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Engineering

分析无节幼体的运动“ Published: July 15, 2014 doi: 10.3791/51502

Summary

我们使用等离子体激元纳米颗粒的光学跟踪探测和表征水生生物的频率变动。

Abstract

我们展示了如何光镊可以提供一种灵敏的工具来分析由小的水生生物的运动所产生的流体振动。通过光镊举行一个单一的黄金纳米粒子作为传感器定量的水样在无节幼体幼虫( 卤虫 )的有节奏的运动。这是通过监测捕获纳米颗粒的时间相关的位移为无节幼体活动的结果来实现。纳米粒子的位置的傅立叶分析,然后产生一个频谱是特征观察到的物种的运动。该实验证明这种方法来测量和表征小的水生幼虫的活性而不需要直接观察它们,以获得关于相对于所述捕集粒子幼虫的位置信息的能力。总体而言,这种方法可以给在水生e实测值对某些物种的活力见识cosystem和可扩展的传统的方法,用于分析水样的范围内。

Introduction

基于化学和生物指标的水质评价是具有根本的重要性,以获得对水生生态系统1-3的状态和环境条件的洞察力。经典方法化学水分析是基于感官特性或物理化学参数的测定。生物指标,而另一方面,是动物物种的存在和生存提供了环境条件和污染物,为发生英寸的指示作用的典型例子,一个生态系统的影响的洞察力是桡足类,一组小甲壳类水,它可以在几乎所有的水生境4,5找到。从水样品观察这些物质的活性和生存能力因此可用于获得关于一个生态系统5的整体条件的信息。桡足类的幼虫,这是所谓的无节幼体,用自己的触角节奏招(每个幼虫有三对appenda的GES在他们的头部区域)水6游泳。这招的频率和强度,从而在年龄,体格,动物7-10环境状况的直接指标。对这些标本的任何调查通常是用显微镜观察和直接计数的无节幼体的天线招完成。由于它们的大小(〜100-500微米)11,这通常要求要么逐个或定出一个单一的无节幼体在基板上做测量。

在这里,我们展示了一种新的方法利用光学被困金纳米粒子作为一种超灵敏探测器来观察桡足类幼虫的活性水样中。光镊通常由许多团体作为精细的实验工具,分子之间适用或测量力下降到piconewton范围12-14。最近,为光镊的应用范围已扩大到观察声波振动和解决NT波动在液体介质中通过监测纳米微粒的被局限在一个光学捕捉器15的运动。被浸没在液体颗粒进行布朗​​运动。内部光陷阱,然而,这项议案的一部分由一个强大的,激光诱导,梯度力衰减。因此,光学阱的刚度和颗粒内的激光束的焦点的定位可以通过将激光功率进行调整。在同一时间,也可以揭示关于俘获电位特性和分析分子与颗粒的相互作用通过在阱监测随时间变化的颗粒运动。这种方法使得可以拾取的频率,强度,和由一个移动的物体在其液体环境中产生的流体运动的方向。我们展示了如何这一般想法可以应用于以获得个体无节幼体的运动的频谱,而不要求直接干扰样品。这种实验方法引入了一个新概念,一般为水生标本的能动的行为在一个非常敏感的方式观察。有关指示生物种的观察,这可能会扩大现行方法进行水质分析,并可以适用于获得有关健康和水生生态系统的完整性信息。

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Protocol

1,实验装置

  1. 使用向上向右显微镜和暗场油冷凝器用数值孔径(NA)= 1.2为暗视场照明。使用水浸物镜与100X的放大倍率和NA = 1.0颗粒的观察和捕捉。使用空气与目标10倍放大倍率和NA = 0.2遵循无节幼体的运动。
  2. 使用光学镊子设置与1,064 nm的连续波激光器耦合到右上方显微镜。将光阱的激光功率为100毫瓦(与目标后,功率计测量)。
  3. 使用CMOS高速相机或数码单镜头反光(DSLR)相机来检测和图像的金颗粒运动的光阱和无节幼体的运动。
  4. 使用一个陷波滤波器,以防止激光进入相机。
  5. 使用功率计的目标后,测量激光功率。

2,样品制备

  • 吸取水滴(180微升)在显微镜载玻片上并在暗场显微镜的样品定位。
  • 从一个小水箱吸管无节幼体的水滴。
  • 使用10X空中目标,观察无节幼体的移动解决方案中,并录制视频流。
  • 使用金​​纳米颗粒的直径为60纳米的检测器,观察由无节幼体中产生的流体运动。因此,添加5微升的高度稀释的粒子溶液成水滴,使约1粒子可以在视图与100X水浸物镜的字段可以看出。
  • 3。粒子跟踪实验

    1. 陷阱一金纳米粒子与光镊。因此,带来1,064 nm的激光捕获接近黄金纳米粒子,是解决在扩散通过移动显微镜载物台。迷人的光学力量拉金纳米粒子对日的焦点Ë激光束。被困粒子没有再扩散,而并保持其地位。采取被困纳米颗粒与数码单反相机的视频流以50赫兹进行30秒的帧速率。
    2. 关闭光镊的激光,并从陷阱里放的金纳米粒子。
    3. 使用粒子跟踪程序,以读出光学被困金颗粒在所述视频流的每个帧中的位置。粒子的XY位置随时间的快速傅立叶变换(FFT)揭示了一个频谱。
      注:在这里,一个自写'IGOR Pro的计算机程序代码来分析随着时间的推移和FFT分析在xy平面上的粒子中心的地位。
    4. 作为替代自己编写的IGOR代码使用免费提供的“视频现场跟踪程序'程序来跟踪颗粒的视频。使用商业软件'起源'来执行跟踪数据的傅立叶变换: 视频文件拖到打开的程序的视频点跟踪“。
    5. 鼠标点击出现在视频流和出现兴趣的圆形区域的第一图像的粒子。
    6. 选择顶部的命令提示符窗口中的“对称”和“优化”来优化粒子的跟踪。
    7. 鼠标点击“登录”,在top命令提示符窗口,然后选择一个文件夹来保存数据。跟踪数据将被保存为一个数据表格。
    8. 鼠标点击“播放视频”关于跟踪程序的左边命令提示符窗口,并等待视频的所有帧进行了分析。
    9. 关闭该程序,并与“起源”打开保存的数据的电子表格。设置列值“Y 1”和“y 2”。
    10. 设定的时间步骤中的“产地”数据的电子表格的每个视频帧作为“×”。
    11. 马克 x位柱和在top命令提示符窗口中选择“数据分析”和“FFT”执行FFT。重复y位置栏的步骤。
    12. 绘制所计算的FFT信号的振幅在x轴和y-方向相对于频率。

    4。数值模拟

    1. 通过使用计算机程序'数学'计算出60纳米金颗粒的极化率α。
      1. 使用等式(1)根据桑等人 16计算的极化。:
        式(1) (1)
      2. 定义在该程序代码中的以下三个参数:金颗粒,所述纳米颗粒的半径,和周围介质的折射率的依赖于波长的复介电函数。
    2. 使用ELEC的描述。聚焦高斯光束根据Agayan [17]来计算作用在60纳米金颗粒的光学力量TRIC场分布:
      公式2 (2)
      1. 用方程(3) - (6)从Agayan [17]来计算两者的梯度和散射作用在粒子力量:
        式(3) (3)
        公式4 (4)
        方程(5) (5)
        公式6 (6)
      2. 在程序代码中,定义参数为激光功率,邻数值孔径bjective,并且所述纳米颗粒的复合极化。
      3. 总结梯度力和散射力来计算作用在光阱的金颗粒的总光力。
    3. 同时按住“控制”和“Enter”键运行仿真。

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    Representative Results

    实验装置的示意图示于图1A中 。暗场配置是必要的,以光学检测为60nm的金颗粒的位移,在一个光学阱15。的1064纳米的捕集激光器中的波长被选择为保证检测器的金颗粒12,14的稳定禁闭。在显微镜的光束分离器是用来通过物镜聚焦俘获光束和一个陷波滤波器可以防止俘获激光进入实验的检测装置。无节幼体进行了变动,周围的光学被困金纳米粒子( 图1B)的水溶液。由动物所产生的流体的振动传播通过该液体介质和与光学俘获粒子相互作用。

    图2A示出了被捕获B A单一60nm的金纳米微粒的暗场图像y中的激光束。在暗场照明的绿颜色表示在该波长范围内其散射频率。观察捕集粒子与单反照相机的色彩可确保只有一个等离激元纳米颗粒是通过聚焦激光俘获以来的第二粒子的捕集会导致颜色变化,由于等离激元的耦合。 ,保持密闭,在阱的粒子的总光力的计算的分布示于图2B。无需任何外部的流体振动,被困等离激元纳米颗粒的位移示出了高斯分布,因为它的运动是完全受布朗运动( 图2C)。只要一个无节幼体被加入到样品中,其运动产生与检测器的颗粒的流体相互作用。在光学阱纳米颗粒开始在流体相互作用高达100纳米( 图2D的振荡振幅的方向上摆动)。

    几无节幼体幼虫的运动监测与高速CMOS摄像头,其游泳行为进行独立分析。一个例子示于图3A中 。大型天线的主臂的周期性运动的一个完整振荡花费148毫秒,对​​应于围绕6.75赫兹的频率。我们观察到相同的无节幼体在几秒钟的时间段,也不同无节幼体从相同的样品。从直接观察,我们观察到的频率之间4.1和7.2赫兹范围内的触角招。

    图3B图3C显示了捕获的金纳米颗粒的频谱不具有(黑色曲线)中,用(红色曲线)一个无节幼体中存在所观察到的水滴。几乎没有信号可以看出,在粒子的傅立叶光谱的x方向。与此相反,在频谱的y方向显示出强大的呼吸道ONSE。这可以通过在无节幼体的相对于该颗粒捕集器的相对位置来解释。该纳米颗粒只检测那些由生物体所产生的振动。因此,在y方向上的强信号表明所述流体振动的方向,并在动物的位置(CP. 图2D)。转化依赖于时间的粒子位移轨迹成傅立叶空间中,因此导致在频谱的信号强度的方向依赖性的差别。在较宽的频率范围存在于我们的测量与净生物动力是一致的。无节幼体的两个主要天线的动作不液体位移的唯一来源。较小的天线对等体突起的运动也有助于观察信号。对于所有的测量,我们发现在3.0和7.2 Hz,持续的无节幼体的运动,这是一个很好的根据来直接观察磁疗频率的最大值生物微生物的胶片时,也非常适合在一个幼虫阶段6,8-10预期的频率范围内的无节幼体。

    图1
    实验装置如图1所示。示意图。 A)暗场配置和光镊。在显微镜分光器是用来捕获光束(1,064 nm的连续波)集中到暗视野显微镜的阶段。陷波滤波器可以防止激光进入高速或数码单反相机B)一个金纳米粒子被截留在光镊检测一种无节幼体的微流体振动在周围介质中。 请点击此处查看这是一个更大的版本图。

    类=“jove_content”FO:保持together.within页=“总是”> 图2
    图2:黄金纳米粒子的光学俘获。一个被困的金颗粒的)暗场图像B)计算在光阱作用于粒子的总兵力。激光波长为1064 nm和100毫瓦的功率下的客观测量。的力被绘制在周围的焦点。℃)的xy位移的光阱的金粒子为2微米的区域。该粒子的运动不受流体的振动干扰,不仅造成了布朗运动D)XY位移的陷阱中金颗粒,加入了无节幼体的液体后。由动物产生的微流体流动导致在y方向上的金纳米颗粒的位移的频率依赖失真。HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg”目标=“_blank”>请点击这里查看该图的放大版本。

    图3
    图3:黄金纳米粒子被困旁边的无节幼体游泳的频率谱。 A)触角招一个单一的无节幼体在不同的时间点。 。主天线的周期性运动一个完整的振荡需要大约148毫秒(6.75赫兹)B)黑色曲线:在x方向不受干扰的光学捕获纳米粒子,被作为参考的位移的频谱。红色曲线:金粒子的旁边有一个无节幼体游泳在x方向的频谱。频谱不会由于无节幼体对光学俘获particl的相对位置显示出强大的信号Ë。插图:在实验过程中无节幼体和金纳米粒子位置的示意图。由移动无节幼体中产生的流动主要是指在y方向C)黑色曲线:y方向的原状金颗粒的参考频谱。红色曲线:在无节幼体存在的金纳米粒子位移的频谱请点击这里查看该图的放大版本。

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    Discussion

    暗场显微术是一种强大的工具,用于可视化的金纳米颗粒与下面的光学衍射极限的尺寸,由于金属纳米粒子的散射截面积超过它们的几何横截面(CP. 2A)18。在镊子的设置,这种方法甚至允许区分如果仅在单个或多个金纳米颗粒被激光束俘获,因为颗粒之间的等离激元的耦合引起红移的等离子体激元共振频率15。暗视野显微镜与光学镊子的配置,因此提供了许多新的和非常有用的实验的可能性,但组合是不言自明。对于稳定的光俘获的强聚焦的激光束是必须的,因为在三维空间中的光阱的原点是由光场密度的梯度。通常情况下,具有高数值孔径(NA = 1.3〜1.4)的目标是用于镊设置实现了紧聚焦激光19。最高适用的市售暗场油冷凝器,但是,是1.2。这限制了可用于捕集颗粒为NA <1.2,因为更高NA的目标承担,不仅散射的问题,而且还直光由物镜收集的目标范围内。对于我们的设置,我们可以通过使用水浸物镜与NA = 1.0和暗场聚光镜与NA = 1.2,实现了稳定的光学捕获。这是可能的,因为激光束扩张在显微镜的前面引导到物镜的后孔的满溢,因此到足够的聚焦激光(即使只有1.0 NA)的。

    一个电浆金纳米粒子的稳定诱捕也强烈地依赖于俘获12-14激光的波长。在我们的实验中,1064纳米的波长被选择为颗粒捕集BECA使用这个波长远远红移从颗粒的等离子体共振波长在约530纳米。这是一个稳定的捕捉重要的,因为作用于金颗粒的光梯度力是主要的这个波长,散射力,从散射和吸收,光子的动量传递的起源,是微乎其微的。既,梯度和散射力,使粒子移动到不同的方向,但仅梯度力导致稳定的光学捕获,因为它们是指向它的激光束的聚焦强度最高的区域。散射力,相反,是指向沿着所述光束的能量通量的轴线。在波长接近粒子共振,光的散射变得强大和散射的力量占主导地位。在这种情况下,颗粒被推向和未捕获由激光束,甚至超出了焦平面20,21。

    粒子非常稳定的诱捕是一个要求检测到任何小的外部微流体扰动,并从时间依赖性质点位移的光阱实现增强的信号在频谱的信噪比。同时,高的激光功率可以导致容易会导致不希望的热效应包括整个水样品加热所述纳米颗粒的大量加热。以实现不同的信号中的粒子的傅立叶空间这两个因素都必须考虑和实验优化,在这样一种方式,热效应最小化,但足够稳定俘获的实现。同样重要的是要指出,水样的条件,如温度和pH值,可能对测量过程中的幼虫的生存力的影响,而这些因素从而需要控制并保持恒定。因此,我们进行所有测量在室温下(〜20℃),并在pH值约7.5。

    总体而言,叔他的方法,通过跟踪单个的金纳米粒子的光阱的位置,以检测无节幼体幼虫的运动代表了非侵入性的方法来分析水生样品的活性而不需要干扰甚至看到无节幼体在测量过程。此外,微流体振荡的方向可以通过所述纳米颗粒的位移的方向依赖性傅立叶频谱分析来确定。光学钳配置从而使得可以检测到小的流体振动在具有高灵敏度的水溶液。在将来,这种方式可以扩大在一个水样,并在同一时间不同种类的生物体之间进行区分。此外,使用金纳米颗粒作为敏感检测器的这个方法并不限于只无节幼体幼虫的测量,并且可以在原则上被应用到由测量更小的物体所产生的任何流动,如单细胞和宝ssibly甚至会滋生细菌。

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    Disclosures

    作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

    Acknowledgments

    在ERC通过高级研究员格兰特HYMEM,由东风集团通过纳米系统倡议慕尼黑(NIM),并通过Sonderforschungsbereich(SFB1032)的资金支持,项目A8深表感谢。我们感谢博士亚历山大Ohlinger,博士溶胶卡雷特罗 - 帕拉西奥斯和水疗中心Nedev支持和富有成果的讨论。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Microscope Zeiss Axio Scope.A1 Carl Zeiss 490035-0012-000 dark field illumination
    Water objective Achroplan Carl Zeiss 440087 100X magnification, NA = 1.0
    Air objective Epiplan Carl Zeiss 442934 10X magnification, NA = 0.2
    Dark field oil condenser Carl Zeiss 445323 NA = 1.2
    Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL Cobolt 1064-05-01-2000-500 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00
    Beam expander Edmund Optics Part no. 1064 2-8X 64414
    High Speed Camera Dimax HD PCO. Germany
    Color Camera Canon EOS 500 D  Canon FAQ-ID: 8201395700
    Notch filter StopLine 532/1064 Semrock A11149-711265 Part no. NF01-532U
    Water 
    Nauplius Artemia salina
    Gold colloid BBInternational Batch 13741  Diameter 60 nm
    MQMie Version 3.2  Dr. Michael Quinten
    Mathematica 8.0 Wolfram
    Comsol Multiphysics 4.0  COMSOL, Inc.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    生物物理学,第89期,光镊,粒子跟踪,电浆纳米粒子,无节幼体,指示生物,水样分析
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    Kirchner, S. R., Fedoruk, M.,More

    Kirchner, S. R., Fedoruk, M., Lohmüller, T., Feldmann, J. Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (89), e51502, doi:10.3791/51502 (2014).

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