Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bildning av Biomembrane Microarrays med en gummiskrapa baserade Assembly Method

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Stödda lipiddubbelskikt och naturliga membranpartiklar är lämpliga system som kan approximera egenskaperna hos cellmembranen och inkorporeras i en mängd olika analytiska strategier. Här visar vi en metod för framställning av microarrays består av stöds membranet belagda SiO 2 pärlor, fosfolipidvesiklar eller naturliga membranpartiklar.

Abstract

Lipidbiskiktmembraner bilda plasmamembran hos celler och definiera gränserna av subcellulära organeller. I naturen, är dessa membran är heterogena blandningar av många olika typer av lipider, innehåller membranbundna proteiner och är dekorerade med kolhydrater. I vissa experiment är det önskvärt att frikoppla de biofysikaliska eller biokemiska egenskaper hos lipiddubbelskikt från de av den naturliga membran. Sådana fall kräver användning av modellsystem såsom jätte vesiklar, liposomer eller stödda lipidbiskikt (SLBs). Arrayer av SLBs är särskilt attraktiva för avkänning applikationer och härma cell-cell interaktioner. Här beskriver vi en ny metod för att bilda SLB arrayer. Submicron diameter SiO 2 pärlor är först belagd med lipidbiskikt att bilda sfäriska SLBs (SSLBs). Pärlorna sedan in på en matris av mikro submikron diameter mikro-fabricerade. Framställningen Tekniken använder en "squeegee" för att rengöra substratytan, samtidigt leaving bakom SSLBs som har bosatt sig i mikrobrunnar. Denna metod kräver ingen kemisk modifiering av mikrobrunnsubstrat, och inte heller några speciella målligander på SSLB. Mikrobrunnar är upptagna av enstaka pärlor eftersom väl diametern är inställd på att vara just större än pärla diameter. Normalt är mer 75% av brunnarna ockuperade, medan resten förblir tomma. I buffert SSLB arrayer har en långsiktig stabilitet av mer än en vecka. Flera typer av SSLBs kan placeras i en enda matris genom serieavsättning, och uppsättningarna kan användas för avkänning, som vi visar genom att karakterisera interaktionen av koleratoxin med gangliosid GM1. Vi visar också att fosfolipidvesiklar utan pärlan stöder och biomembraner från cellulära källor kan klädd med samma metod och cellspecifika membranlipider kan identifieras.

Introduction

Lipidbiskiktmembraner är viktiga strukturer i naturen. Cellular plasmamembran och organell membran består av lipidbiskikt som innehåller ett antal molekyler som är nödvändiga för livet. Många livsuppehållande processer sker på ytan av celler eller förmedlas av molekyler som är associerade med lipid-dubbelskiktsmembran. I själva verket är många läkemedel målgrupp processer eller molekyler som finns på eller i membran 1,2. Det är därför nödvändigt att analytiskt undersöka processer, såsom kemiska reaktioner eller icke-kovalenta bindnings händelser som inträffar på membranytor. Eftersom naturliga membran kan vara svåra att isolera och / eller gränssnitt med sensorer, många forskare använder förenklade modellmembran för att genomföra analytiska studier. Ett antal modellmembransystem beskrivs i litteraturen, som sträcker sig från jätte vesiklar som kan vara tiotals till hundratals mikrometer i diameter till liposomer med nanoskala dimensioner 3,4. Alterntivt, plana lipiddubbelskikt avsatta på fasta bärare, det vill säga, som stöds lipiddubbelskikt (SLBs), kan bildas på ett antal olika underlag och har ofta använts i biofysiska, biokemiska och analytiska applikationer 5. Koppling SLBs med elektriska eller optiska material möjliggör undersökning av membranbiokemi och biophysics genom användning av olika analytiska tekniker. Fluorescensmikroskopi 6, elektrokemi 7, optisk spektroskopi 8, svepspetsmikroskopi 9, ytplasmonresonans 10, och masspektrometri 11 har alla använts för att studera struktur och egenskaper av SLBs.

SLB arrayer erbjuder extra flexibilitet i utformningen av sensorer för multiplex-analyser 12,13. Andra tillämpningar använder SLB arrayer för att efterlikna den korsning som bildas mellan immunceller 14. Förberedelsemetoder för SLB arrayer har varierat från microfluidic närmar sig 15 till de som använder fysiska barriärer mellan närliggande SLB fläckar. 16 Andra grupper har använt tryckmetoder 17, fotokemisk mönstring 18 och olika nanoteknologi närmar sig 19 för att skapa SLB arrayer.

I detta papper och tillhörande video visar vi en metod för att bilda SLB arrayer genom avsättning av SLB-belagda SiO 2 pärlor i ordnade arrangemang av mikrobrunnar 20. Vi hänvisar till SLB-belagda SiO 2 kulor som sfäriska stöds lipidbiskikt (SSLBs). Denna teknik är en förlängning av tidigare arbete som skapade matriser av fosfolipidvesiklar och biomembraner härrör från naturliga källor 21, där vi visar också exempel på resultat. Andra metoder för arraying Biomembrane partiklar eller blåsor har förlitat sig på mönster av specifika målligander på ytor som associerar med komplementära ligander som finns på vesikler ytan. Exempel inbegriper biotin-avidin förening 22,23 och DNA-hybridisering system 24. Vår strategi kräver endast en mikro array utan inriktning eller igenkänningsdelar som behövs. Storleken SSLBs definieras av diametern på SiO 2 bead bärare, som har låg poly-dispersitet. Genom att trimma mikrodiametern till bara större än SSLB diameter, klarnar endast en enda SSLB i varje brunn. En poly (dimetylsiloxan) (PDMS) skrapan avlägsnar sedan från ytan alla SSLBs som inte immobiliseras i mikrobrunnarna. Mikrobrunnarna och resulte SSLB arrayer har hög densitet (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 fim centrum-till-centrumavstånd och hexagonal periodicitet. Genom att serie deponera SSLBs med olika lipidkompositioner, är det möjligt att skapa fler arrayer med slumpmässigt placerade SSLBs. För att visa sensor förmåga SSLB arrayer, använde vi interaktionen av koleratoxin (CTx) med en gangliosid (GM1) införlivas i SSLBs. Mednaturliga membranpartiklar, kunde vi upptäcka cellspecifika lipider i fler arrayer som innehåller membran material från två olika celltyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikro av Micro Array Substrat

  1. Börja med en 4 tums kiselskiva med 100 nm av termiskt odlad oxid.
  2. Spin Vt-955 0,7 fotoresist på skivan vid 4000 rpm under 30 sek.
  3. Baka på en värmeplatta vid 115 ° C under 90 sek.
  4. Exponera fotoresist.
    1. Använd en mask som kommer att skapa en xm hål anordnade i en hexagonal matris med en period 3 um, där arrayen omfattar en 2 mm x 2 mm area.
    2. Exponera oblat i en i-linje stepper med användning av en stegstorlek av 6 mm och en exponering av 200 mJ / cm 2.
  5. Baka på en värmeplatta vid 115 ° C under 90 sek.
  6. Utveckla med hjälp av en spin-utvecklare att sätta in 2 pölar av CD-26 på skivan för en total utvecklingstid på 90 sek.
  7. Skölj noga med ultrarent avjoniserat vatten och torka med N2.
  8. Etsa oxid i en reaktiv-jon etcher för 6 minuter med 50 sccm av Ar, 25 sccm av CF 4, och 50 sccm på CHF 3 flovinge vid ett tryck av 75 mTorr.
  9. Etsa kisel i en ICP djupt dike reaktiv jon-etsningsanordning under 2 min med 63 sccm av C 4 F 8, 27 sccm av SF 6, 40 sccm Ar och 10 sccm av O 2 strömmar vid ett tryck av 14 mTorr.
  10. Skölj i aceton, metanol och isopropanol för avlägsnande av resist.
  11. Placera i ett bad av H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 under 10 min för att rengöra ytan.
  12. Skölj noga med ultrarent avjoniserat vatten och torka med N2.
  13. Sätt in 1,080 Å Al 2 O 3 för atomlager nedfall vid 250 ° C.

2. Framställning av poly (dimetylsiloxan) Sugskrapa

  1. Om möjligt, arbeta i ett renrum. Annars arbetar i den renaste miljön möjligt.
  2. Skaffa en plast petriskål (eller annan ren engångsbehållare) med ≥ 13 mm sidor.
  3. I den maträtt, utgjuta 5 g PDMS härdare, följt av 50 g PDMS base agent (eller vad som helst med en 01:10-förhållande som oftast kommer att fylla petriskålen). Blanda väl med en disponibel plast pipett eller stång.
  4. Avlägsna bubblor genom att placera de blandade PDMS i en kammare med en vakuumledning, anbringande av vakuum till dess att bubblor kommer ut ur blandningen (cirka 30 min).
  5. Om det inte redan i petriskålen, häll PDMS i petriskål, undvika skapandet av luftbubblor.
  6. Cure över natten på en värmeplatta vid> 50 ° C (högre värme under kortare tid fungerar också).
  7. Med ny / ren rakblad, skär försiktigt en rektangulär bit ca 2,5 x 2,5 cm, hålla övre yta så ren som möjligt. Skala ut med en ren pincett. Klipp bort en kant (ner till 1,5 cm) genom att trycka ner på rakblad i en rörelse, för att göra överkanten så skarp som möjligt (detta kommer att bli den kanten som används i rakel processen).
  8. Rengör med aceton, metanol, isopropylalkohol, och ultrarent avjoniserat vatten, och sedan blåsa torrt med ren kvävgas. Förvara i en ren petriskål.

3. Framställning av vesiklar

  1. Samla lipid stamlösningar av 25 mg / ml ägg-fosfatidylkolin (PC) och 1 mg / ml 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N - (lissaminrodamin B-sulfonyl)-ammoniumsalt (Rho-DPPE) i kloroform och en 0,5 mg / ml stamlösning av monosialogangliosid GM1 i kloroform / metanol (02:01 v / v).
  2. I en liten glasflaska att göra en blandning som resulterar i 97 mol% PC, 2 mol% GM1 och 1 mol% Rho-DPPE genom att tillsätta 18,9 l av 25 mg / ml PC, 39.6 l av 0,5 mg / ml GM1 och 7.9 l av 1 mg / ml Rho-DPPE med användning av glassprutor.
  3. Anmärkning:. Det kompletterande material för Nair et al 25 innehåller en utmärkt anpassnings Excel-ark för att beräkna mängden av lipider som krävs för att skapa blåsor i någon önskad komposition.
  4. Placera flaskan i en vakuumexsickator och avlägsna lösningsmedlet genom att lämna flaskan under vakuum i 6 timmar.
  5. Gör en vattenlösning av 0,1M NaCl. Tillsätt 0,5 ml av 0,1 M NaCl-lösning till injektionsflaskan med torkade lipidfilmen.
  6. Tillåt den vattenhaltiga lipidblandningen att vila över natten.
  7. Kortfattat vortexa att skapa en vesikelsuspensionen, då sonikera under 20 minuter i ett bad-sonikator vid rumstemperatur.
  8. Extrudera vesikeln suspensionen genom ett polykarbonatmembran med 100 nm porstorlek. Passera vesikelsuspensionen genom filtret 17x.
  9. Förvara extruderade blåsor i en glasflaska vid 4 ° C.

4. Bildning av Sfäriska stöds lipiddubbelskikt

  1. Samla 700 nm diameter SiO 2 pärlor. Pärlorna levereras i destillerat vatten med en förrådskoncentration av 1,4 x 10 11 pärlor / ml.
  2. I ett 1,5 ml Eppendorf-rör bereda en 1 ml kula suspension med en koncentration av 1,5 x 10 10 pärlor / ml genom att tillsätta 107 pl av vulsten stamlösningen till 893 pl av 0,1 M NaCl.
  3. Vortexa suspensionen för att säkerställa att den är väl milxed.
  4. Centrifugera suspensionen vid 1700 xg under 20 min kassera sedan supernatanten. Återsuspendera pärlorna i 1 ml 0,1 M NaCl. Upprepa detta steg två gånger för att tvätta pärlorna.
  5. För att bilda de SSLBs, i ett 1,5 ml Eppendorf-rör tillsätt 25 ul av SiO 2 pärlsuspension till 200 | il av 1 mg / ml vesikelsuspensionen. Vortex-blandningen och låt stå i en timme vid rumstemperatur. I detta skede bör SSLB koncentrationen vara 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
  6. Centrifugera vid 1700 x g under 20 min för att pelletera SSLBs. Den pellets ska visas rosa på grund av bristning av vesiklar med Rho-DPPE på pärlorna.
  7. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 225 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH = 7,4. Upprepa steg 4,6-4,7 två gånger för att ta bort eventuella spruckit blåsor från SSLB fjädring.

5. Montering av SSLB Array

  1. Cleave rån av mikro matriser resulterar i rektangulära bitar med 4-6 micRowell arrayer per styck.
  2. Vortex blanda SSLB fjädring, sedan placera 10 pl SSLB fjädring på varje mikro array. Så att vila under 1 h för att tillåta SSLBs sedimentera till ytan.
  3. Tvätta försiktigt mikro array chip med PBS från en tvättflaska, sedan dränka i en PBS-bad beredd på en flat tallrik.
  4. Även under vatten, försiktigt placera PDMS skrap flush på mikro array chip och försiktigt dra den längs ytan 5x att avlägsna SSLBs som inte är immobiliserade i mikrobrunnar.
  5. Ta tag i mikro array chip med pincett och försiktigt skaka i PBS badet för att ta bort eventuella överskott SSLBs.
  6. Snabbt bort chipet från skrapbadet och placera i en färsk PBS bad tills vidare användning. Kontrollera att den övre ytan av chipet förblir våt för att bevara SSLBs.

Anm: Hopsättningen ovan beskrivna metoden kan användas för att skapa matriser av naturliga membranpartiklar, såsom myelin partiklar isolerade från mushjärna, eller phospholipid blåsor utan de SiO 2 pärla stöd. Detta arbete beskrivs i detalj i Wittenberg et al. 21 och representativa resultat visas nedan.

6. Kolera Toxin Bindningsanalys

  1. Bered en 2 mg / ml lösning av bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
  2. Bered en lösning med önskad koncentration av Alexa 488-konjugerad koleratoxin B-subenhet i PBS med 2 mg / ml BSA.
  3. Avlägsna SSLB array chip från PBS-bad och transportera bort det mesta av PBS-lösning med hjälp av ett laboratorium torka. Lämna bara tillräckligt PBS på chipet för att hålla SSLB array hydrerad.
  4. För att förhindra ospecifik bindning, tillsätt 200 pl av 2 mg / ml BSA-lösning till SSLB arraychip. Låt vila i 1 timme i en fuktad box.
  5. Med en mikropipett för att avlägsna 200 | il av lösningen från toppen av SSLB arraychip.
  6. Addera 200 pl av koleratoxin lösning på SSLB arraychip och låt vila i en timme i en fuktad box.
  7. Tvätta försiktigt SSLB array chip med PBS från en tvättflaska för att avlägsna eventuellt obundet koleratoxin.
  8. Wick bort överflödigt PBS med hjälp av ett laboratorium torka. Innan avbildning täck chip med en 24 mm x 40 mm täckglas.
  9. Bild arrayer med en upprätt mikroskop med hjälp av filter sätter lämplig för fluoroforema av intresse.
  10. Analysera fluorescensintensiteten hos individuella SSLBs i en array med hjälp av automatiserade partikelanalys funktion ImageJ programvara.
  11. Samman genomsnittliga fluorescensintensiteter från enskilda SSLBs i histogram som sammanfattar intensiteten hos SSLBs som finns på en viss rad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När SiO 2 Kulorna blandas med en lösning av vesiklar bestående av fosfolipider, fluorescerande lipider och andra lipider, såsom gangliosider, vesiklarna brista på SiOa två däckfotsytor för att bilda SSLBs, såsom visas schematiskt i figur 1a. Efter tvättning av SSLBs är en droppe av SSLB lösning placerades på en mikrobrunn array, och pärlorna fick sedimentera till ytan. (Figur 1B1) Detta kan också göras med en suspension av fosfolipidvesiklar eller naturliga membranpartiklar, som visas i figur 1B2. En fluorescens bild av fosfolipidvesikler adsorberas till en mikromatrissubstrat visas i figur 1B3. Då PDMS skrapan görs att glida försiktigt över ytan för att avlägsna eventuella SSLBs (Figur 1C1), blåsor eller naturliga membranpartiklar (Figur 1C2) att inte bosätta sig i mikrobrunnar. Detta resulterar i en SSLB matris i vilken varjemikro innehåller högst en SSLB (Figur 1D1) eller en array där flera blåsor eller naturliga membranpartiklar är i varje brunn (Figur 1D2). En bild av en mikromatris består av fluorescerande blåsor visas i figur 1D3.

Figur 1
.. Figur 1 Bildande av SSLBs och SSLB array församling (a) Illustration av en SSLB består av 3 olika typer av lipider på en SiO 2 pärla: ägg PC (svart), Rho-DPPE (röd) och GM1 (blå). (B1-d1) Processflöde för montering av en SSLB array visar SSLBs utspridda på en mikromatris (b1), användning av en PDMS gummiskrapa för att rensa ytan på SSLBs inte fast i mikrobrunnar (C1), och den sista SSLB array (d1 ). (B2-d2 (B3) En fluorescens bild av fosfolipidvesiklar adsorberade på en mikrosubstrat motsvarande bilden i (b2). (D3) En fluorescens bild av en mikromatris består av fosfolipidvesikler motsvarande bilden i (d2). Anpassad från referenserna 20 och 21 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Individuella SiO 2 pärlor stöd för SSLBs i mikrobrunnar avbildades med svepelektronmikroskop (SEM) från både vinklad topp-view och tvärsnitts perspektiv. En vy uppifrån av en area ca 15 ^ m x 15 ^ m visas i fig. 2a, medan fig. 2b visar en tvärsektion av en enstaka kula immobiliserad i enbrunn. Den ljusare skikt beläggning på mikro är 100 nm av Al 2 O 3 deponerats av atomlager nedfall att stämma väl diametern så att brunnarna kan ta emot endast enstaka pärlor.

Figur 2
Figur 2. Svepelektronmikroskopi bilder av SSLB arrayer. (A) En elektron mikroskop av en 15 mm x 15 mm område visar SSLB pärla stöder immobiliserade på mikro arrayer. (B) En enda 700 nm i diameter SSLB i en brunn. Den mikro beläggningen är Al 2 O 3, som är avsatt för att krympa mikrobrunn, så att endast de enskilda pärlorna kan passa inuti. Anpassad från referens 20 och används med tillstånd av American Chemical Society.

När SSLB matriser framställes, kan de förses med bild genom fluorescensmikroskopi. Figur 3b visar ett område med 550 mikrobrunnar och 416 SSLBs för en uthyrningsgrad om 76%.

Sekventiell avsättning av olika typer av SSLBs användes för att skapa matriser med mer än en typ av SSLB, där identiteten av individuella SSLBs bestämdes genom frånvaro eller närvaro av ett toxin-receptor (GM1) och dess bindning av koleratoxin (CTx). Monteringsprocessen var densamma som för en enda SSLB typ men genomfördes en andra gång med en annan SSLB identitet. Utgångs koncentrationen SSLBs var 10x lägre för att minska beläggning av den första typen av SSLB och så att fler lediga platser som ska upptas av den andra typen av SSLB. I fig. 3c-3e är en SSLB array med två typer av SSLBs visas. All på de SSLBs innehålla röd fluorescerande Rho-DPPE (figur 3c), men endast en del av SSLBs innehålla GM1, en ​​gangliosid som är receptorn för B-subenheten av CTx. När de utsätts för grönt fluorescerande Alexa 488-konjugerat CTx, bara SSLBs innehåller GM1 fluorescerar i den gröna kanalen (figur 3d). När de röda och gröna bilder slås samman, är det möjligt att bestämma vilka SSLBs innehåller GM1 (gul) och som inte (röd) (Figur 3e).

Figur 3
Figur 3. Fluorescens avbildning av SSLB matriser. (A) En 100 ìm x 100 ìm område som innehåller 936 Rho-DPPE-märkta ägg PC SSLBs. (B) En bright och fluorescens overlay som visar en SSLB med 76% av mikrobrunnarna ockuperade. (Ce) A SSLB array som innehåller SSLBs som innehåller Rho-DPPE(C), en bråkdel av dem innehåller också GM1, som är bunden av Alexa-488-konjugerad CTx (d). (E) Sammanslagning av röda och gröna kanaler där samlokaliserades fluorescens indikerar närvaron av GM1 på SSLB. De blå cirklarna indikerar SSLBs som bara fluorescerar rött, det vill säga saknar GM1. Anpassad från referens 20 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Fluorescensdata från SSLB arrays analyserades genom mätning av intensiteten hos individuella SSLBs i en bild. Den SSLB intensitetsdata från arrayer sammanställdes i histogram. Figur 4a visar en sådan histogram från analysen av Rho-DPPE fluorescens från en SSLB array bestående enbart av SSLBs innehåller ägg PC och 1 mol% Rho-DPPE. Data i figur 4a har förvärvats genom att analysera bilden i figur 3a. Vi hittade SSLB arrayer vara robust och stabil i minst en vecka i kylskåp ettnd nedsänkt i buffert. De arrayer förlorade inte någon fluorescensintensiteten, inte heller beläggningen i de matriser förändras under loppet av en vecka (figur 4b).

Figur 4
Figur 4. (A) Histogram som visar fördelningen av fluorescensintensiteterna för SSLB arrayen visas i fig. 3a. Den genomsnittliga intensiteten för varje SSLB i matrisen användes för att sammanställa histogrammet. Den heldragna linjen är en Gauss-passning till data. (B) Genomsnittlig array beläggning (svarta cirklar) och fluorescensintensiteten (röda fyrkanter) för en SSLB array övervakas under loppet av en vecka. Anpassad från referens 20 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Vi gjorde matriser sammansatta av SSLBs med varierande koncentrationer av GM1 (0, 0,5, 1 ennd 2 mol%) och utsatt dem till en fast koncentration av CTx och arrayer med SSLBs med koncentrationer av GM1 och utsatt dem för olika koncentrationer av CTx. Den senare experiment användes för att bestämma jämviktsdissociationskonstanten (Kd) för GM1/CTx bindning. De SSLB arrayer med varierande GM1 koncentration exponerades för 50 nM Alexa-488 märkta CTx för 1 timme sedan tvättas och avbildas. Intensiteten histogram för SSLB arrayer med 0,5-2 mol-% GM1 exponerade för 50 nM Alexa 488-konjugerad CTx kan ses i Figur 5a Figur 5b visar det linjära beroendet av den genomsnittliga fluorescensintensiteten på GM1 koncentration.. När koncentrationen av GM1 i SSLBs är fastställd till 2 mol-% och de SSLB arrayer utsätts för CTx som sträcker sig från 16 pM till 158 nM, följer bindande svar sigmoidala kurvor som visas i figur 5c. Kurvorna passar till dessa data är baserade på två olika bindningsmodeller: Langmuir isoterm (ekvation 1) och Hill-Waud lägel (ekvation 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ekvation 1 (1)

Ekvation 2 (2)

Där F är fluorescensintensiteten vid en given CTx koncentration, är Fmax fluorescensintensiteten när bindningen är mättad, [CTx] är den CTx koncentration, K D och K H är de dissociationskonstanter från Langmuir och Hill-Waud passar respektive , och n är kooperativitet koefficient i Hill-Waud modell. Den kooperativitet koefficient (n) uppskattar mängden multivalent bindning, där ett n är större änman anger att varje CTx molekylen binder flera GM1. Koncentrationen av CTx på 0,5 x F max är K D eller K H för GM1/CTx interaktion. I våra experiment beräknade vi ett Kd på 1,6 ± 0,2 nM och K H på 1,4 ± 0,2 nM med ett n-värde på 1,3, vilket indikerar kooperativ bindning. Dissociationskonstanterna för GM1/CTx interaktionen varierar mycket i litteraturen, som sträcker sig över 5 storleksordningar från 04:05 till 370 nM 26,27.

Figur 5
Figur 5. CTx/GM1 bindningsanalyser på SSLB arrayer. (A) på histogram för fluorescensintensiteten hos individuella SSLBs inom SSLB arrayer. Uppsättningarna innehöll SSLBs med 0,5, 1 eller 2 mol-% GM1 och exponerades för 50 nM Alexa 488-konjugerad CTx. Denheldragna linjer är Gaussiska passar. (B) Rita av fördelningen innebär från (a) som en funktion av GM1 koncentration. (C) Bindande kurvor som visar fördelningen innebär från matriser som innehåller SSLBs med 2 mol% GM1 efter exponering för Alexa-488-konjugerad CTx varierar från 16 pM till 158 nM. Linjerna är passar till Langmuir isoterm (röd) och Hill-Waud (blå) bindande modeller. De felstaplar i (BC) representerar standardavvikelserna för fördelningarna av fluorescensintensitet som motsvarar varje datapunkt. Anpassad från referens 20 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Som tidigare nämnts, är det också möjligt att bilda matriser med biomembran material som härrör från naturliga källor 21. Uppsättningarna är bildade på samma sätt, genom att dispergera membran partiklar på en mikrobrunn substrat, därefter rensas den övre ytan med skrapan att lämna bakom membranpartiklar i microwells. Figur 6 visar exempel på myelin och neuronala lipidaggregat microarrays. I figur 6a, är myelinpartiklar märkta med lipofila fluoroforen FM1-43. Lipidrafts är kända för att anrikas i kolesterol och gangliosider såsom GM1; sålunda, Alexa 488-konjugerad CTx är starkt bundet till lipidaggregat microarrays såsom visas i fig 6b, medan fluorescensmärkt streptavidin (SAPE) inte binder till matrisen. (Figur 6c) Vi skapade också rand arrayer genom att leverera myelin och lipid flotte partiklar till mikrosubstrat med en mikroflödessystem chip med 250 nm-breda kanaler. Efter partikelleverans ades microfluidic chip loss från mikro substratet och skrapans förfarande som utförs som vanligt. Stripe-arrayer exponerades sedan för en fluorescerande anti-oligodendrocyt IgM-antikropp (IgM O4), som binder sulfatid hittats i myelin. (Figur 7) The myelin och lipidaggregat rand microarrays i Figur 7 visas på ökande förstoring, och på den högsta nivån av förstoring, är det uppenbart att IgM O4 binder endast till myelin microarrays eftersom sulfatid är frånvarande från lipid flottar.

Figur 6
Figur 6. Myelin partikel och neuronala lipid flotte partikel arrayer. (A) En myelinpartikelmicroarray där myelinpartiklarna återges fluorescerande av lipofila fluoroforen FM1-43. Den streckade linjen anger kanten på samlingsarea. (B) lipidaggregat mikromatris visande CTx bindning till lipidaggregat partiklar. (C) Lipid flotte microarray utsatt för fluorescerande streptavidin-fykoerytrin (SAPE) visar liten eller ingen icke-specifik bindning. Anpassad från referens 21 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Figur 7
Figur 7. Flerkomponent arrayer bildas av mikroflödes leverans av myelin och neuronala flotte membran. (A) Fluorescens bild efter myelin och flottar sattes in via mikroflödessystem kanaler på microarray substrat. De vänstra och högra band innehåller myelin och mittremsa innehåller neuronala Flotte membran. Membranen färgas med FM1-43, vilka etiketter all lipid material. Skalan bar är 250 nm. (B) Fluorescens bild av samma tre ränder efter applicering av PDMS skrapan och inkubation med IgM O4. Skalan bar är 250 nm. (CE) Förstorade bilder från de tre band som visar att IgM O4 endast binder till myelin microarrays: (c) vänstra rand (e) rätt rand. Skal barer i panels ce är 30 | im. Anpassad från referens 21 och används med tillstånd av American Chemical Society.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete visar vi att monodispersa SiO 2 pärlor belagda med stöds lipiddubbelskikt kan ordnas i mikrobrunn arrayer utan behovet för inriktning ligander på de dubbla lipidskikten eller substratytan, och uppsättningarna kan användas för karakterisering av toxin-lipid-interaktioner. Dissociationskonstanten vi beräknat för CTx/GM1 bindning kan jämföras med tanke på de stora skillnaderna i värden i litteraturen, med en tidigare rapport av Winter et al., Där kolloidalt montering av lipid-belagda kulor användes för att beräkna en dissociationskonstant på cirka 30 nM. Genom anpassning av data till Hill-Waud bindande mallen har vi bestämt att CTx/GM1 interaktionen sannolikt flervärd, vilket överensstämmer med tidigare rapporter 28. B (gangliosid bindande) subenheten av CTx existerar som en pentamer, med var och en av de fem enheter som kan binda en GM1 molekyl 29; därför är det inte förvånande att fler än en underenhet kan vara bunden med tanke på diffusive rörlighet GM1 i SLBs 30.

Arrayer av kemiskt funktion pärlor har använts i andra analytiska studier 31. I dessa typer av experiment, är pärlorna typiskt immobiliseras i mikrobrunnar som skapas i slutet av etsade optiska fibrer. Multiplex fluorescensanalyser kan utföras i denna konfiguration genom att blanda subpopulationer av pärlor och immobilisera dem samtidigt på änden av den optiska fibern 32. I vår multiplex analys (figur 3c-3e), immobiliserade vi optiskt kodade SSLBs sekventiellt eftersom lipider på SSLBs fri i lösning skulle kunna överföras från en typ av SSLB till en annan 33. Även om detta lägger till extra steg vid framställningen av SSLB arrayer, inte alltför tid det krävande och är den mest effektiva metoden för lipid-functionalized pärlor. Vi har också rumsligt kodad arrayer genom att deponera olika SSLB populationer i angränsande mikrobrunn arrayer, och det finns ingen observerbar cross-talk mellan uppsättningarna 20. För att minska prov-förberedelsetider, kan SSLB arrayer förberedas i förväg och användas när så önskas. Vi testade stabiliteten hos matriser under loppet av en vecka och fann ingen signifikant nedbrytning av uppsättningarna i termer av fluorescensintensitet, vilket tyder på att mängden av lipidmaterialet på SSLBs inte förändras med tiden. Dessutom gör matrisen beläggning inte förändras över tiden, vilket tyder på att en gång SSLBs är immobiliserade de inte lossnar från mikrobrunnarna (Figur 4B).

Förutom pärlor belagda med syntetiska lipiddubbelskikt, har vi också använt denna metod för att skapa matriser av naturliga membranpartiklar 21. I det arbetet, immobiliserade vi myelin partiklar från mushjärna samt neuronala membran partiklar, såsom lipid-flotte fraktionen. Vi kunde använda matriser för att identifiera cellspecifika membran ytmolekyler av antikropps binding (figurerna 6 och 7). Vidare, när storleken på mikrobrunnarna minskades till nanonivå och den övre ytan av uppsättningen belades med guld, kunde vi använda ytplasmonresonans för att övervaka bindning av antikroppar mot myelinmembranpartiklar utan användning av fluorescerande markörer. Den stora skillnaden mellan att använda SSLB och vesiklar eller naturliga membranpartiklar för att bilda arrayer är att i fallet med SSLBs den exakta mängden membranmaterial i varje mikrobrunn är känd eftersom endast en enstaka kula kan passa i varje brunn. Med vesiklar eller naturliga membranpartiklar, det finns inget sätt att kontrollera mängden av material i varje brunn, med undantag för att justera startkoncentration av vesiklar eller partiklar. Men är inte särskilt stor att väl-till-bra variation av antalet blåsor jämfört med fördelningen av vesikler diameter 21.

Slutligen kan den här metoden ha divErse framtida tillämpningar. Junesch och medarbetare har använt en gummiskrapa för att ta bort nanopartiklar under kolloidal litografi nanofabrikation 34. Membran arrayer kan formas för att efterlikna cell-cellkontakter för att undersöka cellulär fokal adhesion 35 eller undersöka bindningen av membran krökning kännande proteiner 36. Dessutom skulle användningen av porösa pärlor underlätta införandet av transmembranproteiner i lipidbiskikten 37 eller lokal tillförsel av lagrat gods till celler odlade på ett biomembran array substrat. Den mikroplattform tillverkas genom fotolitografi, vilket möjliggör design flexibilitet. Här våra arrayer hade sexkantiga geometri, men torget, linjär eller andra geometrier kan skapas med varierande utbud periodicitet och mikro dimensioner för att undersöka de rumsliga effekterna av fokal adhesion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag till SHO från National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIÄR Award och DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program och Minnesota Partnership Award för bioteknik och medicinska Genomics. Komponentframställning utfördes vid University of Minnesota Nanotekniklaboratoriet Center (NFC), som får stöd från NSF genom National Nanotechnology infrastrukturnätverk. Detta arbete har också finansierats med bidrag till MR från National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson och Sanford stiftelser och McNeilus familjen. Författarna vill tacka Hyungsoon Im för hjälp med illustrationer och Shailabh Kumar om hjälp med svepelektronmikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
  2. Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
  3. Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
  5. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
  6. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  7. Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
  8. Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
  9. Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
  10. Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
  11. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
  12. Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
  13. Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
  14. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
  15. Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
  16. Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
  17. Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
  18. Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
  19. Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
  20. Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
  21. Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
  22. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
  23. Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
  24. Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
  25. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
  26. Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
  27. Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
  28. Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
  29. Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
  30. Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
  31. Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
  32. Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
  33. Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
  34. Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
  35. Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
  36. Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
  37. Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).

Tags

Bioteknik som stöds membranet pärlor microarray fluorescens mikrofabrikation nanofabrikation atomlager nedfall myelin lipidaggregat
Bildning av Biomembrane Microarrays med en gummiskrapa baserade Assembly Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W.,… More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter