Summary
支持的脂质双层和天然膜颗粒是方便的系统，可以近似细胞膜的性质和在各种分析战略中。这里，我们证明了制备微阵列支持的脂质双层包被的SiO 2的有孔玻璃珠，磷脂囊泡或天然膜颗粒组成的方法。
Abstract
脂质双层膜形成细胞的质膜和限定亚细胞器的边界。在自然界中，这些膜有许多种脂质的多相混合物，含有膜结合蛋白，并装饰有碳水化合物。在一些实验中，最好是去耦从这些天然细胞膜的脂质双层的生物物理或生物化学特性。这种情况下要求使用的模型系统如巨泡，脂质体或支撑脂质双层（SLBs中）。 SLBs中的阵列是用于感测应用和模仿细胞 - 细胞相互作用特别有吸引力的。在这里，我们描述了形成SLB阵列的新方法。亚微米直径的SiO 2小珠首先用脂质双层，以形成球形的SLBs（SSLBs）。然后使小球沉积到微制造亚微米直径的微孔阵列。制备工艺采用了“刮刀”，以清洁衬底表面，而要走背后的落户为微孔SSLBs克。这种方法需要的微孔基质的无化学修饰，也没有对SSLB任何特定的靶向配体。微孔是由单个珠子占据，因为井径调到只是比珠直径。典型地，孔的75％以上都被占用，而其余的保持为空。在缓冲SSLB阵列显示大于一个星期的长期稳定性。多种类型SSLBs可以放置在一个单独的阵列通过串行沉积和阵列可以用于检测，这表明我们通过表征霍乱毒素与神经节苷脂的相互作用。我们还表明，磷脂泡囊，而不珠载体和生物膜从蜂窝源可以排列具有相同的方法和细胞特异性膜脂质可以被识别。
Introduction
脂双层膜的性质是基本的结构。细胞质膜和细胞器的膜构成的，即包括许多分子，是生命所必需的脂质双层中。许多维持生命过程发生的细胞的表面上，或通过与脂质双层膜相关分子介导的。事实上，许多药品目标进程或分子被发现，或在膜1,2。因此，有必要对解析调查过程，如在膜表面发生的化学反应或非共价结合事件。因为天然的膜可能难以分离和/或接口的传感器，许多研究人员采用简化模型膜，进行分析研究。一些模型膜系统在文献中有描述，从巨囊，可以是几十到几百微米的直径，以脂质体具有纳米级尺寸的3,4。 ALTERNatively，沉积在固体载体上的平面脂双层， 即 ，支持的脂质双层（SLBs中），可以形成多种不同的表面和已被广泛应用于生物物理，生物化学，和分析应用程序5。耦合SLBs的电气或光学材料通过使用不同的分析技术使膜生物化学和生物物理学研究。荧光显微镜6，7电化学，光学光谱8，扫描探针显微镜9，表面等离子体共振10，和质谱11都被用来研究的SLBs的结构和性能。
SLB阵列提供额外的多功能性传感器的多重检测12,13的设计。其他应用程序使用SLB阵列来模拟免疫细胞14之间形成的交界处。为SLB阵列的制备方法从microflu变化IDIC接近15到那些采用SLB相邻斑块之间的物理障碍。16其他团体使用的印刷方法17，光化学图案18以及各种纳米工程学接近19创建SLB阵列。
在本文中和所附的视频为大家演示了SLB-涂SiO 2的珠子存入微孔20的有序排列形成阵列负载均衡的方法。我们指的是SLB-涂上二氧化硅珠为球形支持的脂质双层（SSLBs）。这种技术是创建从天然来源21，从中我们也显示例子的结果得出磷脂囊泡和生物膜的数组早期工作的延伸。其他方法排列生物膜颗粒或小泡都依赖于特定的靶向配体的模式上，与包含在囊泡表面的互补关联的配体表面。例子包括生物素 -抗生物素蛋白关联22,23和DNA杂交方案24。我们的方法只需要一个微孔阵列，没有必要定位或识别部分。 SSLBs的大小是由SiO 2的珠载体，它具有低的聚分散度的直径限定。通过调节微孔的直径只比SSLB直径大，只有一个单一的SSLB稳定于各微孔。聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）刮刀然后从表面移除，但在固定微孔所有SSLBs。微孔和所得SSLB阵列具有高密度（〜10 5 SSLBs 个 / mm 2）与3微米的中心到中心的间距和六边形周期性。通过串联使用不同脂质组合物沉积SSLBs，它可以创建多组阵列与随机定位SSLBs。以证明SSLB阵列的感测能力，我们使用了一个并入SSLBs神经节苷脂（GM1）霍乱毒素（CTX）的相互作用。同天然膜颗粒，我们能够检测细胞特异性脂质中含有的膜材料从两个不同的细胞类型的多组分阵列。
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Protocol
1，微细加工的微孔阵列基板
- 从一个4英寸的硅晶片上热生长氧化物为100nm。
- 旋SPR-955 0.7光刻胶的晶片上以4000rpm进行30秒。
- 烘烤的加热板上，在115℃下进行90秒。
- 曝光光刻胶。
- 使用会产生1微米的孔排列成六边形阵列具有3微米的周期，其中该阵列包括有2毫米×2毫米区域的掩模。
- 使用6毫米的步长和200毫焦耳/厘米2的曝光在一个i-线步进曝光晶片。
- 烘烤的加热板上，在115℃下进行90秒。
- 开发利用旋开发商沉积在晶圆上2水坑的CD-26的90秒的总开发时间。
- 用超纯水去离子水和干与N 2彻底冲洗。
- 在反应性离子蚀刻机蚀刻氧化物为6分钟，使用50 sccm的氩，CF 4 25 sccm的，和50sccm的CHF的3 FLO机翼在75毫托的压力。
- 在ICP深沟槽反应性离子蚀刻机2分钟，以63 sccm的或C 4 F 8，27 sccm的SF 6气体，40sccm的氩气和10标准立方厘米的为14毫托的压力下O 2的流动蚀刻硅。
- 漂洗在丙酮，甲醇和异丙醇，以除去抗蚀剂。
- 这里的H 2 SO 4浴：H 2 O 2 1:1 10分钟来清洁表面。
- 用超纯水去离子水和干与N 2彻底冲洗。
- 沉积的Al 2 1,080 A O 3通过原子层沉积在250°C。
2，制备聚（二甲基硅氧烷）刮刀
- 如果可能的话，工作在洁净室。在可能的最清洁的环境，否则工作。
- 得到的塑料培养皿（或其它清洁的一次性容器）与≥13毫米两侧。
- 在那道菜，倒出来5克PDMS固化剂，接着加入50克的PDMS浅ë剂（或用1:10的比例，将大部分填补了培养皿中的任何东西）。用一次性塑料吸管或棒调匀。
- 通过将混合的PDMS中的腔与真空管线，施加真空，直至气泡出来的混合物（约30分钟）除去气泡。
- 如果不是已经在培养皿，倒入PDMS在培养皿中，避免产生气泡。
- 一夜之间治愈的电炉在> 50°C（用于更短的时间高热量也适用）。
- 随着新/干净的刀片，小心地切一块长方形约2.5×2.5厘米，保持顶面尽可能的干净。剥出用干净的镊子。通过按下刀片中的一个运动，以使上边缘尽可能尖锐（这将是在所述刮墨刀的过程中使用的边缘）修剪过的一个边缘（下降到1.5厘米）。
- 干净，用丙酮，甲醇，异丙醇，和超纯去离子水，然后吹干用干净的氮气。存放在一个干净的培养皿中。
囊泡3。准备
- 收集的25毫克/毫升的蛋磷脂酰胆碱（PC）的脂质储备溶液和1 mg / ml的1,2 -二棕榈酰-sn-甘油基-3 -磷酸乙醇胺-N - （丽丝胺罗丹明B磺酰基）铵盐（ρ-DPPE）的氯仿以及0.5毫克/毫升的库存单唾液酸神经节苷脂GM1的氯仿/甲醇溶液（2:1体积/体积）。
- 在一个小的玻璃瓶中作出，结果在97％（摩尔）的PC，2％（摩尔）神经节苷脂GM1和1％（摩尔）的Rho-DPPE，加入18.9微升的25毫克/毫升的PC，39.6微升的0.5毫克/毫升GM1和7.9微升的混合物1毫克/毫升的Rho-DPPE使用玻璃注射器。
- 注：为Nair 等人 25的补充材料包含一个极好的可定制的Excel电子表格计算脂质创建任何所需组成的囊泡所需的金额。
- 放置小瓶在真空干燥器中，并除去溶剂，留下在真空下6小时的小瓶中。
- 使0.1的水溶液M氯化钠。加入0.5毫升的0.1M NaCl溶液到含有干燥的脂质膜的小瓶。
- 允许水性脂质混合物休息过夜。
- 简要地涡旋混合，以创建一个小泡悬浮液中，然后超声处理20分钟，在浴中超声破碎仪在室温下。
- 通过聚碳酸酯膜具有100nm的孔径挤出囊悬浮液。通过过滤器通过17倍的囊泡停牌。
- 储存在玻璃小瓶中挤出的膜泡在4℃下
球面支持的脂质双层膜4。形成
- 收集700纳米直径的SiO 2的珠子。珠粒被提供在蒸馏水中以原料浓度为1.4×10 11珠/毫升。
- 在1.5ml Eppendorf管中，加入107微升的珠子储备溶液以893微升0.1M的氯化钠制备1毫升珠粒悬浮液以1.5×10 10珠/ ml的浓度。
- VORTEX暂停，以确保它是很好英里固定的。
- 离心该悬浮液在1700×g离心20分钟，然后弃上清。重悬珠在1ml的0.1M NaCl洗涤。重复此步骤两次彻底清洗珠。
- 以形成SSLBs，在1.5ml的Eppendorf管中加入25微升的SiO 2珠悬浮于200微升的1毫克/毫升的小泡悬浮液中。涡旋混合，静置1小时，在室温下进行。在这个阶段SSLB浓度应为1.7×10 9 SSLBs /毫升。
- 离心机在1700×g离心20分钟以沉淀SSLBs。粒料应出现粉红色由于对珠的Rho-DPPE囊泡的破裂。
- 丢弃在225微升磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值= 7.4的上清，重悬。重复步骤4.6-4.7两次从SSLB悬挂删除任何未破裂的小泡。
SSLB阵列5。大会
- 导致矩形件4-6麦克风微孔阵列的顺劈片每件罗威尔阵列。
- 旋涡混合SSLB暂停，然后将10微升SSLB悬挂的每个微孔阵列上。免得休息1小时，以允许SSLBs沉淀到表面上。
- 用PBS轻轻从洗瓶清洗微孔阵列芯片上，然后浸入在浅盘制备的PBS浴。
- 而淹没，轻轻将PDMS刮刀冲洗微孔阵列芯片上，并轻轻沿表面滑动5倍，除去未微孔中固定SSLBs。
- 在PBS浴握微孔阵列芯片镊子，轻轻摇晃，以消除任何多余的SSLBs。
- 从吸水扒浴快速去除芯片，并放置在一个新鲜的PBS浴备用。确保芯片的顶表面保持湿润以保留SSLBs。
注意：上述的组装方法，可用于创建天然膜颗粒的阵列，如髓鞘颗粒从小鼠脑，或坡分离spholipid无泡在SiO 2珠的支持。详细维滕贝格等 21这一工作描述和代表性的结果如下所示。
6。霍乱毒素结合分析
- 准备一个2毫克/毫升的溶液的牛血清白蛋白（BSA）的PBS中。
- 准备与Alexa 488缀合的霍乱毒素B亚单位的在PBS中的2毫克/毫升牛血清白蛋白的所需浓度的溶液。
- 从PBS浴中取出SSLB阵列芯片和灯芯大多数的PBS溶液相差使用实验室擦拭。留在芯片上刚好够的PBS，以保持SSLB阵列的水分。
- 为了防止非特异性结合，加入200μl的2毫克/毫升BSA溶液的SSLB阵列芯片。让我们休息1小时的加湿盒。
- 用微量的SSLB阵列芯片的顶部取出200微升的解决方案。
- 加入200μl的霍乱毒素解决SSLB阵列芯片，并让其余的1小时在加湿盒。
- 用PBS轻轻从洗瓶清洗SSLB阵列芯片以除去任何未结合的霍乱毒素。
- 威克用实验室走多余的PBS擦拭。前盖成像芯片装有24mm×40mm的盖玻片。
- 使用过滤器一个堂堂正正的显微镜图像阵列设置适合感兴趣的荧光。
- 分析使用ImageJ软件的自动颗粒分析函数数组中的各个SSLBs的荧光强度。
- 编译个别SSLBs平均荧光强度成汇总SSLBs的一个给定的数组中找到的强度直方图。
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Representative Results
当SiO 2的珠粒与囊泡磷脂，荧光脂质和其他脂类如神经节苷脂组成的溶液混合时，囊泡破裂，在SiO 2胎圈表面上以形成SSLBs，如在图1a中示意性示出。洗涤SSLBs后，一滴SSLB溶液置于一个微孔阵列上，并且小珠静置至表面。 （ 图1B1）这也可以与磷脂小泡或天然膜颗粒，其显示在图1B2中的悬浮液进行。吸附到微孔阵列基板磷脂囊泡的荧光图像显示在图1B3。然后将PDMS刮刀制成轻轻滑过表面，以去除任何SSLBs（ 图1C1），水疱或天然膜颗粒（ 图1C2）未融入微孔。这将导致一个SSLB阵列，其中每微孔包含最多一个SSLB（ 图1D1）或数组，其中多个囊泡或天然膜颗粒在每个微孔（ 图1D2）。荧光标记的囊泡组成的微阵列的图像被显示在图1D3。
。图1形成SSLBs和SSLB阵组件（一 ）插图上的SiO 2珠3种脂质组成SSLB的：卵PC（黑色），ρ-DPPE（红色）和神经节苷脂（蓝色）。 （B1-D1）一个SSLB数组表示SSLBs散一个微孔阵列（B1）上的处理流程进行组装，使用PDMS刮板清除SSLBs的表面不安定入微孔（c1）中 ，并最终SSLB阵列（D1 ）。 （B2-d2的 （B3）的荧光吸附到对应于（B2）的插图微孔底物磷脂囊泡的形象。 （D3）一个对应于（d2）中的插图磷脂小泡组成的微阵列的荧光图像。从参考文献20和21改编，并与美国化学学会的许可使用。
个别的SiO 2小珠支持在微孔SSLBs进行成像以从两个成角度的顶视图和横截面透视图的扫描电子显微镜（SEM）。一个区域的顶视图约15微米×15微米示于图2a，图2b示出了一个单珠固定在一个剖视图微孔。较轻的层涂覆微孔为Al 2为100nm的O 3的沉积通过原子层沉积来调整井直径，使得孔中能够容纳仅单个珠子。
SSLB阵列的图2。扫描电子显微镜图像。 （a）一种电子15mm的×15毫米面积表示固定在微孔阵列SSLB珠载体的显微照片。 （b）一个单一的700纳米直径SSLB的微孔。微孔涂层的Al 2 O 3，其被沉积以缩小微孔，使得只有单个珠子能适应内侧。从图20和适于与美国化学协会授权使用。
一旦SSLB阵列制备，它们可以通过荧光显微镜进行成像。
不同类型SSLBs的顺序沉积用于与多个飞行SSLB，其中个别SSLBs的身份是由毒素受体（GM1）的存在或不存在下测定的与霍乱毒素（CTX），其结合创建阵列。在装配过程中是一样的单一SSLB类型但进行与不同的SSLB同一性的第二时间。 SSLBs的起始浓度是低10倍，以减少SSLB的第一类型的占用，并允许更多的空位，以通过所述第二类型SSLB的占用。在图3c-3E，示出了SSLB阵列两种类型SSLBs的。人升的SSLBs的含有红色荧光的Rho-DPPE（ 图3c），但只有一些SSLBs的含有GM1，神经节苷脂，它是受体的B亚基霍乱毒素。当暴露于绿色荧光的Alexa 488缀合的霍乱毒素，只含有GM1的SSLBs发出荧光的绿色通道（ 图3d）。当红色和绿色的图像合并，有可能确定哪些SSLBs含有GM1（黄色）和不（红色）（ 图3e）。
SSLB阵列的图3。荧光成像。 （a）含有936的Rho-DPPE标记的卵PC SSLBs一个100微米×100微米的面积。 （b）在明场和荧光叠加显示与所占用的微孔76％SSLB。 （CE），其中包含包含的Rho-DPPE SSLBs一个SSLB阵列（ 三），其中的一小部分还含有GM1，这势必根据Alexa-488标记的霍乱毒素（D）。 （ 五）红色和绿色通道，其中荧光共定位表明GM1对SSLB存在合并。蓝色的圆圈表示SSLBs，只有红色荧光， 即缺乏GM1。从图20和适于与美国化学协会授权使用。
从SSLB阵列的荧光数据，通过测量个体SSLBs的强度在图像分析。从阵列的SSLB强度数据进行编译成直方图。 图4a示出从得自一个SSLB阵列只含卵PC和1％（摩尔）的Rho-DPPE SSLBs组成的Rho-DPPE荧光分析一个这样的直方图。在图4a中的数据是由图像分析在图3a中获取。我们发现冷藏时SSLB阵列是可靠和稳定至少一个星期ND淹没在缓冲区中。该数组没有失去任何荧光强度，也没有数组的占用超过一个星期（ 图4b）的过程中发生变化。
图4（a）直方图表示荧光强度为在图3a所示的SSLB阵列的分布。在阵列中的平均强度为每SSLB被用于编译直方图。实线是一个高斯拟合到数据。 （二）平均数阵列占用（黑色圆圈）和荧光强度（红色正方形）的SSLB阵列监控超过一周的过程。从图20和适于与美国化学协会授权使用。
我们做了阵列SSLBs组成与不同浓度GM1（0，0.5，1的ND 2摩尔％），并将其暴露于霍乱毒素的固定浓度，以及与SSLBs与GM1浓度的数组，并将它们暴露于不同浓度的霍乱毒素。后来的实验是用于确定GM1/CTx结合的平衡解离常数（Kd）。该SSLB阵列具有不同的神经节苷脂浓度暴露至50nM的Alexa-488标记的霍乱毒素1小时，然后洗涤并成像。的强度直方图SSLB阵列用0.5 - 2％（摩尔）神经节苷脂GM1暴露至50nM的Alexa 488缀合的霍乱毒素可以看出，在图5a图5b示出了线性时GM1浓度平均荧光强度的依赖关系。当GM1在SSLBs的浓度被固定在2％（摩尔）和SSLB阵列暴露于霍乱毒素范围从16点到158纳米，结合反应如下的S形曲线， 如图5c所示。曲线拟合这个数据是基于两个不同的结合模式：Langmuir吸附等温线（公式1）和希尔 - WAUD模式L（公式2）。 请点击此处查看该图的放大版本。
（1）
（2）
其中，F是在给定的霍乱毒素浓度的荧光强度，F max是荧光强度时，结合是饱和的，[霍乱毒素]是霍乱毒素的浓度，K D和K H为从Langmuir和希尔- WAUD的解离常数配合，分别，n是在希尔- WAUD模型协同系数。的协同系数（n）的估计，多价结合的量，比那里的n更大1表示每个霍乱毒素分子结合一个以上的GM1。霍乱毒素在0.5 x F 最大浓度是杀敌D或K H为GM1/CTx相互作用。在我们的实验中，我们计算为1.6±0.2 nM和A K的D 1.4±0.2nM的ĶH带130的n的值，表示协同结合。的解离常数为GM1/CTx相互作用有很大的不同文献中，从下午4点05超过5个数量级，以370 nM的26,27。
图5。CTx/GM1约束力SSLB阵列检测。 （一）SSLB阵列内的个别SSLBs的荧光强度的柱状图。该阵列包含SSLBs用0.5或2％（摩尔）神经节苷脂GM1和暴露至50nM的Alexa 488缀合的霍乱毒素。该实线为高斯拟合。 （ 二）分布容积是指从（ 一 ）为GM1浓度的函数。 （ 三）结合曲线显示分布是指从含SSLBs用2 mol％GM1接触到的Alexa-488标记的霍乱毒素从16时到不等158纳米后阵列。该线是拟合的Langmuir吸附等温线（红色）和希尔 - WAUD（蓝色）的结合模式。在（BC）的误差棒表示荧光强度对应于每个数据点的分布的标准偏差。从图20和适于与美国化学协会授权使用。
如前所述，它也可以形成阵列，从天然来源21来自生物膜材料。的阵列形成同样的方式，通过在基片的微孔膜的分散的颗粒，然后清洁的顶表面与刮墨刀留下的话筒隔膜颗粒背后rowells。 图6显示了髓鞘和神经细胞的脂筏微阵列的例子。在图6a中 ，髓鞘颗粒标记的亲脂性荧光团的FM1-43。脂筏是已知的胆固醇和神经节苷脂如GM1加以充实;因此，Alexa的488 -共轭霍乱毒素强烈地结合到脂筏微阵列， 如图6b所示 ，而荧光标记的链亲和素（SAPE）不结合至阵列。 （ 图6c），我们还通过提供和髓鞘脂筏颗粒与微流控芯片具有250微米，宽渠道的微孔基材创建的条带阵列。颗粒分娩后，微流控芯片从微孔基板分离与挤压过程像往常一样进行。条纹阵列，然后暴露于荧光抗少突胶质细胞的IgM抗体（IgM抗体O4），其结合在硫脂髓鞘找到。 （ 图7）和髓鞘脂筏条纹芯片在图7中S是示出在放大倍率水平的增加，并且在放大倍率的最高水平，这是显而易见，IgM型O4仅结合到微阵列的髓鞘因为硫苷脂是从脂筏不存在。
图6。髓鞘颗粒和神经元脂质筏粒子阵列。 （a）一个髓鞘粒子的微阵列，其中髓鞘颗粒由亲脂性荧光团的FM1-43呈现荧光。虚线表示的阵列区域的边缘。 （二）脂筏微阵列显示霍乱毒素结合于脂筏颗粒。 （ 三）脂筏微阵列暴露在荧光灯链亲和素-藻红蛋白（SAPE），显示几乎没有非特异性结合。从参考21改编，并与美国化学SOC的使用许可iety。
图7。多元阵列通过微流体输送髓鞘和神经筏膜的形成。 （一）髓鞘和木筏后荧光图像通过微阵列基板上的微流体通道沉积。左边和右边的条纹包含髓鞘和中间条纹包含神经筏膜。膜沾满FM1-43，其中标签的所有脂类物质。比例尺为250微米。相同的3条带施加的PDMS刮板与IgM抗体孵育O4（b）之后的荧光图像。比例尺为250微米。 （CE）放大图像从三条纹可见IgM抗体O4只绑定到髓鞘芯片：（ 三）离开条纹及（e）条的权利。在P中的比例尺anels ce的是30微米。从图21和适于与美国化学协会授权使用。
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Discussion
在这项工作中，我们表明，单分散的SiO 2珠粒涂有支持的脂质双层可排列成微孔阵列，而不需要在脂质双层或在基板表面的靶向配体，并且阵列可用于表征毒素-脂质相互作用。计算CTx/GM1结合的解离常数，我们绝不逊色，给定的值在文献悬殊，与先前的报告Winter 等 ，其中脂质包被的磁珠胶体组装用于计算的有关解离常数30纳米。由数据拟合的山，WAUD结合的模式，我们确定CTx/GM1互动是多价的可能，这与以前的报告28。霍乱毒素的B（神经节苷脂结合）亚单位的存在是为五聚体，以每五个单元能够结合GM1分子29;因此，这并不奇怪，不止一个亚基可以结合特定的差异GM1的SLBs的30 usive流动性。
的化学官能化的珠子阵列已经用于其它分析研究31。在这些类型的实验中，有孔玻璃珠，通常固定在在蚀刻的光纤的端部产生微孔。多重荧光测定法可通过将有孔玻璃珠的亚群，并同时将它们固定到光纤32的端部进行在此配置。在我们的多重检测（ 图3C-3E），我们固定化的光学编码SSLBs顺序，因为在自由SSLBs在溶液中的脂质可以从一种类型SSLB的转移到另一个33。虽然这增加了在SSLB阵列的制备额外的步骤，它不是太费时，是脂质 - 官能珠最有效的方法。我们还空间编码阵列由在相邻微孔阵列的不同SSLB种群沉积，也没有观察到的CRO阵列20之间S-谈话。以减少样品制备时间，SSLB阵列可以预先制备并在需要时使用。我们超过一周的过程中测试阵列的稳定性，发现该阵列的无显著降解的荧光强度，这表明脂质材料在SSLBs量不随时间而改变的方面。此外，该阵列占用不随时间而变化，这表明一旦SSLBs被固定，只要不从微孔（ 图4b）中分离。
除了 小珠涂有合成脂质双层，我们也用这个方法来建立天然膜颗粒21的数组。在这一工作中，我们固定从鼠脑以及神经元膜的颗粒衍生的髓磷脂颗粒，如脂质筏分数。我们能使用该阵列由抗体宾迪识别细胞特异性膜表面分子纳克（ 图6和7）。此外，当微孔的尺寸减少到该阵列的纳米级和顶表面涂有金，我们能够使用表面等离子共振来监测抗体与髓磷脂膜的颗粒的结合，而无需使用荧光标记物。使用SSLB和囊泡或天然隔膜颗粒，以形成阵列之间的主要区别在于，在SSLBs的情况下，膜材料在各微孔的确切量是已知的，因为只有单个珠子可以容纳在每个孔中。与囊泡或天然的膜的颗粒，也没有办法来控制物料在各微孔的量，比以调节囊泡或颗粒的起始浓度等。然而，相对于囊泡的直径21的分布囊泡的数量的油井到井变异性不那么大。
最后，这个方法可以有格ERSE未来的应用。 Junesch和同事们采用刮刀期间胶体刻蚀34纳米加工去除纳米粒子。膜阵列可以形成模拟细胞间接触，以探讨细胞粘着斑35或检查膜曲率传感蛋白36的结合。另外，使用多孔珠将有利于夹杂物的跨膜蛋白在脂质双层膜37或局部递送贮存货物的细胞生物膜阵列基板上培养。微孔平台，通过光刻，这允许灵活设计的制造。在这里，我们的阵列有六角形几何，但方型，线型，或其他几何形状可以具有不同的阵列周期性和微孔尺寸调查粘着的空间效果来创建。
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Disclosures
作者没有竞争经济利益披露。
Acknowledgments
这项工作是由赠款，以资助自置居所从美国国立卫生研究院（R01 GM092993）的支持，美国国家科学基金会（NSF CAREER奖和DBI 0964216），海军研究办公室（ONR）青年研究者计划和明尼苏达合作奖的生物技术和医学基因组学。在明尼苏达大学的纳米加工中心（NFC）技术，它从美国国家科学基金会通过了国家纳米技术基础设施网络接收支持进行设备制造。这项工作也是由补助到MR卫生（NS048357，R21 NS073684），国家多发性硬化症协会（CA1060A11）时，鲍姆，希尔顿，彼得森和桑福德基础和MCNEILUS家庭的国家机构的支持。作者要感谢Hyungsoon林与插图和Shailabh库马尔与扫描电子显微镜的协助援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
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