Summary
Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.
Abstract
Membranas de bicapa lipídica forman las membranas plasmáticas de las células y definen los límites de orgánulos subcelulares. En la naturaleza, estas membranas son mezclas heterogéneas de muchos tipos de lípidos, contienen proteínas unidas a membrana y están decoradas con hidratos de carbono. En algunos experimentos, es deseable desacoplar las propiedades biofísicas o bioquímicas de la bicapa lipídica de las de la membrana natural. Tales casos requieren el uso de sistemas modelo tales como vesículas gigantes, liposomas o bicapas lipídicas soportadas (SLBS). Las matrices de SLBS son particularmente atractivos para aplicaciones de detección y imitando las interacciones célula-célula. Aquí se describe un nuevo método para la formación de matrices de SLB. Submicron de diámetro SiO 2 perlas se recubrieron primero con bicapas de lípidos para formar SLBS esféricas (SSLBs). Las perlas se depositan en una matriz de pocillos de micro-fabricada submicrónica de diámetro. La técnica de preparación utiliza un "escobilla de goma" para limpiar la superficie del sustrato, mientras que Leaving detrás SSLBs que se han asentado en los micropocillos. Este método no requiere ninguna modificación química del sustrato de micropocillos, ni ningún ligandos de dirección particulares sobre el SSLB. Los micropocillos están ocupados por perlas individuales debido a que el diámetro del pozo está sintonizado para ser justo más grande que el diámetro de la perla. Por lo general, más del 75% de los pozos están ocupadas, mientras que el resto permanece vacía. En búfer arrays SSLB muestran estabilidad a largo plazo de más de una semana. Múltiples tipos de SSLBs se pueden colocar en una sola matriz por deposición de serie, y las matrices se pueden utilizar para la detección, lo que se demuestra mediante la caracterización de la interacción de la toxina del cólera con el gangliósido GM1. También ponen de manifiesto que las vesículas de fosfolípidos sin los soportes de cuentas y biomembranas de fuentes celulares pueden ser dispuestos con el mismo método y los lípidos de membrana específicos de células se pueden identificar.
Introduction
Membranas de bicapa lipídica son estructuras esenciales en la naturaleza. Membranas plasmáticas celulares y membranas de orgánulos están compuestas de bicapas de lípidos que incorporan una serie de moléculas que son necesarias para la vida. Muchos de los procesos que mantienen la vida ocurren en la superficie de las células o están mediadas por moléculas asociadas con membranas bicapa lipídica. De hecho, muchos productos farmacéuticos procesos diana o moléculas se encuentran sobre o en las membranas de 1,2. Por lo tanto, es necesario investigar analíticamente procesos, tales como reacciones químicas o acontecimientos de unión no covalentes que se producen en las superficies de membrana. Debido a que las membranas naturales pueden ser difíciles de aislar y / o de la interfaz con sensores, muchos investigadores emplean membranas modelo simplificado para llevar a cabo estudios analíticos. Un número de sistemas de membrana modelo se describen en la literatura, que van desde las vesículas gigantes que pueden ser decenas a cientos de micrómetros de diámetro a liposomas con dimensiones nanométricas 3,4. Alterntivamente, bicapas lipídicas planas depositados sobre soportes sólidos, es decir, soportadas bicapas de lípidos (SLBS), se pueden formar en un número de diferentes superficies y han sido ampliamente utilizados en aplicaciones biofísicas, bioquímicas, y de análisis 5. Acoplamiento SLBS con materiales eléctricos u ópticos permite la investigación de la bioquímica y biofísica de la membrana a través de la utilización de diferentes técnicas analíticas. La microscopía de fluorescencia 6, la electroquímica 7, 8 espectroscopia óptica, microscopía de sonda 9, resonancia de plasmón superficial 10, y espectrometría de masas 11 han sido empleados para estudiar la estructura y propiedades de SLBS.
Matrices SLB ofrecen versatilidad adicional en el diseño de sensores para ensayos multiplex 12,13. Otras aplicaciones utilizan arrays SLB para imitar la unión que se forma entre las células inmunes 14. Métodos de preparación de matrices SLB han variado de microfluidic se acerca 15 de las que emplean las barreras físicas entre parches SLB adyacentes. 16 Otros grupos han utilizado métodos de impresión 17, 18 patrones fotoquímica y diversos enfoques nanoingeniería 19 para crear matrices SLB.
En este artículo y el video adjunto se demuestra un método para formar matrices SLB depositando recubiertos-SLB SiO 2 cuentas en conjuntos ordenados de micropocillos 20. Nos referimos a los recubiertos de SLB SiO 2 cuentas como bicapas lipídicas soportadas esféricas (SSLBs). Esta técnica es una extensión del trabajo anterior que crea matrices de vesículas de fosfolípidos y biomembranas derivados de fuentes naturales 21, de donde también muestran ejemplos de resultados. Otros métodos para formar clusters de partículas de biomembrana o vesículas se han basado en los patrones de ligandos de direccionamiento específicos en las superficies que se asocian con ligandos complementarios contenidos en la superficie de la vesícula. Ejemplos incluyen biotina-asociación avidina 22,23 y esquemas de hibridación de ADN 24. Nuestro enfoque sólo requiere una matriz de micropocillos sin restos necesarias de orientación o de reconocimiento. El tamaño de SSLBs se define por el diámetro de los soportes de SiO 2 de talón, que tienen baja polidispersidad. Al ajustar el diámetro de micropocillos a sólo mayor que el diámetro SSLB, sólo un único SSLB se asienta en cada micropocillo. Un poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de rasqueta retira entonces de la superficie de todos los SSLBs que no están inmovilizados en micropocillos. Los micropocillos y matrices SSLB resultantes tienen alta densidad (~ 10 5 SSLBs / mm 2) con 3 micras separación de centro a centro y periodicidad hexagonal. Al depositar en serie SSLBs con diferentes composiciones de lípidos, es posible crear matrices de múltiples componentes con SSLBs posicionado al azar. Para demostrar la capacidad de detección de matrices SSLB, hemos utilizado la interacción de la toxina del cólera (CTx) con un gangliósido (GM1) incorporado en los SSLBs. Conpartículas de membrana naturales, hemos sido capaces de detectar los lípidos específicos de células en matrices de múltiples componentes que contienen material de la membrana a partir de dos tipos de células diferentes.
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Protocol
1. Microfabricación de micropocillos matriz de sustrato
- Comience con una oblea de silicio de 4 pulgadas con 100 nm de óxido térmico crecido.
- Girar SPR-955 0,7 fotorresistente sobre la oblea a 4.000 rpm durante 30 seg.
- Hornear en un placa caliente a 115 ° C durante 90 seg.
- La exposicion fotoprotector.
- Utilice una máscara que creará 1 m agujeros dispuestos en una matriz hexagonal, con un período de 3 micras, donde la matriz cubre un área de 2 mm x 2 mm.
- La exposicion de obleas en un paso a paso i-line utilizando un tamaño de paso de 6 mm y una exposición de 200 mJ / cm 2.
- Hornear en un placa caliente a 115 ° C durante 90 seg.
- Desarrollar el uso de un desarrollador de centrifugado para depositar 2 charcos de CD-26 sobre la oblea para un tiempo de desarrollo total de 90 seg.
- Enjuague bien con agua ultrapura DI y seque con N 2.
- Grabe el óxido en un grabador con iones reactivos durante 6 minutos con 50 sccm de Ar, 25 sccm de CF 4 y 50 sccm de CHF 3 floala a una presión de 75 mTorr.
- Silicio grabado en un ICP-zanja profunda grabador con iones reactivos durante 2 min con 63 sccm de C 4 F 8, 27 sccm de SF 6, 40 sccm de Ar, y 10 sccm de O 2 que fluye a una presión de 14 mTorr.
- Enjuague en acetona, metanol, e isopropanol para eliminar resistir.
- Colocar en un baño de H 2 SO 4 H 2 O 2 01:01 durante 10 minutos para limpiar la superficie.
- Enjuague bien con agua ultrapura DI y seque con N 2.
- Deposita 1.080 Å de Al 2 O 3 mediante deposición de capa atómica a 250 ° C.
2. Preparación de poli (dimetilsiloxano) escobilla de goma
- Si es posible, trabajar en una sala limpia. Trabajar de otro modo en el medio ambiente más limpio posible.
- Obtener un plato de plástico Petri (u otro recipiente desechable limpio) con ≥ lados de 13 mm.
- En ese plato, verter 5 g de agente de curado PDMS, seguido por 50 g de PDMS basagente de correo (o cualquier cosa con una relación 1:10 que en su mayoría va a llenar el plato de Petri). Mezclar bien con una pipeta de plástico desechable o varilla.
- Eliminar las burbujas mediante la colocación de los PDMS mixtos en una cámara con una línea de vacío, aplicando vacío hasta que las burbujas salen de la mezcla (aproximadamente 30 min).
- Si no está ya en la placa de Petri, vierta PDMS en placa de Petri, evitando la creación de burbujas de aire.
- Curar durante la noche en una placa caliente a> 50 ° C (más alto de calor durante menos tiempo también trabaja).
- Con la nueva hoja de afeitar / limpio, corte cuidadosamente una pieza rectangular de aproximadamente 2,5 x 2,5 cm, dejando la superficie superior lo más limpio posible. Pelar con unas pinzas limpias. Se quita uno de los bordes (hasta 1,5 cm) presionando hacia abajo en la hoja de afeitar en un solo movimiento, para que el borde superior tan nítidas como sea posible (esto será el borde utilizado en el proceso de la escobilla de goma).
- Limpiar con acetona, metanol, alcohol isopropílico y agua desionizada ultrapura, y después seque al aire con gas nitrógeno limpio. Almacene en un plato de Petri limpia.
3. Preparación de vesículas
- Recoger las soluciones madre de lípidos fosfatidilcolina de 25 mg / ml de huevo (PC) y 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - (lisamina rodamina B sulfonil) sal de amonio (Rho-DPPE) en cloroformo y una solución de 0,5 mg / ml de stock de monosialogangliósido GM1 en cloroformo / metanol (2:1 v / v).
- En un vial de vidrio pequeño hacer una mezcla que resulta en 97% en moles de PC, 2% en moles GM1 y 1% en moles de Rho-DPPE mediante la adición de 18,9 l de 25 mg / ml de PC, 39,6 l de 0,5 mg / ml GM1 y 7,9 l de 1 mg / ml de Rho-DPPE utilizando jeringas de vidrio.
- Nota:. El material suplementario para Nair et al 25 contiene una excelente hoja de cálculo Excel personalizable para calcular las cantidades de lípidos necesarios para crear las vesículas de cualquier composición deseada.
- Colocar el vial en un desecador de vacío y eliminar el disolvente, dejando el vial al vacío durante 6 h.
- Hacer una solución acuosa de 0,1M NaCl. Añadir 0,5 ml de la solución de NaCl 0,1 M al vial que contiene la película de lípido seca.
- Dejar que la mezcla acuosa de lípidos para descansar durante la noche.
- Mezcla, agitar brevemente para crear una suspensión de vesículas, a continuación, se somete a ultrasonidos durante 20 minutos en un sonicador de baño a temperatura ambiente.
- Extruir la suspensión de vesículas a través de una membrana de policarbonato con 100 nm de tamaño de poro. Pase la suspensión de vesículas a través del filtro de 17x.
- Guarde las vesículas extruidos en un vial de vidrio a 4 ° C.
4. Formación de rótula compatibles bicapas lipídicas
- Recoge 700 nm de diámetro de SiO2 cuentas. Las perlas se suministran en agua destilada con una concentración de reserva de 1,4 x 10 11 cuentas / ml.
- En un tubo Eppendorf de 1,5 ml preparar una suspensión de perlas de 1 ml con una concentración de 1,5 x 10 10 perlas / ml mediante la adición de 107 l de solución de bolas de stock a 893 l de 0,1 M de NaCl.
- Agite la suspensión para asegurar que es así mijo.
- Centrifugar la suspensión a 1.700 xg durante 20 min y después se descartó el sobrenadante. Resuspender las perlas en 1 ml de 0,1 M de NaCl. Repita este paso dos veces más para lavar bien las cuentas.
- Para formar los SSLBs, en un tubo Eppendorf de 1,5 ml añadir 25 l de la suspensión de perlas de SiO 2 a 200 l de 1 mg / ml de suspensión de vesículas. Vortex la mezcla y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. En esta etapa la concentración SSLB debe ser 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
- Se centrifuga a 1700 × g durante 20 min para sedimentar las SSLBs. El sedimento debería aparecer de color rosa debido a la ruptura de las vesículas con la Rho-DPPE sobre las perlas.
- Desechar el sobrenadante y resuspender en 225 l de tampón fosfato salino (PBS), pH = 7,4. Repita los pasos 4.6 a 4.7 dos veces más para eliminar las vesículas intactas de la suspensión SSLB.
5. Asamblea de SSLB matriz
- Oblea Cleave de arrays de micropocillos que resulta en piezas rectangulares con 4-6 microwell arrays por pieza.
- Vortex mezclar la suspensión SSLB, a continuación, colocar 10 l de SSLB suspensión en cada matriz de micropocillos. Lest resto durante 1 hora para permitir SSLBs se depositen en la superficie.
- Lave suavemente el chip de gama micropocillos con PBS a partir de una botella de lavado, a continuación, sumergirse en un baño de PBS preparado en un plato llano.
- Mientras sumergida, coloque suavemente la escobilla de goma PDMS ras en el chip de matriz de micropocillos y deslice suavemente por la superficie de 5x para eliminar SSLBs que no están inmovilizados en los pocillos.
- Agarre el chip de gama micropocillos con pinzas y suavemente agite en el baño de PBS para eliminar cualquier exceso SSLBs.
- Quite rápidamente el chip del baño de la escobilla de goma y colocar en un baño de PBS fresco hasta su uso posterior. Asegúrese de que la superficie superior del chip se mantiene húmedo para preservar los SSLBs.
Nota: El método de montaje descrito anteriormente se puede utilizar para crear matrices de partículas de membrana naturales, como las partículas de mielina aisladas de cerebro de ratón, o phovesículas spholipid sin los SiO 2 soportes de talón. Este trabajo se describe en detalle en Wittenberg et al. 21 y resultados representativos se muestran abajo.
6. Toxina del Cólera Ensayo de unión
- Preparar una solución de 2 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS.
- Preparar una solución con la concentración deseada de Alexa 488-conjugado toxina del cólera subunidad B en PBS con 2 mg / ml de BSA.
- Retire el chip de gama SSLB del baño de PBS y absorber la mayor parte de la solución de PBS usando un laboratorio de limpiar. Deja suficiente PBS en el chip para mantener la matriz SSLB hidratado.
- Para evitar la unión no específica, añadir 200 l de 2 mg / ml de solución de BSA al chip de matriz SSLB. Deje reposar durante 1 hora en una caja húmeda.
- Con una micropipeta, retirar 200 l de solución de la parte superior del chip de matriz SSLB.
- Añadir 200 l de solución de la toxina del cólera en el chip de gama SSLB y dejar reposar durante 1 hora en una caja húmeda.
- Lave suavemente el chip de gama SSLB con PBS a partir de una botella de lavado para eliminar cualquier toxina del cólera desatado.
- Wick el exceso de PBS usando un laboratorio de limpiar. Antes de obtener imágenes de chip cubierta con una hoja de 24 mm x 40 mm cubierta.
- Arrays de imagen con un microscopio vertical utilizando conjuntos de filtros adecuados para los fluoróforos de interés.
- Analizar la intensidad de fluorescencia de SSLBs individuales de un conjunto con la función de análisis de partículas automatizado de software ImageJ.
- Compilar intensidades medias de fluorescencia de SSLBs individuales en los histogramas que resumen las intensidades de SSLBs se encuentran en una matriz determinada.
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Representative Results
Cuando SiO 2 perlas se mezclan con una solución de vesículas compuestas de fosfolípidos, lípidos fluorescentes y otros lípidos, tales como gangliósidos, las vesículas se rompen en las superficies de las perlas de SiO 2 para formar SSLBs, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1a. Después de lavar las SSLBs, una gota de solución SSLB se coloca en una matriz de micropocillos, y las perlas se dejó sedimentar a la superficie. (Figura 1b1) Esto también se puede hacer con una suspensión de vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales, que se muestran en la Figura 1b2. Una imagen de fluorescencia de vesículas de fosfolípidos adsorbidos a un sustrato matriz de micropocillos se muestra en la figura 1B3. A continuación, la escobilla de goma PDMS se hace deslizar suavemente por la superficie para eliminar cualquier SSLBs (Figura 1c1), vesículas o partículas de membrana naturales (Figura 1c2) que no se asiente en los micropocillos. Esto da como resultado una matriz en la que cada SSLBmicropocillos contiene como máximo un SSLB (Figura 1d1) o una matriz en donde múltiples vesículas de membrana o partículas naturales están en cada pocillo (Figura 1d2). Una imagen de un microarray compuesto de la etiqueta fluorescente vesículas se muestra en la Figura 1d3.
.. Figura 1 Formación de SSLBs y SSLB conjunto de dispositivos (a) Ejemplo de un SSLB compuesta por 3 tipos de lípidos en un cordón de SiO2: PC de huevo (negro), Rho-DPPE (rojas) y GM1 (Azules). (B1-d1) El flujo del proceso para el montaje de una matriz SSLB mostrando SSLBs dispersas en una matriz de micro pozos (b1), el uso de una escobilla de goma PDMS para limpiar la superficie de SSLBs no se instaló en micropocillos (c1), y el conjunto final de SSLB (d1 ). (B2-d2 (B3) Una imagen de fluorescencia de vesículas de fosfolípidos adsorbidos sobre un sustrato de micropocillos que corresponde a la ilustración en (b2). (D3) Una imagen de fluorescencia de una micromatriz compuesto de vesículas de fosfolípidos correspondientes a la ilustración en (D2). Adaptado de las referencias 20 y 21, y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
Individuales SiO 2 cuentas soportes para SSLBs en pocillos fueron imágenes con microscopía electrónica de barrido (SEM), tanto de la vista superior en ángulo y perspectivas transversales. Una vista superior de un área de aproximadamente 15 micras x 15 micras se muestra en la Figura 2a, mientras que la figura 2b muestra una vista en sección transversal de una única perla inmovilizada en unpocillo. La capa más ligero recubrimiento de la cúpula es de 100 nm de Al 2 O 3 depositado por deposición de capas atómicas para ajustar el diámetro del pozo, para que los pozos son capaces de acomodar sólo a cuentas individuales.
Imágenes de microscopía electrónica de la Figura 2. De barrido de matrices SSLB. (A) Una micrografía electrónica de un área de 15 mm x 15 mm que muestra SSLB soportes de perlas inmovilizadas en matrices de micropocillos. (B) Un único diámetro de 700 nm SSLB en un micropocillo. El recubrimiento de micropocillos es Al 2 O 3, que se deposita a reducir el tamaño del micropocillo de manera que sólo los granos individuales pueden caber dentro. Adaptado de la referencia 20 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
Una vez que las matrices se preparan SSLB, que se pueden obtener imágenes por microscopía de fluorescencia.
Se utilizó la deposición secuencial de diferentes tipos de SSLBs para crear matrices con más de un tipo de SSLB, donde la identidad de SSLBs individuales se determinó por la ausencia o presencia de un receptor de la toxina (GM1) y su unión de la toxina del cólera (CTx). El proceso de montaje fue el mismo que para un solo tipo SSLB pero se llevó a cabo una segunda vez con una identidad SSLB diferente. La concentración de partida de SSLBs era 10 veces más baja para reducir la ocupación de la primera tipo de SSLB y para permitir que más vacantes a ser ocupados por el segundo tipo de SSLB. En las figuras 3c a 3e, se muestra una matriz SSLB con dos tipos de SSLBs. All de los SSLBs contiene fluorescente de color rojo Rho-DPPE (Figura 3c), pero sólo algunos de los SSLBs contiene GM1, un gangliósido que es el receptor de la subunidad B de CTx. Cuando se expone a verde fluorescente Alexa 488-conjugado CTx, sólo los SSLBs contienen GM1 fluorescencia en el canal verde (Figura 3d). Cuando se fusionan las imágenes en rojo y verde, es posible determinar qué SSLBs contienen GM1 (amarillo) y que no (rojo) (Figura 3e).
Figura 3. Imágenes de fluorescencia de arrays SSLB. (A) A x 100 área micras 100 micras que contiene 936 marcadas con Rho-DPPE SSLBs PC de huevo. (B) Una superposición de campo claro y fluorescencia que muestra una SSLB con el 76% de los micropocillos ocupados. (Ce) Una matriz que contiene SSLB SSLBs que contienen Rho-DPPE(C), una fracción de la que también contienen GM1, que está obligado por Alexa-488 conjugado CTx (d). (E) Fusión de canales rojo y verde donde colocalized fluorescencia indica la presencia de GM1 en la SSLB. Los círculos azules indican SSLBs que sólo emiten fluorescencia roja, es decir, que carecen de GM1. Adaptado de la referencia 20 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
Los datos de fluorescencia de matrices SSLB se analizó mediante la medición de la intensidad de SSLBs individuales de una imagen. Los datos de intensidad SSLB de matrices se compila en histogramas. Figura 4a muestra una de tales histograma a partir del análisis de la Rho-DPPE fluorescencia de una matriz de SSLB compuesto únicamente de SSLBs que contienen PC de huevo y 1% en moles de Rho-DPPE. Los datos en la Figura 4a se adquirieron mediante el análisis de la imagen en la Figura 3a. Nos pareció que las matrices SSLB sean robustos y estables durante al menos una semana en el refrigerador unND sumergido en tampón. Los arrays no perdieron intensidad de fluorescencia, ni tampoco la ocupación de las matrices cambian en el transcurso de una semana (Figura 4b).
Figura 4. (A) Histograma que muestra la distribución de las intensidades de fluorescencia para la matriz SSLB se muestra en la Figura 3a. La intensidad media de cada SSLB en la matriz se utilizó para compilar el histograma. La línea continua es un ajuste gaussiano a los datos. (B) La media de ocupación de matriz (círculos negros) y la intensidad de fluorescencia (cuadrados rojos) para una matriz de SSLB monitorizado en el transcurso de una semana. Adaptado de la referencia 20 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
Hicimos matrices compuestas de SSLBs con concentraciones variables de GM1 (0, 0,5, 1 unND 2% en moles) y expuestos a una concentración fija de CTx, así como matrices con SSLBs con concentraciones de GM1 y los expuso a concentraciones variables de CTx. El experimento posterior se utilizó para determinar la constante de disociación de equilibrio (Kd) para GM1/CTx de unión. Las matrices SSLB con concentraciones variables de GM1 se expusieron a 50 nM de Alexa-488 CTx marcado durante 1 hora y después se lavó y fotografiado. La intensidad de histogramas para las matrices SSLB con 0,5 a 2% en moles GM1 expuestas a 50 nM Alexa 488-conjugado CTx se puede ver en la Figura 5a Figura 5b muestra la dependencia lineal de la intensidad media de fluorescencia de la concentración de GM1.. Cuando la concentración de GM1 en SSLBs se fija en 2% en moles y las matrices SSLB están expuestos a CTx que van desde 16 pM a 158 nM, la respuesta de unión sigue curvas sigmoideas como se muestra en la Figura 5c. Las curvas de ajuste a estos datos se basan en dos modelos de unión diferentes: la isoterma de Langmuir (Ec. 1) y el modo de Hill-Waudl (Ec. 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(1)
(2)
Donde F es la intensidad de fluorescencia a una concentración de CTx dado, F max es la intensidad de fluorescencia de unión cuando está saturado, [CTx] es la concentración de CTx, K D y K H son las constantes de disociación de la de Langmuir y Hill-Waud encaja, respectivamente , y n es el coeficiente de cooperatividad en el modelo de Hill-Waud. El coeficiente de cooperatividad (N) calcula la cantidad de unión multivalente, donde un n mayor queuno indica que cada molécula de CTx se une más de un GM1. La concentración de CTx a 0,5 x F max es la K D o K H para la interacción GM1/CTx. En nuestros experimentos, se calculó una KD de 1,6 ± 0,2 nM y K H de 1,4 ± 0,2 nM con un valor de n de 1,3, lo que indica la unión cooperativa. Las constantes de disociación para la interacción GM1/CTx varían ampliamente en la literatura, que van más de 5 órdenes de magnitud de 16:05 a 370 nM 26,27.
Figura 5. CTx/GM1 ensayos sobre arrays SSLB vinculante. (A) Los histogramas de la intensidad de fluorescencia de SSLBs individuales dentro de matrices SSLB. Las matrices contenían SSLBs con 0,5, 1 o 2% en moles GM1 y se expusieron a 50 nM Alexa 488-conjugado CTx. Lalíneas continuas son ajustes Gaussianos. (B) Parcela de los medios de distribución de (a) como una función de la concentración de GM1. (C) Curvas de unión que muestran la distribución de los medios de matrices que contienen SSLBs con 2 mol% GM1 después de la exposición a Alexa-488 conjugado CTx variando de 16 pM a 158 nM. Las líneas son ajustes a la isoterma de Langmuir (rojo) y Hill-Waud (azul) modelos de fijaciones. Las barras de error en (BC) representan las desviaciones estándar de las distribuciones de la intensidad de fluorescencia correspondientes a cada punto de datos. Adaptado de la referencia 20 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
Como se mencionó anteriormente, también es posible formar matrices con material de biomembrana derivados de fuentes naturales 21. Las matrices se forman de la misma manera, mediante la dispersión de partículas de membrana sobre un sustrato de micropocillos, a continuación, la limpieza de la superficie superior con la escobilla de goma para dejar detrás de partículas de membrana en el micrófonoRowells. Figura 6 muestra ejemplos de la mielina y neuronales microarrays lípidos balsa. En la Figura 6a, partículas de mielina se etiquetan con el fluoróforo lipofílico FM1-43. Las balsas de lípidos se conocen para ser enriquecido en colesterol y gangliósidos, tales como GM1; por lo tanto, Alexa 488-conjugado CTx se une fuertemente a los microarrays de balsa de lípidos como se muestra en la Figura 6b, mientras estreptavidina marcada con fluorescencia (SAPE) no se une a la matriz. (Figura 6c) También hemos creado matrices de banda mediante la entrega de las partículas de mielina y lípidos balsa al sustrato micropocillos con un chip de microfluidos con 250 canales micras de ancho. Después de suministro de partículas, el chip de microfluidos se desprende del sustrato de micropocillos y el proceso de la escobilla de goma lleva a cabo como de costumbre. Las matrices de la raya se expusieron entonces a un anticuerpo anti-IgM fluorescente de oligodendrocitos (IgM O4), que se une sulfatida que se encuentra en la mielina. (Figura 7) La mielina y lípidos balsa franja de microarrayss en la Figura 7 se muestran en el aumento de los niveles de ampliación, y en el más alto nivel de ampliación, es fácilmente evidente que la IgM O4 se une a los microarrays de mielina porque sulfátido está ausente de las balsas de lípidos.
Figura 6. Partícula Mielina y matrices de partículas de lípidos balsa neuronales. (A) Un microarray de partículas de mielina en donde las partículas de mielina se representan fluorescente por el fluoróforo lipófilo FM1-43. La línea discontinua indica el borde de la zona de matriz. (B) de microarrays balsa lipídica mostrando CTx unión a las partículas de lípidos balsa. (C) de microarrays balsa lipídica expuesto a fluorescente estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) que muestra poca o ninguna unión no específica. Adaptado de la referencia 21 y se utiliza con permiso de la American Chemical Soc.iety.
Figura 7. Arrays multicomponentes formadas por la entrega de microfluidos de la mielina y las membranas neuronales balsa. (A) Imagen de fluorescencia después de la mielina y balsas fueron depositados a través de los canales de microfluidos en el sustrato de microarrays. Las rayas izquierda y derecha contienen la mielina y la banda central contiene membranas neuronales balsa. Las membranas se tiñeron con FM1-43, que las etiquetas de todo el material lipídico. La barra de escala es de 250 micras. (B) Imagen de fluorescencia de las mismas tres bandas tras la aplicación de la escobilla de goma PDMS y la incubación con IgM O4. La barra de escala es de 250 micras. (ce) de imágenes ampliadas de las tres bandas que muestran que la IgM O4 sólo se une a los microarrays de mielina: (c) a la izquierda de la raya y (e) de la raya derecha. Las barras de escala en pos grupos especiales ce son 30 micras. Adaptado de la referencia 21 y se utiliza con permiso de la American Chemical Society.
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Discussion
En este trabajo se muestra que monodispersas de SiO 2 perlas recubiertas con bicapas lipídicas soportadas pueden ser dispuestos en matrices de micropocillos sin la necesidad de ligandos en las bicapas lipídicas o la superficie del sustrato, y las matrices se pueden utilizar para la caracterización de interacciones lípido-toxina. La constante de disociación hemos calculado para CTx/GM1 vinculante se compara favorablemente, dada la gran disparidad de los valores en la literatura, con un informe anterior por Winter et al., Donde se utilizó el montaje coloidal de cuentas de lípidos recubiertos para calcular una constante de disociación de aproximadamente 30 nM. Por ajuste de los datos para el modelo de unión a colina-Waud, se determinó que la interacción multivalente CTx/GM1 es probable, que está de acuerdo con informes anteriores 28. Existe El B (de unión a gangliósido) subunidad de CTx como un pentámero, con cada una de las cinco unidades capaces de unirse a una molécula de GM1 29; por lo tanto, no es de extrañar que más de una subunidad puede estar unido dado el diffmovilidad usive de GM1 en SLBS 30.
Las matrices de perlas químicamente funcionalizados han sido utilizados en otros estudios analíticos 31. En estos tipos de experimentos, los granos son típicamente inmovilizados en micropocillos creados en el extremo de las fibras ópticas grabadas. Ensayos de fluorescencia Multiplex pueden llevarse a cabo en esta configuración mediante la mezcla de subpoblaciones de perlas y los inmoviliza simultáneamente en el extremo de la fibra óptica 32. En nuestro ensayo multiplex (Figuras 3c-3e), nos inmovilizados SSLBs ópticamente codificadas secuencialmente porque los lípidos en forma gratuita SSLBs en solución pueden ser transferidos de un tipo de SSLB a otro 33. Si bien esto añade pasos adicionales en la preparación de matrices SSLB, no demasiado tiempo y es el enfoque más eficaz para los granos de lípidos-funcionalizado. También hemos espacialmente codificada matrices mediante el depósito de diferentes poblaciones SSLB en matrices de micropocillos adyacentes, y no hay Cros observabless de hablar entre las matrices 20. Para reducir los tiempos de preparación de muestras, matrices SSLB se pueden preparar con antelación y se utilizan cuando se desee. Hemos probado la estabilidad de las matrices en el transcurso de una semana y no encontramos ninguna degradación significativa de las matrices en términos de intensidad de fluorescencia, lo que indica que la cantidad de material lipídico en los SSLBs no cambia con el tiempo. Además, la ocupación matriz no cambia con el tiempo, lo que sugiere que una vez que se inmovilizan SSLBs, que no se desprenden de los micropocillos (Figura 4B).
Además de perlas recubiertas con bicapas de lípidos sintéticos, también hemos utilizado este método para crear matrices de partículas de membrana naturales 21. En este trabajo, hemos inmovilizados partículas derivadas de la mielina del cerebro del ratón, así como partículas de la membrana neuronal, como la fracción de lípidos balsa. Hemos sido capaces de utilizar las matrices para identificar moléculas de la superficie de la membrana de células específicas por bindi anticuerpong (Figuras 6 y 7). Además, cuando el tamaño de los micropocillos se redujo a la nanoescala y la superficie superior de la matriz se revistió con oro, hemos sido capaces de emplear resonancia de plasmón superficial para controlar la unión de anticuerpos a partículas de membrana de mielina sin el uso de etiquetas fluorescentes. La principal diferencia entre el uso de SSLB y vesículas de membrana o partículas naturales para formar las matrices es que en el caso de SSLBs se conoce la cantidad exacta de material de la membrana en cada micropocillo porque sólo una única perla puede ajustarse en cada pocillo. Con las vesículas de membrana o partículas naturales, no hay manera de controlar la cantidad de material en cada micropocillo, que no sea para ajustar la concentración a partir de vesículas o partículas. Sin embargo, la variabilidad pocillo a pocillo del número de vesículas no es muy grande en comparación con la distribución de diámetros de vesículas 21.
Por último, este método puede tener divERSE aplicaciones futuras. Junesch y colaboradores han empleado una escobilla de goma para eliminar las nanopartículas durante nanofabricación litografía coloidal 34. Matrices de membrana podrían formarse para imitar contactos célula-célula para investigar celular de adhesión focal 35 o examinar la unión de las proteínas de curvatura de detección de la membrana 36. Además, el uso de perlas porosas facilitaría la inclusión de proteínas de transmembrana en las bicapas lipídicas 37 o entrega local de la carga almacenada para las células cultivadas en un sustrato matriz de biomembrana. La plataforma de micropocillos se fabrica mediante fotolitografía, que permite la flexibilidad de diseño. Aquí nuestros arrays tenían geometría hexagonal, pero cuadrado, lineal, o de otras geometrías se podrían crear con diferentes periodicidad matriz y micropocillos dimensiones para investigar los efectos espaciales de adhesión focal.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de SHO de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM092993), la Fundación Nacional de Ciencia (NSF premio CARRERA y DBI 0964216), la Oficina de Investigación Naval (ONR) Programa de Jóvenes Investigadores y el Premio de la Asociación de Minnesota de Biotecnología y Genómica Médicos. La fabricación del dispositivo se realizó en la Universidad de Minnesota Nanofabrication Center (NFC), que recibe el apoyo de la NSF a través de la Red de Infraestructura Nacional de Nanotecnología. Este trabajo también fue apoyado por becas a MR de los Institutos Nacionales de Salud (NS048357, R21 NS073684), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (CA1060A11), el Applebaum, Hilton, Peterson y Sanford Fundaciones y la familia McNeilus. Los autores desean agradecer a Hyungsoon Im para obtener ayuda con las ilustraciones y Shailabh Kumar de asistencia con microscopía electrónica de barrido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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