Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Dannelse af Biomembrane Microarrays med en svaber-baserede Assembly Method

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Understøttede lipid dobbeltlag og naturlige membran partikler er bekvemme systemer, der kan tilnærme egenskaber cellemembraner og blive indarbejdet i en række analytiske strategier. Her vi demonstrere en fremgangsmåde til fremstilling microarrays sammensat af understøttede lipiddobbeltlag overtrukket SiO 2 perler, phospholipidvesikler eller naturlige membran partikler.

Abstract

Lipiddobbeltlagsmembraner danne plasmamembraner celler og definere grænserne for subcellulære organeller. I naturen disse membraner er heterogene blandinger af mange typer af lipider, indeholder membranbundne proteiner, og er indrettet med kulhydrater. I nogle forsøg, er det ønskeligt at afkoble de biofysiske eller biokemiske egenskaber af lipiddobbeltlaget fra dem af det naturlige membran. Sådanne tilfælde kræver anvendelse af modelsystemer såsom gigantiske vesikler, liposomer eller understøttede lipid dobbeltlag (SLBs). Arrays af SLBs er særligt attraktiv for sensing applikationer og efterligne celle-celle interaktioner. Her beskriver vi en ny fremgangsmåde til dannelse SLB arrays. Submicron diameter SiO 2 kugler først er belagt med lipiddobbeltlag for at danne sfæriske SLBs (SSLBs). Perlerne bliver derefter indsat på en vifte af mikrobrønde submicron diameter mikro-fabrikerede. Fremstillingen teknik anvender et "squeegee" at rense substratoverfladen, mens leaving bag SSLBs der har bosat sig i mikrobrønde. Denne metode kræver ingen kemisk modifikation af mikrobrønd substrat, og heller ikke nogen særlig målretningsligander på SSLB. Microwells er besat af enkelte perler fordi borehulsdiameter er tunet til at være lige større end perlediameteren. Typisk er mere 75% af brøndene besat, mens resten forbliver tom. I buffer SSLB arrays vise langsigtet stabilitet på mere end en uge. Flere typer af SSLBs kan anbringes i et enkelt array ved seriel afsætning og arrays kan anvendes til registrering, hvilket viser vi ved at karakterisere interaktionen af ​​koleratoksin med gangliosid GM1. Vi viser også, at phospholipidvesikler uden perle-støtter og biomembraner fra cellulære kilder kan klædt med samme metode og kan identificeres cellespecifikke membranlipider.

Introduction

Lipiddobbeltlagsmembraner er væsentlige strukturer i naturen. Cellular plasmamembraner og organel membraner er sammensat af lipid-dobbeltlag, der indeholder et antal molekyler, som er nødvendige for livet. Mange livsopretholdende processer finder sted på overfladen af ​​celler eller medieret af molekyler associeret med lipid-dobbeltlag-membraner. I virkeligheden er mange farmaceutiske target processer eller molekyler der findes på eller i membranerne 1,2. Det er derfor nødvendigt at analytisk undersøge processer, såsom kemiske reaktioner eller kovalente bindende begivenheder, der opstår på membranoverflader. Fordi naturlige membraner kan være svært at isolere og / eller grænsefladen med sensorer mange forskere anvender forenklede modelmembraner at udføre analytiske undersøgelser. En række model membransystemer er beskrevet i litteraturen, der spænder fra gigantiske vesikler, som kan være ti til hundrede mikrometer i diameter til liposomer med nanoskala dimensioner 3,4. Alternholdsvis, plane lipid dobbeltlag deponeret på faste underlag, dvs støttede lipid dobbeltlag (SLBs), kan dannes på en række forskellige overflader og er ofte blevet brugt i biofysiske, biokemiske og analytiske applikationer 5. Kobling SLBs med elektriske eller optiske materialer muliggør undersøgelse af membranen biokemi og biofysik ved anvendelse af forskellige analytiske teknikker. Fluorescensmikroskopi 6 elektrokemi 7 optisk spektroskopi 8 scanning probe mikroskopi 9 overfladeplasmonresonans 10 og massespektrometri 11 har alle været anvendt til at studere strukturen og egenskaber SLBs.

SLB arrays tilbyder ekstra alsidighed i design af sensorer til multiplex assays 12,13. Andre programmer bruger SLB arrays til at efterligne krydset, der danner mellem immunceller 14. Forberedelse metoder til SLB arrays har varieret fra microfluIDIC tilgange 15 til dem, der anvender fysiske barrierer mellem tilstødende SLB patches. 16 Andre grupper har brugt trykmetoder 17, fotokemisk mønster 18 og diverse nanoengineering tilgange 19 for at skabe SLB arrays.

I dette papir og ledsagende video demonstrere vi en fremgangsmåde til dannelse SLB arrays ved at deponere SLB-belagte SiO 2 perler i ordnede arrays af mikrobrønde 20. Vi henviser til SLB-belagte SiO 2 kugler som sfæriske understøttede lipid dobbeltlag (SSLBs). Denne teknik er en udvidelse af tidligere arbejde, der skabte arrays af phospholipidvesikler og biomembraner stammer fra naturlige kilder 21, hvorfra vi også viser f.eks resultater. Andre metoder til at gruppere Biomembrane partikler eller blærer har påberåbt sig mønstre af specifikke målretningsligander på overflader, der forbinder med komplementære ligander indeholdt på blærens overflade. Eksempler indbefatter biotin-avidin forening 22,23 og DNA hybridisering ordninger 24. Vores tilgang kræver kun en microwell array med nogen målretning eller anerkendelse dele er nødvendige. Størrelsen af SSLBs er defineret af diameteren af SiO 2 perle understøtninger, som har lavt poly-dispersitet. Ved tuning mikrobrønden diameter på bare større end SSLB diameter, kun en enkelt SSLB liggende i hver mikrobrond. Et poly (dimethylsiloxan) (PDMS) visker fjerner derefter fra overfladen alle SSLBs, der ikke er immobiliseret på mikrobrønde. Mikrobrøndene og deraf SSLB arrays har høj massefylde (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 um center-til-center og sekskantede periodicitet. Ved serielt deponere SSLBs med forskellige lipidsammensætninger, er det muligt at skabe multikomponent arrays med tilfældigt placerede SSLBs. For at demonstrere sensing evne SSLB arrays, brugte vi den vekselvirkning af kolera toksin (CTx) med et gangliosid (GM1) indarbejdet i SSLBs. Mednaturlige membran partikler, var vi i stand til at opdage cellespecifikke lipider i flerkomponent arrays indeholdende membran materiale fra to forskellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Microfabrication af Microwell Array Substrat

  1. Start med en 4 tommer siliciumskive med 100 nm af termisk dyrket oxid.
  2. Spin SPR-955 0.7 fotoresist på wafer ved 4.000 rpm i 30 sek.
  3. Bag på en varmeplade ved 115 ° C i 90 sek.
  4. Expose fotoresist.
    1. Brug en maske, der vil skabe en um huller anbragt i en sekskantet matrix med en 3 um periode, hvor arrayet omfatter en 2 mm x 2 mm-området.
    2. Udsætte wafer i en i-linie stepper hjælp af en trinstørrelse på 6 mm og en eksponering på 200 mJ / cm 2.
  5. Bag på en varmeplade ved 115 ° C i 90 sek.
  6. Udvikle bruge et spin-udvikler til at deponere 2 pytter af CD-26 på wafer til en samlet udviklingstid på 90 sek.
  7. Skyl grundigt med ultrarent DI vand og tør med N2.
  8. Etch oxid i en reaktiv-ion etcher i 6 min med 50 SCCM af Ar, 25 SCCM af CF 4 og 50 SCCM af CHF 3 flokanten ved et tryk på 75 mTorr.
  9. Etch silicium i en ICP dyb grøft reaktiv ion etcher i 2 minutter med 63 sccm C 4 F 8, 27 SCCM af SF 6, 40 sccm Ar og 10 sccm O2 strømmer ved et tryk på 14 mTorr.
  10. Skyl i acetone, methanol og isopropanol for at fjerne modstå.
  11. Sted i et bad af H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 i 10 minutter for at rengøre overfladen.
  12. Skyl grundigt med ultrarent DI vand og tør med N2.
  13. Indbetal 1.080 Å af Al 2 O 3 ved atomare lag deposition ved 250 ° C.

2.. Fremstilling af poly (dimethylsiloxan) sugefod

  1. Hvis det er muligt, at arbejde i et renrum. Ellers arbejder i den reneste mulige miljø.
  2. Anskaf en plastik petriskål (eller en anden ren engangsbeholderen) med ≥ 13 mm sider.
  3. I så fad, hæld 5 g PDMS kurere agent, efterfulgt af 50 g PDMS base agent (eller noget med en 1:10 ratio, der vil oftest fylde petriskålen). Bland grundigt med en plastikflaske pipette eller stang.
  4. Fjern bobler ved at anbringe de blandede PDMS i et kammer med en vakuumledning, påføring af vakuum, indtil boblerne kommer ud af blandingen (ca. 30 min.)
  5. Hvis det ikke allerede i petriskålen, hæld PDMS i petriskål, undgå skabelse af luftbobler.
  6. Cure natten over på en varmeplade ved> 50 ° C (højere varme for mindre tid fungerer også).
  7. Med ny / ren barberblad, forsigtigt skære et stykke rektangulært ca 2,5 x 2,5 cm, holder overfladen så ren som muligt. Skræl ud med en ren pincet. Skær en kant (ned til 1,5 cm) ved at trykke ned på barberblad i en bevægelse, at den øverste kant så skarpe som muligt (dette vil være den kant, der anvendes i skraberen processen).
  8. Rengør med acetone, methanol, isopropylalkohol og ultrarent DI vand, og derefter blæse tør med ren kvælstof gas. Opbevar i et rent petriskål.

3.. Fremstilling af blærer

  1. Saml lipid stamopløsninger af 25 mg / ml ægge-phosphatidylcholin (PC) og 1 mg / ml 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N - (lissamin rhodamin B-sulfonyl)-ammoniumsalt (Rho-DPPE) i chloroform og en 0,5 mg / ml stamopløsning af monosialogangliosid GM1 i chloroform / methanol (2:1 v / v).
  2. I et hætteglas lille glas lave en blanding, der resulterer i 97 mol-% PC, 2 mol% GM1 og 1 mol-% Rho-DPPE ved tilsætning af 18,9 pi 25 mg / ml PC, 39.6 pi 0,5 mg / ml GM1 og 7,9 pi 1 mg / ml Rho-DPPE hjælp glassprøjter.
  3. Bemærk:. Den supplerende materiale til Nair m.fl. 25 indeholder en glimrende tilpasses Excel-regneark til beregning af mængden af lipider, der er nødvendige for at skabe vesikler af enhver ønsket sammensætning.
  4. Placer hætteglasset i vakuum, og opløsningsmidlet fjernes ved at lade hætteglasset under vakuum i 6 timer.
  5. Foretag en vandig opløsning af 0,1M NaCl. Tilsæt 0,5 ml 0,1 M NaCl-opløsning til hætteglasset indeholdende den tørrede lipidfilm.
  6. Lad vandige lipidblanding at hvile natten over.
  7. Kort vortex blanding for at skabe en vehikelsuspension derefter sonikeres i 20 minutter i et bad-sonikator ved stuetemperatur.
  8. Ekstrudere vehikelsuspension gennem en polycarbonatmembran med 100 nm porestørrelse. Pass vehikelsuspension gennem filteret 17x.
  9. Opbevar de ekstruderede vesikler i et hætteglas ved 4 ° C.

4.. Dannelse af sfæriske Understøttede lipiddobbeltlagenes

  1. Saml 700 nm diameter SiO 2 perler. Perlerne leveres i destilleret vand med en stamkoncentration på 1,4 x 10 11 perler / ml.
  2. I et 1,5 ml Eppendorf-rør forberede en 1 ml perlesuspension med en koncentration på 1,5 x 10 10 perler / ml ved tilsætning af 107 pi bead stamopløsning til 893 pi 0,1 M NaCl.
  3. Vortex suspension for at sikre, det er godt miXED.
  4. Centrifugeres suspensionen ved 1.700 xg i 20 min og derefter supernatanten. Resuspendere perlerne i 1 ml 0,1 M NaCl. Gentag dette trin to gange mere til grundigt at vaske perlerne.
  5. At danne SSLBs, i et 1,5 ml Eppendorf-rør tilsættes 25 ul af SiO2 perlesuspension til 200 pi af 1 mg / ml vehikelsuspension. Vortex blandingen og lad stå i 1 time ved stuetemperatur. På dette stadium SSLB koncentration bør være 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
  6. Centrifuger ved 1.700 xg i 20 min for at pelletere SSLBs. Pelleten skal vises lyserød på grund af brud af vesikler med Rho-DPPE på perlerne.
  7. Bortkast supernatanten og resuspender i 225 pi phosphatpufret saltvand (PBS), pH = 7,4. Gentag trin 4,6-4,7 to flere gange for at fjerne eventuelle unruptured vesikler fra SSLB suspension.

5.. Montering af SSLB Array

  1. Cleave wafer af mikrobrønde arrays resulterer i rektangulære stykker med 4-6 micRowell arrays per stykke.
  2. Vortex blande SSLB suspension, og derefter placere 10 pi SSLB suspensions hver mikrobrond array. Lest hvile i 1 time for at give SSLBs at bosætte sig til overfladen.
  3. Forsigtigt vaske mikrobrønd-chip med PBS fra en vaskeflaske, derefter nedsænkes i en PBS bad fremstillet i en flad skål.
  4. Mens neddykket, blidt sted PDMS sugefod flush på mikrobrønden vifte chip og forsigtigt skubbe den langs overfladen 5x at fjerne SSLBs, der ikke er immobiliseret i mikrobrønde.
  5. Grip mikrobrøndovertrækket vifte chip med pincet og forsigtigt ryste i PBS badet for at fjerne eventuelle overskydende SSLBs.
  6. Hurtigt fjerne chippen fra sugefoden bad og placere i en frisk PBS bad indtil videre brug. Kontroller den øverste overflade af chippen forbliver våd at bevare SSLBs.

Bemærk: Den ovenfor beskrevne samling metode kan bruges til at skabe arrays af naturlige membran partikler, som myelin partikler isoleret fra muse hjerne, eller phospholipid vesikler uden SiO 2 perle understøtter. Dette arbejde er beskrevet i detaljer i Wittenberg et al. 21 og repræsentative resultater er vist nedenfor.

6.. Koleratoksin Bindingsassay

  1. Der fremstilles en opløsning af bovint serumalbumin (BSA) i PBS 2 mg / ml.
  2. Der fremstilles en opløsning med den ønskede koncentration af Alexa 488-konjugeret koleratoksin B-underenhed i PBS med 2 mg / ml BSA.
  3. Fjern SSLB-chip fra PBS bad og bortsuge meste af PBS-opløsning ved hjælp af en laboratorie tørre. Lad lige nok PBS på chippen for at holde SSLB matrix hydreret.
  4. For at forhindre ikke-specifik binding, der tilsættes 200 pi 2 mg / ml BSA-opløsning til SSLB-chip. Lad hvile i 1 time i en fugtig boks.
  5. Med en mikropipette fjernes 200 ml af opløsningen fra toppen af ​​SSLB-chip.
  6. Tilsæt 200 pi af choleratoxin løsning på SSLB chip, og lad hvile i 1 time i en fugtig boks.
  7. Forsigtigt vaske SSLB-chip med PBS fra en vaskeflaske at fjerne eventuelt ubundet koleratoksin.
  8. Wick overskydende PBS under anvendelse af en laboratorie tørre. Før billeddannelse dække chip med en 24 mm x 40 mm dækglas.
  9. Billede arrays med en opretstående mikroskop bruge filter sætter passende for fluoroforerne af interesse.
  10. Analyser fluorescensintensiteten af ​​individuelle SSLBs i et array ved hjælp af den automatiserede partikel analyse funktion ImageJ software.
  11. Kompiler gennemsnitlige fluorescensintensiteterne fra individuelle SSLBs i histogrammer, som sammenfatter de intensiteter SSLBs fundet på en given array.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når SiO2 perler blandes med en opløsning af vesikler sammensat af phospholipider, fluorescerende lipider og andre lipider, såsom gangliosider, vesiklerne sprænges på SiO 2 perle overflader til dannelse SSLBs, som vist skematisk i figur 1a. Efter vask SSLBs er en dråbe SSLB løsning placeret på en mikrobrond array, og perlerne er tilladt at afregne til overfladen. (Figur 1B1) Dette kan også gøres med en suspension af phospholipidvesikler eller naturlige membran partikler, som er vist i figur 1B2. En fluorescens-billede af phospholipidvesikler adsorberet til en mikrobrønd matrix substrat er vist i fig 1B3. Så PDMS sugefod er lavet til at glide blidt hen over overfladen for at fjerne eventuelle SSLBs (figur 1C1), blærer eller naturlige membran partikler (figur 1C2), der ikke bosætte sig i mikrobrønde. Dette resulterer i en SSLB matrix, hvor hvermikrobrond indeholder højst én SSLB (figur 1D1), eller et array, hvor flere vesikler eller naturlige membran partikler er i hver mikrobrond (figur 1D2). Et billede af en microarray består af fluorescensmærkede vesikler er vist i figur 1D3.

Figur 1
.. Figur 1. Dannelse af SSLBs og SSLB vifte samling (a) Illustration af en SSLB består af 3 typer af lipider på en SiO 2 perle: æg PC (sort), Rho-DPPE (rød) og GM1 (blå). (B1-d1) Process flow til samling af en SSLB matrix viser SSLBs spredt på en microwell array (b1), brug af en PDMS sugefod at rydde overfladen af SSLBs ikke afgjort i mikrobrønde (C1) og den endelige SSLB array (d1 ). (B2-d2 (B3) Et fluorescens billede af phospholipidvesikler adsorberet på en mikrobrønd substrat svarende til illustrationen i (b2). (D3) Et fluorescens billede af en microarray består af phospholipidvesikler svarende til illustrationen i (d2). Tilpasset fra referencerne 20 og 21, og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Individuelle SiO 2 perler støtter for SSLBs i mikrobrønde blev afbildet med scanning elektronmikroskopi (SEM) fra både vinklet top-view og tværsnits-perspektiver. En afbildning fra oven af et område på ca 15 um x 15 um, er vist i figur 2a, mens figur 2b viser et tværsnit af en enkelt perle immobiliseret i enmikrobrønd. Lighteren lag belægning på mikrobrønd er 100 nm Al 2 O 3 deponeret af atomare lag deposition at tune og diameter, således at brøndene er i stand til at rumme kun enkelte perler.

Figur 2
Figur 2. Scanning elektronmikroskopi billeder af SSLB arrays. (A) En elektron mikrograf af en 15 mm x 15 mm område viser SSLB perle understøtter immobiliseret i mikrobrønde arrays. (B) En enkelt 700 nm diameter SSLB i en mikrobrønd. Mikrobrøndovertrækket er Al 2 O 3, der er deponeret til at skrumpe mikrobrønden således at kun enkelte perler kan passe ind. Tilpasset fra henvisning 20 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Når SSLB arrays fremstilles, kan de afbildes ved fluorescensmikroskopi. Figur 3b viser et område med 550 mikrobrønde og 416 SSLBs for en belægningsprocent på 76%.

Sekventiel udfældning af forskellige typer af SSLBs blev anvendt til at skabe arrays med mere end én type SSLB, hvor identiteten af ​​individuelle SSLBs blev bestemt ved fravær eller nærvær af et toksin receptor (GM1) og binding af koleratoksin (CTx). Samleprocessen var den samme som for en enkelt SSLB type, men blev udført en anden gang med en anden SSLB identitet. Udgangspunktet koncentration af SSLBs var 10x lavere for at mindske belægningsprocent på den første type SSLB og at give flere ledige stillinger at være besat af den anden type SSLB. I figur 3c-3e, er en SSLB array med to typer af SSLBs vist. All af SSLBs indeholder rødt fluorescerende Rho-DPPE (figur 3c), men kun nogle af de SSLBs indeholder GM1, et gangliosid, der er receptor for B-underenheden af CTx. Når de udsættes for grønt fluorescerende Alexa 488-konjugeret CTx, kun SSLBs indeholder GM1 fluorescerer i den grønne kanal (figur 3d). Når de røde og grønne billeder er lagt sammen, er det muligt at afgøre, hvilke SSLBs indeholder GM1 (gul), og som ikke (rød) (figur 3e).

Figur 3
Figur 3. Fluorescens billeddannelse af SSLB arrays. (A) En 100 um x 100 um område, der indeholder 936 Rho-DPPE-mærkede æg PC SSLBs. (B) En brightfield og fluorescens overlay viser en SSLB med 76% af mikrobrøndene besat. (Ce) En SSLB array indeholdende SSLBs der indeholder Rho-DPPE(C), en fraktion, som også indeholder GM1, som er bundet af Alexa-488-konjugeret CTx (d). (E) Sammenlægning af røde og grønne kanaler, hvor colocalized fluorescens indikerer tilstedeværelsen af GM1 på SSLB. De blå cirkler angiver SSLBs der kun fluorescerer rødt, dvs mangler GM1. Tilpasset fra henvisning 20 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Fluorescens data fra SSLB arrays blev analyseret ved måling af intensiteten af ​​de enkelte SSLBs i et billede. Den SSLB intensitet data fra arrays blev samlet ind i histogrammer. 4a viser et sådant histogram fra analysen af Rho-DPPE fluorescens fra en SSLB vifte udelukkende består af SSLBs indeholder æg PC og 1 mol% Rho-DPPE. Dataene i figur 4a blev opnået ved at analysere billedet i figur 3a. Vi fandt SSLB arrays til at være robust og stabil i mindst en uge, når nedkølet ennd nedsænket i puffer. Opstillingerne ikke mister nogen fluorescensintensitet, heller ikke belægning af arrays ændre sig i løbet af en uge (figur 4b).

Figur 4
Fig. 4. (a) Histogram viser fordelingen af fluorescensintensiteterne for SSLB matrix er vist i figur 3a. Gennemsnittet i array intensitet for hver SSLB blev brugt til at kompilere histogrammet. Den fuldt optrukne linie er en Gauss fit til data. (B) Middel matrix belægning (sorte cirkler) og fluorescensintensitet (røde firkanter) for en SSLB matrix overvåget i løbet af en uge. Tilpasset fra henvisning 20 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Vi gjorde arrays sammensat af SSLBs med varierende koncentrationer af GM1 (0, 0,5, 1 and 2 mol%) og udsatte dem for en fast koncentration af CTx samt arrays med SSLBs med koncentrationer af GM1 og udsatte dem for varierende koncentrationer af CTx. Den senere forsøg blev anvendt til at bestemme ligevægten dissociationskonstant (Kd) for GM1/CTx binding. De SSLB arrays med varierende GM1 koncentration blev udsat for 50 nM Alexa-488 mærket CTx i 1 time og derefter vasket og afbildes. Intensiteten histogrammer for SSLB arrays med 0,5-2 mol% GM1 udsat for 50 nM Alexa 488-konjugeret CTx kan ses i figur 5a 5b viser den lineære afhængighed af den gennemsnitlige fluorescensintensitet ved GM1-koncentration.. Når koncentrationen af GM1 i SSLBs er fastsat til 2 mol%, og SSLB arrays udsættes for CTx spænder fra 16 pM til 158 nM bindingen respons følger sigmoidale kurver som vist i figur 5c. Kurverne fit til disse data er baseret på to forskellige bindende modeller: Langmuir isoterm (Eq. 1) og Hill-Waud tilstandl (Eq. 2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Ligning 1 (1)

Ligning 2 (2)

Hvor F er fluorescensintensiteten ved en given CTx koncentration F max er fluorescensintensiteten, når bindingen er mættet [CTx] er CTx koncentration, K D og K H er dissociationskonstanter fra Langmuir og Hill-Waud passer hhv , og n er kooperativitet koefficient i Hill-Waud model. Den kooperativitet koefficient (n) estimerer størrelsen af multivalente binding, hvor en n er større endén betyder, at hver CTx molekyle binder mere end én GM1. Koncentrationen af CTx på 0,5 x F max er K D eller K H for GM1/CTx interaktion. I vores eksperimenter beregnes vi KD på 1,6 ± 0,2 nM, og K H på 1,4 ± 0,2 nM med en n-værdi på 1,3, hvilket indikerer kooperativ binding. Dissociationskonstanterne for GM1/CTx interaktion varierer meget i litteraturen, der spænder over 5 størrelsesordener fra 04:05 til 370 nM 26,27.

Figur 5
Figur 5. CTx/GM1 bindingsassays på SSLB arrays. (A) Histogrammer fluorescensintensiteten af individuelle SSLBs inden SSLB arrays. Opstillingerne indeholdt SSLBs med 0,5, 1 eller 2 mol% GM1 og blev udsat for 50 nM Alexa 488-konjugeret CTx. Denfuldt optrukne linier er gaussiske passer. (B) Plot af fordelingsorganet fra (a) som en funktion af GM1-koncentration. (C) Bindende kurver viser fordelingen betyder fra arrays indeholdende SSLBs med 2 mol% GM1 efter udsættelse for Alexa-488-konjugeret CTx varierende fra 16 pM til 158 nM. Linjerne er passer til Langmuir isoterm (rød) og Hill-Waud (blå) bindende modeller. Fejlsøjlerne i (BC) repræsenterer standardafvigelser af fordelingen af fluorescens intensitet svarende til hvert datapunkt. Tilpasset fra henvisning 20 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Som tidligere nævnt, er det også muligt at danne arrays med biomembran udvundet fra naturlige kilder 21. Opstillingerne er udformet på samme måde, ved at dispergere membran partikler på en mikrobrønd substrat, derefter rense den øverste overflade med gummiskraber efterlade membran partikler i mikrofonenRowells. Figur 6 viser eksempler på myelin og neuronale lipidklump microarrays. I figur 6a er myelin partikler mærket med den lipofile fluorofor FM1-43. Lipidklumper er kendt for at blive beriget i kolesterol og gangliosider såsom GM1; således, Alexa 488-konjugeret CTx binder kraftigt til lipidklump microarrays som vist i figur 6b, mens fluorescensmærket streptavidin (SAPE) ikke binder til arrayet. (Figur 6c) Vi har også skabt stribe arrays ved at levere myelin og lipidklump partikler mikrobrønden underlaget med en mikrofluid chip med 250 um brede kanaler. Efter partikel levering blev mikrofluid chip løsrevet fra mikrobrønden substrat og sugefod proces, der udføres som sædvanligt. De stribe arrays blev derefter udsat for et fluorescerende anti-oligodendrocyt IgM-antistof (IgM O4), som binder sulfatid fundet i myelin. (Figur 7) myelin og lipidklump stribe microarrays i Figur 7 er vist ved stigende niveauer af forstørrelse, og på det højeste niveau af forstørrelse, er det umiddelbart indlysende, at IgM O4 kun binder sig til myelin microarrays fordi sulfatid er fraværende fra lipidklumperne.

Figur 6
Figur 6. Myelin partikel og neuronale lipidklump partikel arrays. (A) En myelin partikel microarray hvor myelin partikler gjort fluorescerende ved den lipofile fluorofor FM1-43. Den stiplede linje angiver kanten af ​​array-området. (B) lipidklump microarray viser CTx binding til lipid raft partikler. (C) lipidklump microarray udsat for fluorescerende streptavidin-phycoerythrin (SAPE), der viser ringe eller ingen ikke-specifik binding. Tilpasset fra henvisning 21 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Figur 7
Fig. 7. Multikomponent arrays dannet ved mikrofluid levering af myelin og neuronale Gummibåd membraner. (A) Fluorescens billede efter myelin og flåder blev aflejret via mikrofluidkanaler på microarray substrat. Venstre og højre striber indeholder myelin og den midterste stribe indeholder neuronale tømmerflåde membraner. Membranerne farves med FM1-43, hvilke etiketter alt lipid materiale. Skalaen bar er 250 um. (B) Fluorescens billede af de samme tre striber efter anvendelse af PDMS gummiskraber og inkubering med IgM O4. Skalaen bar er 250 um. (CE) forstørrede billeder fra de tre striber, der viser, at IgM O4 kun binder sig til myelin microarrays: (c) venstre stribe og (e) lige stribe. Skalaen barer i panels ce er 30 um. Tilpasset fra henvisning 21 og bruges med tilladelse fra American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde viser vi, at monodisperse SiO 2 perler overtrukket med understøttede lipiddobbeltlag kan grupperes i mikrobrønde arrays uden behov for at målrette ligander på lipiddobbeltlagene eller substratoverfladen og arrays kan anvendes til karakterisering af toksin-lipid-interaktioner. Dissocieringskonstanten vi beregnet for CTx/GM1 binding sammenligner positivt i betragtning af de store forskelle i værdier i litteraturen, med en tidligere rapport fra Winter et al., Hvor kolloid samling af lipid-belagte kugler blev brugt til at beregne en dissociationskonstant på omkring 30 nM. Ved montering af data til Hill-Waud bindende model, vi fastslået, at CTx/GM1 interaktion er sandsynligvis multivalente, som er enig med tidligere rapporter 28. B (gangliosid binding) underenheden af CTx eksisterer som en pentamer med hver af de fem enheder, der kan binde et GM1-molekyle 29; det er således ikke overraskende, at mere end en underenhed kan være bundet givet diffusive mobilitet GM1 i SLBs 30.

Arrays af kemisk funktionaliserede perler er blevet anvendt i andre analytiske undersøgelser 31. I disse typer af eksperimenter, er perler typisk immobiliseret i mikrobrønde skabt i slutningen af ​​ætsede optiske fibre. Multiplex fluorescensanalyser kan udføres i denne konfiguration ved at blande subpopulationer af perler og immobilisere dem samtidigt på enden af den optiske fiber 32. I vores multiplex assay (figur 3c-3e), vi immobiliseret optisk kodede SSLBs sekventielt fordi lipider på SSLBs fri i opløsning kan overføres fra en type SSLB til en anden 33. Mens dette tilføjer ekstra trin i udarbejdelsen af ​​SSLB arrays, er det ikke alt for tidskrævende og er den mest effektive metode til lipid-funktionaliserede perler. Vi har også rumligt kodet arrays ved at deponere forskellige SSLB populationer i tilstødende microwell arrays, og der er ingen observerbar cross-talk mellem arrays 20. For at reducere prøve-tilberedningstider kan SSLB arrays være forberedt på forhånd og anvendes, når det ønskes. Vi testede stabilitet arrays i løbet af en uge og fandt ingen signifikant nedbrydning af arrays i form af fluorescensintensitet, hvilket indikerer, at mængden af ​​lipid materiale på SSLBs ikke ændrer sig med tiden. Også, array belægningsprocent ikke ændre sig over tid, hvilket tyder på, at når SSLBs er immobiliserede, de ikke løsnes fra mikrobrøndene (figur 4b).

Ud over perler belagt med syntetiske lipid-dobbeltlag, har vi også brugt denne metode til at oprette arrays af naturlige membran partikler 21. I dette arbejde, vi immobiliseret myelin partikler fra mus hjernen samt neuronale membran partikler såsom fraktion lipid-tømmerflåde. Vi var i stand til at bruge arrays til at identificere cellespecifikke membranproteiner overflademolekyler af antistof binding (figur 6 og 7). Endvidere, når størrelsen af ​​mikrobrøndene blev reduceret til nanoskala og overfladen af ​​arrayet blev belagt med guld, var vi i stand til at ansætte overfladeplasmonresonans at overvåge bindingen af ​​antistoffer mod myelin membran partikler uden anvendelse af fluorescerende markører. Den største forskel mellem at bruge SSLB og blærer eller naturlige membran partikler til at danne arrays er, at det nøjagtige beløb af membran materiale i hver mikrobrond i tilfælde af SSLBs er kendt, fordi kun en enkelt perle kan passe ind i hver brønd. Med blærer eller naturlige membran partikler, er der ingen måde at styre mængden af ​​materiale i hver mikrobrønd, andet end at justere startkoncentration af vesikler eller partikler. Imidlertid godt til-brønd variabiliteten af antallet af vesikler er ikke meget stor i forhold til fordelingen af vesikel diametre 21.

Endelig kan denne metode, divErse fremtidige ansøgninger. Junesch og kolleger har ansat en svaber til at fjerne nanopartikler under kolloid litografi nanofabrikation 34. Membran arrays kunne dannes til at efterligne celle-celle-kontakter for at undersøge cellulær omdrejningspunkt vedhæftning 35 eller undersøge binding af membran krumning-sensing proteiner 36. Endvidere vil anvendelse af porøse perler lette optagelsen af transmembrane proteiner i lipiddobbeltlagene 37 eller lokal levering af lagret ladning til celler dyrket på en biomembran matrix substrat. Mikrobrøndovertrækket platformen er fremstillet ved fotolitografi, hvilket muliggør design fleksibilitet. Her havde vores arrays sekskantede geometri, men firkantet, lineær eller andre geometrier kan oprettes med varierende vifte hyppighed og microwell dimensioner til at undersøge de rumlige virkninger af fokal vedhæftning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud til SHO fra National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIERE Award og DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program og Minnesota Partnership Award for Bioteknologi og Medicinsk Genomics. Device fabrikation blev udført på University of Minnesota Nanofabrikation Center (NFC), der modtager støtte fra NSF gennem National Nanotechnology Infrastructure Network. Dette arbejde blev også støttet af tilskud til MR fra National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Scleroseforeningen (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Fonde og McNeilus familien. Forfatterne ønsker at takke Hyungsoon Im for hjælp med illustrationer og Shailabh Kumar om hjælp med scanning elektronmikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
  2. Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
  3. Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
  5. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
  6. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  7. Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
  8. Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
  9. Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
  10. Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
  11. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
  12. Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
  13. Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
  14. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
  15. Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
  16. Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
  17. Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
  18. Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
  19. Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
  20. Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
  21. Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
  22. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
  23. Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
  24. Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
  25. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
  26. Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
  27. Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
  28. Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
  29. Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
  30. Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
  31. Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
  32. Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
  33. Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
  34. Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
  35. Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
  36. Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
  37. Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).

Tags

Bioteknik understøttet lipiddobbeltlag perler microarray fluorescens microfabrication nanofabrikation atomare lag deposition myelin lipidklumperne
Dannelse af Biomembrane Microarrays med en svaber-baserede Assembly Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W.,… More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter