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Bioengineering

एक squeegee आधारित विधानसभा विधि के साथ Biomembrane डीएनए की संरचना

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

समर्थित लिपिड bilayers और प्राकृतिक झिल्ली कणों कोशिका झिल्ली के गुण अनुमानित कर सकते हैं और विश्लेषणात्मक रणनीतियों की एक किस्म में शामिल किया है कि सुविधाजनक व्यवस्था कर रहे हैं. यहाँ हम समर्थित लिपिड bilayer में लिपटे 2 Sio मोती, फॉस्फोलिपिड पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों से बना प्रोटीन की तैयारी के लिए एक विधि का प्रदर्शन.

Abstract

लिपिड bilayer झिल्ली कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली और subcellular organelles की सीमाओं को परिभाषित. प्रकृति में, इन झिल्ली, लिपिड के कई प्रकार की विषम मिश्रण हैं झिल्ली ही सीमित प्रोटीन होते हैं और कार्बोहाइड्रेट से सजाया जाता है. कुछ प्रयोगों में, यह प्राकृतिक झिल्ली के उन लोगों से लिपिड bilayer की biophysical या जैव रासायनिक गुणों दसगुणा करने के लिए वांछनीय है. इस तरह के मामलों में इस तरह के विशाल पुटिका, liposomes या समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) के रूप में मॉडल प्रणाली के उपयोग के लिए कहते हैं. SLBs की सारणियों अनुप्रयोगों संवेदन और सेल सेल बातचीत की नकल उतार के लिए विशेष रूप से आकर्षक हैं. यहाँ हम SLB सरणियों के गठन के लिए एक नई विधि का वर्णन. Submicron व्यास 2 Sio मोती पहले गोलाकार SLBs (SSLBs) के रूप में लिपिड bilayers साथ लेपित हैं. माला तो सूक्ष्म गढ़े submicron व्यास microwells की एक सरणी में जमा कर रहे हैं. leavin जबकि तैयारी तकनीक, सब्सट्रेट सतह को साफ करने के लिए एक "squeegee" का उपयोग करता हैmicrowells में तय हो चुका है कि SSLBs पीछे छ. इस विधि microwell सब्सट्रेट का कोई रासायनिक परिवर्तन, और न ही SSLB पर किसी विशेष को निशाना बनाने ligands की आवश्यकता है. अच्छी तरह से व्यास मनका व्यास की तुलना में अभी भी बड़ा होना देखते है क्योंकि microwells एकल मोती के कब्जे में हैं. बाकी खाली रहते हैं, जबकि आमतौर पर, कुओं की अधिक 75%, कब्जा कर रहे हैं. बफर में SSLB सरणियों एक से अधिक सप्ताह के दीर्घकालिक स्थिरता प्रदर्शित करते हैं. हम ganglioside GM1 साथ हैजा विष की बातचीत निस्र्पक द्वारा प्रदर्शित करता है, जो SSLBs के कई प्रकार के धारावाहिक बयान से एक एकल सरणी में रखा जा सकता है, और सरणियों संवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी सेलुलर स्रोतों से मनका का समर्थन करता है और biomembranes बिना फॉस्फोलिपिड पुटिका एक ही विधि के साथ arrayed जा सकता है और सेल विशिष्ट झिल्ली लिपिड पहचाना जा सकता है.

Introduction

लिपिड bilayer झिल्ली प्रकृति में आवश्यक संरचनाओं हैं. सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली और organelle झिल्ली जीवन के लिए आवश्यक हैं कि अणुओं की एक संख्या शामिल है कि लिपिड bilayers से बना रहे हैं. कई जीवन बनाए रखने प्रक्रियाओं कोशिकाओं की सतह पर होते हैं या लिपिड bilayer झिल्ली के साथ जुड़े अणुओं द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. वास्तव में, कई दवाइयों लक्ष्य प्रक्रियाओं या अणुओं 1,2 पर या झिल्ली में पाया जाता है. यह विश्लेषणात्मक ऐसी झिल्ली सतहों पर होने वाले रासायनिक प्रतिक्रियाओं या noncovalent बंधन घटनाओं के रूप में प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए आवश्यक है. प्राकृतिक झिल्ली सेंसर के साथ अलग और / या इंटरफेस के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि कई शोधकर्ताओं विश्लेषणात्मक अध्ययन से बाहर ले जाने के लिए सरल मॉडल झिल्ली को रोजगार. मॉडल झिल्ली प्रणालियों के एक नंबर nanoscale आयाम 3,4 के साथ liposomes के लिए व्यास में microns के सैकड़ों के दसियों हो सकता है कि विशाल vesicles से लेकर साहित्य में वर्णित हैं. Alternatively, ठोस समर्थन पर जमा तलीय लिपिड bilayers, यानी, लिपिड bilayers (SLBs), विभिन्न सतहों के एक नंबर पर गठित किया जा सकता है और व्यापक रूप से biophysical जैव रासायनिक, और विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों 5 में इस्तेमाल किया गया है का समर्थन किया. बिजली या ऑप्टिकल सामग्री के साथ SLBs युग्मन विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों के उपयोग के माध्यम से झिल्ली जैव रसायन और बायोफिज़िक्स की जांच में सक्षम बनाता है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 6, Electrochemistry 7, ऑप्टिकल स्पेक्ट्रोस्कोपी 8, स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी 9, सतह plasmon अनुनाद 10, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री 11 सब SLBs की संरचना और गुणों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है.

SLB सरणियों मल्टीप्लेक्स assays 12,13 के लिए सेंसर की डिजाइन में अतिरिक्त बहुमुखी प्रतिभा की पेशकश. अन्य अनुप्रयोगों प्रतिरक्षा कोशिकाओं 14 के बीच है कि रूपों जंक्शन नकल करने के लिए SLB सरणियों का उपयोग करें. SLB सरणियों के लिए तैयार करने के तरीकों microflu से अलग हैidic आसन्न SLB पैच के बीच शारीरिक बाधाओं को रोजगार है कि उन लोगों के लिए 15 दृष्टिकोण. 16 अन्य समूहों मुद्रण विधियों 17 का इस्तेमाल किया है, प्रकाश रासायनिक patterning 18 और विभिन्न Nanoengineering SLB सरणियों बनाने के लिए 19 दृष्टिकोण.

इस पत्र और साथ वीडियो में हम microwells 20 के आदेश दिए सरणियों में SLB में लिपटे 2 Sio मोती जमा करके SLB सरणियों के गठन के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम गोलाकार समर्थित लिपिड bilayers (SSLBs) के रूप में SLB में लिपटे 2 Sio मोतियों को देखें. इस तकनीक को हम भी उदाहरण परिणाम दिखाने जिसमें से प्राकृतिक स्रोतों 21 से निकाली फॉस्फोलिपिड vesicles और biomembranes की सरणियों बनाया कि पहले काम का एक विस्तार है. Biomembrane कणों या पुटिका arraying के लिए अन्य तरीकों पुटिका सतह पर निहित पूरक ligands के साथ संबद्ध है कि सतहों पर विशिष्ट लक्षित ligands के पैटर्न पर भरोसा किया है. उदाहरण बायोटिन शामिलavidin एसोसिएशन 22,23 और डीएनए संकरण योजनाओं 24. हमारा दृष्टिकोण केवल आवश्यक कोई लक्ष्य या मान्यता moieties साथ एक microwell सरणी की आवश्यकता है. SSLBs का आकार कम पाली dispersity है जो 2 Sio मनका समर्थन करता है, के व्यास से परिभाषित किया गया है. SSLB व्यास की तुलना में सिर्फ बड़ा करने microwell व्यास ट्यूनिंग, केवल एक ही SSLB प्रत्येक microwell में सुलझेगी. एक पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) squeegee तो सतह से microwells में स्थिर नहीं कर रहे हैं कि सभी SSLBs हटा. microwells और परिणामी SSLB सरणियों 3 माइक्रोन केंद्र के लिए केंद्र रिक्ति और हेक्सागोनल अवधि के साथ उच्च घनत्व (~ 10 5 SSLBs / 2 मिमी) है. क्रमानुसार अलग लिपिड रचनाओं के साथ SSLBs जमा करके, यह अनियमित तैनात SSLBs साथ multicomponent सरणियों बनाने के लिए संभव है. SSLB सरणियों की संवेदन क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, हम SSLBs में शामिल एक ganglioside (GM1) के साथ हैजा विष (सीटीएक्स) की बातचीत का इस्तेमाल किया. साथप्राकृतिक झिल्ली कण, हम दो अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं से झिल्ली सामग्री युक्त multicomponent सरणियों में सेल विशिष्ट लिपिड पता लगाने में सक्षम थे.

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Protocol

Microwell ऐरे सब्सट्रेट के 1. Microfabrication

  1. Thermally बड़े हो ऑक्साइड की 100 एनएम के साथ एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर के साथ शुरू करो.
  2. 30 सेकंड के लिए 4000 rpm पर वेफर पर SPR-955 0.7 photoresist स्पिन.
  3. 90 सेकंड के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर सेंकना.
  4. Photoresist बेनकाब.
    1. सरणी एक 2 मिमी x 2 मिमी क्षेत्र को शामिल किया गया है, जहां एक 3 माइक्रोन की अवधि के साथ एक हेक्सागोनल सरणी में व्यवस्थित 1 माइक्रोन छेद बनाएगा एक मुखौटा का प्रयोग करें.
    2. 6 मिमी के एक कदम के आकार और 200 MJ / 2 सेमी की एक जोखिम का उपयोग कर एक मैं ऑनलाइन स्टेपर में वेफर बेनकाब.
  5. 90 सेकंड के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर सेंकना.
  6. 90 सेकंड की कुल विकास समय के लिए वेफर पर सीडी-26 के 2 puddles जमा करने के लिए एक स्पिन डेवलपर का उपयोग कर विकसित.
  7. एन 2 के साथ ultrapure डि पानी और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
  8. एर के 50 sccm, CF 4 की 25 sccm, और CHF 3 फ़्लो के 50 sccm साथ 6 मिनट के लिए एक प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाश में ऑक्साइड खोदना75 mTorr के दबाव में दक्षिणपंथी.
  9. सी 4 एफ 8 से 63 sccm, एसएफ 6 की 27 sccm, एर के 40 sccm, और ओ 2 14 mTorr के दबाव में बहने की 10 sccm साथ 2 मिनट के लिए एक आईसीपी गहरे खाई प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाश में सिलिकॉन खोदना.
  10. विरोध को दूर करने के एसीटोन, मेथनॉल, और isopropanol में कुल्ला.
  11. एच 2 एसओ 4 के एक स्नान में रखें: एच 2 ओ 2 1:01 सतह को साफ करने के लिए 10 मिनट के लिए.
  12. एन 2 के साथ ultrapure डि पानी और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
  13. 250 डिग्री सेल्सियस पर परमाणु परत बयान से अल 2 के 1,080 Å ओ 3 जमा

पाली के 2. तैयारी (dimethylsiloxane) Squeegee

  1. यदि संभव हो तो, एक cleanroom में काम करते हैं. अन्यथा साफ संभव वातावरण में काम करते हैं.
  2. ≥ 13 मिमी पक्षों के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश (या अन्य स्वच्छ प्रयोज्य कंटेनर) प्राप्त करें.
  3. कि डिश में, 50 ग्राम PDMS बस द्वारा पीछा किया, 5 ग्राम PDMS इलाज एजेंट उंडेलई एजेंट (या ज्यादातर पेट्री डिश भर जाएगा कि एक 1:10 अनुपात के साथ कुछ भी). एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक या छड़ी के साथ अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. बुलबुले मिश्रण (लगभग 30 मिनट) से बाहर आने तक वैक्यूम लागू करने, एक निर्वात लाइन के साथ एक कक्ष में मिश्रित PDMS रखकर बुलबुले निकालें.
  5. पहले से ही पेट्री डिश में, हवा के बुलबुले के निर्माण से परहेज पेट्री डिश में PDMS, बहना नहीं हैं.
  6. 50 डिग्री सेल्सियस (कम समय के लिए उच्च गर्मी भी काम करता है)> पर एक hotplate पर रातोंरात इलाज.
  7. नई / साफ धार के साथ, ध्यान से संभव के रूप में साफ ऊपर की सतह रखते हुए, एक आयताकार टुकड़ा लगभग 2.5 x 2.5 सेमी काटा. एक साफ संदंश के साथ बाहर छील. (इस squeegee प्रक्रिया में इस्तेमाल किनारे हो जाएगा) के रूप में संभव के रूप में तेजी शीर्ष बढ़त बनाने के लिए एक प्रस्ताव में धार पर नीचे दबाने से एक किनारे (1.5 सेमी नीचे) बंद ट्रिम.
  8. तब एसीटोन, मेथनॉल, isopropyl शराब, और ultrapure डि पानी के साथ स्वच्छ और साफ नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी झटका. एक साफ पेट्री डिश में स्टोर.

Vesicles के 3. तैयारी

  1. लिपिड शेयर 25 मिलीग्राम / एमएल अंडा phosphatidylcholine (पीसी) का समाधान और 1 मिलीग्राम / एमएल 1,2-dipalmitoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphoethanolamine एन लीजिए - क्लोरोफॉर्म में (Lissamine rhodamine बी Sulfonyl) अमोनियम नमक (रो-DPPE) और क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल में monosialoganglioside GM1 की एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान (2:1 वी / वी).
  2. एक छोटे कांच की शीशी में 25 मिलीग्राम / एमएल पीसी की 18.9 μl, 0.5 मिलीग्राम की 39.6 μl / एमएल GM1 और के 7.9 μl जोड़कर 97% mol पीसी में, 2 मोल% GM1 और 1% mol रो-DPPE परिणाम है कि एक मिश्रण बनाना 1 मिलीग्राम / कांच सीरिंज का उपयोग मिलीलीटर रो-DPPE.
  3. नोट:. नायर एट अल 25 के लिए अनुपूरक सामग्री किसी भी वांछित रचना की पुटिका बनाने के लिए आवश्यक लिपिड की मात्रा की गणना के लिए एक उत्कृष्ट अनुकूलन एक्सेल स्प्रेडशीट शामिल हैं.
  4. एक निर्वात desiccator में शीशी प्लेस और 6 घंटे के लिए शून्य के नीचे शीशी छोड़ कर विलायक हटा दें.
  5. 0.1 की एक जलीय घोल बनाएंएम NaCl. सूखे लिपिड फिल्म युक्त शीशी के लिए 0.1 एम NaCl समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. जलीय लिपिड मिश्रण रात भर आराम करने की अनुमति.
  7. एक पुटिका निलंबन बनाने के लिए संक्षेप में भंवर मिश्रण, फिर कमरे के तापमान पर एक स्नान sonicator में 20 मिनट के लिए sonicate.
  8. 100 एनएम छेद के आकार के साथ एक polycarbonate झिल्ली के माध्यम से पुटिका निलंबन हटा. फिल्टर 17x के माध्यम से पुटिका निलंबन गुजरती हैं.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कांच की शीशी में extruded पुटिका स्टोर

गोलाकार समर्थित लिपिड bilayers के 4. गठन

  1. 700 एनएम व्यास 2 Sio मोती लीजिए. मोती 1.4 x 10 11 मोती / एमएल के एक शेयर एकाग्रता के साथ आसुत जल में सप्लाई कर रहे हैं.
  2. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 0.1 एम NaCl के 893 μl को मनका शेयर समाधान के 107 μl जोड़कर 1.5 x 10 10 मोती / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक 1 मिलीलीटर मनका निलंबन तैयार करते हैं.
  3. यह अच्छी तरह से मील है यह सुनिश्चित करने के लिए निलंबन भंवरxed.
  4. 20 मिनट फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए 1,700 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र. 0.1 एम NaCl के 1 मिलीलीटर में मोती Resuspend. अच्छी तरह मोती धोने के लिए दो बार अधिक इस चरण को दोहराएँ.
  5. , SSLBs फार्म एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 1 मिलीग्राम / एमएल पुटिका निलंबन के 200 μl के लिए 2 Sio मनका निलंबन के 25 μl जोड़ने के लिए. भंवर मिश्रण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए खड़े हो जाओ. इस स्तर पर SSLB एकाग्रता 1.7 x 10 9 SSLBs / एमएल होना चाहिए.
  6. SSLBs गोली 20 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र. गोली की वजह से मोती पर रो-DPPE साथ vesicles के संबंध विच्छेद करने के लिए गुलाबी दिखाई देनी चाहिए.
  7. 225 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), = पीएच 7.4 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें. दोहराएँ SSLB निलंबन से किसी भी unruptured vesicles दूर करने के लिए 4.6-4.7 दो बार कदम.

SSLB ऐरे के 5. विधानसभा

  1. 4-6 mic के साथ आयताकार टुकड़े में जिसके परिणामस्वरूप microwell सरणियों की फोड़ना वेफरटुकड़ा प्रति Rowell सरणियों.
  2. भंवर SSLB निलंबन मिश्रण, तो प्रत्येक microwell सरणी पर SSLB निलंबन के 10 μl जगह है. 1 घंटे के लिए आराम SSLBs सतह को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए ऐसा न हो.
  3. फिर धीरे एक उथले डिश में तैयार एक पीबीएस स्नान में डूब, एक धोने बोतल से पीबीएस के साथ microwell सरणी चिप धो लो.
  4. जलमग्न, वहीं धीरे microwell सरणी चिप पर PDMS squeegee फ्लश जगह है और धीरे microwells में स्थिर नहीं कर रहे हैं कि SSLBs दूर करने के लिए सतह 5x साथ स्लाइड.
  5. पकड़ धीरे microwell सरणी चिमटी के साथ चिप और किसी भी अतिरिक्त SSLBs दूर करने के लिए पीबीएस स्नान में मिलाते हैं.
  6. जल्दी squeegee स्नान से चिप को हटाने और आगे उपयोग करें जब तक एक ताजा पीबीएस स्नान में जगह है. चिप के ऊपर की सतह SSLBs संरक्षित करने के लिए गीला रहता है सुनिश्चित करें.

नोट: ऊपर वर्णित विधानसभा विधि माउस मस्तिष्क, या फोटो से अलग माइलिन कणों की तरह, प्राकृतिक झिल्ली कणों के arrays बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है2 Sio मनका समर्थन के बिना spholipid पुटिका. इस काम Wittenberg एट में विस्तार से वर्णन किया गया है अल. 21 और प्रतिनिधि परिणाम नीचे दिखाई जाती हैं.

6. हैजा विष बंधन परख

  1. पीबीएस में गोजातीय सीरम albumin (BSA) के एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें.
  2. 2 मिलीग्राम / एमएल BSA के साथ पीबीएस एलेक्सा 488 संयुग्मित हैजा विष बी सबयूनिट के वांछित एकाग्रता के साथ एक समाधान तैयार करें.
  3. पीबीएस स्नान से SSLB सरणी चिप निकालें और पोंछ एक प्रयोगशाला का उपयोग पीबीएस समाधान के सबसे दूर बाती. SSLB सरणी हाइड्रेटेड रखने के लिए चिप पर अभी काफी पीबीएस छोड़ दें.
  4. अविशिष्ट बंधन को रोकने के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल SSLB सरणी चिप को बीएसए समाधान के 200 μl जोड़ें. एक humidified बॉक्स में 1 घंटे के लिए आराम करते हैं.
  5. एक micropipette के साथ, SSLB सरणी चिप के ऊपर से समाधान के 200 μl हटा दें.
  6. SSLB सरणी चिप को हैजा विष समाधान के 200 μl जोड़ें और एक humidified बॉक्स में 1 घंटे के लिए आराम करते हैं.
  7. धीरे किसी भी अपार हैजा विष को दूर करने के लिए एक धोने बोतल से पीबीएस के साथ SSLB सरणी चिप धो लो.
  8. एक प्रयोगशाला का उपयोग बाती दूर अतिरिक्त पीबीएस पोंछे. एक 24 मिमी x 40 मिमी कवर पर्ची के साथ कवर चिप इमेजिंग से पहले.
  9. फिल्टर का उपयोग कर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ छवि सरणियों ब्याज की fluorophores के लिए उपयुक्त खेलें.
  10. ImageJ सॉफ्टवेयर का स्वचालित कण विश्लेषण समारोह का उपयोग कर एक सरणी में व्यक्तिगत SSLBs की प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करें.
  11. एक दिया सरणी पर पाया SSLBs की तीव्रता को संक्षेप कि हिस्टोग्राम में व्यक्तिगत SSLBs से मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता संकलित करें.

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Representative Results

2 Sio मोती phospholipids, फ्लोरोसेंट लिपिड और ऐसे gangliosides के रूप में अन्य लिपिड से बना vesicles के एक समाधान के साथ मिश्रित कर रहे हैं जब चित्रा 1 ए में रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है, पुटिका, SSLBs के लिए फार्म 2 Sio मनका सतहों पर टूटना. SSLBs धोने के बाद, SSLB समाधान की एक बूंद एक microwell सरणी पर रखा गया है, और मोती सतह को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है. (चित्रा 1B1) यह आंकड़ा 1B2 में दिखाए जाते हैं जो फॉस्फोलिपिड पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों के निलंबन के साथ भी किया जा सकता है. एक microwell सरणी सब्सट्रेट करने के लिए adsorbed फॉस्फोलिपिड vesicles के एक प्रतिदीप्ति छवि चित्रा 1B3 में दिखाया गया है. फिर PDMS squeegee किसी भी SSLBs (चित्रा 1C1), पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों microwells में व्यवस्थित नहीं था कि (चित्रा 1C2) को हटाने के लिए सतह भर में धीरे स्लाइड करने के लिए किया जाता है. यह एक SSLB सरणी में जो परिणाम प्रत्येक मेंmicrowell ज्यादा से ज्यादा शामिल एक SSLB (चित्रा 1d1) या एकाधिक पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों प्रत्येक microwell (चित्रा 1d2) में हैं, जहां एक सरणी. Fluorescently लेबल पुटिका से बना एक माइक्रोएरे की एक छवि चित्रा 1d3 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
अंडा पीसी (काला), रो-DPPE (लाल) और GM1 (नीला):.. एक Sio 2 मनका पर लिपिड के 3 प्रकार से बना एक SSLB की SSLBs और SSLB सरणी विधानसभा की चित्रा 1 संरचना (क) चित्रण. (बी 1 डी 1) एक microwell सरणी (B1) पर बिखरे SSLBs दिखा एक SSLB सरणी की विधानसभा के लिए प्रक्रिया प्रवाह, SSLBs की सतह स्पष्ट करने के लिए एक PDMS squeegee का उपयोग microwells (C1) में बसे नहीं, और अंतिम SSLB सरणी (डी 1 ). (बी 2 डी 2 (बी 2) में चित्रण को इसी microwell सब्सट्रेट पर adsorbed फॉस्फोलिपिड vesicles के (बी 3) एक प्रतिदीप्ति छवि. (D3) (डी 2) में चित्रण करने के लिए इसी फॉस्फोलिपिड पुटिका से बना एक माइक्रोएरे के एक प्रतिदीप्ति छवि. संदर्भ 20 और 21 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

Microwells में SSLBs दोनों angled ऊपर से देखने और पार के अनुभागीय दृष्टिकोण से स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के साथ imaged थे के लिए व्यक्तिगत Sio 2 मोतियों का समर्थन करता है. चित्रा 2b एक में immobilized एक एकल मनका के एक पार के अनुभागीय देखने से पता चलता है, जबकि एक क्षेत्र के एक शीर्ष दृश्य लगभग 15 माइक्रोन x 15 माइक्रोन, चित्रा 2A में दिखाया गया हैmicrowell. microwell कोटिंग हल्का परत अल 2 की 100 एनएम है ओ 3 कुओं केवल एक मोती को समायोजित करने में सक्षम हैं कि इतनी अच्छी तरह से व्यास धुन पर परमाणु परत बयान से जमा किया.

चित्रा 2
SSLB सरणियों की चित्रा 2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों. Microwell सरणियों में स्थिर SSLB मनका समर्थन करता दिखा एक 15 मिमी x 15 मिमी क्षेत्र के (एक) एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. (ख) एक microwell में एक भी 700 एनएम व्यास SSLB. microwell कोटिंग केवल व्यक्तिगत मोतियों के अंदर फिट कर सकते हैं ताकि microwell हटना करने के लिए जमा किया जाता है, जो अल 2 3 हे, है. संदर्भ 20 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

SSLB सरणियों तैयार हो जाने के बाद, वे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है. चित्रा 3B 76% की एक अधिभोग दर के लिए 550 microwells और 416 SSLBs साथ एक क्षेत्र से पता चलता है.

SSLBs के विभिन्न प्रकार के अनुक्रमिक बयान एक से अधिक व्यक्ति SSLBs की पहचान एक विष रिसेप्टर (GM1) की अनुपस्थिति या उपस्थिति द्वारा निर्धारित किया गया था, जहां SSLB, के प्रकार और उसके हैजा विष (सीटीएक्स) के बंधन के साथ सरणियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. विधानसभा की प्रक्रिया एक भी SSLB प्रकार के रूप में ही था, लेकिन एक अलग SSLB पहचान के साथ एक दूसरी बार किया गया. SSLBs के शुरू एकाग्रता SSLB की पहली प्रकार के अधिभोग कम करने के लिए और अधिक रिक्त पदों SSLB के दूसरे प्रकार के कब्जे में जाने की अनुमति के लिए 10x कम थी. आंकड़े -3 सी-3E में, SSLBs के दो प्रकार के साथ एक SSLB सरणी दिखाया गया है. अलSSLBs के एल लाल फ्लोरोसेंट रो-DPPE (चित्रा -3 सी) होते हैं, लेकिन SSLBs के केवल कुछ GM1, CTX के बी सबयूनिट के लिए रिसेप्टर है कि एक ganglioside होते हैं. हरी फ्लोरोसेंट एलेक्सा 488 संयुग्मित सीटीएक्स के संपर्क में, GM1 युक्त केवल SSLBs ग्रीन चैनल (चित्रा 3 डी) में प्रतिदीप्ति. लाल और हरे रंग की छवियों विलय कर रहे हैं, यह SSLBs GM1 (पीला) होते हैं, जो निर्धारित करने के लिए संभव है और जो नहीं (लाल) (चित्रा 3E).

चित्रा 3
SSLB सरणियों की चित्रा 3. प्रतिदीप्ति इमेजिंग. (क) 936 रो-DPPE लेबल अंडा पीसी SSLBs युक्त 100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन क्षेत्र. (ख) पर कब्जा कर लिया microwells के 76% के साथ एक SSLB दिखा एक brightfield और प्रतिदीप्ति ओवरले. (सीई) रो-DPPE होते हैं कि SSLBs युक्त SSLB सरणी(सी), जिनमें से एक अंश भी एलेक्सा-488 संयुग्मित सीटीएक्स (डी) से बाध्य है जो GM1 होते हैं. (ई) colocalized प्रतिदीप्ति SSLB पर GM1 की उपस्थिति को दर्शाता है, जहां लाल और हरे रंग चैनलों के विलय. नीले हलकों यानी GM1 कमी, केवल लाल प्रतिदीप्ति कि SSLBs संकेत मिलता है. संदर्भ 20 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

SSLB सरणियों से प्रतिदीप्ति डेटा एक छवि में व्यक्तिगत SSLBs की तीव्रता को मापने के द्वारा विश्लेषण किया गया था. सरणियों से SSLB तीव्रता डेटा हिस्टोग्राम में संकलित किया गया. चित्रा -4 ए केवल अंडा पीसी और 1% mol रो-DPPE युक्त SSLBs से बना एक SSLB सरणी से रो-DPPE प्रतिदीप्ति के विश्लेषण से ऐसा ही एक हिस्टोग्राम से पता चलता है. चित्रा -4 ए में डेटा चित्रा 3 ए में छवि का विश्लेषण करके हासिल किया गया. हम जब प्रशीतित SSLB सरणियों कम से कम एक सप्ताह के लिए मजबूत और स्थिर हो पाया एकएन डी बफर में डूबे हुए. सरणियों किसी भी प्रतिदीप्ति तीव्रता खोना नहीं था, न ही सरणियों की अधिभोग एक सप्ताह (चित्रा 4 बी) के पाठ्यक्रम पर बदल दिया.

चित्रा 4
चित्रा 4. (एक) हिस्टोग्राम चित्रा 3 ए में दिखाया SSLB सरणी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का वितरण दिखा. सरणी में प्रत्येक SSLB के लिए मतलब तीव्रता हिस्टोग्राम संकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ठोस लाइन डेटा को एक गाऊसी फिट है. (ख) सरणी अधिभोग (काला हलकों) और एक सप्ताह के पाठ्यक्रम पर नजर रखी एक SSLB सरणी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता (लाल वर्गों) मतलब. संदर्भ 20 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

हम GM1 (0, 0.5, 1 की अलग सांद्रता के साथ SSLBs से बना सरणियों बना एकएन डी 2 मोल%) और एक निश्चित सीटीएक्स की एकाग्रता के साथ ही GM1 की सांद्रता के साथ SSLBs साथ सरणियों उन्हें अवगत कराया और सीटीएक्स के अलग सांद्रता उन्हें अवगत कराया. बाद में प्रयोग GM1/CTx बाइंडिंग के लिए संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (केडी) निर्धारित किया गया था. अलग GM1 एकाग्रता के साथ SSLB सरणियों फिर धोया और imaged 1 घंटे के लिए 50 एनएम एलेक्सा-488 लेबल सीटीएक्स से अवगत कराया गया. तीव्रता 0.5 के साथ SSLB सरणियों के लिए histograms - 50 एनएम एलेक्सा 488 संयुग्मित सीटीएक्स के संपर्क में 2% mol GM1 चित्रा 5A में देखा जा सकता है चित्रा 5 ब GM1 एकाग्रता पर मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता के रैखिक निर्भरता को दर्शाता है.. SSLBs में GM1 की एकाग्रता 2 मोल% पर तय हो गई है और SSLB सरणियों 16 बजे से 158 एनएम को लेकर सीटीएक्स को उजागर कर रहे हैं जब चित्रा 5C में दिखाया गया है, बंधन प्रतिक्रिया sigmoidal घटता इस प्रकार है. इस डेटा के लिए फिट घटता दो अलग बंधन मॉडल पर आधारित होते हैं: Langmuir इज़ोटेर्म (Eq. 1) और पहाड़ी Waud मोडएल (Eq. 2). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

1 समीकरण (1)

2 समीकरण (2)

एफ एक दिया सीटीएक्स एकाग्रता में प्रतिदीप्ति तीव्रता कहां बंधन संतृप्त है जब, एफ अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता है, [सीटीएक्स] सीटीएक्स एकाग्रता, कश्मीर डी और कश्मीर एच Langmuir और पहाड़ी Waud से पृथक्करण स्थिरांक हैं क्रमशः, फिट बैठता है , और एन हिल Waud मॉडल में cooperativity गुणांक है. cooperativity गुणांक (एन) की तुलना में जहां एक n अधिक multivalent बंधन की राशि का अनुमानप्रत्येक सीटीएक्स अणु एक से अधिक GM1 कि बांध इंगित करता है. 0.5 एक्स एफ अधिकतम पर सीटीएक्स की एकाग्रता GM1/CTx बातचीत के लिए कश्मीर डी या कश्मीर ज रहा है. हमारे प्रयोगों में हम सहकारी बंधन का संकेत है, 1.3 का एक एन मूल्य के साथ एक 1.6 ± 0.2 एनएम के कश्मीर डी और 1.4 ± 0.2 एनएम के कश्मीर एच गणना की. GM1/CTx बातचीत के लिए पृथक्करण स्थिरांक 370 एनएम 26,27 को 4:05 से परिमाण के 5 से अधिक के ऑर्डर लेकर साहित्य में व्यापक रूप से भिन्न.

चित्रा 5
चित्रा 5. CTx/GM1 SSLB सरणियों पर assays के बंधन. (क) SSLB सरणियों के भीतर व्यक्तिगत SSLBs की प्रतिदीप्ति तीव्रता का Histograms. सरणियों 0.5, 1 या 2% mol GM1 साथ SSLBs रखी जाती है और 50 एनएम एलेक्सा 488 संयुग्मित सीटीएक्स से अवगत कराया गया.ठोस लाइनों गाऊसी फिट बैठता है. (ख) के वितरण के प्लॉट GM1 एकाग्रता के एक समारोह के रूप में (एक) से मतलब है. (ग) वितरण दिखा बाध्यकारी घटता 158 एनएम के लिए 16 बजे से बदलती एलेक्सा-488 संयुग्मित सीटीएक्स के लिए जोखिम के बाद 2% mol GM1 साथ SSLBs युक्त सरणियों से मतलब है. लाइनों Langmuir इज़ोटेर्म (लाल) और पहाड़ी Waud (नीला) बंधन मॉडल के लिए फिट बैठता है. (ईसा पूर्व) में त्रुटि सलाखों के प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए इसी प्रतिदीप्ति तीव्रता का वितरण का मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. संदर्भ 20 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

पहले उल्लेख किया है, यह प्राकृतिक स्रोतों 21 से व्युत्पन्न biomembrane सामग्री के साथ सरणियों के लिए फार्म भी संभव है. सरणियों तो mic में झिल्ली कणों के पीछे छोड़ने के लिए squeegee के साथ ऊपर की सतह की सफाई, एक microwell सब्सट्रेट पर झिल्ली कणों dispersing द्वारा, उसी तरह बनते हैंrowells. चित्रा 6 माइलिन और neuronal लिपिड बेड़ा प्रोटीन का उदाहरण दिखाता है. चित्रा 6A में, माइलिन कणों lipophilic फ्लोरोफोरे FM1-43 के साथ लेबल रहे हैं. लिपिड rafts कोलेस्ट्रॉल और ऐसे GM1 रूप gangliosides में समृद्ध माने जाते हैं; चित्रा 6B के रूप में दिखाया fluorescently लेबल streptavidin (SAPE) सरणी के लिए बाध्य नहीं है, जबकि इस प्रकार, एलेक्सा 488 संयुग्मित सीटीएक्स, लिपिड बेड़ा प्रोटीन को मजबूती से बांध. (चित्रा 6C) हम भी 250 मीटर चौड़ा चैनल के साथ एक microfluidic चिप के साथ microwell सब्सट्रेट करने के लिए माइलिन और लिपिड बेड़ा कणों देने से धारी सरणियों बनाया. कण प्रसव के बाद, microfluidic चिप microwell सब्सट्रेट से अलग किया गया था और squeegee प्रक्रिया सामान्य रूप से बाहर किया जाता है. धारी सरणियों तो माइलिन में पाया sulfatide बांधता है जो एक फ्लोरोसेंट विरोधी oligodendrocyte आईजीएम एंटीबॉडी (आईजीएम O4), के संपर्क में थे. (चित्रा 7) माइलिन और लिपिड बेड़ा धारी माइक्रोएरेचित्रा 7 में बढ़ाई के बढ़ते स्तर पर दिखाया गया है, और बढ़ाई के उच्चतम स्तर पर, यह sulfatide लिपिड rafts से अनुपस्थित है क्योंकि आईजीएम O4 केवल माइलिन प्रोटीन को बांधता है कि आसानी से स्पष्ट है कर रहे हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6. मेलिन कण और neuronal लिपिड बेड़ा कण सरणियों. माइलिन कणों lipophilic फ्लोरोफोरे FM1-43 के द्वारा फ्लोरोसेंट गाया जाता है, जहां (क) एक माइलिन कण माइक्रोएरे. धराशायी लाइन सरणी क्षेत्र के किनारे को इंगित करता है. (ख) सीटीएक्स लिपिड बेड़ा कणों के लिए बाध्य दिखा लिपिड बेड़ा माइक्रोएरे. (ग) लिपिड बेड़ा माइक्रोएरे कोई अविशिष्ट बंधन को थोड़ा दिखा फ्लोरोसेंट streptavidin-phycoerythrin (SAPE) के संपर्क में. संदर्भ 21 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल समाज की अनुमति के साथ इस्तेमाल कियाiety.

चित्रा 7
चित्रा 7. Multicomponent सरणियों माइलिन और neuronal बेड़ा झिल्ली की microfluidic वितरण का गठन करके. (क) माइलिन और rafts के बाद प्रतिदीप्ति छवि माइक्रोएरे सब्सट्रेट पर microfluidic चैनलों के माध्यम से जमा किए गए थे. बाएँ और दाएँ धारियों माइलिन होते और मध्यम धारी neuronal बेड़ा झिल्ली होती है. झिल्ली FM1-43, सब लिपिड सामग्री लेबल के साथ जो दाग रहे हैं. पैमाने बार 250 मीटर है. PDMS squeegee लागू करने और आईजीएम O4 साथ incubating के बाद ही तीन धारियों का (बी) प्रतिदीप्ति छवि. पैमाने बार 250 मीटर है. आईजीएम O4 केवल माइलिन प्रोटीन को बांधता दिखा रहा है कि तीन धारियों से (सीई) Magnified चित्र: (सी) को छोड़ दिया धारी और (ई) सही धारी. पी में स्केल सलाखोंanels CE 30 माइक्रोन हैं. संदर्भ 21 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

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Discussion

इस काम में हम समर्थित लिपिड bilayers साथ लेपित monodisperse 2 Sio मोती लिपिड bilayers या सब्सट्रेट सतह पर ligands को निशाना बनाने के लिए आवश्यकता के बिना microwell सरणियों में तैनात किया जा सकता है, और सरणियों विष लिपिड बातचीत निस्र्पक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CTx/GM1 बाइंडिंग के लिए गणना की हदबंदी लगातार हम से पिछले एक रिपोर्ट के साथ, साहित्य में मूल्यों की व्यापक असमानता को देखते हुए अनुकूल तुलना शीतकालीन एट अल., लिपिड में लिपटे मोतियों की कोलाइडयन विधानसभा के बारे में की हदबंदी निरंतर गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जहां एनएम 30. हिल Waud बंधन मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा, हम CTx/GM1 बातचीत पिछली रिपोर्टों 28 के साथ सहमत हैं जो की संभावना multivalent, निर्धारित किया है कि. सीटीएक्स बी (ganglioside बंधन) सबयूनिट एक GM1 अणु 29 बाध्य करने में सक्षम पांच इकाइयों में से प्रत्येक के साथ, एक pentamer के रूप में मौजूद है; इस प्रकार, यह एक से अधिक सबयूनिट अन्तर दिया बाध्य किया जा सकता है कि आश्चर्य की बात नहीं हैSLBs 30 में GM1 के usive गतिशीलता.

रासायनिक functionalized मोतियों की सारणियों अन्य विश्लेषणात्मक अध्ययन 31 में इस्तेमाल किया गया है. प्रयोगों के इन प्रकार में, मोती आमतौर पर etched ऑप्टिकल फाइबर के अंत में बनाया microwells में स्थिर रहे हैं. मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति assays मोतियों की subpopulations मिश्रण और ऑप्टिकल फाइबर 32 ओवर की समाप्ति पर उन्हें एक साथ immobilizing द्वारा इस विन्यास में किया जा सकता है. समाधान में मुफ्त SSLBs पर लिपिड एक और 33 को SSLB का एक प्रकार से हस्तांतरित किया जा सकता है क्योंकि हमारे मल्टीप्लेक्स परख (आंकड़े -3 सी-3E) में, हम क्रमिक रूप से ऑप्टिकली इनकोडिंग SSLBs immobilized. इस SSLB सरणियों की तैयारी में अतिरिक्त कदम कहते हैं, यह नहीं पीढ़ी समय लगता है और लिपिड क्रियाशील मोती के लिए सबसे कारगर तरीका है. हम भी स्थानिक आसन्न microwell सरणियों में अलग SSLB आबादी जमा करके सरणियों इनकोडिंग है, और कोई नमूदार CROs हैसरणियों के बीच 20 एस बात करते हैं. नमूना तैयारी के समय को कम करने के लिए, SSLB सरणियों पहले से तैयार और जब वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक सप्ताह के पाठ्यक्रम पर सरणियों की स्थिरता परीक्षण किया और SSLBs पर लिपिड सामग्री की मात्रा समय के साथ बदल नहीं करता है इंगित करता है कि जो प्रतिदीप्ति तीव्रता के संदर्भ में सरणियों का कोई महत्वपूर्ण गिरावट पाया. इसके अलावा, सरणी अधिभोग SSLBs स्थिर रहे हैं, एक बार वे microwells (चित्रा 4 बी) से अलग नहीं है कि जो पता चलता है, समय के साथ बदल नहीं है.

कृत्रिम लिपिड bilayers साथ लिपटे मोतियों के अलावा, हम भी प्राकृतिक झिल्ली कणों 21 की सरणियों बनाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. उस काम में, हम इस तरह के लिपिड बेड़ा अंश के रूप में माउस मस्तिष्क के साथ ही neuronal झिल्ली कणों से व्युत्पन्न माइलिन कणों, immobilized. हम एंटीबॉडी बिंदी द्वारा सेल विशिष्ट झिल्ली सतह अणुओं की पहचान करने के लिए सारणियों का उपयोग करने में सक्षम थेएनजी (आंकड़े 6 और 7). इसके अलावा, microwells का आकार सरणी के nanoscale और ऊपर की सतह को कम हो गया था जब सोने के साथ लेपित किया गया था, हम फ्लोरोसेंट लेबल के उपयोग के बिना माइलिन झिल्ली कणों को एंटीबॉडी के बंधन नजर रखने के लिए सतह plasmon अनुनाद काम करने में सक्षम थे. सरणियों के लिए फार्म SSLB और vesicles या प्राकृतिक झिल्ली कणों का उपयोग कर के बीच प्रमुख अंतर यह है कि केवल एक ही मनका अच्छी तरह से प्रत्येक में फिट कर सकते हैं क्योंकि SSLBs के मामले में प्रत्येक microwell में झिल्ली सामग्री की सही मात्रा में जाना जाता है. पुटिका या प्राकृतिक झिल्ली कणों के साथ, पुटिका या कणों के शुरू एकाग्रता को समायोजित करने के अलावा और प्रत्येक microwell में सामग्री की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए कोई रास्ता नहीं है. हालांकि, vesicles की संख्या की अच्छी तरह से अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता पुटिका व्यास 21 के वितरण की तुलना में बहुत बड़ी नहीं है.

अंत में, इस विधि div हो सकता हैभविष्य अनुप्रयोगों आइरिश. Junesch और सहकर्मियों कोलाइडयन लिथोग्राफी nanofabrication 34 के दौरान नैनोकणों दूर करने के लिए एक squeegee कार्यरत है. झिल्ली सरणियों सेलुलर फोकल आसंजन 35 की जांच या झिल्ली वक्रता संवेदन प्रोटीन 36 के बंधन जांच करने के लिए सेल सेल संपर्कों की नकल करने के लिए गठित किया जा सकता है. इसके अलावा, झरझरा मोती का उपयोग लिपिड bilayers 37 या एक biomembrane सरणी सब्सट्रेट पर संवर्धित कोशिकाओं को संग्रहित कार्गो के स्थानीय वितरण में transmembrane प्रोटीन के शामिल किए जाने में सुविधा होगी. microwell मंच डिजाइन लचीलेपन के लिए अनुमति देता है जो फोटोलिथोग्राफी, द्वारा निर्मित है. यहाँ हमारे सरणियों हेक्सागोनल ज्यामिति था, लेकिन वर्ग, रैखिक, या अन्य geometries फोकल आसंजन के स्थानिक प्रभाव की जांच करने के लिए सरणी अवधि और microwell आयाम अलग से बनाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01 GM092993) से एसएचओ को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF कैरियर पुरस्कार और DBI 0,964,216), नौसेना अनुसंधान कार्यालय (ONR) युवा अन्वेषक कार्यक्रम और जैव प्रौद्योगिकी के लिए मिनेसोटा भागीदारी पुरस्कार और मेडिकल जीनोमिक्स. उपकरण निर्माण राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क के माध्यम से NSF से समर्थन प्राप्त करता है जो मिनेसोटा विश्वविद्यालय Nanofabrication केंद्र (एनएफसी), में प्रदर्शन किया था. यह काम भी स्वास्थ्य (NS048357, R21 NS073684), राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (CA1060A11), Applebaum, हिल्टन, पीटरसन और सैनफोर्ड मूलाधार और MCNEILUS परिवार के राष्ट्रीय संस्थानों से एमआर को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता के लिए चित्र और Shailabh कुमार के साथ सहायता के लिए Hyungsoon इम धन्यवाद देता हूँ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

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References

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