحفاظ على SSLBs.

ملاحظة: أسلوب التجميع المذكورة أعلاه يمكن استخدامها لإنشاء صفائف جزيئات الغشاء الطبيعي، مثل جزيئات المايلين المعزولة من مخ الفأر، أو بوالحويصلات spholipid دون الدعم حبة شافي 2. يوصف هذا العمل بالتفصيل في فيتنبرغ وآخرون 21 ويتم عرض نتائج ممثلة أدناه.

6. الكوليرا السمية تجليد الفحص

  1. إعداد محلول 2 ملغ / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني.
  2. يعد حل مع التركيز المطلوب من اليكسا 488 مترافق بكتيريا الكوليرا B-الوحيدات في برنامج تلفزيوني مع 2 ملغ / مل BSA.
  3. إزالة مجموعة رقاقة SSLB من حمام PBS والفتيل بعيدا أكثر من الحل PBS باستخدام مختبر قضاء. ترك ما يكفي PBS على الرقاقة للحفاظ على مجموعة SSLB رطب.
  4. لمنع الربط غير محددة، إضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ / مل BSA حل لمجموعة رقاقة SSLB. دعونا بقية لمدة 1 ساعة في مربع مرطب.
  5. مع micropipette، وإزالة 200 ميكرولتر من الحل من الجزء العلوي من مجموعة رقاقة SSLB.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من الحل الكوليرا السم لمجموعة رقاقة SSLB وترك بقية لمدة 1 ساعة في مربع مرطب.
  7. بلطف غسل مجموعة رقاقة SSLB مع برنامج تلفزيوني من زجاجة غسل لإزالة أي سموم الكوليرا غير منضم.
  8. الفتيل الزائدة بعيدا PBS باستخدام مختبر قضاء. قبل التصوير غطاء رقاقة مع الانزلاق 24 مم × 40 مم غطاء.
  9. صفائف الصورة مع المجهر تستقيم باستخدام فلتر يحدد المناسبة لfluorophores من الفائدة.
  10. تحليل كثافة مضان من SSLBs الفردية في صفيف باستخدام وظيفة تحليل الجسيمات الآلي البرمجيات يماغيج.
  11. تجميع كثافة مضان يعني من SSLBs الفردية في رسوم بيانية تلخص شدة SSLBs العثور على مجموعة معينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما يتم خلط شافي 2 حبات بمحلول مكون من حويصلات مؤلفة من الدهون الفوسفاتية والدهون الفلورسنت والدهون الأخرى مثل gangliosides، تمزق الحويصلات على السطوح حبة شافي 2 لتشكيل SSLBs، كما هو مبين تخطيطي في الشكل 1A. بعد غسل SSLBs، يتم وضع قطرة من حل SSLB على مجموعة microwell، ويسمح للالخرز لتستقر في السطح. ويمكن أيضا (الشكل 1B1) أن يتم ذلك مع تعليق من الحويصلات فوسفورية أو جزيئات الغشاء الطبيعي، والتي تظهر في الشكل 1B2. يظهر صورة مضان من الحويصلات فوسفورية كثف إلى ركيزة مجموعة microwell في الشكل 1B3. ثم يتم إجراء ممسحة PDMS إلى الشريحة بلطف عبر السطح لإزالة أي SSLBs (الشكل 1C1)، حويصلات أو جزيئات الغشاء الطبيعي (الشكل 1C2) التي لم تستقر في microwells. هذه النتائج في مجموعة SSLB فيها كليحتوي microwell على الأكثر واحدة SSLB (الشكل 1D1) أو صفيف حيث حويصلات متعددة أو جزيئات الغشاء الطبيعية هي في كل microwell (الشكل 1d2). وأظهرت صورة لميكروأري تتألف من fluorescently المسمى الحويصلات في الشكل 1d3.

الشكل 1
. الشكل 1 تشكيل SSLBs وSSLB التجمع مجموعة (أ) توضيحات من SSLB تتكون من 3 أنواع من الدهون على شافي 2 حبة: PC البيض (أسود)، رو DPPE (الحمراء) وGM1 (الازرق). (B1-D1) تدفق عملية لتجميع مجموعة SSLB تظهر SSLBs متناثرة على مجموعة microwell (B1)، واستخدام ممسحة PDMS لمسح سطح SSLBs لا استقر في (C1) microwells، وSSLB مجموعة النهائي (D1 ). (B2-D2 (B3) صورة مضان من الحويصلات فوسفورية كثف على ركيزة microwell الموافق التوضيح في (B2). (D3) صورة مضان من ميكروأري تتألف من الحويصلات فوسفورية الموافق التوضيح في (D2). مقتبس من المراجع 20 و 21 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

فرد شافي 2 حبات يدعم لتم تصوير SSLBs في microwells مع المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) من كل من الزاوية العلوية الرأي ووجهات النظر مستعرضة. وجهة نظر أعلى منطقة ويظهر حوالي 15 ميكرومتر × 15 ميكرون في الشكل 2A، في حين يبين الشكل 2B وجهة نظر مستعرضة من حبة واحدة يجمد فيmicrowell. طبقة طلاء أخف وزنا هو 100 نانومتر microwell من آل 2 O 3 أودعتها ترسب طبقة ذرية لضبط قطر جيدا بحيث الآبار هي قادرة على استيعاب سوى الخرز واحد.

الرقم 2
صور الشكل 2. الضوئي المجهر الإلكتروني صفائف SSLB. (أ) صورة مجهرية الإلكترون من 15 ملم × 15 ملم منطقة تظهر يدعم حبة SSLB يجمد في صفائف microwell. (ب) واحد قطره 700 نانومتر SSLB في microwell. طلاء microwell هو آل 2 O والتي أودعت لتقليص microwell بحيث حبات الفردية فقط يمكن أن يصلح في الداخل. مقتبس من المرجع 20 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

مرة واحدة يتم إعدادها صفائف SSLB، ويمكن تصويرها بواسطة المجهر مضان. الشكل 3B منطقة مع 550 و 416 microwells SSLBs لنسبة الإشغال من 76٪.

وقد استخدم ترسب متتابعة من أنواع مختلفة من SSLBs لإنشاء صفائف مع أكثر من نوع واحد من SSLB، حيث تم تحديد هوية SSLBs الفردية بسبب غياب أو وجود مستقبلات السم (GM1) ولها صفة الإلزام للبكتيريا الكوليرا (CTX). كانت عملية التجميع نفس لنوع واحد ولكن SSLB أجريت للمرة الثانية مع هوية SSLB مختلفة. كان تركيز بدءا من SSLBs 10X أقل للحد من إشغال النوع الأول من SSLB والسماح للمزيد من الشواغر التي سوف يشغلها النوع الثاني من SSLB. في الأرقام 3C-3E، يظهر مجموعة SSLB مع نوعين من SSLBs. آللتر من SSLBs تحتوي على أحمر فلوري رو DPPE (الشكل 3C)، ولكن فقط بعض من SSLBs تحتوي GM1، وهو غانغليوزيد هذا هو مستقبل لB-الوحيدات من CTX. عندما تتعرض لالفلورية الخضراء اليكسا 488 مترافق CTX، فقط SSLBs تحتوي على GM1 يتألق في قناة خضراء (الشكل 3D). عندما يتم دمج الصور الأحمر والأخضر، فمن الممكن لتحديد والتي تحتوي على SSLBs GM1 (الصفراء) والتي لا (أحمر) (الشكل 3E).

الرقم 3
الشكل 3. التصوير الإسفار من صفائف SSLB. (أ) 100 × 100 ميكرومتر ميكرومتر منطقة تحتوي على 936 رو DPPE المسمى SSLBs PC البيض. (ب) brightfield ومضان تراكب يظهر SSLB مع 76٪ من microwells المحتلة. (م) وهناك مجموعة SSLB تحتوي على SSLBs التي تحتوي على رو DPPE(ج)، جزء منها تحتوي أيضا على GM1، والتي تلتزم اليكسا-488-مترافق CTX (د). (ه) دمج قنوات الأحمر والأخضر حيث يشير مضان colocalized وجود GM1 على SSLB. وتشير الدوائر الزرقاء SSLBs أن يتألق فقط أحمر، أي تفتقر GM1. مقتبس من المرجع 20 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

تم تحليل البيانات مضان من صفائف SSLB عن طريق قياس كثافة SSLBs الفردية في صورة ما. وجمعت البيانات من شدة SSLB صفائف في رسوم بيانية. يبين الشكل 4A احدة من هذا القبيل الرسم البياني من تحليل رو DPPE مضان من مجموعة تتألف فقط من SSLB SSLBs تحتوي PC البيض و 1٪ مول رو DPPE. تم الحصول على البيانات في الشكل 4A من خلال تحليل الصورة في الشكل 3A. وجدنا صفائف SSLB أن تكون قوية ومستقرة لمدة أسبوع واحد على الأقل عندما المبردة والثانية المغمورة في المنطقة العازلة. لم صفائف لا تفقد أي كثافة مضان، ولم إشغال صفائف تغيير على مدى أسبوع واحد (الشكل 4B).

الرقم 4
الشكل 4 (أ) يظهر الرسم البياني توزيع كثافة مضان لمجموعة SSLB هو مبين في الشكل 3A. تم استخدام كثافة يعني لكل SSLB في مجموعة لتجميع الرسم البياني. خط الصلبة هي نوبة الضبابي للبيانات. (ب) يعني الإشغال مجموعة (الدوائر السوداء) وكثافة مضان (المربعات الحمراء) لمجموعة SSLB رصدها على مدى أسبوع واحد. مقتبس من المرجع 20 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

التي قطعناها على أنفسنا صفائف تتألف من SSLBs مع تركيزات مختلفة من GM1 (0، 0.5، 1 لالثانية 2 مول٪) ويعرضهم إلى تركيز ثابت من CTX وكذلك مع صفائف SSLBs مع تركيزات GM1 ويعرضهم لتركيزات متفاوتة من CTX. واستخدمت هذه التجربة في وقت لاحق لتحديد التوازن التفكك المستمر (دينار كويتي) لGM1/CTx ملزمة. تعرضت صفائف SSLB مع اختلاف تركيز GM1 إلى 50 نانومتر اليكسا-488 المسمى CTX لمدة 1 ساعة ثم غسلها وتصويرها. كثافة المدرج الاحصائي للصفائف SSLB مع 0،5-2٪ مول GM1 تتعرض ل50 نانومتر اليكسا 488 مترافق CTX يمكن أن ينظر إليه في الشكل 5A يوضح الشكل 5B الاعتماد خطية من متوسط ​​كثافة مضان على تركيز GM1. عندما يتم إصلاح تركيز GM1 في SSLBs في 2 مول٪ ويتعرضون صفائف SSLB لCTX تتراوح من 16 مساء إلى 158 نانومتر، واستجابة ملزمة يتبع منحنيات السيني كما هو مبين في الشكل 5C. وتستند منحنيات يصلح لهذه البيانات على نموذجين ملزمة مختلفة: الأيسوثرم انجميور (ما يعادل 1) ووضع هيل Waudلتر (ما يعادل 2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المعادلة 1 (1)

المعادلة 2 (2)

حيث F هو كثافة مضان بتركيز CTX معين، F ماكس هو كثافة مضان عندما يتم المشبعة ملزمة، [CTX] هو تركيز CTX، K D و K H هي ثوابت التفكك من انجميور وهيل Waud يناسب، على التوالي وn هو معامل cooperativity في نموذج هيل Waud. معامل cooperativity (ن) وتقدر كمية ملزمة متعددي حيث لن أكبر منواحد يشير إلى أن كل جزيء CTX يربط أكثر من GM1. تركيز CTX عند 0.5 س F ماكس هو K D أو K H للتفاعل GM1/CTx. في تجاربنا نحن احتساب K D من 1.6 ± 0.2 نانومتر وK H 1.4 ± 0.2 نانومتر مع قيمة ن 1.3، مشيرا ملزمة التعاونية. ثوابت التفكك للتفاعل GM1/CTx تختلف على نطاق واسع في الأدب، والتي تتراوح ما يزيد على 5 أوامر من حجم من 04:05 إلى 370 نانومتر 26،27.

الرقم 5
الرقم 5. CTx/GM1 فحوصات على صفائف SSLB ملزمة. (أ) المدرج الإحصائي من كثافة مضان من SSLBs الفردية ضمن المصفوفات SSLB. الواردة صفائف SSLBs مع 0.5، 1 أو 2٪ مول GM1 وتعرضوا ل50 نانومتر اليكسا 488 مترافق CTX. الخطوط الصلبة هي نوبات جاوس. (ب) يعني الأرض من التوزيع من (أ) كدالة للتركيز GM1. (ج) ربط منحنيات تبين توزيع يعني من المصفوفات التي تحتوي على SSLBs مع 2 مول٪ GM1 بعد التعرض للاليكسا-488-مترافق CTX متفاوتة من 16 مساء إلى 158 نانومتر. خطوط هي نوبات لالأيسوثرم انجميور (الحمراء) وهيل Waud (الأزرق) نماذج ملزمة. أشرطة الخطأ في (ق) تمثل الانحرافات المعيارية لتوزيع كثافة مضان المقابلة لكل نقطة بيانات. مقتبس من المرجع 20 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

كما ذكر آنفا، فمن الممكن أيضا أن تشكل المصفوفات مع المواد غشاء حيوي مشتق من مصادر طبيعية 21. تتشكل صفائف بنفس الطريقة، عن طريق تشتيت جزيئات الغشاء على ركيزة microwell، ثم تنظيف السطح العلوي مع ممسحة لتترك وراءها جزيئات الغشاء في هيئة التصنيع العسكريrowells. ويبين الشكل 6 أمثلة على المايلين الدهنية والخلايا العصبية ميكروأرس الطوافة. في الشكل 6A، وصفت الجزيئات المايلين مع fluorophore محبة للدهون FM1-43. ومن المعروف الطوافات الدهنية لتخصيبه في الكولسترول وgangliosides مثل GM1؛ وبالتالي، اليكسا 488 مترافق CTX يربط بقوة ميكروأرس طوف الدهون كما هو مبين في الشكل 6B، في حين streptavidin fluorescently المسمى (SAPE) لا ربط صفيف. (الشكل 6C) ونحن أيضا خلق صفائف شريط من خلال تقديم المايلين الدهنية وطوف الجسيمات إلى الركيزة microwell مع شريحة ميكروفلويديك مع 250 قنوات واسعة ميكرومتر. بعد تسليم الجسيمات، تم فصل رقاقة ميكروفلويديك من الركيزة microwell وحملت عملية ممسحة على النحو المعتاد. تم صفائف شريط ثم تعرضت لالفلورسنت مكافحة دبقية قليلة التغصن الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي O4)، الذي يربط سلفاتيد جدت في المايلين. (الشكل 7) والمايلين الدهنية وأساسات شريطية ميكروأريوتظهر في الشكل 7 ق في زيادة مستويات التكبير، وعلى أعلى مستوى من التكبير، فمن الواضح تماما أن يربط الغلوبولين المناعي O4 فقط على ميكروأرس المايلين لأن سلفاتيد غائب من الطوافات الدهنية.

الرقم 6
الرقم 6. الجسيمات المايلين الدهنية والخلايا العصبية صفائف طوف الجسيمات. (أ) ميكروأري المايلين الجسيمات حيث يتم تقديم الجزيئات المايلين الفلورسنت من fluorophore محبة للدهون FM1-43. خط متقطع يدل على حافة منطقة الجزاء صفيف. (ب) الدهون طوف ميكروأري تظهر CTX ملزما للجزيئات الدهون طوف. (ج) الدهون طوف ميكروأري تتعرض لالفلورسنت streptavidin-فيكوإيريترين (SAPE) تظهر شيئا يذكر لولا ملزمة غير محددة. مقتبس من المرجع 21 و تستعمل بإذن من شركة نفط الجنوب الكيميائية الأمريكيةiety.

الرقم 7
الرقم 7. صفائف متعددة المكونات التي شكلتها تسليم ميكروفلويديك المايلين والأغشية العصبية الطوافة. (أ) صورة الإسفار بعد المايلين والطوافات ترسبت عبر قنوات ميكروفلويديك على الركيزة ميكروأري. المشارب اليسار واليمين تحتوي على المايلين والشريط يحتوي على الأغشية منتصف طوف العصبية. هي ملطخة الأغشية مع FM1-43، التي تصف جميع المواد الدهنية. شريط المقياس هو 250 ميكرون. (ب) صورة مضان من نفس ثلاثة المشارب بعد تطبيق ممسحة PDMS ويحتضنها مع الغلوبولين المناعي O4. شريط المقياس هو 250 ميكرون. (م) وصور مكبرة من الأشرطة الثلاثة تبين أن الغلوبولين المناعي O4 يربط فقط على ميكروأرس المايلين: (ج) ​​ترك شريط و (ه) شريط الحق. أشرطة النطاق في عanels م هي 30 ميكرومتر. مقتبس من المرجع 21 و تستعمل بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل وتبين لنا أن monodisperse شافي 2 حبات المغلفة مع طبقات ثنائية الدهون يؤيد يمكن المحتشدة في صفائف microwell دون الحاجة لاستهداف بروابط على طبقات ثنائية الدهون أو سطح الركيزة، وصفائف يمكن استخدامها لوصف التفاعلات السمية الدهون. ونحن ثابت التفكك المحسوبة لCTx/GM1 ملزمة يقارن ايجابيا، نظرا للتفاوت واسع من القيم في الأدب، مع تقرير سابق قبل الشتاء وآخرون، حيث كان يستخدم التجمع الغروية من الخرز الدهون المغلفة لحساب ثابت تفكك حول 30 نانومتر. من المناسب البيانات إلى نموذج ملزم هيل Waud، توصلنا إلى أن التفاعل CTx/GM1 هو متعددي الأرجح، والتي تتفق مع التقارير السابقة 28. ب (غانغليوزيد ملزم) الوحيدات من CTX موجود باعتباره مخموس، مع كل من خمس وحدات قادرة على ربط جزيء GM1 29؛ وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن الوحيدات أكثر من واحد قد تكون ملزمة بالنظر إلى فرقالتنقل usive من GM1 في SLBs 30.

وقد استخدمت المصفوفات من الخرز بين functionalized كيميائيا في الدراسات التحليلية الأخرى 31. في هذه الأنواع من التجارب، وعادة ما يجمد الخرز في microwells إنشاؤها في نهاية الألياف البصرية محفورا. ويمكن إجراء فحوصات متعددة مضان في هذا التكوين عن طريق خلط القطعان من الخرز وشل حركة في وقت واحد على نهاية الألياف البصرية 32. في مقايسة لدينا متعددة (أرقام 3C-3E)، ونحن يجمد SSLBs المرمزة بصريا بالتسلسل لأن الدهون على SSLBs الحرة في الحل يمكن أن يتم تحويلها من نوع واحد من SSLB إلى 33 أخرى. في حين أن هذا يضيف خطوات إضافية في إعداد مصفوفات SSLB، فإنه لا تستغرق وقتا طويلا أكثر من اللازم وهو النهج الأكثر فعالية لالخرز بين functionalized الدهون. ونحن أيضا المرمزة مكانيا صفائف عن طريق إيداع السكان SSLB مختلفة في صفائف microwell المجاورة، وليس هناك كروس ملاحظتهاق الحديث بين المصفوفات 20. لتقليل مرات عينة التحضير، صفائف SSLB يمكن إعدادها مسبقا وتستخدم عندما المرجوة. اختبرنا استقرار صفائف على مدى أسبوع واحد وجدت أي تدهور كبير في صفائف من حيث كثافة مضان، مما يدل على أن لا تغيير كمية المواد الدهنية على SSLBs مع مرور الوقت. أيضا، لا يغير الإشغال مجموعة مع مرور الوقت، مما يشير إلى أنه بمجرد أن يتم يجمد SSLBs، فإنها لا فصل من microwells (الشكل 4B).

بالإضافة إلى حبات المغلفة مع طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية، ونحن قد استخدمت أيضا هذه الطريقة لإنشاء صفائف جزيئات الغشاء الطبيعي 21. في هذا العمل، ونحن يجمد جزيئات المايلين المستمدة من مخ الفأر وكذلك جزيئات غشاء الخلايا العصبية، مثل الكسر الدهون طوف. كنا قادرين على استخدام المصفوفات لتحديد جزيئات سطح الخلية غشاء محددة من قبل الأجسام المضادة بيندينانوغرام (أرقام 6 و 7). وعلاوة على ذلك، عندما تم تخفيض حجم microwells إلى النانومترية الحجم والسطح العلوي للصفيف والمغلفة بالذهب، كنا قادرين على استخدام سطح مأكل صدى لمراقبة ملزمة من الأجسام المضادة لغشاء الميلين الجسيمات دون استخدام تسميات الفلورسنت. الفرق الرئيسي بين استخدام SSLB وحويصلات أو جزيئات الغشاء الطبيعي لتشكيل المصفوفات هو أنه في حالة SSLBs ومن المعروف أن المبلغ المحدد للمادة غشاء في كل microwell فقط لأن حبة واحدة يمكن أن يصلح في كل بئر. مع حويصلات أو جزيئات الغشاء الطبيعي، لا توجد وسيلة للسيطرة على كمية المواد في كل microwell، بخلاف لضبط تركيز ابتداء من الحويصلات أو جزيئات. ومع ذلك، فإن تقلب جيدا لجيدا من عدد الحويصلات ليست كبيرة جدا بالمقارنة مع توزيع أقطار حويصلة 21.

أخيرا، يمكن لهذا الأسلوب أن يكون شعبةERSE التطبيقات المستقبلية. Junesch وزملاء العمل قد استخدمت ممسحة لإزالة الجسيمات النانوية الغروية أثناء الطباعة الحجرية nanofabrication 34. يمكن تشكيل المصفوفات غشاء لتقليد الاتصالات خلية خلية للتحقيق التصاق التنسيق الخلوية 35 أو دراسة ملزمة غشاء الاستشعار انحناء البروتينات 36. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخرز التي يسهل اختراقها تسهيل إدراج البروتينات عبر الغشاء في طبقات ثنائية الدهون 37 أو التسليم المحلي من البضائع المخزنة إلى الخلايا المستزرعة على ركيزة مجموعة غشاء حيوي. ملفقة منصة microwell بواسطة ضوئيه، والذي يسمح للمرونة التصميم. هنا كان لدينا صفائف الهندسة سداسية، ولكن يمكن أن تنشأ مربع، خطي، أو هندستها الأخرى مع تواتر مجموعة وmicrowell أبعاد متفاوتة للتحقيق في الآثار المكانية للالتصاق التنسيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى SHO من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM092993)، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF جائزة التوظيف وDBI 0964216)، ومكتب البحوث البحرية (شركة أوريكس) برنامج الباحث الشاب وجائزة مينيسوتا الشراكة للتكنولوجيا الحيوية وعلم الجينوم الطبية. تم إجراء تصنيع الجهاز في جامعة مينيسوتا مركز Nanofabrication (NFC)، التي تتلقى دعما من جبهة الخلاص الوطني من خلال شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة أيضا إلى MR من المعاهد الوطنية لل، الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (CA1060A11)، وأبلباوم، هيلتون، وبيترسون سانفورد المؤسسات الصحية (NS048357، R21 NS073684) والأسرة McNeilus. الكتاب أود أن أشكر Hyungsoon ايم للحصول على المساعدة مع الرسوم التوضيحية وShailabh كومار للحصول على المساعدة مع المجهر الإلكتروني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
  2. Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
  3. Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
  5. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
  6. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  7. Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
  8. Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
  9. Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
  10. Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
  11. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
  12. Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
  13. Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
  14. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
  15. Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
  16. Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
  17. Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
  18. Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
  19. Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
  20. Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
  21. Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
  22. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
  23. Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
  24. Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
  25. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
  26. Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
  27. Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
  28. Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
  29. Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
  30. Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
  31. Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
  32. Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
  33. Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
  34. Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
  35. Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
  36. Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
  37. Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 87، بدعم طبقة ثنائية الدهن، والخرز، ميكروأري، مضان، التصنيع الدقيق، nanofabrication، ترسب طبقة ذرية، المايلين، الطوافات الدهنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W.,More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter