Summary
Usiamo tracciamento ottico di nanoparticelle plasmoniche per sondare e caratterizzare i movimenti frequenza degli organismi acquatici.
Abstract
Mostriamo come pinzette ottiche possono fornire uno strumento sensibile per analizzare le vibrazioni fluidici generate dal movimento dei piccoli organismi acquatici. Una singola nanoparticella di oro tenuto da una pinzetta ottica viene utilizzato come sensore per quantificare il movimento ritmico di una larva Nauplius (Artemia salina) in un campione di acqua. Ciò si ottiene sorvegliando lo spostamento dipendente dal tempo della nanoparticella intrappolato in conseguenza dell'attività Nauplius. Una analisi di Fourier della posizione della nanoparticella poi produce uno spettro di frequenza che è caratteristica per il movimento delle specie osservate. Questo esperimento dimostra la capacità di questo metodo per misurare e caratterizzare l'attività di piccole larve acquatiche senza l'obbligo di osservare direttamente e di ottenere informazioni sulla posizione delle larve rispetto alla particella intrappolata. Nel complesso, questo approccio potrebbe dare una panoramica sulla vitalità di alcune specie si trovano in una e acquaticaCoSystem e potrebbe ampliare la gamma di metodi convenzionali per l'analisi di campioni d'acqua.
Introduction
Valutazione della qualità delle acque sulla base di indicatori chimici e biologici è di fondamentale importanza per ottenere informazioni sulle condizioni di stato e ambientali di un ecosistema acquatico 1-3. Metodi classici per l'analisi chimica dell'acqua sono basati sulle proprietà organolettiche e la determinazione dei parametri fisico-chimici. Indicatori biologici, d'altra parte, sono specie animali la cui presenza e vitalità fornire indicazioni sulle condizioni ambientali e l'effetto di inquinanti per un ecosistema che si verificano trovi Esempi tipici di bioindicatori sono Copepods, un gruppo di piccoli crostacei acqua, che può essere trovato in quasi ogni habitat di acqua 4,5. Osservando l'attività e la vitalità di queste specie da un campione di acqua può quindi essere utilizzato per ottenere informazioni sulle condizioni complessive di un ecosistema 5. Le larve di copepodi, che sono chiamati naupli, utilizzare colpi ritmici della loro antenne (ogni larva ha tre paia di appendages al loro regione della testa) per nuotare in acqua 6. La frequenza e l'intensità di questi colpi è quindi un indicatore diretto di età, fitness, e le condizioni ambientali dell'animale 7-10. Eventuali indagini su tali campioni sono di solito fatto con un microscopio osservando e contando i colpi antenna del naupli direttamente. A causa delle loro dimensioni (~ 100-500 micron) 11, questo spesso richiede di fare misurazioni sia uno per uno o per fissare un unico Nauplius ad un substrato.
Qui, dimostriamo un nuovo approccio per osservare l'attività di Copepodo larve in campioni di acqua utilizzando un nanoparticelle d'oro otticamente intrappolati come un rilevatore ultrasensibile. Pinzette ottiche sono tipicamente utilizzati da molti gruppi come strumento sperimentale multa di applicare o misurare le forze tra le molecole fino alla gamma piconewton 12-14. Più recentemente, la gamma di applicazioni per pinzette ottiche è stata ampliata per osservare vibrazioni acustiche e risolverefluttuazioni nt in mezzi liquidi monitorando il movimento di nano e microparticelle che sono confinati in una trappola ottica 15. Particelle che vengono immersi in un liquido sono sottoposti a moto browniano. All'interno di una trappola ottica, tuttavia, questo movimento è parzialmente attenuato da un laser indotto, forza forte pendenza. Pertanto, la rigidità della trappola ottica e la localizzazione della particella nel fuoco del fascio laser possono essere regolati tramite la potenza del laser. Allo stesso tempo, è possibile rivelare caratteristiche circa il potenziale di cattura e di analizzare le interazioni di molecole con la particella monitorando il moto delle particelle dipendente dal tempo nella trappola. Questo approccio rende possibile la presa la frequenza, l'intensità e la direzione del movimento fluidico generato da un oggetto in movimento nel suo ambiente liquido. Si dimostra come questa idea generale può essere applicato per ottenere uno spettro di frequenza del moto di un individuo Nauplius senza il requisitointerferire direttamente con il campione. Questo approccio sperimentale introduce un nuovo concetto generale per l'osservazione del comportamento mobili di esemplari acquatici in un modo molto sensibile. Per le osservazioni sulle specie bioindicatori, questo potrebbe espandere l'attuale metodologia per l'analisi delle acque e potrebbe essere applicata per ottenere informazioni sulla salute e l'integrità degli ecosistemi acquatici.
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Protocol
1. Setup sperimentale
- Utilizzare un microscopio in alto a destra e un campo condensatore olio scuro con una apertura numerica (NA) = 1.2 per l'illuminazione a campo scuro. Utilizzare un obiettivo di immersione in acqua con ingrandimento 100X e NA = 1.0 per le osservazioni di particelle e trapping. Utilizzare un obiettivo aria con ingrandimento 10X e una NA = 0,2 per seguire il moto del Nauplius.
- Utilizzare una configurazione pinzette ottiche con un nm laser ad onda continua 1.064 accoppiato nel microscopio in alto a destra. Impostare la potenza del laser della trappola ottica a 100 mW (misurata con un misuratore di potenza dopo l'obiettivo).
- Utilizzare una telecamera ad alta velocità CMOS o una reflex digitale a obiettivo singolo (DSLR) per rilevare e l'immagine del movimento delle particelle d'oro nella trappola ottica e il movimento del Nauplius.
- Utilizzare un filtro notch per evitare il laser di entrare nella camera.
- Utilizzare un misuratore di potenza per misurare la potenza del laser dopo l'obiettivo.
2. Preparazione del campione
3. Particle inseguimento Experiment
- Trappola una nanoparticella d'oro con la pinzetta ottica. Pertanto, portare il 1.064 nm laser cattura vicino a una nanoparticella d'oro che si sta diffondendo in soluzione spostando il palco microscopio. Le forze ottici attraenti tirare nanoparticelle d'oro verso il punto focale del secoloraggio laser e. La particella intrappolata non si sta diffondendo più e invece mantiene la sua posizione. Prendete un flusso video della nanoparticella intrappolato con la fotocamera DSLR ad un frame rate di 50 Hz per 30 sec.
- Spegnere il laser della pinzetta ottica e rilasciare il nanoparticelle d'oro dalla trappola.
- Utilizzare un programma di monitoraggio di particelle di leggere prima la posizione della particella oro otticamente intrappolati in ogni fotogramma del flusso video. Una trasformazione di Fourier veloce (FFT) di xy-posizione della particella nel tempo rivela uno spettro di frequenza.
NOTA: Qui, un 'IGOR PRO' codice informatico angolo scritta è stato utilizzato per analizzare la posizione centrale particella nel piano xy nel tempo e per l'analisi FFT. - Come alternativa ad un codice IGOR auto-scritta usare il programma liberamente disponibile 'Video Spot Tracker' per l'inseguimento della particella nel video. Utilizzare il software commerciale 'Origin' per eseguire la trasformazione di Fourier dei dati di monitoraggio:
- Clic del mouse sulla particella visto nella prima immagine del flusso video e una regione circolare appare di interesse.
- Scegliere "simmetrico" e "ottimizzare" nella finestra del prompt dei comandi superiore per ottimizzare il monitoraggio della particella.
- Clic del mouse "logging" nella finestra del prompt dei comandi in alto e scegli una cartella per salvare i dati. I dati di monitoraggio saranno salvati come un foglio di calcolo di dati.
- Clic del mouse "il video gioco" sul prompt dei comandi finestra di sinistra del programma di monitoraggio e attendere che vengono analizzati tutti i fotogrammi del video.
- Chiudere il programma e aprire il foglio dati salvati con 'Origin'. Impostare i valori di colonna come "y 1" e "y 2".
- Impostare intervalli di tempo per ogni fotogramma video come "x" nel foglio dati 'Origin'.
- Mark x-Posizione della colonna ed eseguire una FFT scegliendo "Analisi dei dati" e "FFT" nella finestra del prompt dei comandi in alto. Ripetere il passaggio per la colonna posizione y.
- Tracciare le ampiezze del segnale FFT calcolata in x-e y-direzione rispetto alla frequenza.
4. Simulazione Numerica
- Calcolare i α polarizzabilità della particella oro 60 nm utilizzando il programma informatico 'Mathematica'.
- Utilizzare l'equazione (1) per calcolare la polarizzabilità secondo Kuwata et al 16.:
(1) - Definire i seguenti tre parametri nel codice programma: il complesso funzione dielettrica dipendente dalla lunghezza d'onda della particella d'oro, il raggio nanoparticelle, e l'indice di rifrazione del mezzo circostante.
- Utilizzare l'equazione (1) per calcolare la polarizzabilità secondo Kuwata et al 16.:
- Utilizzare la descrizione delle eletdistribuzione di campo trica di un fascio gaussiano focalizzato secondo Agayan et al 17 per calcolare le forze ottici agiscono su una particella d'oro 60 nm.:
(2) - . Utilizzare le equazioni (3) - (6) da Agayan et al 17 per calcolare sia, il gradiente e spargendo forze che agiscono sulla particella:
(3) 
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(6) - Nel codice di programma, definire i parametri per la potenza del laser, l'apertura numerica della oggettivo, e il complesso polarizzabilità della nanoparticella.
- Riassumere la forza di gradiente e la forza di scattering per calcolare la forza ottica totale agente sulla particella oro in una trappola ottica.
- . Utilizzare le equazioni (3) - (6) da Agayan et al 17 per calcolare sia, il gradiente e spargendo forze che agiscono sulla particella:
- Simula premendo contemporaneamente "Control" e "Enter".
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Representative Results
Una illustrazione schematica della configurazione sperimentale è mostrato nella Figura 1A. Una configurazione di campo scuro è necessario rilevare otticamente lo spostamento di una particella d'oro 60 nm in una trappola ottica 15. La lunghezza d'onda di 1.064 nm per il laser trapping viene scelta per garantire un confinamento stabile del rivelatore di particelle d'oro 12,14. Un divisore di fascio nel microscopio viene utilizzata per focalizzare il fascio cattura attraverso l'obiettivo e un filtro notch impedisce il laser cattura di entrare nel dispositivo di rilevazione dello esperimento. La Nauplius stava eseguendo movimenti nella soluzione di acqua che circonda il nanoparticelle d'oro otticamente intrappolati (Figura 1B). Le vibrazioni fluidiche che genera l'animale si propagano attraverso il mezzo liquido e interagiscono con la particella otticamente intrappolati.
Figura 2A mostra un'immagine campo scuro di un singolo nanoparticelle d'oro 60 nm che è intrappolato by il raggio laser. Il colore verdastro sotto illuminazione a campo scuro indica la sua frequenza di scattering in tale intervallo di lunghezze d'onda. Osservando il colore della particella intrappolata con una fotocamera DSLR assicura che un solo nanoparticella plasmonica è intrappolato dal laser focalizzato da schiacciamento di una seconda particella comporterebbe una variazione di colore dovuta all'accoppiamento plasmonica. La distribuzione calcolata della forza ottica totale che mantiene la particella confinata nella trappola è illustrato nella Figura 2B. Senza vibrazioni fluidico esterno, lo spostamento della nanoparticella plasmonica intrappolato mostra una distribuzione gaussiana, poiché il suo movimento è soggetta unicamente al moto browniano (Figura 2C). Non appena un Nauplius viene aggiunta al campione, il suo movimento crea un'interazione fluidico con la particella rivelatore. La nanoparticella nella trappola ottica inizia ad oscillare nella direzione dell'interazione fluido fino ad una ampiezza di oscillazione di 100 nm (Figura 2D).
I movimenti di vari larve Nauplius sono stati analizzati in maniera indipendente monitorando il loro comportamento piscina con una fotocamera CMOS ad alta velocità. Un esempio è illustrato nella Figura 3A. Una oscillazione completa del moto periodico del braccio principale delle grosse antenne prende 148 msec, che corrisponde ad una frequenza di circa 6,75 Hz. Abbiamo osservato lo stesso Nauplius per un periodo di tempo di alcuni secondi e diverso anche naupli dallo stesso campione. Dalla osservazione diretta abbiamo osservato frequenze per i tratti antenne nel range tra 4,1 e 7,2 Hz.
Figura 3B e Figura 3C mostrano spettri di frequenza di una nanoparticella di oro intrappolata senza (curva nera) e con (curva rossa) un presente Nauplius nella goccia d'acqua osservata. Quasi nessun segnale può essere visto in direzione x dello spettro di Fourier della particella. Al contrario, la direzione y dello spettro di frequenza mostra una forte risponse. Questo può essere spiegato con la posizione relativa del Nauplius rispetto alla trappola per il particolato. La nanoparticella rileva solo le vibrazioni generate dall'organismo. Un segnale forte in direzione y indica quindi la direzione delle oscillazioni fluidici e anche la posizione dell'animale (cfr. Figura 2D). Trasformando la particella spostamento traiettoria dipendente dal tempo nello spazio di Fourier pertanto comporta una disparità dipendente direzione nell'intensità del segnale spettri di frequenza. L'ampia gamma presente nelle nostre misure di frequenza è coerente con motilità netto organismo. I movimenti delle due antenne principali del Nauplius non sono la fonte esclusiva di spostamento di liquido. Movimenti di coppie di antenne più piccole e altre sporgenze del corpo contribuiscono al segnale osservato. Per tutte le misurazioni, abbiamo trovato maxima frequenza tra 3.0 e 7.2 Hz per il movimento Nauplius, che è in una buona conformità alla magnetotera direttamente osservataper proiezioni del microrganismo biologico e anche adatta bene alla gamma di frequenza previsto per un Nauplius in uno stadio larvale 6,8-10.
Figura 1. Illustrazione schematica del setup sperimentale. A) configurazione di campo scuro e pinzetta ottica. Un divisore di fascio nel microscopio viene utilizzata per focalizzare il fascio cattura (1.064 nm, onda continua) alla fase del microscopio a campo scuro. Un filtro notch impedisce il laser di entrare ad alta velocità o fotocamera DSLR. B) Un nanoparticelle d'oro è intrappolato nel pinzetta ottica per rilevare le vibrazioni microfluidica di uno Nauplius nel mezzo circostante. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 2: intrappolamento ottico di una nanoparticella di oro. A) immagine campo scuro di una singola particella d'oro intrappolata. B) Calcolo della forza totale che agisce sulla particella in una trappola ottica. La lunghezza d'onda del laser è 1.064 nm e potenza di 100 mW è stata misurata sotto l'obiettivo. La forza è tracciata nella regione di 2 micron attorno al punto focale. C) xy-spostamento di una particella d'oro in una trappola ottica. Il movimento delle particelle non è disturbato da vibrazioni fluidici e solo causato dal moto browniano. D) xy-spostamento della particella d'oro nella trappola, dopo aver aggiunto un Nauplius al liquido. Il flusso generato dalla microfluidica animale provoca una distorsione dipendente dalla frequenza dello spostamento oro nanoparticelle in direzione y.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51502/51502fig2highres.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Frequenza spettri di una nanoparticella di oro intrappolata accanto a un Nauplius nuoto. A) Antenne colpi di un singolo Nauplius in diversi momenti. . Un'oscillazione completa del movimento periodico delle antenne principale dura circa 148 msec (6,75 Hz) B) curva nera: Spettro di frequenza dello spostamento di un indisturbato nanoparticelle otticamente intrappolati in direzione x che è stato preso come riferimento. Curva rossa: Spettro di frequenza della particella d'oro accanto a un Nauplius nuotare in direzione x. Lo spettro non mostra un forte segnale a causa della posizione relativa del Nauplius al particl otticamente intrappolatie. Inserto: Illustrazione schematica della posizione Nauplius e nanoparticelle d'oro durante l'esperimento. Il flusso generato dalla Nauplius movimento sia rivolta principalmente nella direzione y C) curva nera:. Riferimento spettro di frequenza della particella oro indisturbato nella direzione y. Curva rossa:. Spettro di frequenza dello spostamento di nanoparticelle d'oro in presenza di un Nauplius Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Microscopia a campo scuro è uno strumento potente per la visualizzazione nanoparticelle di oro con dimensioni inferiori al limite di diffrazione ottica, poiché la sezione trasversale dispersione delle nanoparticelle metalliche supera la loro sezione trasversale geometrica (cfr. Figura 2A) 18. In una configurazione pinzetta, questo approccio permette anche di distinguere se solo un singolo o multiplo nanoparticelle di oro sono intrappolati dal fascio laser perché plasmonica accoppiamento tra le particelle provoca un red-shift della frequenza di risonanza plasmonica 15. Microscopia a campo scuro con una configurazione pinzetta ottica offre quindi numerose nuove e utilissime possibilità di sperimentazione, ma la combinazione non è auto-evidente. Per intrappolamento ottico stabile è richiesto un fascio laser fortemente focalizzato, poiché l'origine di una trappola ottica in tre dimensioni è causato da un gradiente di densità campo ottico. Di solito, gli obiettivi con aperture numeriche alti (NA = 1,3-1,4) sono utilizzati per pinzettaimpostazioni per ottenere una stretta di focalizzazione del laser 19. La massima NA attualmente in commercio condensatori ad olio a campo oscuro, tuttavia, è 1.2. Questo limita la gamma di obiettivi che possono essere utilizzati per la cattura delle particelle di NA <1.2 perché obiettivi NA superiori recano il problema che ha disperso non solo, ma anche la luce diritta viene raccolta dalla lente obiettivo. Per la nostra configurazione, siamo in grado di conseguire un intrappolamento ottico stabile utilizzando un obiettivo ad immersione acqua con una NA = 1,0 e un condensatore per campo scuro con NA = 1.2. Questo è possibile perché l'espansione raggio laser davanti al microscopio ha portato ad un eccessivo riempimento dell'apertura posteriore dell'obiettivo e quindi ad una sufficiente focalizzazione del laser (anche con una NA di soli 1,0).
Intrappolamento stabile di una nanoparticella di oro plasmonica è anche fortemente dipendente dalla lunghezza d'onda del laser 12-14 trapping. Nei nostri esperimenti, una lunghezza d'onda di 1064 nm è stato scelto per la cattura delle particelle becausa questa lunghezza d'onda è molto spostata verso il rosso di risonanza plasmonica di lunghezza d'onda della particella a ~ 530 nm. Questo è importante per un intrappolamento stabile da quando le forze gradiente ottici agiscono sulla particella di oro sono dominanti per questa lunghezza d'onda, mentre la dispersione delle forze, che provengono da un trasferimento di moto dei fotoni dispersi e assorbiti, sono minime. Entrambi, gradiente e la forza di scattering, causano la particella di muoversi in diverse direzioni, ma solo forze gradiente conducono ad un intrappolamento ottico stabile, dal momento che sono rivolte verso la regione di massima intensità, che è al centro del fascio laser. Scattering forze, al contrario, vengono punta lungo l'asse del flusso di energia del fascio luminoso. Alla lunghezza d'onda vicina alla risonanza particella, diffusione della luce diventa forte e disperdendo forze dominante. Particelle in questo caso vengono spinti e non intrappolati dal fascio laser, anche oltre il piano focale 20,21.
Una cattura molto stabile della particella è unrequisito riscontrare la minima perturbazione microfluidica esterno ed ottenere un segnale migliorato per rumore nello spettro di frequenza dallo spostamento delle particelle in funzione del tempo nella trappola ottica. Allo stesso tempo, un laser di potenza elevata può portare al riscaldamento sostanziale del nanoparticelle che potrebbero indurre effetti termici indesiderati quali riscaldamento del campione d'acqua. Per ottenere un segnale distinto nello spazio di Fourier della particella entrambi i fattori devono essere considerati e l'esperimento ottimizzata in modo tale che gli effetti di riscaldamento sono ridotti al minimo ma sufficiente intrappolamento stabile è raggiunto. È anche importante sottolineare che le condizioni del campione di acqua, come la temperatura e pH, possono avere un impatto sulla vitalità delle larve durante la misura, e che questi fattori devono quindi essere controllata e mantenuta costante. Abbiamo quindi effettuato tutte le misurazioni a temperatura ambiente (~ 20 ° C) e ad un pH di circa 7,5.
Nel complesso, tegli metodo per rilevare il movimento di Nauplius larve con il tracciamento della posizione di una singola nanoparticella di oro in una trappola ottica rappresenta un modo non invasivo per analizzare l'attività del campione acquatici senza l'obbligo di disturbare o anche vedere la Nauplius durante la misurazione. Inoltre, la direzione delle oscillazioni microfluidica può essere determinato analizzando la direzione dipendente spettro di Fourier di spostamento della nanoparticella. La configurazione pinzetta ottica rende così possibile rilevare anche piccole vibrazioni fluidiche in una soluzione acquosa ad alta sensibilità. In futuro, questo approccio potrebbe essere esteso per distinguere i diversi tipi di organismi in un campione di acqua e allo stesso tempo. Inoltre, questo approccio di utilizzare una nanoparticella di oro come un rivelatore sensibile non è limitato alla misura di soli larve Nauplius e può in principio essere applicato per misurare qualsiasi flusso generato da oggetti molto più piccoli, come singole cellule e Pobatteri ssibly anche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario da parte del CER attraverso l'Advanced Investigator Grant HYMEM, dalla DFG attraverso il Nanosystems Iniziativa Monaco di Baviera (NIM) e attraverso il Sonderforschungsbereich (SFB1032), progetto A8 Si ringrazia. Siamo grati al Dr. Alexander Ohlinger, Dr. Sol Carretero-Palacios e wellness Nedev per il supporto e discussioni fruttuose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Zeiss Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | 490035-0012-000 | dark field illumination |
| Water objective Achroplan | Carl Zeiss | 440087 | 100X magnification, NA = 1.0 |
| Air objective Epiplan | Carl Zeiss | 442934 | 10X magnification, NA = 0.2 |
| Dark field oil condenser | Carl Zeiss | 445323 | NA = 1.2 |
| Cobolt Rumba CW 1,064 nm DPSSL | Cobolt | 1064-05-01-2000-500 | 1,064 nm, CW, λ = 1,064 nm, 2 Watt, TEM00 |
| Beam expander | Edmund Optics | Part no. 1064 2-8X 64414 | |
| High Speed Camera Dimax HD | PCO. Germany | ||
| Color Camera Canon EOS 500 D | Canon | FAQ-ID: 8201395700 | |
| Notch filter StopLine 532/1064 | Semrock | A11149-711265 | Part no. NF01-532U |
| Water | |||
| Nauplius Artemia salina | |||
| Gold colloid | BBInternational | Batch 13741 | Diameter 60 nm |
| MQMie Version 3.2 | Dr. Michael Quinten | ||
| Mathematica 8.0 | Wolfram | ||
| Comsol Multiphysics 4.0 | COMSOL, Inc. |
References
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